DK162531B

DK162531B - Monoklonalt antistof, fremgangsmaade til fremstilling deraf og diagnostisk udstyr egnet til detektering og diagnosticering af human ikke-smaacellet lungecancer under anvendelse af det monoklonale antistof

Info

Publication number: DK162531B
Application number: DK021985A
Authority: DK
Inventors: James L Mulshine; John D Minna
Original assignee: Us Health
Priority date: 1983-05-18
Filing date: 1985-01-17
Publication date: 1991-11-11
Also published as: EP0125928A3; EP0125928B1; DE3482905D1; CA1230565A; JPH0552193B2; US4569788A; DK21985D0; EP0125928A2; AU577293B2; DK162531C; WO1984004599A1; DK21985A; JPS60501309A; AU2966284A

Description

DK 162531B

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof, der er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

5 Det monoklonale antistof er foretrukkent IgG2A* monoklonalt antistof af cellelinierne 703D4 og 704A1, deponeret som ATCC nr. HB 8301 og HB 8302. Antistofferne betegnes 703D4 og 704A1 for nemheds skyld.

10 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det omhandlede antistof, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 4's kendetegnende del anførte.

15 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen udviser betydelig bindingsaktivitet med ikke-småcellet lungecancer (non-SCLC). Ingen af de monoklonale antistoffer (MAB) binder med småcellet lungecancer eller med normalt lungevæv. Begge antistoffer udfælder 31 kilodalton dublet 35 20 bånd af [ S]methionin-mærkede proteiner fra human ikke-småcellet lungecancer og humane melanomaceller. Andre bindingsegenskaber er vist i tabel I - V.

De foretrukne monoklonale antistoffer er to uafhængige 25 igG2A* antistoffer, der genkender forskellige epitoper på samme 31 kD protein eller separate 31 kD proteiner. Udbredelsen af disse antigener er begrænset til ikke-små-cellede former for lungecancer. Ingen af de afprøvede SCLC har udtrykt disse antigener, men nogle andre lkke-30 pulmonære neoplasmer, specielt melanoma, udtrykker disse epitoper. Disse antigener detekteres ikke i normalt væv fra voksne mennesker ved immunohistokemiske prøver eller assays eller radiobindingsassays. Disse antistoffers værdi ligger i, at de indgår i den gruppe monoklonale 35 antistoffer, der anvendes til at skelne ikke-småcellede fra småcellede former for lungecancer.

DK 162531 B

2

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er nyttige til detektering og differentiering af human ikke-små-cellet lungecancer. De histologiske hovedtyper af lungecancer er delt i to grupper: squamocellulær adenocarcinom 5 og storcellet betegnes kollektivt som ikke-småcellede lungecarcinomer (non-SCLC). De kan skelnes fra småcellet lungecancer (SCLC) ved klinisk fremvisning, respons på kemoterapi og bestrålingsterapi og ved biologiske egenskaber. SCLC er meget sjældent lokaliseret, så kirurgi 10 eller bestrålingsterapi kan ikke anvendes som den eneste behandling; non-SCLC er meget mere modtagelig for lokale terapier. For eksempel responderer over 90% af patienter med SCLC over for kombinationskemoterapi, mens kun 30-40% af non-SCLC patienter responderer. Evnen til at skelne 15 mellem non-SCLC og SCLC er afgørende, fordi hovedbehandlingsbeslutninger er baseret på den indledningsvise skelnen mellem SCLC og non-SCLC.

Desuden er disse monoklonale antistoffer (MAB) specifikke 20 over for en antigen fænotype, der findes på non-SCLC, men ikke findes på normale celler, således at disse MABer virker som et diagnostisk reagens.

På tegningen viser 25

Fig. 1 konkurrence-bindingsundersøgelsen for monoklonale antistoffer med fem hybridomakloner (701B2, 702A6, 703D4, 704A1 og 704B4). 534F8, M0PC21 og BSA (bovin serum albumin) er alle kontroller. Bindingsforholdene mellem to 125 30 I-mærkede monoklonaler, 701B2 og 703D4, er vist, når de er inkuberet med mætningskoncentrationer af umærkede antistoffer. Dette forsøg hjælper til at skelne bindingsegenskaberne for et monoklonalt antistof.

35 Fig. 2 er titreringsbindingskurven for monoklonale antistoffer 703D4 og 704A1 med fastfase-NCI-H157 celler (original immuniserende storcellet cancercellelinje) og

DK 162531B

3 NCI-H209 celler (human SCLC-linje) i et direkte radio-assay ved to ganges seriefortyndinger med resultater udtrykt som bindingsforhold. Dette assay giver titeren eller styrken af et antistofpræparat.

5

Fig. 3 er SDS-PAGE analyse af antigener immunf ældet med MABer 703D4 og 704A1 fra metabolisk mærkede cellulære ly- sater fra humane storcellede lungecancerceller (NCI-H157) og humane melanomaceller (NC1-H234); immunudfældning af 35 10 C S]methionin-inkorporerende NCI-H157 cellelysater (bane A), udfældning med monoklonalt antistof 703D4 (bane B), udfældning med monoklonalt antistof 704A1 (bane C) og udfældning med kontrol muse-lgG M0PC21 (bane D); immunud-35 fældning af [ S]methionin-inkorporerende NCI-H234 celle-15 lysater (bane E), udfældning med monoklonalt antistof 703D4 (bane F), udfældning med monoklonalt antistof 704A1 (bane G) og udfældning med kontrol muse-lgG M0PC21 (bane H). Bemærk dubletten ved 31 kD i bane C. Denne analyse hjælper med at etablere den biokemiske profil for anti-20 stofmålet

Baylin, Stephen B., et al. omtaler den iagttagelse af overfladeprotein fænotyperne, der skelner ikke-småcellede fra småcellede lungecancere.

25

Brown, J.P. et al., Clinical Chemistry, 27, p. 1592 (1981), omtaler anvendelsen af monoklonale antistoffer til at specificere normale celler mod neoplastiske cel ler. Skønt denne artikel omhandler et middel til at skel-30 ne lungecancer fra normale celler, mangler den et middel til at diagnosticere eller skelne mellem adskillige typer lungecancer.

Minna, J.D., et al., In Vitro, 17, p. 1058 (1981) og 35 Cuttitta, F., et al., PNAS, 78, p. 4591 (1981) omtaler begge fremstillingen og anvendelsen af monoklonale antistoffer, der er specifikke for lungecancer, men disse

DK 162531 B

4 artikler er begrænset til småcellet lungecancer og omhandler ikke et middel til at skelne småcellet lungecancer fra ikke-småcellet lungecancer.

5 Kohier, G. og Milstein, C., Nature, 256, p. 495 (1975) giver den første omtale af den monoklonale antistofteknologi, af hvilken en modifikation blev anvendt i den foreliggende opfindelse.

10 Cellelinjerne 703D4 og 704A1 er blevet deponeret i American Type Culture Collection. Deponeringsnumrene er HB 8301 og HB 8302.

Der findes fire typer lungecancer hos mennesket: squamo- 15 cellulær, adeno, småcellet og storcellet. Hver tumor udtrykker specifikke differentieringstræk eller overflade fænotype determinanter, der alle skelner disse celler fra normale celler. Udviklingen af diagnoseteknikken for monoklonalt antistof har i høj grad forbedret fremstil-20 lingen af reagenser, der er i stand til at skelne normale celler fra cancerceller og skelne typer af cancerceller fra andre typer af cancerceller. Den foreliggende opfindelse omhandler en fremgangsmåde og de monoklonale antistoffer, der er i stand til at specificere ikke-småcellet 25 lungecancer fra andre typer lungecancer og fra normalt lungevæv.

Udviklingen af somatisk cellehybridteknologi til fremstillingen af monoklonale antistoffer har givet adskil-30 lige monoklonale antistoffer med forskellige grader af specificitet for en række forskellige humane cancere. Den foreliggende opfindelse omhandler anvendelsen af denne teknologi til fremstilling af antistoffer, der ikke blot detekterer human lungecancer, men også skelner mellem 35 varianterne af human lungecancer.

5

DK 162531 B

Antistofferne (ΜΆΒ) ifølge opfindelsen detektorer for- 35 skellige epitoper på 31 kO [ S]methionin-inkorporerende proteiner. Radiobinding og immunohistokemiske undersøgelser viser, at disse MABer binder til størstedelen 5 (11/13) af humane ikke-småcellede lungecancere (adeno carcinoma, epidermoid og storcellet), men binder ikke til småcellet lungecancer. For tiden foretages denne skelnen ved hjælp af lysmikroskopi. Imidlertid er selv eksperter inden for området lungecancerpatologi uenige om denne 10 underopdeling af lungecancer. Det har vist sig, at SCLC indeholder en cytogenetisk markør, deletionen på den korte arm af chromosom 3, komplicerede peptidhormoner, såsom bombesin, og har høj specifik aktivitet af neuronspecifik enolase, L-dopa-decarboxylase og creatinphospho-15 kinase BB. Disse markører er enten fraværende eller udtrykt i meget lavere mængder i non-SCLC. Desuden har SCLC og non-SCLC helt forskellige membranprotein fænotyper ved todimensional gelelektroforese.

20 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen blev fremstillet ved alment at følge en variation af den procedure, der er skitseret af Koprowski i US patentskrifterne nr. 4 172 124 og nr. 4 196 265. Denne variation muliggør fremstillingen af monoklonale antistoffer, der er egnede 25 til detektering og/eller diagnose af ikke-småcellet lungecancer. I almindelighed fjernes antistofdannende celler fra milten af immuniserede mus og blandes med musemyelomaceller. Nogle af disse celler smelter sammen til hybrider, der fravælges ved at anbringe blandingen i 30 HAT medium (dvs. kun hybride celler overlever). De antistofdannende hybrider klones derpå og anvendes til produktion af store mængder antistof. Den specifikke proces, der anvendes i den foreliggende opfindelse, beskrives nærmere i det følgende.

Den cellelinje, der anvendes til immunisering (NC1-H157), blev afledt fra en malign lungehindeeffusion fra en ube- 35

DK 162531 B

6 handlet; patient med storcellet lungecancer. På immunise-ringstidspunktet havde cellelinjen været holdt 1 kultur i 24 måneder.

5 Storcellede småcelle-varianter forveksles let med non-SCLC. Disse klinisk vigtige transformanter kan skelnes ved at have reduceret eller helt mangle L-dopa-decarboxy-lase, mens de stadig har forhøjede koncentrationer af neuron-spedfik enolase og den 3p chromosomale deletion.

10 Humane SCLC-kulturer omdannet til storcellet cytologi, herunder en cellelinje fra en patient, hvis tumor havde blandinger af SCLC og storcellet histologi (linje NCI-H82), mens en anden forekom spontant under langtidig vævskultur (linje NCI-N231/417), blev anvendt som eksemp-15 ler på dette fænomen.

Miltceller fra en BALB/c mus hyperimmuniseret med 7 NCI-H157 celler (10 levende celler til at begynde med indgivet subcutant med komplet Freund's adjuvans, derpå 20 gentaget ugentligt fire gange intraperitonealt og endelig intravenøst 72 timer før fusion) blev sammensmeltet med musemyelomacellelinie X63-Ag8.653. Efter 10 dages forløb blev mikrotiterbrønde positive for vækst afprøvet for antistofbindingsaktivitet. Under den indledende screen-25 ing, hvor der anvendtes fast fase RIA til afprøvning for binding af antistof i kultursupernatanter til glutar-aldehyd-fikserede humane cellelinjer, blev der udvalgt brønde med antistoffer, som bandt til NCI-H157 (non-SCLC), men ikke til NCI-H128 (qSCLC) eller 30 NCI-H128BL (human B-lymfoblastoid cellelinje autolog til NCI-128). De hybridomer, der viste sig at være stabile under fem minikloninger efterfulgt af strengt enkeltcellet kloning under opretholdelse af specifik binding for NCI-H157, men ikke for SCLC-linjer eller B-lymfocyt-35 linjer, blev indført i BALB/c-mus til ascites dannelse.

DK 162531 B

7

Immunoassays

Kanin-anti-mus-immunoglobulin (RAM:Miles Laboratories,

Inc., Elkhart, IN) rettet mod muse-immunoglobulin Fab2~ 5 området blev anvendt i fastfase RIA systemer. En modifikation af dette system var udeladelse af sekundært antistof i visse assays under anvendelse af staphylococ-protein A (Pharmacia, Piscataway, NJ), der direkte binder primært antistof. De monoklonale antistoffer blev type-10 klassificeret efter binding til fikserede celler ved anvendelse af en modifikation af det enzymbundne immuno-absorbentassay, med kanin-anti-mus-immunoglobulin klassespecifikke reagenser efterfulgt af detektering af det bundne kanin-antistof med peberrodperoxidase-mærket gede-15 anti-kanin-IgG (alle detektorreagenser fortyndet 1:500).

Til direkte assays blev NH.SO.-rensede monoklonale anti- 125 4 4 stoffer mærket med I under anvendelse af chloramin-T- metoden med 20 ug monoklonalt antistof mærket til speci- 20 fikke aktiviteter på 1-2 uCi/ug. Mærkede antistoffer blev derpå titreret på 96 brøndplader af fastfase-NCI-H157 celler. Direkte assays af fastfaseceller og membraner fra normalt væv opnået ved autopsi blev foretaget ved at in- 125 kubere plader af glutaraldehydfikserede mål med de I-25 mærkede monoklonale antistoffer (50 ng, 100 000 cpm/0,025 ml/brønd) i 1 time i PBS/1% BSA og derpå vaske pladerne syv gange med PBS. Til konkurrenceundersøgelser blev de mærkede antistoffer i et totalvolumen på 0,05 ml derpå coinkuberet med kolde antistoffer (5 ug) til bestemmelse 30 af konkurrencen ved binding til fastfase NCI-H157 celler.

Immunoudf ældninger

Humane tumorceller blev inkuberet natten over med 35 35 [ S]methionin (800 uC/ml, Amersham Corp., Arlington

Heights, IL) i methioninfrit medium (GIBCO, Grand Island, NY). Cellelysater blev fremstillet og præinkuberet ved

DK 162531 B

8 binding af heste-anti-mus-IgG (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN) bundet til staphylococ-protein A (Pansorbin, Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA). Alikvoter på 106 cpm af cellelysater blev først inkuberet med ammonium-5 sulfatrenset ascitisk protein og derpå med heste-anti-mus-IgG bundet til protein A. Protein A komplekset blev sedimenteret og vasket 5 gange, og antigenerne blev analyseret sammen med såvel lavmolekylære som højmolekylære præmærkede markører (Bethesda Research Laboratories, 10 Gaithersburg, MD) med 12% SDS-PAGE i såvel reduceret som · ureduceret tilstand.

Immunohistokemi 15 Normalt og malignt humant væv såvel som tumorer xeno-transplanteret på nøgen mus blev opnået, formalin-fikseret, indlejret, udskåret og farvet under anvendelse af metoden beskrevet af Hsu et al., J. Histochem. Cytochem., 30, p. 1079 (1982). Ammoniumsulfatrenset 20 ascites blev standardiseret til en koncentration på 10 ug protein/ml til anvendelse i immunohistokemiassays.

Primære antistoffer blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i et fugtkammer. Biotinyleret sekundært anti-25 stof og avidin-biotin-konjugeret peberrodperoxidase blev opnået fra Avidin-Biotin-Complex (ABC) kits (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Både inkubering af antistoffet og af ABC blev foretaget i 30 minutter ved stuetemperatur. Enzymsubstratet var nikkel-chlorid-imprægne-30 ret med diaminobenzidin, som blev inkuberet i 20 minutter.

Resultater 35 Dannelse af antistoffer. Efter fusion udviste 169 af de 672 brønde hybrider i vækst, og 38 brønde viste selektiv binding til den humane storcellede lungecancer cellelinje 9

DK 162531 B

(NCI-H157), men ikke til human SCLC (NCI-H128, NCI-H209) eller B-lymfoblastoid (NCI-H128BL, NCI-H209BL) linjer.

Efter sekventiel minikloning blev fem af de oprindelige selektive kloner etableret som stabile hybridomalinjer.

5 De fem klonede linjer viste sig alle at udskille IgG2A*.

Alle fem kloner blev Indført i BALB/c mus til ascites- dannelse. Oprensede antistoffer blev derefter mærket med 125 I og anvendt i konkurrenceundersøgelser - fire af de fem kloner konkurrerede om samme epitop, mens en (704A1) 10 detekterede en anden epitop (fig. 1). Af denne grund blev der til alle efterfølgende karakteriseringsundersøgelser kun anvendt to antistoffer (704A1 og 703D4), der genkendte forskellige epitoper. Ved screening af cellelinjer i fastfase RIA assays blev der anvendt såvel et dobbelt 15 antistofsystem som direkte Staph Protein A binding med lignende resultater. Fig. 2 viser en direkte Staph Protein A binding titreringskurve for de to monoklonale antistoffer med den humane storcellede lungecancer (NCI-H157), som var den immunogene linje. De monoklonale anti-20 stoffer binder ikke væsentligt til SCLC-linjen (NCI-H209) som vist på fig. 2.

Reaktion mellem anti-storcelle monoklonale antistoffer og forskellige cellelinier i fast fase RIA assay. De to mo-25 noklonale antistoffer blev afprøvet for binding til et panel af maligne og ikke-maligne humane cellelinjer såvel som gnaver-cellelinjer som vist i tabel 1 - III. Mono-klonalt antistof 703D4 udviste signifikant binding til 9 af 11 non-SCLC cellelinjer, herunder to mesothelioma-30 cellelinjer, mens 704A1 kun bandt til fem non-SCLC; ingen af antistofferne udviste signifikant binding til nogle af de ni SCLC linjer eller til de to småcellede linjer, der var konverteret til storcellede histologiske varianter (NCI-H82 og NCI-N231/417).

Alle forskellige non-SCLC celletyper var bundet til enten det ene eller det andet af de monoklonale antistoffer.

35

DK 162531 B

10 703D4 bandt begge de humane storcellede tumorlinier (9812 og NCI-H157). Der blev også fundet kraftig reaktivitet med humane melanomacel lelinjer. Af de otte afprøvede melanomacellelinjer var syv positive for binding i alle 5 tilfælde, på nær et, med begge de monoklonale antistoffer. To andre humane tumor lin jer, en renal carcinoma og en osteogen sarcoma, udtrykte også det eller de antigener, der blev bundet af disse antistoffer. De resterende ni afprøvede humane tumorcellelinjer repræsenterende 10 seks forskellige sygdomme, herunder myeloma, T-celle- leukæmi/lymphoma, neuroblastoma, brystcancer, coloncancer og en melanoma, udtrykte ikke detekterbare mængder af disse antigener (tabel II). En binding af lav størrelse, men konsistent, blev fundet med begge antistoffer til den 15 føtale lungef ibroblastlinje IMR-90, men ikke til den føtale lungefibroblastlinje HR-6. En række forskellige gnaver-cellelinjer udviste ikke detekterbar udtrykkelse af disse determinanter som målt i fastfase-radioimmun-assayet (tabel III).

20

Immunoudf ældningsresultater. Immunoudfældningsundersø- gelser for monoklonale antistoffer 703D4 og 704A1 blev foretaget med biosyntetisk mærkede NCI-H157 cellelysater, såvel som NCI-H234, en melanomalinje (fig. 3). Det eller 25 de proteiner, der bærer den antigene determinant, der genkendes af disse antistoffer, synes at være af identisk molekylvægt med 31 kD (p31) i både ureduceret og reduceret tilstand. Monoklonalt antistof 703D4 udfælder et protein, som er dublet af natur, og intet bemærkelsesværdigt 30 bånd bliver specifikt immunoudfældet under anvendelse af det B-lymphoblastoide cellelinjelysat. Monoklonalt antistof 704A1 udfælder et meget lignende, men ikke identisk dubletprotein trods identiske lysater og antistofkoncentrationer. Begge antistoffer udfælder 31 kD dubletbåndene 35 35 fra membranproteiner af [ S ] methionin-mærket melanoma- celle NCI-H234. Ingen af antistofferne udfælder noget 35 protein fra cellelysater mærket med [ S]methionin fra

DK 162531 B

11 SCLC linje NCI-H128.

Inanunohistokemisk afprøvning af tumorer. Heterotrans- planter på nøgen mus af forskellige humane lunge-5 cancerlinjer blev screenet med både 703D4 og 704A1 under anvendelse af koncentrationer på 10 ug/ml af ammonium-sulfatrensede antistoffer. Resultater af farvning af paraffinindlej rede, formalinfikserede væv er vist i tabel IV og V. Det antigen, der genkendes af 704A1, er udtrykt 10 i et diffust stiplet mønster i cytoplasmaet og ekstra-cellulært i keratiniserede områder. Antistof 703D4 farvede ligesom 704A1 fire af de seks non-SCLC linjer. Antistof 703D4 var negativt med adenocarcinoma Ά549 og positivt med squamocellulær carcinoma NCI-H348, mens det om-15 vendte gjaldt 704A1. Således var antigenerne stabile over for fiksering og indlejringsprocedurer, og i det mindste nogle tumorer kan udtrykke den ene, men ikke den anden af epitopeme.

20 Afprøvning for antistofbinding til normalt væv. Det direkte immunoassay, der gør brug af ioderede monoklonale antistoffer som mål-fastfase-membranpræparater (0,050 ml af en 1 vol-% suspension/brønd) af 32 forskellige normale væv fra voksne opnået fra autopsi, viste ikke nogen 25 væsentlig binding af antistofferne til normalt væv. Da man var klar over, at antistofferne kunne binde til sjældne delmængder af normale celler, blev der foretaget immunohistokemi. En screening af normalt væv fra 9 voksne personer (formalinfikseret, paraffinindlejret autopsi-30 materiale) med begge monoklonale antistoffer udviste ikke signifikant binding (tabel V).

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er egnede til anvendelser i diagnostisk udstyr eller kits bestående 35 af antistoffer 703D4 og 704A1, de oncogene celler der skal afprøves, og enhver egnet screeningsteknik (såsom immunoassay, immunoudfældningsassays eller immunohisto- 12

DK 162531 B

kemiske assays). En udefra kommende kilde for målceller sættes til kittets bestanddele. Dette kit omfatter en kilde for antistof (mindst et eller begge antistofferne 703D4 og 704Ά1) og screeningsmidler til de i det fore-5 gående viste assays.

Tabel I - V viser bindingsegenskabeme for monoklonale antistoffer 703D4 og 704Ά1. Tabel 1 og IV viser binding til en varietet af lungecancercellelinjer. Signifikant 10 bedre bindingsforhold til de ikke-småcellede lungecancere er vist. Tabel II og III viser bindingsevnen til en række ikke-lungecancere. Tabel V fremhæver den totale mangel på binding til normale humane vævsceller.

15 20 25 30 35

DK 162531 B

13

TABEL I

Binding af monoklonale antistoffer 703D4 og 704A1 til humane lungecancerlinjer 1 fastfase radioimmunassay3 5

Bindings for hold*3

Humane lungecancerlinjer 703D4 704Al

Storcellet NCI-H157 170 140 9812C 6 <1 10

Adenocarcinoma NCZ-H125 1 1 NCI-H23 201 3 A549 18 18 SK-LU-1 32 2 15 NCI-H324 2 3

Calu-6 6 1

Mucoepidermoid NCI-H292 7 <1 20 Mesothelioma NCI-H28 17 9 NCI-H226 6 1

Sm&cellet NCI-H69 2 <1 NCI-H187 1 <1 25 NCI-H146 1 2 NCI-H60 1 1 NCI-H209 1 1 NCI-H249 2 2 NCI-N231 <1 <1 30 NCI-H128 <1 <1 NCI-H-123 1 2 SCLC convertersdNCI-N231/417 1 1 NCI-H82 1 2 35 14

DK 162531 B

a 125

Prøver blev udført 4 gange under anvendelse af I- protein A assay med monoklonale antistoffer fra ascites renset med 40% ammoniumsulfat og anvendt i en koncentration på 1 ug/ml.

5 b Bindingsforhold * (cpm prøvebrønd - cpm negativ kontrol ): cpm negativ kontrol for at tillade sammenligning mellem prøver. Resultater er gennemsnittet af 4 bestemmelser (mindre end 20% variation mellem brønde for et 10 vilkårligt forsøg). Den negative kontrol (i området 50- 300 cpm for alle afprøvede cellelinjer) blev opnået ved udeladelse af det monoklonale antistof og erstattet med PBS i reaktionen. Et signifikant bindingsforhold er et større end 2.

15 c Tumortype 9812 er blevet refereret som lungecancer og melanoma. Histologisk er heterotransplantet på den nøgne mus en storcellet udifferentieret tumor, der er sammenlignelig med hver type.

20 ^ Cellelinjer som i kultur har undergået histologisk ændring fra små celler til store celler med tab af typiske egenskaber for små APUD celler.

25 30 35

DK 162531 B

15

TABEL II

Humane ikke-lunge-tumorcellelinjer med signifikant bin-5 dingsforhold 1 fastfase-radioimmunassay med monoklonale antistoffer 703D4 og 704A1

Bindingsforhold

Cellellnje Type 703D4 704A1 10

Renal cellecarclnoma NCI-H201 23 30

Osteogen sarcoma NCI-H135 9 3 15 Melanoma 6208-WE 17 20 A375 9 5 NCI-H234 4 4 A875 8 6 SKMEL-28 4 4 20 A3827 20 3 A101 14 2 25 30 35 16

DK 162531 B

TABEL III

Cellelinjer med lav eller ubetydelig binding af anti-human storcellet lungecancer monoklonale antistoffer 703D4 og 704Ά1 1 fastfase-radlolmmunassay 5

Bindingsforhold Målcelle 703D4 704A1 B-lymphoblastoid NCI-H128BL1 <1 <1 NCI-H209BL1 <1 <1 10 Makrofag U937 2 1

Multimyeloma U266 <1 <1 T-celle-leukæmi/lymphoma Hut78 1 3

Hutl02 <1 <1 CHP100 <1 2 15 Neuroblastoma IMR-32 2 <1 MCF-7 1 1

Brystcancer MDA-MB231 2 1

Melanoma SKMEL-31 2 1

Colon SWI-222 3 3 20 Fibroblast, human IMR-90 3 4 HR-6 2 2

Gnaver-cellelinj er:

Muse RAG (BALB/c, renal cellecarcinoma) 1 1 25 B82 (C3H, transformerede fibroblaster) <1 <1 L51784R (DBA, L-celle) <1 2 L-celle (TH-) (musefibroblast) <1 <1 30 Rotte GHg (pituitøs tumor) <1 <1 PCI2 (Phecchromocytoma) 1 1

Kinesisk hamster E36 (transformeret lunge) 2 2 35 3-Lymphoid-linje afledt fra SCLC-patient.

TABEL IV

DK 162531 B

17

Binding af tumor fra nøgen mus fra humane lungecancer-cellelinje-heterotransplanter 1 Immunohlstokemlsk assay 5 med monoklonale antistoffer 703D4 og 704A1

Farvning 703D4 704Al 10 Ikke-småcellet lungecarcinoma NCI-H23 (adenocarcinoma) + + NCI-H207 (adenocarcinoma) + + NCI-H292 (mucoepidermoid) + + A549 (adenocarcinoma) - + 15 NCI-H348 (squamocelle) + NCI-Hi25 (adenocarcinoma)

Småcellet lungecancer NCI-NI79 20 NCI-H69 NCI-H128 NCI-H328 NCI-H329 25 Småcellet til storcellet konvertering NCI-N231/417 NCI-H82 30 35

Claims

10 Lever 0/3 0/3 Nyre 0/3 0/3 Hjerne 0/4 0/4 Pancreas 0/2 0/2 Prostata 0/2 0/2 15 Blære 0/2 0/2 Skeletmuskel 0/1 0/1 Colon 0/1 0/1 20

1. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, 25 at det kan fremstilles ved dyrkning af hybridomacelle- linjen 703D4, der er deponeret som ATCC nr. HB 8301 eller hybridomacellelinjen 704Ά1, der er deponeret som ATCC nr. HB 8302, og at det er specifikt over for ikke-småcellet lungecancer (non-SCLC). 30

2. Monoklonalt antistof *9G2AK krav ken detegnet ved, at det er fremstillet ved dyrkning af hybridomacellelinj en betegnet 703D4, der er deponeret som ATCC nr. HB 8301. 35

3. Monoklonalt antistof IgG2A* ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er fremstillet ved dyrkning DK 162531 B af hybridomacellelinjen betegnet 704Ά1, der er deponeret som ATCC nr. HB 8302.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt 5 antistof ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved sammensmeltning af miltceller fra mus hyperimmunise-ret med celler fra en human lkke-småcellet lunge-10 cancer (non-SCLC) cellelinje med en egnet muse- rayelomacellelinje, screening for de hybrider, som udskiller antistoffer, der binder til human non-SCLC, 15 kloning af de antistofproducerende hybrider, og fraskillelse af det antistof, der er dannet af hybriderne. 20

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at musemyelomacellelinjen er X63-Ag8.653.

6. Diagnostisk udstyr egnet til detektering og 25 diagnosticering af human non-SCLC til anvendelse med en kilde for monoklonale antistoffer, kendetegnet ved, at det består af: et eller flere monoklonale antistoffer ifølge krav 30 1-3, og et middel til detektering valgt blandt screeningsteknikkerne radioimmunprøve, immunudfældningsprøve og immunhistokemisk prøve. 35