FI79025C - Foerfarande foer inaktivering av lipidvirus och desinficering av blodplasmaprodukter. - Google Patents

Description

, 79025

Menetelmä lipidiviruksen inaktivoimiseksi ja veriplasma-tuotteiden desinfioimiseksi

Aina vuodesta 1940 lähtien on virushepatiitti nähty ulkopuolisen veri- ja verikomponenttiannoksen aiheuttamana 5 tärkeänä ja vakavana jälkitautina. Alunperin luultiin, että sellainen vereen kytkeytyvä hepatiitti oli kokonaan seerumin hepatiittiviruksen aiheuttama (nykyisin tätä virusta nimitetään hepatiitti B -virukseksi eli HBV:ksi). Tämän viruksen aiheuttaman infektion määrittämiseksi kehitetyt her-10 kät menetelmät paljastivat myöhemmin, että HBV aiheutti ainoastaan vain noin 1/3:n verensiirtoon liittyvistä hepatiiteista. Jäljelle jääviä hepatiittejä luultiin hepatiitti A-viruksen aiheuttamiksi. HAV:n suhteen herkkien määritysmenetelmien kehittyminen johti kuitenkin uuden hepatiittiviruk-15 sen, non-A, non-B-hepatiittiviruksen (NANB) löytymiseen v. 1975. HBV:n suhteen herkkien seulontamenetelmien menestyksellinen käyttö verenluovuttajiin on johtanut HBV:n vähenemiseen (mutta ei häviämiseen) verensiirtoon liittyvissä hepatiiteissa; tällä hetkellä noin 90 % sellaisista hepatii-20 teista on non-A, non-B-agenssien aiheuttamia.

Samalla tavalla arveltiin HBV:n yksinomaan aiheuttaneen hepatiitin, joka oli seurauksena verituotteiden, kuten esimerkiksi antihemofiilisen tekijän antamisesta. Kuitenkin myöhään 1970-luvulla tehtiin selkoa NANB-agenssien liitty-25 misestä antihemofiilisen tekijän antamiseen verenvuototautia vastaan sekä varmistettiin tämä asia. Verensiirtoon kyt-keytyvänä hepatiittina HBV:n tärkeys sellaisissa verituotteisiin liittyvissä hepatiittitapauksissa on vähentynyt plasman luovuttajiin käytettyjen seulontamenetelmien myötä. 30 Valitettavasti ei ole saatavissa serologisia testejä NANB-agenssien havaitsemiseksi mahdollisesti tartunnanvaa-rallisten luovuttajien löytämiseksi, koska agensseja ei ole riittävästi identifioitu ja karakterisoitu laajaperäisistä yrityksistä huolimatta. Sen tähden veri ja verituotteet jää-35 vät vastaanottajille siirtyvien hepatiittiagenssien mahdollisiksi lähteiksi. Syntyvä hepatiitti voi olla melkoisen ____ I.

2 79025 vakava, jopa hengenvaarallinen ja se voi merkittävässä osassa tapauksia johtaa ei ainoastaan akuuttiin, vaan myös krooniseen hepatiittiin.

Näistä syistä yrityksiä veressä ja verituotteissa 5 esiintyvien hepatiittiagenssien inaktivoimiseksi on tehty pontevasti. Sellaisiin yrityksiin sisältyy lämmön käyttö, anti-HBV-vasta-aineen lisäys, kiinteiden immunoadsorbenssien tai muiden kemiallisesti spesifisten adsorbenssien käyttö, ultraviolettisäteilylle alttiiksipano, tiettyjen inaktivoi-10 vien aineiden, kuten esimerkiksi beetapropiolaktonin, pinta-aktiivisten aineiden jne. lisääminen. Mikään näistä yrityksistä ei ole ollut yksinomaan menestyksellinen, ja jotkut ovat johtaneet mahdollisen riskin lisääntymiseen (esim. beeta-propiolaktoni-karsinogeenisen). Joitakin näistä yri-15 tyksistä ei ole tutkittu tehokkuuden suhteen (esim. pinta-aktiiviset aineet). Näiden yritysten epäonnistuminen on lähtöisin agenssien suhteellisesta kestävyydestä fysikaalista ja kemiallista inaktivoitumista kohtaan, erityisesti suurten proteiinikonsentraatioiden läsnä ollessa, kuten verituot-20 teiden ollessa kysymyksessä sekä hepatiittiagenssien, erityisesti NANB-agenssien luonteen rajoitetusta tuntemuksesta.

Standardisoiduilla virologisilla menetelmillä NANB-agenssien systemaattisen karakterisoinnin osana ovat kyseessä olevat keksijät näyttäneet toteen, että HBV ja ainakin 25 osa NANB-agenssia sisältäviä lipidejä, jotka ovat olennaisia virusten kokonaisuudelle sekä elinkyvylle. Tämä näytettiin toteen asettamalla virukset alttiiksi voimakkaalle lipidiliuottimelle (kloroformi) sekä todistamalla, että sellaiset kloroformilla uutetut virukset oli tehty 30 infektiokyvyttömiksi sopivassa, herkässä isännässä, simpanssissa (Pan troglodytes).

On selvää, että kyseessä oleva keksintö koskee kaikkia lipidejä sisältäviä NANBH-partikkeleita, joita pakostakin saattaa olla useampia kuin yksi partikkeli, kuten esi-35 merkiksi äskettäin löydetty delta-partikkeli.

3 79025

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää proteii-nikantajassa olevan lipidiviruksen inaktivoimiseksi, kun virus on valittu ryhmästä, johon kuuluvat hepatiitti B-virus (HBV) sekä non-A, non-B-virus (NANBH).

5 Menetelmälle on tunnusomaista, että a) kantajan suojaama virus saatetaan kosketukseen halogeenilla substituoidun alempi-alkaani-käsittelyaineen kanssa, 1/2 - 5 tunnin ajan ja ympäristön lämpötilan ollessa 4 - 40°C, ja 10 b) käsittelyaine erotetaan proteiinikantajasta.

Tämä käsittelyaine on valittu edullisesti kloroformin piiristä, ja siihen kuuluvat yleisimmät freonit, joita ovat CH2F2, CC12F2 jne., 5-50 %:n tilav./tilav. määrinä.

Yllä mainittu käsittelyaika on noin $-5 tuntia ja 15 tavallisesti ympäristön lämpötila on noin 4-40°C. Paras käsittelyaine on kloroformi, CHCl^ ja pannaan merkille, että on käytetty hyväksi menetelmää, jossa vettä sisältävien verituotteiden uuttaminen suoritetaan fysikaalisin keinoin, sentrifugoimalla tai muulla tavoin, mutta myös menetelmin, 20 joissa uutetaan lyofilisoimalla kuivattuja verituotteita ja liuotin poistetaan sopivin keinoin, joihin sisältyy tyhjössä suoritettu haihduttaminen. Tavallisesti nämä kaksi menetelmää voidaan erottaa siinä suhteessa, että viimeksi mainitun menetelmän käytön jälkeen tapahtuu muunnos jauhe-25 maiseen muotoon. On havaittu, että lyofilisoidut tuotteet täytyy suojata.

HBV:n ja NANBV:n inaktivoituminen on osoitettu eläimillä, kuten simpansseilla.

Non-A, non-B-hepatiitti on Yhdysvalloissa pääasial-30 linen syy verensiirtoon kytkeytyvään hepatiittiin. Tällä hetkellä vähemmän kuin 10 % siirron jälkeisistä tapauksista on hepatiitti B -viruksen aiheuttamia. Loppuosasta saattaa sytomegalovirus vastata pieneltä osin, mutta pääosan aiheuttaa tähän mennessä tunnistamaton agenssi. On olemassa suuri 35 joukko todisteita, jotka tukevat käsitystä, että siirrettävä aine on NANBH:n aiheuttaja. Tähän aineistoon sisältyvät verensiirtoa koskevat tutkimukset, jotka on suoritettu sekä ihmisillä että non-humaani-kädellisillä. Simpanssien ja 4 79025 silkkiapinoiden on molempien osoitettu olevan herkkiä ainakin joidenkin NANB-agenssien aiheuttamalle infektiolle.

Vaikka on vaivalloista ja kallisarvoista työskennellä näiden eläinten kanssa, niitä voidaan käyttää apuna NANBH-infek-5 tion aiheuttavaa agenssia karakterisoitaessa.

Yksi virusten peruspiirteistä on, sisältyykö luonteenomainen lipidi osana niiden rakenteeseen. Virukset, jotka sisältävät luonteenomaisen lipidin, voidaan inaktivoi-da lipidiliuottimilla, kuten esimerkiksi kloroformilla.

10 Tutkimus koskee erityisesti NANBH:n H-kannan herkkyyttä kloroformille.

Kirjallisuudessa on mainittu, että dietyylieetteri on tehokas inaktivoiva aine sen tähden, että se tuhoaa endo-toksiinin tai non-hepatiittivirusten infektiivisyyden ja 15 estää hyytymisen aktivoitumisen. Se on kuitenkin tehottomampi lipidien liuotin. Myöskään dietyylieetterin käyttöä ei suositella kyseessä olevien agenssien laajempaan käyttöön poxvirusten nuklisaatiossa; sellaista virusta saatetaan valaista smallpox- ja vacciniaviruksen avulla. Ei ole mai-20 nittu ainoastaan dietyylieetteriä, vaan on mainittu myös muita eettereitä, kuten esimerkiksi fenoksi, polyetoksieta-noli sekä yleisen kaavan RCgH4(OC2H4)nOH mukaisia yhdisteitä .

Kloroformin ja freonin tai genetron-fluorihiili-agens-25 sien kyseessä olevan käytön on havaittu olevan käyttökelpoista käsiteltäessä ns. lipidiviruksia, joihin kuuluvat HBV sekä NANBH ja myös ne viruspartikkelit, joilla on li-pidiulkokuori, joka herkästi poistuu käsittelyn avulla.

Tätä keksintöä hyväksikäytettäessä kloroformi on 30 edullinen, mutta tässä yhteydessä vaihtoehtoisina, käyttökelpoisina reagensseina voidaan käyttää freonia, joka määritellään yksi tai kaksi hiiliatomia sisältävänä kloorifluo-rihiilenä. Nämä saatetaan katsoa metaanin tai etaanin fluo-ratuiksi johdannaisiksi. Tämän lisäksi freoneina saatetaan 35 käyttää kloorifluorihiiliyhdisteitä, kuten esim. CCl^F:a, CCl~F_:a, CCl^FCClF :a jne. Esimerkiksi juoksevan numeroinnin 2 2 2 2 5 7»025 mukaiset, metaani- ja etaanisarjan seuraavat yhdisteet ovat käyttökelpoisia: CC^F, CC12F2, CHC1F2, CC12F-CC1F2 sekä CC1F2CC1F2 ja vastaavasti numeroituina 11, 12, 22, 113 sekä 114.

5 Aiempaa tutkimusta koskeva selvitys

Aiempia patentteja koskeva selvitys on seuraava: US 4 113 712 Funakoshi - Pinta-aktiivisten aineiden, kuten esimerkiksi Tritonin tai Tweenin käyttö hepatiitti B-pinta-antigeenipartikkelien vuoksi.

10 US 4 139 630 Asculai et ai. - Ionittomien pinta-ak tiivisten aineiden käyttö herpes simplex -viruksia inakti-voivina aineina.

US 4 314 997 Shanbrom - Ei denaturoiva amfifiili, käytetty hepatiitti B-virusten sekä non-A, non-B virusten 15 inaktivointiin 0,25 - 10 paino-%:n suuruisena määränä sekä tarkoittaen ionittomia, anionisia ja kationisia pinta-ak-tiivisia aineita.

US 4 315 919 Shanbrom - Yllä esitetyn 4 314 997:n kaltainen julkaisu.

20 Purcell, "Hepatiittivirukset: Yleiskatsaus ja histo riallinen perspektiivikuva", Viral Hepatitis, 1981 International Symposium, julk. Szmuness, Alter ja Maynard, Franklin Institute Press, Philadelphia, s. 3-12. Philipson, "Vesi - orgaaninen liuotin faasijärjestelmät", Methos in 25 Virology, julk. Maramorosch et ai., osa II, 1967, s. 235-244.

Piirroksia koskeva kuvaus

Kuva osoittaa aikaa vasten ordinaatalle merkittynä simpanssin käsittelyn kloroformilla uutetulla non-A, non-B 30 viruksella sekä hepatiitti B -viruksella ja kokeen johtopäätöksenä nämä olivat negatiivisia 31 viikkoa rokotuksesta. Tehtiin lisäksi kontrollitestejä, jolloin ei suoritettu viruksen kloroformi-inaktivointia ja eläimet saivat hepatiitin .

6 79025

Esimerkki 1

Tartunnanvaarallinen ymppi

Ihmisen plasmaa, joka on merkitty H:ksi, otettiin plasmaforeesin avulla potilaasta, jolla oli akuutti, veren 5 siirtoa seurannut NANBH. Osa plasmayksiköstä oli aiemmin annosteltu lml:n vetoisiin pulloihin ja vasikan sikiön seerumiin oli valmistettu kymmenkertainen laimennussarja 10^:sta -1 0 10 :aan, annosteltu 1 ml:n erinä pulloihin sekä varastoitu -70°C:ssa käyttöön asti. Tämän plasman infektiokykytiit- 10 terin simpanssilla oli osoitettu olevan ainakin 10°. 1 ml -1 tätä plasmaa laimennoksena 10 sulatettiin ja käsiteltiin alla kuvatulla tavalla.

Ihmisen hepatiitti B -seerumi, joka oli merkitty g MS-2:ksi ja joka sisälsi 10 simpanssille tartunnanvaaral-15 lista annosta ml kohti, oli myös aiemmin annosteltu, laimennettu sekä varastoitu samalla tavalla kuin NANBH-plas-ma. 1 ml:n sisältävä pullollinen MS-2-seerumin 10 "^-laimennusta sulatettiin ja sitä käsiteltiin alla kuvatulla tavalla.

20 Kontrollivirukset

Sisäisiksi ja ulkoisiksi kontrolleiksi valittiin kloroformille herkkien ja resistenttien virusten tyypilliset edustajat. Sisäinen kontrolli lisättiin suoraan NANBH-plas-maan tai HBV-seerumiin. Valittiin sisäisinä kontrolleina 25 toimivat virukset, koska ihmisen seerumista tai plasmasta, joka sisältää hepatiittiagensseja, puuttuu vasta-aine kont-rolliviruksia kohtaan, ne eivät merkittävästi replikoitui-si simpansseissa, joita käytettiin hepatiittivirusten määrittämiseen ja ne voitaisiin häiriöttä määrittää kukin 30 erikseen. Lintuinfluenssavirusta H.N. käytettiin kloroformille herkkänä sisäisenä kontrollina. Kuhunkin hepatiitti-

O

näytteeseen lisättiin likimäärin 10 TCID^^ia. Kolifagia 0 x 174 käytettiin kloroformin suhteen resistenttinä viruk- 9 sena ja kuhunkin hepatiitti-näytteeseen lisättiin noin 10 35 tartunnanvaarallista partikkelia. Ulkoiset kontrollivirukset valittiin, koska ne edustivat tyypillisiä ihmiselle 7 79025 tartunnanvaarallisia agensseja ja ne voitiin määrittää helposti. 1 ml poliovirustyypin I LSC rokotekantaa, joka sisälsi arviolta 107TDIC5Q/ml, lisättiin 1 ml:aan vasikan sikiön seerumin 1:1O-laimennusta kloroformille resistenttinä, ul-5 koisena kontrolliviruksena. 1 ml vacciniavirus Elstree-kan-taa, joka sisälsi noin 106 TCID50:a, lisättiin samalla tavalla häränsikiön seerumiin ja se toimi kloroformille herkkänä, ulkoisena kontrolliviruksena.

Kloroformiuutto 10 Kukin hepatiitti- ja jokainen ulkoinen kontrolli- vasikansikiönseerumivalmiste laimennettiin 10 ml:n lopputi-lavuuteen tai seerumin tai plasman loppukonsentraatioon 1:100. Kukin 10 ml:n näyte jaettiin sitten tasan kahteen kierrekorkilla varustettuun lasiputkeen. Toiseen, kunkin 15 näytteen putkista lisättiin 0,55 ml kloroformia, joka otettiin juuri avatusta pullosta, jolloin kloroformin lopulliseksi konsentraatioksi tuli 10 % (tilav./tilav.). Kaikkia putkia (sekä niitä, jotka sisälsivät kloroformia, että niitä, jotka eivät sisältäneet kloroformia) ravisteltiin kie-20 rukkasekoittimessa 10 minuutin ajan, huoneen lämpötilassa ja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeudella 1 000 kierrosta minuutissa Sorvali 3B sentrifugissa.

Vesijae poistettiin sitten huolellisesti näytteitä sisältävän kloroformin rajapinnasta sekä laskeutuneesta, 25 kiinteästä materiaalista, näytteistä, jotka eivät sisältäneet kloroformia. Nämä jaettiin 1 ml:n suuruisiin eriin ja varastoitiin -70°C:ssa määrittämiseen saakka.

Virusinfektiokyvyh määritys

Lintuinfluenssa määritettiin MDCK-soluilla CPE:n ja 30 hemadsorption avulla käyttämällä marsun punasoluja. Kuuden kammiolevyn neljänä kappaleena oleviin kammioihin siirros-tettiin sekä kloroformilla käsiteltyjen että kontrollina käsiteltyjen näytteiden kymmenkertaisen laimennussarjän kutakin laimennusta.

35 0 x 174 määritettiin kunkin testattavan näytteen L-lihaliemeen valmistetun koeputkilaimennuksen avulla 8 79025 (näytteet neljänä kappaleena) käyttämällä E. coli 4704 isäntäsoluna.

Vacciniaviruksen infektiokyky määritettiin CPE:n avulla vero-soluissa. Kuuden kammiolevyn neljänä kappaleena ole-5 viin kammioihin siirrostettiin vaccinia-virusta sisältävien vasikansikiönseerumisuspensioiden 10-kertaisten laimennusten sarja ja verrattiin kloroformilla käsiteltyjen ja kontrolleina käsiteltyjen näytteiden vastaavia tiittereitä.

Poliovirus määritettiin CPE:n avulla vero-soluissa 10 samalla tavalla kuin vacciniavirus.

Simpanssien rokotukset

Kaksi simpanssia rokotettiin kumpikin yhdellä milli-litralla kloroformilla käsiteltyä H-plasmaa. Yksi simpanssi käsiteltiin yhdellä millilitralla kloroformilla käsiteltyä 15 MS-2-seerumia. Simpansseja tarkkailtiin hepatiitin suhteen määrittämällä alaniiniaminotransferaasi-tasot (ALT) sekä aspartaattiaminotransferaasi-tasot (AST) viikottaisista plasmafereesi-näytteistä. Hepatiitti B-pinta-antigeeni (HBsAg), vasta-aine HBsAg:lle (anti-HBs) sekä vasta-aine 20 hepatiitti B -ydinantigeenille (anti-HBc) mitattiin kaupallista radioimmunologista menetelmää käyttäen (Ausria,

Ausab ja Corab, Abbot Laboratories) plasmasta, joka oli saatu MS-2:lla rokotetusta simpanssista. Lisäksi otettiin mak-sabiopsiat ihon kautta kaikilta simpansseilta joka viikko.

25 Nämä biopsiat jaettiin kolmeen osaan ja kiinnitettiin 10-%:isessa, puskuroidussa formaliinissa rutiinihistolo-giaa varten, glutaraldehydissä elektronimikroskopiaa varten sekä äkkijäädytyksen avulla immunofluoresenssia varten.

Hepatiitin diagnoosi 30 Hepatiitti määritettiin simpanssissa, jos ALT-taso nousi suuremmaksi kuin kaksi kertaa normaalin arvon yläraja, joka oli 40 IU/1. Hepatiitti varmistettiin maksabiopsia-näytteiden valo- ja elektromikroskooppisella tutkimuksella.

Tulokset: 35 Kaikki sisäiset ja ulkoiset kontrollivirukset rea goivat kloroformikäsittelylle, kuten ennustettiin ja nämä 9 79025 tulokset esitetään taulukossa 1. Lintuinfluenssavirus sekä vacciniavirus inaktivoituivat täydellisesti kloroformilla, kun taas poliovirus ja 0 x 174 olivat pääasiallisesti koskemattomia .

5 Taulukko 1

Kontrollivirusten kloroformiuutto

Virustiitteri log^qID^q/0,1 ml CHCl^- Kontrolli-uutto uutto** 10 Sisäiset kontrollit 0 x 174 H-plasmassa* 9,0 9,5 MS-2-seerumissa*/vasikansikiön- seerumissa* 9,0 9,5

Lintuinfluenssavirus 15 H-plasmassa* <0,5 5,25 MS-2-seerumissa/vasikansikiön- seerumissa* 10,5 5,5

Ulkoiset kontrollit poliovirus tyyppi 1 20 vasikansikiönseerumissa* 6,5 6,5 vacciniavirus vasikansikiönseerumissa* <0,5 5,5 * Lopullinen seerumin tai plasman kokonaiskonsentraatio kutakin virussuspensiota kohtaan oli 1:100.

25 **Ilman CHCl^ra

Kuva ilmaisee viikottaiset ALT-tasot kahdella simpanssilla (numerot 889 ja 947) , jotka on rokotettu kloroformilla käsitellyllä H-plasmalla sekä yhdellä simpanssilla (nro 967) , joka on rokotettu kloroformilla käsitellyllä 30 MS-2-seerumilla. Kuten voidaan nähdä, mikään näistä eläimistä ei kehittänyt hepatiitin biokemiallista todistetta. Simpanssi 967, joka oli rokotettu MS-2-plasmalla, kehitti anti-HBS;a, mutta ei anti-HBC:ä, joka on tyypillinen haptiitti B—rokotevasteelle ja ilmaisee, että rokotteessa oli HBsAGrä 35 mutta ei tartunnanvaarallista virusta. Tämä eläin oli luultavasti resistentti elävän HBV:n aiheuttamalle infektiolle, 10 7 O f' ^ r

IU i > u £. O

mikä johtui sen hankitusta anti-HBs:stä. Sen tähden sitä ei provosoitu kontrollina käsitellyllä MS-2-plas-malla. Kuuden kuukauden kuluttua alkuperäisestä rokotuksesta kaikki kolme eläintä rokotettiin kontrollina käsitellyllä 5 H-plasmalla. Kuten kuviosta on nähtävissä, simpanssi 967, joka ei aiemmin ollut alttiina NANBHrlle, kehitti NANBHta viiden viikon pituisen inkubointijakson aikana. Simpanssi 889, joka alunperin oli ympätty kloroformilla käsitellyllä H-plasmalla, kehitti myös NANBH:a noin viiden viikon pitui-10 sen inkubointijakson aikana, sen jälkeen kun se oli uudelleen provosoitu kontrollina käsitellyllä H-plasmalla. Kuitenkaan simpanssilla 947 ei ollut osoitettavissa mitään todisteita hepatiitista, joka olisi seuraus joko kloroformilla käsitellyllä plasmalla tai kontrollina käsitellyllä H-15 plasmalla suoritetusta rokotuksesta.

Alustavassa, kontrolloimattomassa kokeessa plasman _2 10 -laimennus oli vielä simpanssissa tartunnanvaarallinen sen jälkeen, kun sitä oli käsitelty 5-%:isella (tilav./ti-lav.) kloroformilla. Tällä eläimellä taudin itämisaika oli 20 9,5 viikkoa, mikä ilmaisi virustiitterin vähentyneen kloro- formikäsittelyn johdosta.

On tutkittu kaksi ihmisplasmanäytettä simpansseissa ja havaittiin, että niiden infektiivisyystiitteri oli alhai--2 sempi kuin 10 . Toinen kuitenkin infektoi simpanssin lai- 25 mennuksena 10 6. Tämä suhteellisen korkeatiitterinen plasma tekee mahdollisiksi tietyt karakterisointikokeet, joita ei voida sopivasti tehdä matalatiitterisellä rokotteella.

Tässä kokeessa lähtöplasma laimennettiin lopulliseen laimen-_2 nukseen 10 , jotta poistettiin plasman korkeiden konsentraa- 30 tioiden vaikutus kloroformiuuttoon ja oli vielä mahdollista 4 nähdä, voitiinko kloroformilla inaktivoida 10 simpanssille tartunnanvaarallista yksikköä. Kaikilla muilla simpanssiro- kotteilla, joista on esitetty tietoja, on suhteellisen alhai- 3 nen tiitteri, tavallisesti 10 tai sitä alhaisempi. Näiden 35 rokotteiden täytyy olla vähemmän käyttökelpoisia monia ka- rakterisointikokeita ajatellen.

11 79025

Hepatiittivirus ei sisällä lipidivaippaa, joka on peräisin solumembraanista, mutta kuori koostuu lipoprote- 4 iinista. Kloroformikäsittely inaktivoi täydellisesti 10 HBV:n tartunnanvaarallista annosta. Koska NANBrn H-kannan 4 5 10 simpanssille tartunnanvaarallista annosta myös inakti voitu! kloroformilla, pääteltiin tämän agenssin myös sisältävän luonteenomaisen lipidin.

Esimerkki 2

Koevirusten kloroformi-inaktivointi antihemofiili-10 sessä jakeessa Tämä koe suoritettiin sen seikan määrittämiseksi, oliko lyofilisoidun, antihemofiilisen jakeen kloroformiuut-to tehokkaasti inaktivoitunut 2 lipidiä sisältävää virusta, influenssaviruksen sekä poxviruksen.

15 Näiden virusten inaktivointi vesinäytteiden kloro- formiuuton avulla on standardoitu menetelmä. Sellaista klo-roformiuuttoa on käytetty inaktivoimaan hepatiitti B -virus sekä non-A, non-B-hepatiittivirus laimennetuissa plas-manäytteissä. Kuitenkin tämän menetelmän käytännön sovellu-20 tus hepatiittivirusten inaktivoimiseksi kaupallisessa antihemof iilisessa jakeessa edellyttää kuivan jauheen uuttamista. Tämän menettelyn tarkoituksena on varmistaa, että sellainen inaktivointi tapahtuu "standardivirusten" ollessa kysymyksessä. Lintuinfluenssavirusta käytettiin, koska ihmi-25 seltä puuttuu vasta-aine tälle virukselle. Vaikka tavallisella väestöllä on vasta-aine vacciniavirusta kohtaan, tätä virusta käytettiin sopivien kontrollien kanssa sen seikan määrittämiseksi, neutraloivatko antihemofiilisessä jakeessa olevat vasta-ainetähteet viruksen.

30 Kaupallinen AHF siirrostettiin mitatulla määrällä lintuinfluenssavirusta (A/S8) tai vacciniavirusta (ATCC VR 862 erä 1) tai kudosviljelmäelatusaineella (MEM täydellinen sisältäen 10 % FBS). Tuote lyofilisoitiin ja uutettiin kloroformilla yhdessä tai useammassa lämpötilassa: 35 5, 20 tai 40°C:ssa. Kloroformilla uutetut sekä kontrolli- näytteet muodostettiin uudelleen veden kanssa injektioon 12 79025 sopivaan muotoon ja influenssavirus ja vacciniavirus määritettiin sopivissa kudosviljelmäjärjestelmissä.

Kudosviljelmälle tartunnanvaarallinen lintuinfluens- 7 5 sapoolin annos^-tiitteri oli 10 ' /ml; vacciniaviruspoo-^ 6 5 5 lille se oli noin 10 ' /ml. Kolme 30 ml:n pullollista AHF:aa, jotka olivat samasta erästä, muodostettiin uudelleen injektioon sopivaan muotoon. Pulloon nro 1 lisättiin 1 ml lintuinf luenssavirusymppiä. Pulloon nro 2 lisättiin 1 ml vacci-niavirusymppiä. Pulloon nro 3 lisättiin 1 ml kudosviljelmä-10 elatusainetta. Kukin pullollinen sekoitettiin perusteellisesti (vaahdottamatta). Kustakin pullosta 5 ml jaettiin kuuteen vastaparipulloon, jotka merkittiin vastaavasti 1A, 1B, 1C, 1E, 1F, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F jne. (katso taulukko 1). Kaikki 18 pullollista lyofilisoitiin ja suljettiin.

15 Pullolliset A, B sekä C uutettiin kloroformilla, kuten taulukossa; pullollisia D, E sekä F pidettiin vastaavasti lämpötiloissa 5, 20 sekä 40°C, lyofilisoidussa tilassa kontrolleina. Kloroformiuuton jälkeen pullot 1A-1F sekä pullot 2A-2F palautettiin hepatiittivirusryhmään infektiivisyystit-20 rausten suorittamista varten. Pulloja pidettiin 5°C:ssa tai sitä alhaisemmassa lämpötilassa siirtämisen ja varastoinnin aikana.

Laskeminen: 7 5

Lintuinfluenssapooli (TCID^q 10 ' ) laimennettu 25 101'5 = 106 TCIDcn/ml. Vacciniapooli (TCIDcn 106'5) lai- -1 5 50 5 50 mennettu 1- ' - 10 TCID50/ml.

Esimerkki 3

Lyofilisoitujen tekijöiden kloroformiuutto

Lyofilisoitu tekijä VIII (valmistaja Armour) uu-30 tettiin kloroformilla käyttämällä kolmea erilaista menetelmää .

A. 1 g valmistetta (kuivaa jauhetta) sekoitettiin 4°C:ssa 20 minuutin ajan 20 ml:n kanssa kylmää kloroformia. Sitten kloroformi poistettiin suodattamalla ja kuiva jauhe 35 pestiin suodattimen päällä vielä 10 ml :11a kylmää kloroformia .

13 79025 B. 1 g valmistetta (kuivaa jauhetta) sekoitettiin 10 ml:n kanssa kylmää kloroformia 4°C:ssa 10 minuutin ajan. Kloroformi poistettiin suodattamalla, ja jauhe pestiin suodattimena 5 ml:11a kylmää kloroformia. Tämä tapahtuma 5 toistettiin sitten toisen kerran.

C. 1 g valmistetta (kuivaa jauhetta) sekoitettiin 20 ml:n kanssa kloroformia huoneen lämpötilassa, 20 minuutin ajan. Kloroformi poistettiin suodattamalla ja kuivaa jauhetta pestiin suodattimena 10 ml:n kanssa kloroformia, huoneen 10 lämpötilassa.

Näytteet rekonstituoitiin ionittoman veden kanssa ja määritettiin tekijän VIII:c:n, fibronektiinin sekä fibri-nogeenin suhteen (taulukko 2).

Taulukko 2 15 Lyofilisoidun faktorivalmisteen faktori VIII-, fib- ronektiini- sekä fibrinogeeniaktiivisuus kloroformiuuton jälkeen Näyte Yksiköitä/ml Fibronektiini Fibrinogeeni mg/ml mg/ml 20 Kontrolli 9,1 1,11 8,9

Uutto huoneen lämpötilassa 9,5 1,14 9,3 4°C:ssa 1 x uutettu 8,9 1,19 9,3 25 4°C:ssa 2 x uutettu 9,3 1,29 8,6

Claims (3)

14 79025

1. Menetelmä proteiinikantajassa olevan lipidivi-ruksen inaktivoimiseksi, kun virus on valittu ryhmästä, 5 johon kuuluvat hepatiitti B-virus (HBV) sekä non-A, non- B-virus (NANBH), tunnettu siitä, että a) kantajan suojaama virus saatetaan kosketukseen halogeenilla substituoidun alempi-alkaani-käsittelyaineen kanssa, 1/2 - 5 tunnin ajan ja ympäristön lämpötilan ol- 10 lessa 4 - 40°C, ja b) käsittelyaine erotetaan proteiinikantajasta.

2. Menetelmä veriplasmatuotteiden desinfioimiseksi, tunnettu siitä, että ennen käyttöä mainittuja tuotteita käsitellään ^5 a) vähintään yhdellä halogeenilla substituoidul- la alempi-alkaani-käsittelyaineella, 1/2 - 5 tunnin ajan 4 - 40°C:n lämpötilassa ja konsentraationa 5 - 50 % ti-lav./tilav., ja b) käsittelyaine erotetaan tuotteista.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetel- mä, tunnettu siitä, että käsittelyaine on kloroformi.