DK163210B - Fremgangsmaade til inaktivering af et lipidvirus i form af hepatitis b virus og/eller non-a, non-b hepatitis virus - Google Patents

Description

i

DK 163210 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til inaktivering af lipidvirus i form af hepatitis B virus (HBV) og/eller non-A, non-B hepatitis virus (NANBH), specielt i blodprodukter.

5

Viral hepatitis er blevet erkendt som en vigtig og alvorlig følgesygdom ved parenteral kontakt med blod og blodkomponenter siden tidligt i 1940'erne. Man troede oprindeligt, at al sådan blodassocieret hepatitis var forårsa-10 get af serum hepatitis virus (nu kendt som hepatitis B virus eller HBV). Senere viste udviklingen af følsomme prøver for infektion med dette virus, at kun ca. 1/3 af transfusionsassocieret hepatitis var forårsaget af HBV.

Man troede, at den resterende hepatitis var forårsaget af 15 hepatitis A virus (HAV). Udviklingen af følsomme prøver for HAV har imidlertid ført til erkendelsen af et nyt hepatitis virus, non-A, non-B hepatitis virus (NANBH) i 1975. Anvendelsen af succesfulde følsomme sorteringstests for HBV på bloddonorer har resulteret i et fald (men ikke 20 forsvinden) af HBV i transfusionsassocieret hepatitis; for tiden er ca. 90% af sådan hepatitis forårsaget af non-A, non-B stoffer.

På tilsvarende måde har man troet, at hepatitis efter ad-25 ministrering af blodprodukter, såsom antihæmofil faktor, var forårsaget udelukkende af HBV. Sidst i 1970'erne blev forbindelsen mellem NANB-stoffer og administrering af an-tihæmofil faktor til blødere rapporteret og bekræftet.

Som transfusionsassocieret hepatitis har anvendelsen af 30 serologe sorteringsmetoder på plasmadonorer resulteret i et relativt fald i betydningen af HBV i sådan blodpro-duktassocieret hepatitis.

Uheldigvis findes der ikke serologe testmetoder til de-35 tektering af NANB-stoffer til detektering af potentielt infektiøse donorer, fordi stofferne ikke er blevet tilstrækkeligt identificeret og karakteriseret på trods af

DK 163210 B

2 omfattende anstrengelser for at gøre dette. Derfor forbliver blod og blodprodukter potentielle kilder for overføring af hepatitis-stoffer til recipienter eller modtagere. Den resulterende hepatitis kan være helt alvorlig, 5 endog livstruende og kan resultere ikke blot i akut hepatitis, men også i kronisk hepatitis i et betydeligt antal tilfælde.

Af disse grunde er forsøg på at inaktivere hepatitis-10 stoffer i blod og blodprodukter blevet fulgt meget stærkt op. Sådanne forsøg har omfattet anvendelse af varme, tilsætning af anti-HBV antistof, anvendelse af faste immuno-adsorberingsmidler eller andre kemisk specifikke adsorbe-ringsmidler, udsættelse for ultraviolet bestråling, til-15 sætning af visse inaktiverende stoffer, såsom Ø-propio-lacton, overfladeaktive stoffer, etc. Ingen af disse forsøg er faldet heldigt ud, og nogle har indført en yderligere kraftig risiko (f.eks. Ø-propiolacton, der er car-cinogent). Nogle af forsøgene er ikke blevet kontrolleret 20 for effektivitet (f.eks. overfladeaktive stoffer). Mangler ved disse forsøg stammer fra relativ resistens af stofferne over for fysisk eller kemisk inaktivering, især når de er i nærværelse af høje proteinkoncentrationer, som tilfældet er med blodprodukter, og fra begrænset 25 kendskab til naturen af hepatitis-stofferne, specielt NANB-stofferne.

Som del af en systematisk karakterisering af NANB-stoffer ved standardiserede virologe metoder har ansøgerne kon-30 stateret, at HBV og mindst ét NANB-stof indeholder lipi-der, der er væsentlige for integriteten og levedygtigheden af de omhandlede vira. Dette blev konstateret ved at udsætte de omhandlede vira for et kraftigt lipidopløs-ningsmiddel (chloroform) og vise, at sådanne chloroform-35 ekstraherede vira blev gjort ikke-infektiøse i en egnet modtagelig vært, chimpansen (Pan troglodytes).

DK 163210 B

3

Det vil forstås, at den foreliggende opfindelse gælder alle lipidholdige NANBH-partikler, som nødvendigvis kan være mere end en partikel, som f.eks. den for nylig opdagede delta-partikel.

5

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, a) at viruset i bæreren i 1/2-5 timer og ved omgivelsernes temperatur mellem 4 og 40 °C bringes i kontakt med 10 et behandlingsmiddel i form af en halogensubstitueret lavere alkan, og b) at dette behandlingsmiddel fjernes fra proteinbæreren.

15 Den er særlig nyttig ved inaktivering af blod og blodprodukter. Et særligt fordelagtigt behandlingsmiddel er chloroform, CH^Cl, men de mest almindelige Freon®-midler, såsom CH2F2 og CC12F2, kan anvendes.

20 Fremgangsmåden er anvendelig både hvor ekstraktionen af de vandige blodprodukter foretages ved hjælp af fysiske midler, centrifugering, eller på anden måde, og også hvor ekstraktionen foretages på de lyofiliserede tørrede blodprodukter, og fjernelsen af opløsningsmidlet foretages 25 ved passende midler, som omfatter vakuuminddampning. Almindeligvis kan disse to processer skelnes derved, at i sidstnævnte er der en reduktion til pulverform efter anvendelse. Det har vist sig, at der er et behov for beskyttelse af produkter, som er blevet lyofiliseret.

30

Inaktiveringen af HBV og NANBH er blevet vist på dyr, såsom chimpanser.

Non-A, non-B hepatitis er hovedårsagen til transfusions-35 associeret hepatitis i USA. For tiden er mindre end 10% af post-transfusionstilfælde forårsaget af hepatitis B virus. Af resten kan cytomegalovirus tegne sig for en

DK 163210B

4 lille del, men det overvejende flertal er forårsaget af et indtil nu uidentificeret stof. Der er stor sandsynlighed for, at et overførbart stof er årsagen til NANBH.

Dette omfatter overførselsstudier foretaget i både menne-5 sker og ikke-humane primater. Chimpanser og egernaber har begge vist sig at være modtagelige for infektion med i det mindste nogle NANBH-stoffer. Skønt det er meget kostbart og besværligt at arbejde med disse dyr, kan de anvendes til hjælp ved karakterisering af det infektiøse 10 stof i NANBH.

En af de fundamentale egenskaber for vira er, hvorvidt de indeholder væsentligt lipid eller ikke som en del af deres struktur. Vira, som indeholder væsentligt lipid, kan 15 inaktiveres af lipidopløsningsmidler, såsom ether eller chloroform. Den foreliggende opfindelse angår især chlo-roformfølsomheden for H-stammen af NANBH.

Det har været nævnt i litteraturen, at diethylether er et 20 effektivt inaktiveringsmiddel til ødelæggelse af endo toxin eller infektivitet af non-hepatitis vira og undgåelse af sammenklumpningsvirkning. Det er imidlertid et mindre effektivt opløsningsmiddel for lipider. Heller ikke anvendelsen af diethylether er anbefalet til den bre-25 dere anvendelse af de omhandlede stoffer i nucliseringen af koppevirus (pox virus); sådan koppevirus kan illustreres ved almindelig koppevirus (small pox) og kokoppevirus (vaccinia virus). Ikke blot diethylether nævnes, men også andre ethere, såsom phenoxyethanol, polyethoxyethanol og 30 forbindelser med den almene formel RCgH^(0C2H^)n0H.

Den omhandlede anvendelse af chloroform og Freon®- eller Genetron-fluorcarbonmidler har vist sig nyttige ved såkaldt lipidvirus, som omfatter HBV og NANBH,og også de 35 viruspartikler, som har en lipid yderkappe, som er modtagelig for fjernelse ved behandling.

DK 163210 B

5

Ved anvendelsen af den foreliggende opfindelse foretrækkes chloroform, men som alternative reagenser, der er anvendelige, kan nævnes en Freon®, som er defineret som et chlorfluorcarbon med et eller to carbonatomer. Disse 5 stoffer kan betragtes som fluorerede derivater af methan og ethan. Yderligere kan som Freon®-forbindelser anvendes chlorfluorcarboner, f.eks. CClgF, CC12F2, CC12FCC1F2 etc.

F.eks. kan følgende forbindelser i methan- og ethanrækken efter den løbende nummerering anvendes: CCl^F, CC12F2, 10 CHC1F2, CC12F-CC1F2 og CC1F2CC1F2, der benævnes henholds vis Freon® 11, Freon® 12, Freon®22, Freon® 113 og Freon® 114.

Følgende til teknikkens stade hørende patentskrifter kan 15 nævnes: US patentskrift nr. 4 113 712 Funakoshi - anvendelse af et overfladeaktivt middel, såsom Triton®- eller Tween®-forbindelser for hepatitis B overfladeantigenpartikler.

20 US patentskrift nr. 4 139 630 Asculai et al., - anvendelse af ikke-ioniske overfladeaktive midler som inaktiveringsmidler for herpes simplex virus.

25 US patentskrift nr. 4 314 997 Shanbrom - en ikke-denatu-rerende amfifil anvendt til at inaktivere hepatitis vira B og non-A, non-B i en mængde på 0,25 til 10 vægt-%, idet der nævnes ikke-ionogene, anioniske og kationiske overfladeaktive midler.

30 US patentskrift nr. 4 315 919 Shanbrom - lignende indhold som det i det foregående angivne for US patent skri ft nr.

4 314 997.

35 Purcell, "The Hepatitis Viruses: An Overview and Historical Perspective", Viral Hepatitis, 1981 International Symposium, udg. Szmuness, Alter og Maynard, Franklin In-

DK 163210 B

6 stitute Press, Philadelphia, pp. 3-12.

Philipson, "Water-Organic Solvent Phase Systems", Methods in Virology, udg. Maramorosch et al., bind II, 1967, pp.

5 235-244.

Tegningens figur viser en afbildning i forhold til tiden på ordinaten af chimpansebehandlingen med chloroform-eks-traheret non-A, non-B virus og hepatitis B virus, og det 10 kunne konkluderes af prøven, at den var negativ 31 uger efter indpodning. Yderligere simulerede forsøg blev foretaget, hvor der ikke var nogen chloroforminaktivering af virus, og dyrene fik hepatitis.

15 EKSEMPEL 1

Infektiøst podemedium

Humant plasma, betegnet H, blev ved plasmaforese udtaget 20 fra en patient med akut NANBH efter transfusion. En por tion af plasmaenheden var tidligere blevet fordelt i 1 ml beholdere, og en 10 ganges rækkefortynding i føtalt kalveserum fra 10® til 10-1® blev fremstillet, fordelt i mængder på 1 ml i beholdere og opbevaret ved -70 °C ind-25 til anvendelse. Dette plasma havde vist sig at have en g chimpanseinfektivitetstiter på mindst 10 . 1 ml af dette plasma blev optøet ved en 10-1 fortynding og behandlet som beskrevet i det følgende.

30 Et humant hepatitis B serum betegnet MS-2 indeholdende 10 chimpanseinfektiøse doser pr. ml var også tidligere blevet fordelt i lige store portioner, fortyndet og opbevaret på lignende måde som NANBH-plasma. En 1 ml beholder _3 med en 10 fortynding af MS-2 serum blev optøet og be-35 handlet som beskrevet i det følgende.

DK 163210 B

7

Kontrolvira

Repræsentative chloroform-følsomme og -resistente vira blev udvalgt som indre og ydre kontroller. De indre kon-5 troller blev sat direkte til NANBH-plasmaet eller til HBV-seraet. De indre kontrolvira blev valgt, fordi det humane serum eller plasma indeholdende hepatitisstofferne manglede antistof til kontrol af vira, de ville ikke re-plikere af betydning i chimpanser, som skulle anvendes 10 til prøve for hepatitis vira, og de kunne prøves separat hver især i nærværelse af den anden under interferens. Luftbårent influenza virus H.N. blev anvendt som den g chloroformfølsomme indre kontrol. Ca. 10 TCID^q blev sat til hver af hepatitisprøverne. Den colifage ΦΧ174 blev g 15 anvendt som det chloroformresistente virus, og ca. 10 infektiøse partikler blev sat til hver af hepatitisprøverne. Ydre kontrolvira blev valgt, fordi de repræsenterede typiske humane infektiøse midler og let kunne afprøves. En ml poliovirus type I LSC vaccinestamme indehol- 7 20 dende ca. 10 TDIC50/ml blev sat til 1 ml af en 1:10 fortynding af føtalt kalveserum som det chloroformresistente ydre kontrolvirus. En ml Vaccinia virus Elstree stamme indeholdende ca. 10^ TCIDj-q blev på lignende måde sat til føtalt kalveserum og tjente som det chloroformfølsomme 25 ydre kontrolvirus.

Chloroformekstraktion

Hvert hepatitispræparat og hvert ydre kontrol føtalt kal-30 veserumpræparat blev fortyndet til et slutvolumen på 10 ml eller en 1:100 slutkoncentration af serum eller plasma. Hver 10 ml prøve blev derpå jævnt fordelt i to glasrør med skruelåg. Til det ene af rørene for hver prøve blev der sat 0,55 ml chloroform fra en frisk åbnet flaske 35 til en endelig 10 vol.%'s chlorof ormkoncentrat ion. Alle rør (både dem indeholdende og dem ikke indeholdende chloroform) blev derpå rystet på en vortex-blander i 10 mi-

DK 163210B

8 nutter ved stuetemperatur og centrifugeret ved 1000 omdr./min. i 10 minutter i en Sorvall 3B centrifuge.

Den vandige fase blev derpå omhyggeligt pipetteret fra 5 grænsefladen af de chloroformholdige prøver og fra eventuelt pelletteret fast materiale fra prøverne ikke indeholdende chloroform. Disse blev fordelt i 1 ml portioner og opbevaret ved -70 °C indtil afprøvning.

10 Virale infektivitetsprøver. Luftbåren influenza virus blev afprøvet på normal hundenyrecellelinie, MDCK-celler, ved cytopatisk effekt, CPE og hæmadsorption med røde blodlegemer fra marsvin. Firedobbelte fordybninger i seks fordybningsplader blev podet for hver fortynding af en 15 række 10-ganges fortyndingsrække med både den chloroform-behandlede og den simuleret behandlede prøve.

ΦΧ174 blev afprøvet ved rørfortynding (firedobbelte prøver) i L-medium for hver prøve, der skal afprøves, under 20 anvendelse af E. coli 4704 som værtscelle.

Vaccinia virus infektivitet blev afprøvet ved CPE i Vero-celler. Firedobbelte fordybninger i 6 fordybningsplader blev podet med række 10-gange fortyndinger af de føtale 25 kalveserumsuspensioner indeholdende Vaccinia virus, og de relative titere for de chloroform-behandlede og simuleret behandlede prøver blev sammenlignet.

Poliovirus blev afprøvet ved CPE i Veroceller på samme 30 måde som Vaccinia virus.

Chimpansepodninger

To chimpaner blev podet hver med 1 ml af det chloroform-35 behandlede H-plasma. En chimpanse blev podet med 1 ml af det chloroform-behandlede MS-2 serum. Chimpanserne blev undersøgt for hepatitis ved bestemmelse af alaninamino- 9

DK 163210 B

transferase (ALT) koncentrationer og aspartataminotransferase (AST) koncentrationer på ugentlige plasmaferese-prøver. Hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), antistof mod HBsAg (anti-HBs) og antistof mod hepatitis B kernean-5 tigen (anti-HBc) blev også målt i plasmaet fra den med MS-2 podede chimpanse under anvendelse af i handelen tilgængelige radioimmunoprøver (Ausria®, Ausab og Corab, Abbott Laboratories). Desuden blev percutane leverbiopsier opnået ugentlig fra alle chimpanser. Disse biopsier blev 10 delt i tre stykker og fikseret i 10%’s pufret formalin til rutinehistologi, glutaraldehyd til elektronmikroskopi og hurtigt frosset til immunofluorescens.

Diagnose af hepatitis 15

Hepatitis blev diagnostiseret i en chimpanse, hvis ALT-koncentrationen steg til mere end det dobbelte af den øvre grænse, der normalt regnes for at være 40 IE/liter. Hepatitis blev bekræftet ved lys- og elektronmikroskopi 20 af leverbiopsierne.

Resultater;

Alle de indre og ydre kontrolvira reagerede mod chloro-25 form-behandlingen som forventet, og disse resultater er summariseret i tabel I. Det luftbårne influenza virus og Vaccinia virus blev totalt inaktiveret af chloroform, medens poliovirus og ΦΧ174 var i alt væsentlig upåvirket.

30 35

TABEL I

DK 163210 B

10

Chloroformekstraktion af kontrolvira 5 Virustiter log^Q IDjjq/0,1 ml CHClg- Simuleret ekstraktion ekstraktion1 1

Indre kontroller 10 ΦΧ174 i H-plasma1 9,0 9,5 MS-2 serum1/føtalt kalveserum 9,0 9,5 15

Luftbårent influenza virus i H-plasma1 ^0,5 5,25 MS-2 serum/føtalt kalveserum1 ^0,5 5,5 20

Ydre kontroller poliovirus type 1 i føtalt kalveserum1 6,5 6,5

Vaccinia virus i 25 føtalt kalveserum1 ^0,5 5,5 slutkoncentrationen for det totale serum eller plasma var 1:100 for hver virussuspension 30 2 uden CHClg 2

Figuren viser de ugentlige ALT-koncentrationer i de to chimpanser (nr. 889 og 947) podet med det chloroform-be-handlede H plasma og den ene chimpanse (nr. 967) podet 35 med det chloroform-behandlede MS-2 serum. Som det kan ses udviklede ingen af disse dyr biokemisk sandsynlighed for hepatitis. Chimpanse 967, der blev podet med MS-2 plasma-

DK 163210 B

11 et, udviklede anti-HBs, men ikke anti-HBc, hvilket er typisk hepatitis B vaccinerespons indikerende, at HBsAG var i podemediet, men ikke infektiøs virus.

5 Dette dyr var sandsynligvis resistent over for infektion med levende HBV på grund af dets erhvervelse af anti-HBs.

Det blev derfor ikke udsat for simuleret behandlet MS-2 plasma. Seks måneder efter den begyndende podning blev alle tre dyr podet med det simuleret behandlede H-plasma.

10 Som det kan ses af figuren udviklede chimpanse 967, der ikke tidligere var udsat for NANBH, NANBH med en 5-ugers inkuberingstid. Chimpanse 889, der til at begynde med var podet med det chloroform-behandlede H-plasma, udviklede også NANBH med en inkuberingstid på ca. 5 uger efter gen-15 udsættelse for det simuleret behandlede H-plasma. Chimpanse 947 udviste imidlertid ingen tegn på hepatitis efter hverken podninger med chloroform-behandlet eller simuleret behandlet H-plasma. Derimod viste chimpansen sandsynlighed for infektion med non-A, non-B hepatitis 20 virus efter inokulering med skin-behandlet virus, men ikke chloroform-behandlet virus. Dette er vist på tegningen som minus-tegn og plus-tegn. Plus-tegnene repræsenterer karakteristiske elektronmikrografiske ændringer, der er indikative for non-A, non-B hepatitis virusreplikation og 25 -infektion. Chimpanse 947 havde således en subklinisk, men utvetydig infektion med non-A, non-B hepatitis efter inokulering med skin-behandlet virus. Sådanne subkliniske infektioner er almindelige med hepatitis vira såvel som med andre vira. Demonstrationen af non-A, non-B virus-30 replikation i alle tre chimpanser inokuleret med skinbehandlet non-A, non-B hepatitis virus bestyrker således konklusionen, at chloroform-behandling, men ikke skinbehandling eller simuleret behandling, inaktiverer non-A, non-B hepatitis virus.

35 _2 I et indledende, ukontrolleret forsøg var en 10 opløsning af H-plasmaet stadig infektiøs i en chimpanse efter

DK 163210 B

12 behandling med 5 vol.%'s chloroform. Dette dyr havde imidlertid en inkuberingsperiode på 9,5 uger, hvilket indikerede, at virustiteren var reduceret ved chloroformbehandlingen .

5

To humane plasmaprøver i chimpanser er blevet studeret, idet ansøgerne var så heldige at opnå klinisk materiale (plasma), der indeholdt non-A, non-B hepatitis virus med høj infektionstiter, som muliggjorde det i det følgende 10 beskrevne eksperiment. Ellers ville det have været teknisk meget vanskeligt at udføre dette eksperiment. Rådigheden over sådant høj-titer-plasma indeholdende non-A, non-B hepatitis virus muliggjorde udførelse af eksperimentet under samme betingelser som eksperimentet med he-15 patitis B virusholdigt plasma, hvorved man eliminerer en anden variabel og yderligere forbedrer værdien og pålideligheden af eksperimentet. Det viste sig, at den ene prø- _2 ve havde en infektivitetstiter på mindre end 10 . Den anden prøve inficerede imidlertid en chimpanse ved en 20 10“® fortynding. Dette plasma med forholdsvis høj titer muliggør som nævnt visse karakteriseringsforsøg, der ikke

kan udføres ordentligt med et podemedium med lav titer. I

dette forsøg blev udgangsplasma fortyndet til en slut-_2 fortynding på 10 for at fjerne det meste af virkningen 25 af de høje koncentrationer af plasma ved chlorof ormekstraktionen og stadig muliggøre et forsøg for at se, om 4 10 chimpanseinfektionsenheder kunne inaktiveres med chloroform. Alle andre chimpansepodemedier, der blev rap- 3 porteret, har en forholdsvis lav titer, sædvanligvis 10 30 eller derunder. Disse podemedier har meget mindre anvendelighed til karakteriseringsforsøg.

Hepatitis B virus indeholder ikke et lipidhylster afledt fra en cellemembran, men overtrækket er sammensat af li- 4 35 poprotein. 10 infektiøse doser af HBV blev fuldstændig 4 inaktiveret ved behandling med chloroform. Da 10 chim-panseinfektiøse doser af H-stammen af NANB også var inak-

DK 163210 B

13 ti veret med chloroform, blev det konkluderet, at dette stof også indeholdt væsentligt lipid.

EKSEMPEL 2 5

Chloroforminaktivering af prøvevira i antihæmofil fraktion.

Dette forsøg blev udført for at bestemme, om chloroform-10 ekstraktion af lyofiliseret antihæmofil fraktion effektivt inaktiverede 2 lipidholdige vira, et influenzavirus og et koppevirus.

Inaktivering af disse vira ved chloroformekstraktion af 15 vandige prøver er en standardiseret procedure. Sådan chloroformekstraktion er blevet anvendt til at inaktivere hepatitis B virus og non-A, og non-B hepatitis virus i fortyndede plasmaprøver. En praktisk anvendelse af denne procedure til inaktivering af hepatitis vira i en i han-20 delen tilgængelig antihæmofil fraktion ville imidlertid kræve ekstraktion af det tørre pulver. Formålet med denne protokol eller fremgangsmåde var at bekræfte, at sådan inaktivering finder sted med "standard"-vira. Luftbårent influenza virus blev anvendt, fordi mennesker mangler an-25 tistof mod dette virus. Skønt den almindelige befolkning har antistof mod vaccinia-virus, blev dette virus anvendt med passende kontroller til at bestemme, hvorvidt spor af antistof i den antihæmofile fraktion neutraliserede viru set.

30 I handelen tilgængelig AHF blev podet med en målt mængde luftbårent influenzavirus (A/S8) eller vaccinia virus (ATCC VR 862 Lot 1) eller et vævskulturmedium (MEM complete med 10% FBS). Produktet blev lyofiliseret og eks-35 traheret med chloroform ved en eller tre temperaturer: 4 °C, 20 °C eller 40 °C. De chloroformekstraherede prøver og kontrolprøverne blev rekonstitueret med vand til in- 14

DK 163210 B

jektion, og infektivitetstitrene for influenzavirus og vacciniavirus blev bestemt i passende vævskultursystemer.

Den vævskulturinfektiøse dosis^Q titer (TCID^q) af det 5 samlede luftbårne influenza var 10^'^/ral; det samlede 6 5 vaccinia-virus var ca. 10 ' /ml. Tre 30 ml beholdere med AHF fra samme portion blev rekonstitueret med 30 ml vand til injektion. Til beholder nr. 1 blev der sat 1 ml luft-bårent influenzavirus-podemedium. Til beholder nr. 2 blev 10 der sat 1 ml vacciniavirus-podemedium. Til beholder nr. 3 blev der sat 1 ml vævskulturmedium. Hver beholder blev omhyggeligt blandet (uden skumning). 5 ml fra hver beholder blev fordelt i seks mellembeholdere mærket henholdsvis 1A, IB, 1C, ID, 1E, 1F, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F etc.

15 Alle 18 beholdere blev lyofiliseret og lukket lufttæt. Beholderne A, B og C blev ekstraheret med chloroform; beholdere D, E og F blev holdt ved 4 °C, 20 “C og henholdsvis 40 °C i den lyofiliserede tilstand som kontroller.

Efter chloroformekstraktion blev beholdere 1A til F og 20 beholdere 2A til F returneret til hepatitis-virussektio-nen for at deltage i infektivitetstitreringer. Beholderne blev holdt ved 4 °C eller lavere temperaturer under overførsel og opbevaring.

25 Under forsøgsbetingelserne (ekstraktion af det tørre produkt i 20 minutter) blev vacciniavirus ikke inaktiveret ved 4 °C, og blev 70% inaktiveret ved 20 og 40 °C. Luftbåren influenzavirus blev 99,8% inaktiveret ved 4 °C og 90% inaktiveret ved 20 °C. Ved 40 °C kunne inaktivering 30 af influenzavirus ikke bestemmes. Resultaterne fremgår af efterfølgende tabel II.

35

Tabel II

DK 163210 B

15

Virkning af temperaturen på chloroform-inaktivering af vaccinia og influenza-vira i faktor VIII.

5

Titer (TCID^g/ml)

Virus_Temperatur* Kontrol CHCl^_Inaktivering, % 10 Vaccinia 4 °C ΙΟ3'3 103'5 0

Vaccinia 20 0C ΙΟ3'3 102'8 70

Vaccinia 40 °C ΙΟ3'5 103'0 70

Influenza 4 °C 103'5 10°'5 99,8

Influenza 20 °C ΙΟ2'0 101'0 90

15 Influenza 40 °C ΝΙΔ NI NI

* Ekstraheret i tør tilstand i 20 min.

Δ Ubestemmelige resultater 20 Yderligere afprøvning af vacciniavirus indikerede, at når virus blev ekstraheret med chloroform i tør tilstand ved stuetemperatur (20 °C) i tidsrum beliggende i området 20 minutter til 12 timer, var vacciniavirus 98% inaktiveret efter 2 timers forløb og fuldstændig inaktiveret efter 4 25 timer eller mere med udsættelse for chloroform.

Beregning: 7 5

Samlet luftbåren influenza (TCIDj-q på 10 ' ) fortyndet 30 ΙΟ-1'5 = 106 TCID50/ml.

Samlet vaccinia (TCID^q på 108,3) fortyndet 10-1'3 = 103 TCID50/ml.

35 EKSEMPEL 3

DK 163210 B

16

Chloroformekstraktion af lyofiliseret "Factorate®".

5 Lyofiliseret faktor VIII ("Factorate®" - Armour) blev ekstraheret med chloroform under' anvendelse af tre forskellige procedurer.

A. 1 g "Factorate®" (tørt pulver) blev ved 4 °C blandet i 10 20 minutter med 20 ml kold chloroform. Chloroformen blev derpå fjernet ved filtrering, og det tørre pulver blev vasket på filteret med yderligere 10 ml kold chloroform.

15 B. 1 g "Factorate®" (tørt pulver) blev blandet med 10 ml kold chloroform ved 4 °C i 10 minutter. Chlorof ormen blev derpå fjernet ved filtrering, og pulveret blev vasket på filteret med 5 ml kold chloroform. Denne proces blev derpå gentaget en anden gang.

20 C. 1 g "Factorate®" (tørt pulver) blev blandet med 20 ml chloroform ved stuetemperatur i 20 minutter. Chloro-formen blev fjernet ved filtrering, og det tørre pulver blev vasket på filteret med 10 ml chloroform ved 25 stuetemperatur.

Prøverne blev rekonstitueret med deioniseret vand og afprøvet for faktor VIII:c, fibronectin og fibrinogen (tabel III).

30 35

TABEL XII

DK 163210 B

17

Faktor VIII, fibronectin og fibrinogen aktivitet for lyo-filiseret "Factorate®" efter chloroformekstraktionen.

5

Faktor VIII Fibronectin Fibrinogen Prøve Enheder/ml rog/ml mg/ml

Kontrol 9,1 1,11 mg 8,9 mg 10

Stuetemperaturekstraktion 9,5 1,14 mg 9,3 mg 4 °C 1 x 15 ekstraheret 8,9 1,19 mg 9,3 mg 4 °C 2 x ekstraheret 9,3 1,29 mg 8,6 mg 20 De opnåede resultater viser, at de biologiske egenskaber af lyofiliseret "Factorate®" ikke er ødelagt efter chloroformekstraktion. Tabellen supplerer således tabel I, der viser virkningerne af chloroformekstraktion på vira, 25 30 35

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til inaktivering af lipidvirus i form af 5 hepatitis B virus (HBV) og/eller non-A, non-B hepatitis virus (NANBH) i en proteinbærer, kendetegnet ved, a) at viruset i bæreren i 1/2-5 timer og ved omgivelser- 10 nes temperatur mellem 4 og 40 °C bringes i kontakt med et behandlingsmiddel i form af en halogensubstitueret lavere alkan, og b) at dette behandlingsmiddel fjernes fra proteinbæreren. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til inaktivering af lipidvirus i blodplasmaprodukter, kendetegnet ved, at produkterne før anvendelse behandles med mindst ét behandlingsmiddel i form af en halogensubstitueret lavere 20 alkan i 1/2-5 timer, ved en temperatur mellem 4 og 40 °C, i en mængde på 5-50 vol.%, og at dette behandlingsmiddel fjernes fra produkterne.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg-25 net ved, at der som behandlingsmiddel anvendes chloroform. 30 35