DK162412B - Enkeltlagsanalyseanordning til vaeskeproever - Google Patents

Description

DK 162412 B

Den foreliggende opfindelse angår en enkeltlagsanordning til bestemmelse af en analyt i en væskeprøve. Endvidere angår op'findelse'n en fremgangsmåde til udførelse af en sådan analyse.

I mange år har man kendt reagenser og anordninger inde-5 holdende disse til anvendelse på mange områder, herunder pH-prøvepapir, in vitro diagnostiske anordninger til bestemmelse af bestanddele i legemsvæsker og terapeutiske midler i sådanne legemsvæsker. Reagenserne eller anordningen bringes i kontakt med den væske, hvis bestand-10 dele skal analyseres. En påviselig forandring sker så ved kemiske eller andre reaktioner.

En kendt anordning til et sådant formål har være udviklet i form af et uregelmæssigt fibrøst reagensholdigt lag, såsom papir. Tykkelsen af laget har ikke været kri-15 tisk, men har kun skullet være tilstrækkeligt stort til at gøre laget opakt, idet det f.eks. har kunnet være optisk uigennemsigtigt. Koncentrationen af analytten blev så bestemt semikvantitativt ved visuel sammenligning af det diffuse reflekterede signal med et farvekort. Sådan-20 ne anordninger er omtalt i US patenterne nr. 3 012 976.,

3 164 934 og 3 585 587 og er beskrevet i Anal. Chem. 55:498A

(1983). Uregelmæssigheden af denne type anordninger eller elementer begrænser i høj grad den kvantitative nøjagtighed, som har kunnet opnås.. Selv indføringen af fotometriske 25 instrumenter har ikke overvundet denne fundamentale begrænsning.

Den tekniske udvikling er gået i den retning, at de fleste på "tør kemi" baserede elementer nu styres ved reflek-tionsmetoden og omfatter flere lag med forskellig lami-nær konfiguration. Hvert af disse er et bestemt separat 30 lag, som udøver en eller flere, men ikke alle, af de nødvendige funktioner og er sammenbundet med de øvrige lag. I et eller flere reagensholdige lag er indkorpore-ret en komposition, som sædvanligvis omfatter alle de

DK 162412 B

2 nødvendige reagenser for analyse af en bestemt væske-bestanddel, terapeutisk lægemiddel eller en .anden ana-lyt for at tilvejebringe et måleligt respons. Se Walter et al., supra og også Shirey, Clin. Biochem., 16:147-5 155 (1983). I sådanne elementer passerer indfaldne lys gennem det eller de gennemskinnelige reagenslag, hvor det absorberes i en grad, som er bestemt af analyt/rea-gens-sammensætningen. Dette forudsætter, at det eller de reagensholdige lag er ensartede og af præcist kon-10 trolleret tykkelse. Et glat opalt reflekterende lag lamineres på den modsatte side af reagensmiddel-laget.

Dette reflekterer ikke-absorberet lys tilbage gennem reagensmiddellaget til en detektor.

En af de simpleste analyser for bestemmelse af konven-15 tionelle kemiske systemer har været albumin. Ved sådan ne på "tør kemi" baserede metoder har også denne analyt forudsat et multilag-element. I beskrivelsen til USA patent nr. 4 230 456 er omtalt et analytisk multilagelement for albumin, som omfatter et spredningslag, et 20 substitutlag og et reagenslag. Reagenslaget indeholder et kompleks af anilinonapthalensulfonsyre (ANS) og po-lyvinylalkohol (PVA). En albuminprøve føres ind i spredningslaget, men normalt ikke ind i reagenslaget. Alligevel anføres det, at dette albumin forårsager en frigi-25 velse af ANS fra komplekset til spredningslaget. Det anføres også, at det under anvendelsen, når albumin kvantificeres ved måling af et kompleks af albumin og påviselige stoffer, er ønskeligt at anvende et analytisk element i form af et multilag, der omfatter et 30 transparent spredningslag og et opakt reagenslag, og at der kan anvendes ethvert egnet opacifiseringsmiddel, såsom titandioxid. Den beskrevne metode til aflæsning af resultatet går ud på at føre elementet gennem en zone, hvori et egnet spektrofotometri-apparat retter en energistråle, såsom en lysstråle, gennem bæreren og reagens-laget. Det er uklart, hvorledes et sådant system kan

DK 162412 B

3 fungere, når det påviselige stof vandrer til et separat lag på den modsatte side af det opakke reagenslag.

Med en anden apparattype er der dannet reaktionslag af hule mikrokugler eller perler, og det nødvendige reagens 5 inkorporeres i det indre. Dette forslag fremgår bl.a.

af US patentskrifterne 3 092 463, 3 926 732, 3 993 451, 4 129.417, 4 356 149 og W0 79/01081. F.eks. er der i beskrivelsen til W0 79/01081 beskrevet et analyseapparat, omfattende en inert bærer, der er dækket med et lag po-10 lymere kugler, som indeholder reagenser, og hvori farve reaktionen finder sted. De nævnte polymere kugler tjener som beholdere for det farvestofdannende reagens, således at der undgås en spredning af reaktionsprodukterne med detaf følgende risiko for fejlanalyser. Som yderligere 15 eksempler kan nævnes US patent nr. 4 356 149, som angår et multilagelement, hvori reaktionslaget er en dispersion af typen olie-i-vand, hvori reagenset er indeholdt i hydrofobe partikler, der er dispergeret i hydrofilt bindemiddel.

Det beskrevne multilag-element omfatter også et strålings-20 blokerende eller lys-reflekterende lag mellem reagenslaget og et vandigt flydende prøve-spredende lag.

US patenterne nr. 4 258 001 og 4 381 921 (udskilt af 4 258 001) angår en videreudvikling af analytiske multilags-elementer, som er karakteriseret ved en kompleks 25 tre-dimensional gitterstruktur. Disse gitterstrukturer er meget vanskelige at fremstille og er ikke kommercielt tilgængelige. Sådanne strukturer foreslås anvendt i forbindelse med de ovenfor beskrevne multilag-elementer. Opfindelsen er også rettet på anvendelsen af en sådan struk-30 tur på anden måde end til spredningslag eller reflekte rende lag eller lag af anden art. De eneste to analytiske eksempler på denne gitterstruktur, bortset fra andre lag, er begrænset til "kvalitative" resultater for glucose -be stemme Ise over et snævert koncentrationsområde 35 og anvendelsen til hæmoglobin-analyser, for hvilke der 4

DK 162412 B

ikke er rapporteret data for differencierings-hæmoglo-binkoncentrationer. Den trecfimensionelle gitterstruktur er dannet af varmestabile, ikke-kvældbare organiske polymere partikler og klæbemiddel for disse partikler. Rea-5 genserne er fortrinsvis kemisk bundne til den polymere enhed af disse partikler. Selv om partikelstørreis og form kan variere, er de fortrinsvis ensartede og sfæriske. Partiklerna består typisk af mindst 25 vægt-°o og fortrinsvis 50 vægt-% eller derover af organisk polymert -— 10 - materiale.- Ved mange udførelsesformer består disse' par- tikler helt, dvs. 100 vægt-?i af sådant organisk polymert materiale. Resten af disse partikler kan bestå af andre stoffer, f.eks. farvestoffer, såsom pigmenter eller opløselige farver.

15 Sammenfattende kan det siges, at de hidtil kendte rea gens-imprægnerede papirstrimler har været begrænsede med hensyn til præcision og anvendelsen, medens den kvantitative nøjagtighed ved flerlagselementer er opnået på bekostning af forøget kompleksitet og følsomhed over for 20 små variationer af fremstillingsspecifikationerne. Indkapslingen af reagenserne har hverken formindsket denne kompleksitet eller reduceret følsomheden for aflæsninger over for interferens. Fremstillingen af elementer, dannet af komplekse tre-dimensionelle, organo-polymere git.-25 re reducertr ikke kompleksiteten ved fremstillingen og giver heller ikke tilfredsstillende reflekterende egenskaber over for det beskrevne lag,.

Den foreliggende opfindelse adskiller sig fra de reagens-matricer eller elementer, som er beskrevet ovenfor, og 30 er baseret på ideen om at kombinere et komplet reagenssystem med en reflekterende komponent i et enkelt lag, der kan aflæses ved diffus refleksion. Ulemperne ved prøve-uklarhed er undgået. Begrænsningerne med hensyn til ensartet og nøjagtig tykkelse af matricen er også undgået derved’, at 35 der ikke kræves lys til fuldstændig passage gennem reagenset, 5

DK 162412 B

idet påvisningen sker med reflekteret lys. Desuden kan elementerne omfatte komponenter, som forhindrer områder med uensartet reagens-fordeling med deraf følgende risiko for fejlagtige kvantitative aflæsninger.

5 Endvidere er det muligt at benytte anordningen ifølge opfindelsen i forbindelse med et ikke tidligere opnået bredt udvalg af analytter, der kan indkorporeres i sådanne elementer, herunder homogene immuno-assay-reagenssys-temer og konventionelle systemer med kliniske kemiske 20 reagenser, alt uden behov for forud fortynding af prøven før anvendelsen i elementet. Behovet for forudgående fortynding af prøven ved de hidtil kendte analytiske elementer har været en alvorlig ulempe under deres anvendelse.

Den nedre sprednings-koefficient af matricen gør det mu-15 ligt at opnå højere følsomhed ved lavere koncentration af analyser i sammenligning med papir eller andre matricer og spredningslag, som er karakteristisk for de hidtil kendte anordninger. Koncentrationsområdet af ana-lytterne går fra meget laver niveauer af blod-enzymer, 20 hormoner og terapeutiske lægemidler til meget høje ana-lyt-koncentrationer, såsom glucose.

Disse og andre fordele opnås ved hjælp af anordningen ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at den består af et dimensionelt stabilt, ensartet porøst dif-25 fust reflekterende enkeltlag, dannet af 'en polymer ikke-* fibrøs matrix, idet der i denne matrix er dispergeret mindst et stof, som giver en påviselig reaktion over for den analyt, ;som skal bestemmes i væskeprøven. Den polymere er fortrinsvis HD-polyethylen, som er behandlet for 33 at gøre det hydrofilt. Den polymere har tilfældigt rettede, indbyrdes forbundne porer, hvis størrelse kan kontrolleres nøjagtigt mellem 5 og 500 mikrometer. De optiske egenskaber kan yderligere modificeres ved blanding i pigmenter, såsom titandioxid. Det med analytten rea-35 gerende stof kan omfatte en første komponent, som reagerer med analytten til dannelse af et reaktionsprodukt 6

DK 162412 B

og en anden komponent, der reagerer med reaktionsproduktet til opnåelse af en påviselig ændring. Anordningens enkeltlag kan yiderligere have inkorporeret et højmolekylært stof, der reducerer eller minimerer migreringen af 5 reagenset som følge af strømningskræfterne, der opstår ved påføring af væsken. Dette forhindrer dannelsen af områder med koncentrationsgradienter af reagenset, hvorved man forhindrer uensartethed af det påviselige respons fra det ene området til det andet på enkeltlaget. Anord-10 ningen danner en integreret helhed derved, at enkeltla get er fuldstændigt effektivt i fravær af andre elementer eller strukturer til fremkaldelse af et kvantitativt påviseligt respons hvorfor tilstedeværelsen af analyt-ten under prøven.

15 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til at ana lysere en væskeprøve, hvorved denne bringes i berøring med anordningen og iagttages for reaktion. Der kan også forudses forskellige udførelsesformer, som omfatter anvendelsen af anordningen og/eller fremgangsmåden. F.eks.

20 kan prøvematerialet udgøre en del af et kit. Et sådant kan omfatte en pakningskombination af en eller flere anordninger eller beholdere hertil i forskellige fysiske formater.

Opfindelsen skal i .det. efterfølgende beskrives.,nærmere 25 ved hjælp af tegningen, hvor fig. 1 i skematisk udformning viser en anordning ifølge opfindelsen, fig. 2 er et diagram over data, som er opnået ved de i eksempel 1 beskrevne forsøg, 30 fig. 3 er et diagram over data, som er opnået ved de i eksempel 2 beskrevne forsøg, 7

DK 162412 B

fig. 4 er et diagram over data, som er opnået ved de i eksempel 3 beskrevne forsøg, fig. 5 er et diagram over data, som er opnået ved de i eksempel 4 beskrevne forsøg, 3 fig. 6 er et diagram over data, som er opnået ved de i eksempel 5 beskrevne forsøg, fig. 7 er et diagram over data, som er opnået ved de i eksempel 6 beskrevne forsøg, og fig. 8 er et diagram over data, som er opnået ved de i 10 eksempel 7 beskrevne forsøg.

I det efterfølgende beskrives den i fig. 1 illustrerede foretrukne udførelsesform for opfindelsen.

Anordningen 10 har et enkelt analyselag 20, der omfatter en reflekterende polymer matrix med et heri ensartet dis-15 pergeret reagens. Enkeltlagsmatricen er sædvanligvis dannet ved sintring af polymere partikler til opnåelse af dimensionel stabilitet af enkeltlag. Anordningen har også en bærer 30, som ikke indgår i selve analysen, men som udelukkende findes for at lette håndteringen. Ved opfindelsen 20 er en sådan bærer ikke obligatorisk, og den undgås sædvanligvis, fordi enkeltlaget har en høj dimensionel stabilitet. Væskeprøver, der påføres anordningen 10, reagerer med reagenset i analyselaget 20. Anordningen 10 er anbragt i et instrument 40 på en base 42. Instrumentet har en lyskilde 25 44, som retter lys mod laget 20. En detektor 46 måler mæng den af reflekteret lys, og instrumentet udlæser denne parameter som en funktion af analyt-koncentrationen. Lyskilden 44 og detektoren 46 kan også være anbragt til at rette indfaldne lys og måle reflekteret lys fra begge sider fra samme 8

DK 162412 B

side, l>vor prøven er påført, eller fra den modsatte sidø.

Prøvevæsker, hvormed der er udført prøver, omfatter biologiske, fysiologiske, industrielle, miljømæssige og ........." andre typer væsker eller gasser. Af særlig intere’sse er 5 biologiske væsker, såsom serum, plasma, urin, cerebrospi nal væske, saliva, mælk, urt og andre dyrkningsmedier og ekstrakter eller fraktioner heraf. Som eksempel på en analyse i gasform kan nævnes ammoniak. Fysiologiske væsker af betydning omfatter infusionsvæsker, puffere, præ-10 serveringsmidler eller antimikrobielle opløsninger. Som eksempler på industrielle væsker kan nævnes fermenterings-medier og andre procesvæsker, f.eks. i forbindelse med fremstilling af farmaceutiske produkter, mejeriprodukter og bryggeriprodukter. Andre kilder for bryggevæsker, som 15 er analyseret ved konventionelle metoder, kan også ana lyseres ved hjælp af anordningen ifølge opfindelsen.

De til fremstilling af den polymere matrice anvendte faste, reflekterende partikler er optisk opalt granulat eller partikelformede materiale, som ikke indeholder rea-20 genser eller væsentligt indre tomrum, og som er kemisk inerte overfor prøven reagenserne og den reaktion, som den omhandlede, anordning skal benyttes til. Inden for disse begrænsninger er det ønskeligt at udnytte partikler, som giver en matrice, der ikke er lysabsorberende 25 ved den under prøven anvendte bølgelængde, og som har det højst mulige brydningsforhold, fortrinsvis over 1,6. Fortrinsvis har partiklerne en diameter på 0,l^um til 200^um.

Den foretrukne polymere matrice for det analytiske ele-30 ment er porøs, ensartet i alle retninger, dimensions stabil, kemisk'inert og ikke-kvældbar med reagenser eller analytiske p-røvemedier. D-en er også optisk forligelig med reflekterende foranstaltninger, således at den har ringe eller ingen absorption i det ultraviolette 9

DK 162412 B

og synlige område af lyset, dvs. mellem 300 nm og 700 nm. Matricen kan have forskellig porøsitet, porestørrelse, tykkelse, form og polymer sammensætning ved lav pris.

Eksempler på materialer, der kan anvendes til denne sær-5 lige anvendelse er Interflo Porous Plastic fra Chromex

Corp, Brooklyn, New York og Porex Porous Plastics available fra Porex Technologies, Fairburn, Georgia. Anvendelsen af porøse plastmaterialer som matrice for "tør-kemi-ske" reaktioner har ikke været omtalt i litteraturen.

10 Særligt egnede polymere til dannelse af matricen af det analytiske element er HD polyethylen (HDPE), ultra-høj-molekylært polyethylen, polypropylen, polyvinyliden-fluorid (Kynar), polytetrafluorethylen (PTFE), nylon, polyvinylchlorid (PVC), polyestere, polysulfoner og an-15 dre polymere og polymer-blandinger.

Det kan være henstigtsmæssigt at anvende hydrofobe polymere partikler til fremstilling af matricen og at indføre hydrofile egenskaber hertil ved inkofeporering af et eller flere emulgeringsmidler eller overfladeaktive 20 materialer, såsom anioniske, kationiske eller ikke-ionis- ke overfladeaktive stoffer i det analytiske element. Der foretrækkes dog ikke-ioniske overfladeaktive midler. De kan f.eks. også forbedre overtræksevnen og forøge fugt-ningsgraden af elementer, der ikke let fugtes af væske-25 prøver i fravær af et sådant hjælpemiddel. Egenskaberne for de polymere kan yderligere modificeres ved iblanding af sådanne, overfladeaktive stoffer under fremstillingen af den polymere matrice eller ved overflédeimprægnering af den forud formede polymere matrice med sådanne over-30 fladeaktive stoffer. F.eks. kan der for hver 100 g af blandingen, som benyttes til dannelse af elementerne, indføres 0,1 g overfladeaktivt stof, såsom partielle estere af fedtsyre og sorbitolanhydrider. Andre eksempler på overfladeaktive stoffer er Triton X-100 (fra 35 Rohm og Haas, Philadelphia, PA). Span 20, Brij 35 og

DK 162412B

10 Τνι/een 20 (fra ICI Americas, Wilmington, DE), Zonyl FSN (fra E.I. duPont deNemours, Wilmington, DE) o-g Pluoro-nics (fra BASF Wyandotte, Parsippany, NJ).

Enkeltlaget kan også indeholde uregelmæssige reflekteren-' 5 de organiske partikler. Kombinationen af partikler med høj brydningsforhold og uregelmæssig.partikelform forbedrer spredning af indfaldende lys, således at der opnås et kraftigere analysesignal ved kolorimetrisk bestemmelse af diffust reflekterende lys. Dette er en fordel, 10 hvor analytterne med høj koncentration og høj udsluk ningskoefficient skal undersøges. Særlig foretrukne partikler er basisk blyhydroxid, basisk blycarbonat, oxider, såsom titandioxid, zinkoxid og magnesiumoxid, og sulfater, såsom bariumsulfat, calciumsulfat og stronti-15 umsulfat. Andre anvendelige materialer er siliciumoxid, calcit, silicater og aluminiumsilicater, zinksulfid, kiselgur, ler og blandinger deraf.

Mindst et af de stoffer, som giver en målelig reaktion i nærværelse af analytten» udvælges blandt de reagenser, 20 som traditionelt benyttes til påvisning af de pågælden de analytter. Ifølge en udførelsesform kan der benyttes et stof, der fysisk ændrer prøven, såsom et cytolytisk middel, til frigivelse af en analyt for analyse. Hvis analytten f.eks. er hæmoglobin, kan stoffet være et cy-25 tolytisk middel, såsom et overfladeaktivt stof. Dette kan f.eks. omfatte polyoxyethylenethere af alifatiske alkoholer, såsom Brij surfactants (ICI United States,

Wilmington, DE), polyoxyethylen-derivater af sorbitol-anhydrid partielle fedtsyreestere, såsom T\i/een surfac-30 tants (ICI United States) og alkylaryl-polyethere a.f al koholer, sulfonater eller sulfater, såsom Triton surfactants (Rohm & Haas Company, Philadelphia, PA). Ifølge en anden udførelsesform kan det analyt-responderende stof være et forholdsvis simpelt kromogent reagens. Et eksenr-35 pel på denne udførelsesform er anvendelsen af bromere- 11

DK 162412 B

sol-grønt til bestemmelse af albumin. Endnu et eksempel, hvor analytten er bilirubin, kan benyttes en diazofor-bindelse, såsom diazosulfanilsyre, og et fortrængnings-middel, et middel der frigører bilirubin fra sin bundne 5 form, såsom diphenylen, coffein eller dimethylsulfoxid.

Hvis analytten er glucose, kan blandingen omfatte en første og anden komponent, som er indført i præparatet samtidigt. Den første komponent kan bestå af glucoseoxidase.

F.eks. kan reagensindholdet for hver 5-15 ml af en 0,2 10 molær (M) phosphatpuffer (pH = 7,0) omfatte 4.500-40.000 internationale enheder (IU) glucoseoxidase, 2.000-40.000 IU peroxidase, 250-1.000 mg okseserumalbumin, 250-1.500 mg 4-aminoantipyrin, 100-30.000 mg natrium-p-hydroxyben-zoat, 5-50 mg dinatrium EDTA (ethylendiamintetraeddike-15 syre), 5-20 mg kaliumazid og 5-400 mg polyvinylpyrroli- don. Enzymkommisionen af the International Union of Biochemistry har defineret en international enhed (IU) af enzymaktiviteten som 1 mikromol (^umol) substrat, som udnyttes pr. minut under specificerede betingelser for 20 pH og temperatur.

Præparatet kan være således sammensat, at det analyt-responderende stof omfatter en første komponent, som reagerer over for analytten, til dannelse af et reaktions-produkt, og en anden komponent, som kan være adskilt fra 25 den første komponent ved en selektiv permeabel polymer, og som bevirker en målelig reaktion over for reaktions-produktet. Ifølge en udførelsesform for bestemmelse af ammoniak kan den første komponent omdanne ammoniumionen til ammoniak, den anden komponent er f.eks. bromcre-30 solgrønt, og de to komponenter opretholdes adskilt ved hjælp af en for gas (f.eks. ammoniak) gennemtrængelig polymer, såsom celluloseacetatbutyrat. Ved en anden fore-trukken udførelsesform er den første komponent reaktiv over for analytten til dannelse af hydrogenperoxid, og 35 den anden komponent omfatter et peroxidativt aktivt stof, 12

DK 162412 B

såsom peroxidase, og en redoxindikator. Hvis analytten f.eks. er cholesterol, omfatter den første komponent cholesteroloxidase og cholesterolesterhydrolase. Hvis analytten er urinsyre, kan den første komponent være uri-5 case.

Udtrykket "peroxidativt aktivt stof" definerer den præcise kemiske aktivitet af det forudsete stof. En peroxi-· dase er et enzym, som katalyserer en reaktion, hvorved hydrogenperoxid oxiderer et andet stof. Peroxidase er 10 i almindelighed proteiner, som omfatter en jern-porphy- rin-gruppe. Peroxidaser forekommer i hesteræddiker, kartofler, figentræsaft og turnips (planteperoxidase); i mælk (lactoperoxidase); og i hvide blodlegemer (verdo-peroxidase); den findes også i mikroorganismer og kan 15 dannes ved fermentering. Visse syntetiske peroxidaser, såsom beskrevet af Theorell og Maehly in Acta Chem. Scand 4:422-434 (1950) er også tilfredsstillende til anvendelse i H202-analysesystemer. Mindre tilfredsstillende er sådanne stoffer som hemin, methæmoglobin, oxyhæmoglubin, 20 hæmoglobin, hæmokromogen, alkalisk hæmatin, hæmin-deri- vater og visse andre forbindelser, der udviser peroxi-dativ eller peroxidaselignende aktivitet, nemlig evnen til at katalysere oxidation af andre stoffer ved hjælp af oxygenperoxid og andre peroxider. Andre stoffer, som 25 ikke er enzymer, men som udviser peroxidativ aktivitet er: jernsulfocyanat, jerntannat, ferroferrocyanid, kromi-salte (såsom kaliumkromsulfat) absorberer på silica-gel etc. _ .....

Som eksempler på egnede redoxindikatorer skal nævnes 30 benzidin, o-toluidin, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin, 2,7-diamino fluoren, 3-me-thyl-2-benzothiazolinon-hydra-zon, eventuelt med kendte koblere hertil, 4-aminoanti-pyrin, eventuelt med dets kendte koblere og andre phena-zoner og pyroner.

13

DK 162412 B

I stedet kan det analyt-responderende stof omfatte reagenser for et homogent specifikt bindings-prøvesystem, som giver en påviselig reaktion, som er en funktion af indholdet af analyt i prøven. Sådanne homogene specifik-5 ke bindingssystemer kan omfatte en indikator, som del tager i en enzymatisk reaktion. Mere specifik kan den homogene bindingsprøve omfatte et antistof, som binder analytten, et konjugat af analytten eller en bindingsdel deraf og en indikator eller etikette og et detektionssy-10 stem, som indvirker på etiketten til opnåelse af et på viseligt respons, som er forskelligt, når etikette-konju-gatet er bundet til antistoffet, sammenlignet med den ubundne tilstand. Ethvert af de forskellige etikette-systemer, som vides at være egnet til homogene immuno-15 prøver, er anvendelige ved den omhandlede fremgangsmåde.

Makromolekylære stoffer, der egner sig i forbindelse med den omhandlede anordning, er proteiner, gummier, vokser og, fortrinsvis, polymere. Eksempler på egnede polymere er celluloseacetat, polyvinylchlorid, nylon, polyacryla-20 ter, stivelse, polycarboant, polyvinylalkohol, polyvinyl- acetat, dextran, polyvinyl-pyrrolidon, polyurethan, cellulose, cellulosenitrat eller celluloseacetatbutyrat.

Hver 100 ml af præparatet, der benyttes til at danne det analytiske lag, kan f.eks. indehold 1-9 gram (g) poly-25 vinylpyrrolidon.

Prøveanordningen eller det analytiske element består i hovedsagen af en enkelt sammenhængende matrix, kombineret med et af de ovenfor beskrevne stoffer. Enkeltlaget er alt, hvad der kræves for udførelse af en komplet 30 analyse. Dette giver frihed fra kravet om multiple sær skilte spredningsreagenser, reflektion og andre lag.

Anordningen kan fremstilles ved egnet teknik, såsom ved inkorporering af opløsninger af præparatet i en forud cintret polymer matrix af partiklerne og henstand af den 14

DK 162412 B

således fremstillede kombination til hærdning eller størkning, i matricen. Selv om det ikke kræves, kan det integrate analytiske element forsynes med en bærer for at lette håndteringen. Foretrukne bærere kan hensigtsmæs-5 sigt bestå af polystyren, polyestere eller tilsvarende plaststoffer. Bæreren kan være opak, gennemskinnelig eller transparent over for lys eller andre stråler.

Som ovenfor angivet kan mange af de reagenssystemer, som kan udnyttes, afgive eller indrettes til at afgive et må-10 leligt respons, såsom en farveforandring, som er knyttet til tilstedeværelsen eller mængden af analytten i væskeprøven. Anordningen ifølge opfindelsen muliggører et forstærket elektromagnetisk strålingssignal, såsom- en forandring af lysreflektionen i det synlige spektrum, til 15 dannelse af en synlig farveændring, eller en forandring af lysreflektionsevnen uden for det synlige område, såsom i det ultraviolette eller in-frarøde område. Det påviselige respons er et sådant, som kan observeres med sanserne direkte eller ved anvendelse af detektionshjæl-20 pemidler, såsom et spektrofotometer eller andre måleme toder. Efter opnåelse af det analytiske resultat som en påviselig ændring, gennemføres en måling, sædvanligvis ved at føre prøveelementet gennem et felt, hvori i egnet apparat for refleksionsmåling er tilvejebragt. Et sådan appa-25 rat tjener til at dirigere en energistråle,, såsom lys, som derefter reflekterer fra elementets bagside til en detektor. Sædvanligvis har elektromagnetisk stråling i området fra 200 til 900 nm vist sig velegnet til sådan,-ne målinger.

s' 30 I det efterfølgende skal opfindelsen beskrives nærmere med henvisning til_eksemplerne, hvorved der anvendes matrixer af porøs plastmaterialer af forskellig porestørrelse og tykkelse, leveret af Porex Technologies, Fair-burn, GA. Som plastpolymer anvendtes HD polyethylen 35 (HDPE), med mindre-andet er angivet. Materialet blev 15

DK 162412 B

gjort hydrofilt ved behandling med 0,5¾ \i//v Span 20 ICI (USA) i methanol, og den ene side blev varmt forseglet til forhindring af lækning om nødvendigt. Cirkel formede skiver med en diameter på 13 mm blev skåret ud fra pla-5 der af HDPE, individuelt dryppet med det specificerede rumfang reagensopløsning og blev enten tørret under almindelige betingelser eller frysetørret. Alle målinger blev udført ved at dryppe skiverne med et bestemt prøve-rumfang og aflæsning af procentreflektion med et Infra-10 Alyzer 300 reaktionsspefctrometer (Technicon Instruments

Corporation, Tarrytou/n, NY), som var modificeret til at dække spektralområdet mellem 340 og 700 nm. Reflektions-målingerne (R) blev omformet til en lineær funktion af analyt-koncentrationen K/S = (1 - R)R /2 , hvor K er ab-15 sorptionscoefficienten, .og S er spredningscoefficienten.

EKSEMPEL 1 Følsomhedssammenliqninq for forskellige materialer

Forskellige bærematerialer blev prøvet for detektion af lavmolekylære absorptivitet (E) med NADH (E er tilnærmel-20 sesvis ækvivalent med 6 x 10^), som er indikatoren, der anvendes ved flere kliniske prøver af analytter med lav koncentration, såsom alaninaminotransferase, aspartat-aminotransferase, creatinin og lactatdehydrogenase.

De valgte bærematerialer for sammenligning var barium-25 sulfat som reflekterende overtræk (150^um tykkelse),

Whatman Paper nr;: 41 og 42, 1,6 mm tykkelse af porøs Kynar med en porestørrelse på 25^um, og 1,6 mm tyk porøs HDPE med porestørrelse på 10, 35, 70 og 120y.um, respektivt.

Serierne af de anvendte prøveopløsninger indeholde NADH 30 ved 1 x 10“6, 5 x ΙΟ-6, 1 x 10-5, 5 x 10“5, 1 x 10-4, 5 x 10 4 og 1 x 10 ^ mol/liter i 0,1 M tris-puffer (pH= 7,8).

16

DK 162412 B

En 70jul rumfang prøve blev dryppet på en skive med en diameter på 13 mm af hvert materiale og reaktionen blev iagttaget ved 340 nm og summeret i fig. 2.

Følsomheden, bestemt ved hældningen, af kurven af. K/S 5 i forhold til koncentrationen, viste sig at være størst for Porex porøs HDPE og Kynar, som gav en detektions-grænse på 1 x 10“^ M.NADH, som er egnet for alle NADH-afhængige kliniske prøver. Whatman papirmaterialer og bariumsulfat som reflekterende overtræk gav mindre føl-10 somhed for reaktionskurven og er derfor uegnede til man ge af de ovennævnte prøver. For et givet materiale, f. eks. porøs HDPE, forøges følsomheden med stigende pore-størrelse. For samme eller sammenlignelig porestørrelse giver det materiale, som har det laveste brydningsfor-15 . hold (RI), f.eks. Kynar (RI 1,42), højere følsomhed end HDPE (RI 1,55).

EKSEMPEL 2

Alanin-aminotransferase (ALT) prøve med porøs plast-matrixe 20 Til hver skive af det porøse plas-t HDPE (35yum porestør- relse), 1,6 mm tykkelse, blev anbragt 30^ul af en reaktionsblanding indeholdende 100 mmol/liter tris-puffer, pH=7,8, 5,0 mmol/liter EDTA, 100 mmol/liter alanin, 1,5 mmol/liter NADH, 1 mmol/liter pyridbxal-phosphat", 1CT 25 mmol/liter 2-oxoglutarat-natriumsalt og 11.100 IU/liter lactat-dehydrogenase, og skiverne blev indstillet til tørring ved stuetemperatur i 2 timer under beskyttelse mod direkte lys.

Disse skiver blev prøvet med 30yul prøver indeholdende 50 alaninaminotransferase (ALT). Koncentrationen af ALT

varieredes for at dække det kliniske område, dvs. 0 til 600 IU/liter. Reflektionen blev registreret for hver 17

DK 162412 B

7,5 sekunder i 3 til 5 minutter. Forandringen i K/S-res-pons pr. minut blev beregnet 30 sekunder efter påsætningen af prøven på skiven. Funktionen for ændring af K/S-respons pr. minut i forhold til ALT-koncentrationen er 5 lineær, således som det er vist på fig. 3, hvilket er et udtryk for effektiviteten af det analytiske element.

Efterfølgende eksempler 3 og 4 illustrerer anvendelsen af den porøse polymere matrix til opløsningsmiddelekstraktion, hvilket involverer ekstraktion af analytten 10 (natrium, kalium) i et opløsningsmiddel med lavt damp tryk (tricresylphosphat) indeholdende reagenser, som bevirker en farveændring (kromogent crovi/n-ether) ved reaktion med den ekstraherede analyt. Yderligere detaljer i relation til opløsningsmiddelekstraktionen fremgår af 15 USA patentansøgning nr. 549 349, der er indleveret den 7. november 1983 og tilhørende ansøgeren.

EKSEMPEL 3

Natrium-analyse 20 En porøs plastskive af ultrahøjmolekylært polyéthylen (lO^um, 1,6 mm tyk) blev dryppet med lOO^ul af en reagensblanding indeholdende 0,75 g tricersylphosphat, 0,25 g Span 20 ICI, 50 mg 2-hydroxy-5-(4-nitrophenylazo)phenyl )oxymethyl-15-crou/n-5, 0,48 g celluloseacetat, 7 ml 25 meth-ylenchlorid, 2 ml absolut ethanol, 1,5 ml isopropa-nol, og blev henstillet til tørring ved stuetemperatur i 1 time under en aftræksskærm. En portion på 80^ul 0,3 M diethanolaminpuffer (pH=90) blev dryppet på skiven, som atter blev tørret. Endnu en crown-ether, der også 30 er anvendelig, er 4 '-(2",4"-dinitro-6"-trifluormethylphe- nyl)-amino-benzo-15-crown-5.

Skiverne blev prøvet med 80^ul portioner indeholdende forskellige koncentrationer af natriumchlorid i de kli- 18

DK 162412 B

niske områder fra 50 meq/1 til 200 meq/1. De diffuse re-flektive signaler efter minutters inkubation blev målt. Funktionen af K/S i forhold til natriumkoncentrationen er lineær som vist i fig. 4.

5 EKSEMPEL 4

Kalium-analyse

Til hver skive (HDPE, 35yum, 1,6 mm tyk) blev 40^ul af en reaktionsblanding indeholdende 0,75 g tricresylphos-phat, 0,25 Span 20 ICI, 0,48 g celluloseacetat, 5 mg 4'-10 (2",4"-dinitro-6"-trifluormethylphenyl)aminobenzo-18- cro\i/n-6, 7 ml methylenchlorid, 2 ml absolut ethanol og 1,5 ml isopropanol aflejret, og skiverne blev henstillet til tørring ved stuetemperatur i 1 time. En portion på 30^,ul 0,3 M diethanolaminpuffer (pH = 90) blev dryppet 15 på skiven, som atter blev tørret. Endnu en crovi/nether, som kan bruges er 4'-picrylaminobenzo-18-crown-6.

Skiverne blev prøvet med 30yUl prøver indeholdende forskellige koncentrationer af kaliumchlorid i dét ^kliniske område fra 2 meq/1 til 8 meq/1. De diffuse reflektions-20 signaler efter 5 minutters blev målt ved 450 nm. En funk tion af K/S forhold til kalium-koncentrationen er lineær, som det er vist på fig. 5.

De efterfølgende to eksempler 5 og 6 viser den udmærkede følsomhed, som opnås med et porøst plast ved blodanaly-25 ser med lave koncentrationer af analyt, såsom bilirubin og urinsyre, hvor normalkoncentrationerne i gennemsnit ligger på henholdsvis 0,5 mg/dl og 7,5 mg/dl.

19

DK 162412 B

EKSEMPEL 5 Bilirubin-prøve

De enkelte skiver (HDPE, 70yUm, 1,6 mm tyk) blev aflej-ret med lOO^ul af en reagensblanding indeholdende 0,3 M 5 diphyllin, 1 % v/v Triton X-100, 79 mM diazoteret sul- fanilsyre, 2,26 M maleinsyre, 0,76 M borsyre og 2% (w/v) polyvinylpyrrolidon (molvfflgt 40.000) og blev henstillet til tørring ved stuetemperatur i 2 timer under beskyttelse fra direkte lys.

10 Skiverne blev prøvet med 80yUl analyser indeholdende bi lirubin ved koncentrationer omfattende det kliniske området fra 0 til 20 mg/dl. De diffuse reflektionssignaler efter 3 minutters inkubation blev målt ved 540 nm. Kurven K/S i forhold til bilirubin-koncentrationen er lineær, 15 således som det ses af fig. 6. Funktionens hældning, der er et mål for følsomheden, viser en udmærket opløsning på - 0,1 mg/dl bilirubin.

EKSEMPEL 6

Urinsyre-analyse 20 Hver skive af den porøse plast (HDPE (70^um) 1,6 mm tyk blev dryppet med lOO^ul af en reagensblanding indeholdende 0,2 M phosphat, pH = 8,5, 20 mM natriumazid, 1 mM EDTA, 1% -(w/v) hydroxypropylmethylcellulose, 10¾ (w/v) lactose, 375.000 IU/liter peroxidase, 40.000 IU/liter 25 uricase, 25 g/1 BSA, 50 g/1 4-aminoantipyrin og 75 g/1 natrium-p-hydroxybenzoat. Skiverne blev tørret ved stuetemperatur i 2 timer.

Skiverne blev prøvet med 50^ul prøver indeholdende urinsyre. Forskellige koncentrationer af urinsyre anvendtes 30 til at dække det kliniske området fra 0 til 20 mg/dl. Må- 20

DK 162412 B

lingerne blev udført ved 540 nm. Kurven for K/S over for urinsyrekoncentreationen er lineær som det fremgår af fig. 7 med en god følsomhed af en opløsning - 0,2 mg/dl urinsyre.

5 EKSEMPEL 7

Glucose-prøve

Anvendelsen af porøst plast er ikke begrænset til analyser af analytter med lav koncentration. Den høje grad af ensartethed for porøst plast, kombineret med valg af 10 forskellige polymere og polymerblandinger med pigmenter, såsom titanoxid, til at modificere de optiske egenskaber gør det muligt at anvende dem hensigtsmæssigt til prøver med høj koncentration/høj molær absorptivitet. I dette eksempel er udført en prøve med en høj koncentration af 15 en analyt, nemlig glucose (normal middelkoncentration 90 til 100 mg/dl), til opnåelse af en simpel måling ved en bølgelængde, hvor lysabsorptionen er mindre end den maksimale.

På hver skive af det porøse plastmateriale HDPE (35^um) 20 1,6 tykt, blev afsat 40 jdl af en reagensblanding inde holdende 3.000 U glucosr-oxidas, 3.000 III peroxidase, 100 mg BSA, 200 mg 4-aminoantipyrin, 600 mg natrium-p-hydroxybenzoat, 40 mg polyvinylpyrrolidon (molvægt 40.000), Q,Q4 m mol natriumazid, 0,003 mmol EDT A i 2 ml 25 0,2 M phosphatpuffer, pH=7,0, og skiverne blev tørret ved stuetemperatur i 2 timer.

Disse skiver blev prøvet med 30yul prøver indeholdende glucose af forskellige koncentrationer dækkende det kliniske område fra 0 til 600 mg/dl. Målingerne blev udført 30 ved 650 nm. Reflektionen for hver prøve efter 5 minut

ters inkubation blev registereret. En funktion af K/S

21

DK 162412 B

over for glucose-koncentrationen viste sig at være lineær som det fremgår af fig. 8. Da koncentrationen af glucose i kliniske serumprøver er forholdsvis høj, blev målingerne udført ved 650 nm i stedet for ved absorptions-5 maksimum ved 500 nm.

Claims (24)

1. Anordning til bestemmelse af en analyt i en væskeprøve, kendetegnet ved, at den består af et dimen-sionelt stabilt, ensartet porøst diffust reflekterende 5 enkeltlag, dannet af en polymer ikke-fibrøs matrix, idet der i denne matrix er dispergeret mindst et stof, som giver en påviselig reaktion overfor nævnte analyt.

2. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at matrixen er HD-polyethylen, ultrahøjmolekylært poly- 10 ethylen, polypropylen, polyvinylidenfluorid, polytetra- fluorethylen, nylon, polyvinylchlorid, polyestere, po-lysulfoner og blandinger deraf.

3. Anordning ifølge krav 2, kendetegnet ved, at matrixen er overtrukket med et hydrofilt overflade- 15 aktivt stof.

4. Anordning ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det overfladeaktive stof er valgt blandt polyoxyethy-lenoctylphenoler, polyoxyethylennonylphenoler og poly-oxyethylenacrylethere. .

5. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten er alanin-aminotransferase, og at det med analytten reagerende stof er alanin, NADK, pyridoxal-phosphat, 2-oxoglutarat-natriumsalt eller lactat-dehydro-genase.

6. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten er natrium og det med analytten reagerende stof er en forbindelse valgt blandt 2-hydroxy-5-(4-ni-trophenylazo) phenyloxy-methyl-15-crovim-5 og 4'-(2",4"-dinitro-6"-trif luormethylphenyl) aminobenzo-15-cro\i/n-5 . DK 162412 B

7. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten er kalium og det med analytten reagerende stof er 4'-(2",4"-dinitro-6"~trifluormethylphenyl)-amino-benzo-18-cro\i/n-6 eller 4 '-pierylaminobenzo-18-cro\i/n-6. 5 · 8. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten er bilirubin, og at mindst et af de analyt-responderende stoffer omfatter en diazoforbindelse og et fortrængningsmiddel.

9. Anordning ifølge krav 8, kendetegnet ved, 10 at diazo-forbindelsen af er diazosulfanilsyre.

10. Anordning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at fortrængningsmidlet er diphyllin, coffein eller di-methylsulfoxid.

11. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, 15 at det analyt-responderende stof omfatter en første komponent, som reagerer over for analytten til dannelse af et reaktionsprodukt, og en anden komponent, der reagerer over for reaktionsproduktet til fremkaldning af en påviselig ændring.

12. Anordning ifølge krav 11, kendetegnet ved, at analytten er ammoniak, den første komponent er effektiv til omdannelse af ammoniumioner til ammoniak, den anden komponent er bromcresolgrønt, og de to komponenter holdes adskilte ved en for ammoniak gennemtrængelig polymer.

13. Anordning ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den første komponent er reaktiv over for analytten til dannelse af hydrogenperoxid, og den anden komponent omfatter et peroxidativt aktivt stof og en redoxindika-tor- og er reaktivt med hy drogenperoxid til opnåelse af 30 en detekterbar reaktion. DK 162412 B

14. Anordning ifølge krav 13, kendetegnet ved, at analytten fer cholesterol, og at den første komponent omfatter cholesteroloxidase og cholesterolesterhydrolase.

13. Anordning ifølge krav 13, kendetegnet ved, 5 at analytten er urinsyre, og at den første komponent om fatter uricase.

16. Anordning ifølge krav 13, kendetegnet ved, at analytten er glucose, og at den første komponent omfatter glucoseoxidase.

17. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det analyt-responderende stof omfatter reagenser for homogen specifik binding til opnåelse af et detekterbart respons, der er en funktion af tilstedeværelsen af ana-lyt i prøven.

18. Anordning ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den homogene specifikke binding omfatter et system med en indikator eller etikette, som deltager i en enzymatisk reaktion.

19. Anordning ifølge krav 17, kendetegnet ved, 20 at den homogene specifikke binding omfatter et system med antistoffer, som binder den nævnte analyt, et conju-gat af analytten eller en bindingsanalog dermed og en indikator eller etliket, samt et detektionssystem, som reagerer med indikatoren til opnåelse af et detekter-25 bart respons, som er forskelligt når indikator-conjuga- tet er bundet af antistoffet i forhold til den ikke-bund-ne tilstand.

20. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter i det mindst et makromolekylært stof, 30 der reducerer migreringen af reagenset i matrixen. DK 162412 B

21. Anordning ifølge krav 20, kendetegnet ved, at det makromolekylære stof er et protein, en polymer, en gummi eller et voks.

22. Anordning ifølge krav 21, kendetegnet ved, 5 at den polymere består af celluloseacetat, polyvinylchlo- rid, nylon, polyacrylater, stivelse, polycarbonat, poly-vinylalkohol, polyvinylacetat, dextran, polyvinylpyrro-lidon, polyurethan, cellulose, cellulosenitrat eller cel-luloseacetatbutyrat.

23. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter uregelmæssigt formede reflekterende uorganiske partikler.

24. Anordning ifølge krav 23, kendetegnet ved, at de nævnte uorganiske partikler er basisk blyhydroxid, 15 basisk blycarbonat, titandioxid, zinkoxid, magnesium oxid, bariumsulfat, calciumsulfat, strontiumsulfat, silica, calcit, silicater, aluminosilicater, zink, sulfid, kiselgur, ler eller blandinger deraf.

25. Fremgangsmåde til bestemmelse af en analyt i en væs- 20 keprøve, kendetegnet ved, at den i krav 1 an givne anordning bringes i berøring med en prøve, som kan indeholde analytten, idet et eventuelt detekterbart respons iagttages.