DK161609B

DK161609B - Electrophoresis arrangement

Info

Publication number: DK161609B
Application number: DK172384A
Authority: DK
Inventors: Edward Martin Chait; Mary Lucille Gianelli; Donald Richard Johnson
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1984-03-29
Filing date: 1984-03-29
Publication date: 1991-07-22
Also published as: DK172384A; DK161609C; DK172384D0

Description

DK 161609 BDK 161609 B

oisland

Den foreliggende opfindelse angår en anordning til gennemførelse af elektroforetiske adskillelser.The present invention relates to a device for carrying out electrophoretic separations.

Elektroforese er en anerkendt metode til adskillelse af biokemiske stoffer. Metoden er især anvendelig 5 ved analyse af proteiner, der findes som komplekse blandinger i fysiologiske fluida og væv. Elektroforesesy-stemer kan også anvendes til at adskille blandinger af DNA og RNA-fragmenter ved sekvensbestemmelse af macromo-lekyler.Electrophoresis is a recognized method for biochemical separation. The method is particularly useful in the analysis of proteins found as complex mixtures in physiological fluids and tissues. Electrophoresis systems can also be used to separate mixtures of DNA and RNA fragments by sequencing macromolecules.

10 Elektroforese gennemføres typisk i et skilleme dium, såsom en gel af agarose eller polyacrylamid. Sådanne geler er enten støbte i forme bestående af to glasplader til dannelse af en plade eller i glasrør til dannelse af en cylindrisk gel. Geler dannes i nærværelse af 15 puffere til regulering af pH-miljøet for adskillelsen samt gelens elektriske ledningsevne. Ved simpel zone-elektroforese adskilles molekyler under indvirkning af et elektrisk felt efter deres elektroforetiske bevægelighed, som er en kompleks funktion af proteinmacromole-20 kylets ladning og størrelse. Isoelektrisk fokusering er en elektroforetisk metode, ved hvilken der anvendes medier, som ikke virker begrænsende for proteinets passage og afhænger af funktionen af en pH-gradient, således at der opnås et middel til at adskille proteiner på basis 25 af deres isoelektriske punkter. Den gængse elektroforese-proces kan også modificeres ved at sætte et detergent til proteinblandingen og skillegelen, således at der opnås en belægning af proteinmolekylet for at få en ensartet ladning, således at adskillelsen forløber udeluk-30 kende på basis af molekylvægt. Molekylvægtsadskillelse kan også opnås ved at justere gelkompositionen, således at der dannes et netværk af porestørrelser, som giver en sigtevirkning til adskillelse af molekylerne.Electrophoresis is typically carried out in a separator such as an agarose or polyacrylamide gel. Such gels are either molded in molds consisting of two glass plates to form a plate or in glass tubes to form a cylindrical gel. Gels are formed in the presence of 15 buffers to regulate the pH environment of the separation as well as the gel's electrical conductivity. By simple zone electrophoresis, molecules are separated under the influence of an electric field according to their electrophoretic motility, which is a complex function of the charge and size of the protein macromolecule. Isoelectric focusing is an electrophoretic method using media which does not restrict the passage of the protein and depends on the function of a pH gradient so as to obtain a means for separating proteins on the basis of their isoelectric points. The conventional electrophoresis process can also be modified by adding a detergent to the protein mixture and the separating gel so that a coating of the protein molecule is obtained to obtain a uniform charge such that the separation proceeds solely on a molecular weight basis. Molecular weight separation can also be achieved by adjusting the gel composition to form a network of pore sizes that provide a sieving effect for the separation of the molecules.

I praksis kan ladnings- og størrelsesadskillelse 35 kombineres for at øge opløsningen ved adskillelsen af komponenterne i en proteinblanding. Denne proces, 2-dimensionalIn practice, charge and size separation 35 can be combined to increase the resolution of the separation of the components of a protein mixture. This process, 2-dimensional

DK 161609 BDK 161609 B

2 o elektroforese, kan skille hundredvis af komponenter fra fysiologiske fluida.2 o electrophoresis, can separate hundreds of components from physiological fluids.

Til gennemførelse af elektroforetisk adskillelse kræves der et middel·' til at tilslutte et elektrisk felt 5 til skillegelen. Sædvanligvis sker dette ved at neddyp- j pe enderne af gelpladen eller gelcylinderen i beholdere med elektrisk ledende puffer. Disse tilsluttes med platin- eller carbonelektroder, der er neddyppet i væsken, til de positive og negative poler på en strømforsyning, 10 som skaber en spændingsgradient på fra 100-3000 volt hen over skillegelen, således at molekylerne i blandingen drives gennem gelmatricen. Denne metode, ved hvilken gelen forbindes til strømforsyningen, kræver store rumfang puffere til opfyldning af beholderne, 15 neddypning af gelen i puffer eller forbindelse via væger og uhåndterligt apparatur til elektroforese. Man skal desuden være forsigtig ved etablering af forbindelsen, fordi der frigives gasser under skilleprocessen. Disse gasser kan svække den elektriske forbindel-20 se til gelen.To perform electrophoretic separation, a means is required to connect an electric field 5 to the separating gel. Usually this is done by immersing the ends of the gel plate or gel cylinder into containers with electrically conductive buffer. These are connected with platinum or carbon electrodes immersed in the liquid to the positive and negative poles of a power supply 10 which creates a voltage gradient of from 100-3000 volts across the separating gel so that the molecules in the mixture are driven through the gel matrix. This method by which the gel is connected to the power supply requires large volumes of buffers to fill the containers, immersion of the gel in buffer or connection via scales and unmanageable electrophoresis apparatus. In addition, care must be taken when establishing the compound because gases are released during the separation process. These gases can weaken the electrical connection to the gel.

I US-patentskrift nr. 3.865.712 har man forsøgt at afbøde problemet med uhåndterlighed og god elektrodekontakt ved at anbringe en væge af et filtrerpapir, der er mættet med en puffer, over gelen. Derefter er 25 der anbragt en elektrode oven på filtrerpapiret. Der opretholdes en god kontakt mellem elektroden og filtrerpapiret ved brug af et belastet element med tandlignende forhøjninger, som presser elektroden ind mod det porøse materiale. Dette har den fordel, at gassen let slipper 30 ud under elektroforesen, men i den situation, hvor det vægeagtige materiale bliver noget udtørret, bringes den elektriske kontinuitet i fare. Yderligere betyder dette arrangement en yderligere unødvendig udvidelse af det elektroforetiske system.U.S. Patent No. 3,865,712 has attempted to mitigate the problem of unmanageability and good electrode contact by applying a wick of a filter paper saturated with a buffer over the gel. Then, an electrode is placed on top of the filter paper. Good contact between the electrode and the filter paper is maintained using a loaded element with tooth-like elevations which press the electrode against the porous material. This has the advantage that the gas easily escapes during the electrophoresis, but in the situation where the wall-like material becomes somewhat dehydrated, electrical continuity is compromised. Further, this arrangement means a further unnecessary expansion of the electrophoretic system.

35 Ved et andet forsøg på at løse problemet med op nåelse af tilstrækkelig elektrodekontakt er der i US- 335 In another attempt to solve the problem of obtaining sufficient electrode contact, US-3

DK 16 1609 BDK 16 1609 B

-patentskrift nr. 3.715.295 beskrevet et elektroforetisk apparat, i hvilket der dannes brønde i begge ender af gelen, og der anbringes en halvfast puffer i brøndene over trådelektroderne eller elektroder, som kan være ma-5 lede eller trykte i brønden. Selv om dette arrangement er en betydelig forbedring og unægtelig et trin i den rigtige retning, opnås der dog stadig ikke en kompakt, formindsket færdig enhed, i hvilken der altid opretholdes en god elektrisk kontakt med gelen. Desuden er dette ar-10 rangement ikke egnet til brug sammen med 2D gelelek-troforeseteknikker, som nu anvendes i stigende omfang.U.S. Patent No. 3,715,295 discloses an electrophoretic apparatus in which wells are formed at both ends of the gel and a semi-solid buffer is placed in the wells over the wire electrodes or electrodes which may be measured or printed in the well. Although this arrangement is a considerable improvement and undoubtedly a step in the right direction, however, a compact, diminished finished unit is still not obtained, in which good electrical contact with the gel is always maintained. Furthermore, this arrangement is not suitable for use with 2D gel electrophoresis techniques which are now being used increasingly.

US patentskrift nr. 3.826.734 angår en elektroforetisk celle, der har et aflangt elektrolyseområde, som er indesluttet mellem et overliggende lag og et underlag, hvor det 15 overliggende lag omfatter en lukkelig åbning, gennem hvilken en væskeprøve kan anbringes på et forud valgt sted på det aflange elektrolyseområde. Cellen giver adskillelse af prøvens bestanddele ved pålægning af en forud valgt spænding på celleelektroderne.U.S. Patent No. 3,826,734 relates to an electrophoretic cell having an elongated electrolysis region enclosed between an overlying layer and a substrate, the overlying layer comprising a closable opening through which a liquid sample can be placed at a preselected location. on the elongated electrolysis region. The cell provides separation of the constituents of the sample by applying a preselected voltage to the cell electrodes.

20 I US patentskrifrt nr. 4.148.703 beskrives en metode til elektrolytisk rensning af enzymer og peptider, hvorved der sker en adskillelse i et rektangulært tyndt lag af gel, der er anbragt mellem to separate uafhængige feltsystemer, der er vinkelrette på hinanden. De to elektriske feltsystemer 25 fungerer ikke samtidig, men drives i korte tidsrum og omskiftes automatisk ved hjælp af regulerede automatiske kontakter.U.S. Patent No. 4,148,703 discloses a method of electrolytically purifying enzymes and peptides, thereby separating into a rectangular thin layer of gel disposed between two separate independent field systems perpendicular to each other. The two electric field systems 25 do not operate simultaneously, but are operated for a short period of time and switched automatically by means of regulated automatic switches.

I FR-A-2.110.080 beskrives elektroder indlejret i en gel. Det anføres, at gas kan undslippe lettere, når elektroden anbringes bort fra enten bund- eller topoverfladen af 30 gelen, således at der muliggøres forbipassage over eller under elektroden, eller når elektroden perforeres.FR-A-2,110,080 describes electrodes embedded in a gel. It is stated that gas can escape more easily when the electrode is disposed away from either the bottom or top surface of the gel, enabling by-pass above or below the electrode or when the electrode is perforated.

I CH-A-576.140 beskrives anvendelse af to skillegeler med en deleanordning derimellem. Adskillelsen gennemføres i én retning ved anvendelse af én gel, når mellemrummet mellem 35 gelerne er fyldt med en elektrolyt, og en 900 1 s adskillelse gennemføres på de således adskilte komponenter.CH-A-576,140 describes the use of two separating gels with a dividing device therebetween. The separation is carried out in one direction using one gel when the gap between the gels is filled with an electrolyte and a 900 liter separation is performed on the components thus separated.

DK 161609BDK 161609B

44

Den foreliggende opfindelse angår en elektroforesean-ordning som defineret i krav 1. En udførelsesform derfor er defineret i krav 2.The present invention relates to an electrophoresis device as defined in claim 1. An embodiment is therefore defined in claim 2.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes 5 der en elektroforeseanordning med et støtteunderlag af en tynd film, skillegeler dannet på en overflade af underlaget samt midler til etablering af et elektrisk potential tværs hen over i det mindste en del af gelen, og etableringsmid- j lerne inkluderer elektroder anbragt med et indbyrdes mellem- 10 rum som en integrerende del af og i elektrisk ledende kontakt med gelen, hvorved anordningens omfang reduceres.According to the present invention there is provided an electrophoresis device with a support film of a thin film, separating gels formed on a surface of the substrate as well as means for establishing an electrical potential across at least a portion of the gel, and the establishment means include electrodes placed at a mutual space as an integral part of and in electrically conductive contact with the gel, thereby reducing the scope of the device.

I forskellige udførelsesformer af opfindelsen er elektroderne fastgjort til den ene overflade af substratet, og elektroderne er dannet ud fra tynde film af le-15 dende materiale. Yderligere kan elektroderne være polymert bundet til gelen,· om ønsket, og kan være opstillet på forskellig måde, således at der opnås forskellige spændingsgradienter.In various embodiments of the invention, the electrodes are attached to one surface of the substrate and the electrodes are formed from thin films of conductive material. Further, the electrodes may be polymerically bonded to the gel, if desired, and may be arranged in different ways so as to obtain different voltage gradients.

I en udførelsesform af opfindelsen, som især er 20 beregnet for 2D gelelektroforese, er der anbragt to forskellige geler på det samme underlag. Hver gel er forsynet med sine egne integrerede elektroder, idet elektrodeparrene for hver gel er anbragt på tværs af hinanden til 2D metoden. Ved en anden udførelsesform af 25 opfindelsen dannes der en anden gel på et første undert -—tag; som anbringes således, at den vender mod cel en oå et andet underlag med en afstandsfilm anbragt mellem gelerne. På denne måde kan man udføre. 2D elektroforesen ved at foretage en første dimensionselektroforese i den ene 20 gel, hvorpå afstandsfilmen fjernes, og derefter foretage elektroforesen i den anden gel.In one embodiment of the invention, which is particularly intended for 2D gel electrophoresis, two different gels are applied to the same support. Each gel is provided with its own integrated electrodes, the electrode pairs for each gel being placed transversely to the 2D method. In another embodiment of the invention, a second gel is formed on a first sub-roof; which is arranged so that it faces the cell and another substrate with a spacer film disposed between the gels. This way one can perform. 2D the electrophoresis by performing a first dimensional electrophoresis in one gel, then removing the spacer film, and then performing the electrophoresis in the second gel.

En elektroforeseanordning ifølge opfindelsen konstrueres ved: dannelse af et pladelignende underlag af et kemisk indifferent materiale, afsætning af en tynd film af et elek-35 trisk ledende materiale i to områder med en indbyrdes afstand på underlaget, hvorpå filmen og substratet overtrækkes medAn electrophoresis device according to the invention is constructed by: forming a sheet-like substrate of a chemically inert material, depositing a thin film of an electrically conductive material in two regions at a distance from one another on the substrate, upon which the film and substrate are coated with

DK 161609 BDK 161609 B

5 et polymert materiale, der er velegnet til gelelektroforese. Elektroforeseanordningen ifølge opfindelsen er fordelagtig ved, at den er kompakt og har elektroderne integreret i selve gelen, således at man undgår problemet med dårlig 5 elektrisk kontakt. De integrerede elektroder letter især 2D gelelektroforeseadskillelser. Dette reducerer behovet for pufferopløsninger og letter den rigtige anbringelse af elektroderne. Tyndtlagsgeler reducerer kravene til afkøling, tillader højere adskillelseshastigheder og øget opløsning 10 af komponenter.5 is a polymeric material suitable for gel electrophoresis. The electrophoresis device of the invention is advantageous in that it is compact and has the electrodes integrated into the gel itself, thus avoiding the problem of poor electrical contact. The integrated electrodes in particular facilitate 2D gel electrophoresis separations. This reduces the need for buffer solutions and facilitates proper placement of the electrodes. Thin-layer gels reduce cooling requirements, allow higher separation rates, and increased resolution of components.

Yderligere fordele og træk ved opfindelsen fremgår af følgende beskrivelse med henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser et billede af en udførelsesform af opfindelsen, ved hvilken der benyttes integrerede elek-15 troder i en elektroforeseanordning, fig. 2 er et delbillede af en foretrukken udførelsesform af anordningen ifølge fig. 1, ved hvilken der anvendes en væge for at opretholde pufferopløsning ved elektroderne, 20 fig. 3 er et billede af en yderligere elek troforeseanordning konstrueret i overensstemmelse med opfindelsen til gennemførelse af todimensional elek-troforeseadskillelse, fig. 4 er en todimensional elektroforeseanord-25 ning konstrueret i overensstemmelse med en alternativ udførelsesform af opfindelsen, fig. 5 er et billede af en todimensional elektroforeseanordning konstrueret i overensstemmelse med en yderligere udførelsesform af opfindelsen, og 30 fig. 6 er en del af et lodret snit af anordningen ifølge fig. 5.Further advantages and features of the invention will become apparent from the following description with reference to the accompanying drawings, in which: FIG. 1 is a view of an embodiment of the invention employing integrated electrodes in an electrophoresis device; FIG. 2 is a partial view of a preferred embodiment of the device of FIG. 1, using a wick to maintain buffer solution at the electrodes; FIG. Figure 3 is a view of a further electrophoresis device constructed in accordance with the invention for carrying out two-dimensional electrophoresis separation; 4 is a two-dimensional electrophoresis device constructed in accordance with an alternative embodiment of the invention; FIG. 5 is a view of a two-dimensional electrophoresis device constructed in accordance with a further embodiment of the invention; and FIG. 6 is a part of a vertical section of the device of FIG. 5th

De forskellige elektroforeseanordninger, der er konstrueret i overensstemmelse med opfindelsen, er udformet således, at der kan anvendes geler med et rela-The various electrophoresis devices constructed in accordance with the invention are designed so that gels with a relay can be used.

O CO C

tivt tyndt tværsnit dannet på et underlag af et passende filmagtigt materiale, typisk med en tykkelse på 50-500 pm.thin thin cross-section formed on a substrate of a suitable film-like material, typically with a thickness of 50-500 µm.

66

OISLAND

DK 161609 BDK 161609 B

Gelen dannes som et hele med elektroderne, der er anbragt på underlaget. Dette har den fordel, at der opnås en god elektrisk kontakt, og at det fylder lidt, samt at det ikke er nødvendigt at medtage pufferbeholdere, væger 5 og lignende.The gel is formed as a whole with the electrodes placed on the substrate. This has the advantage that good electrical contact is obtained and that it fills up a bit, and that it is not necessary to include buffer containers, wickets 5 and the like.

En udførelsesform af en sådan tyndtlagsanordning er illustreret i fig. 1, som omfatter et tyndt filmunderlag 10. Underlaget kan være formet af et vilkårligt kendt materiale, som anvendes som underlag til elektroforese-10 gelmedier og have sådanne egenskaber som at være kemisk indifferent og desuden have en vis stivhed, der er tilstrækkelig til at beskytte gelen mod beskadigelse under håndtering og forsendelse. Det foretrækkes desuden, at substratet er transparent. Som eksempler på filmmaterialer, 15 der er egnede til dette formål, skal nævnes polystyren, polyethylen, ionomere film solgt under varemærket’ "Surlyn". Der foretrækkes imidlertid en polyesterfilm, som kan fås fra E.I. du Pont de Nemours and Company under varemærket "Mylar". Som underlag kan der desuden anvendes 20 glas.An embodiment of such a thin-layer device is illustrated in FIG. 1, which comprises a thin film substrate 10. The substrate may be formed of any known material used as a substrate for electrophoresis gel media and have such properties as being chemically inert and additionally having some stiffness sufficient to protect. the gel against damage during handling and shipping. It is further preferred that the substrate be transparent. Examples of film materials suitable for this purpose include polystyrene, polyethylene, ionomeric films sold under the trademark "Surlyn". However, a polyester film which is available from E.I. du Pont de Nemours and Company under the trademark "Mylar". In addition, 20 glasses can be used as a substrate.

I overensstemmelse med opfindelsen er der langs med begge kanter af underlaget 10 anbragt elektroder 12 og 14 med en indbyrdes afstand, således at de er indbyrdes parallelle. Disse elektroder er dannet af et tyndt 25 ledende, filmagtigt materiale og kan være anbragt på substratoverfladen 10 med et vilkårligt egnet middel, såsom ved vakuumaflejring, forstøvning (sputtering) eller elek-troløs plettering. Alternativt kan den ledende film være en fotopolymer, som dannes på kendt måde ved anvendelse 30 af et passende fotoredskab til polymerisering af de ønskede elektrodedele 12 under anvendelse af aktinisk stråling, og det uønskede overskud af fotopolymer bortvaskes.In accordance with the invention, electrodes 12 and 14 are spaced along both sides of the support 10 so that they are parallel to one another. These electrodes are formed of a thin conductive film-like material and may be disposed on the substrate surface 10 by any suitable means, such as by vacuum deposition, sputtering, or electroplating. Alternatively, the conductive film may be a photopolymer formed in known manner using a suitable photoconductor to polymerize the desired electrode portions 12 using actinic radiation, and the unwanted excess photopolymer is washed away.

Ved en yderligere alternativ måde kan der anvendes vilkårlige ledende pastaer eller sværter, som ønsket. Pa-35 staerne og sværterne kan afsættes på underlaget ved trykning eller silketrykning. Elektroderne kan også være ud-In a further alternative way, any conductive pastes or inks may be used as desired. The pa 35s and blacks can be deposited on the substrate by printing or silk printing. The electrodes may also be provided.

OISLAND

77

DK 161609 BDK 161609 B

formet som en sammensat struktur med et lag af en god leder (sølvledende pasta) påtrykt først og et andet lag kemisk indifferent leder (carbonledende pasta) trykt over sølvet. Herved virker sølvet som en samleskinne, 5 der giver en ens spænding over elektrodelængden.shaped as a composite structure with a layer of a good conductor (silver conducting paste) printed first and a second layer of chemically inert conductor (carbon conducting paste) printed over the silver. Hereby, the silver acts as a busbar, which gives a uniform voltage across the electrode length.

Underlaget kan fortrinsvis være behandlet med et materiale til at styrke bindingen mellem underlaget og elektroforesegelen. P.eks. kan polyesterfilmen behandles med en bifunktionel carboxylsyre eller anhydrid eller en 10 silan eller et andet materiale, som copolymeriserer med gelen, hvorved den bindes til substratet. Elektroderne kan være behandlet tilsvarende.The substrate may preferably be treated with a material to strengthen the bond between the substrate and the electrophoresis seal. P.eks. For example, the polyester film can be treated with a bifunctional carboxylic acid or anhydride or a silane or other material which copolymerizes with the gel thereby binding to the substrate. The electrodes may be treated similarly.

Som det næste trin ved fremstillingen af elek-troforeseanordningen ifølge fig. 1 overtrækkes under-15 laget og elektroderne med en skillegel, hvorved der fås et system eller en anordning, hvori elektroderne er integreret i og i god elektrisk kontakt med gelen. Overtrækningen kan ske på gængs måde, hvorved en blanding af acryl-amid i monomer form og en passende initiator i pufferop-20 løsning hældes i en form, hvori underlagets overflade med elektroderne danner den ene væg, og får lov at polymeri-sere i form af en tynd plade. Gelerne dannes i nærværelse af puffere for at regulere pH miljøet ved adskillelsen samt gelens elektriske ledningsevne. Eftersom de forskel-25 lige geler, der anvendes til elektroforese, er kendte, anses det ikke for nødvendigt at diskutere yderligere særlige geler, der kan anvendes.As the next step in the preparation of the electrophoresis device of FIG. 1, the substrate and electrodes are coated with a separating gel to provide a system or device in which the electrodes are integrated into and in good electrical contact with the gel. The coating can be carried out in a conventional manner whereby a mixture of acrylic amide in monomeric form and a suitable initiator in buffer solution is poured into a mold in which the surface of the substrate with the electrodes forms one wall and is allowed to polymerize in the form of a thin plate. The gels are formed in the presence of buffers to regulate the pH environment of the separation as well as the gel's electrical conductivity. Since the various gels used for electrophoresis are known, it is not considered necessary to discuss additional special gels that may be used.

Efter overtrækningen af elektroderne 12 og 14 kan man etablere de elektriske forbindelser til elektroderne 30 ved hjælp af tråde 18, som er tilsluttet en passende jævnstrømsstrømforsyning 20. Der kan anvendes nåle ved enden af trådene 18 for at trænge ind i gelen og etablere elektrisk kontakt med elektroderne 12. I fig. 2 er vist en mere detaljeret afbildning af en foretrukken måde, på 35 hvilken trådene 18 forbindes til elektroderne. I fig. 2 ses det, at geldimensionerne er forkortet, således at 8After coating electrodes 12 and 14, electrical connections to electrodes 30 can be established by wires 18 connected to a suitable DC power supply 20. Needles at the end of wires 18 can be used to penetrate the gel and establish electrical contact with the electrodes 12. In FIG. 2 shows a more detailed view of a preferred way in which the wires 18 are connected to the electrodes. In FIG. 2 it is seen that the gel dimensions are shortened so that 8

OISLAND

DK 161609 BDK 161609 B

underlaget 10 har en større udstrækning end gelen i begge retninger, og elektroderne 12 også strækker sig ud over skillegelen 16, således at de er nær ved eller ved kanten af underlaget 10. På denne måde kander anvendes 5 simple alligatorklonmer eller andre forbindelsesmekanismer, såsom elektrodekantforbindelsesklemmer eller fjederkontakter af kendt type til at forbinde strømforsyningen med de forskellige elektroder. En anden form for elektrisk kontakt til elektroderne kan etableres med platinkontakter, 10 der er presset ind mod elektrodeenderne, som rager frem fra kanten af skillegelen.the substrate 10 has a greater extent than the gel in both directions, and the electrodes 12 also extend beyond the separating gel 16 so that they are near or at the edge of the substrate 10. In this way, 5 simple alligator clips or other connection mechanisms such as electrode edge connection terminals are used. or spring contacts of known type to connect the power supply to the various electrodes. Another form of electrical contact to the electrodes may be established with platinum contacts 10 pressed against the electrode ends protruding from the edge of the separating gel.

Som det fremgår af fig. 2, kan det i mange tilfælde være ønskeligt, at der oven på gelen 16 i nærheden af elektroderne 12 er anbragt en papirvæge 22, 15 der er mættet med en passende pufferopløsning, for at sikre, at der er tilstrækkelig puffer (og fugt) til rådighed for den nødvendige elektriske kontinuitet.As shown in FIG. 2, it may in many cases be desirable to place on top of the gel 16 near the electrodes 12 a paper wall 22, 15 saturated with a suitable buffer solution to ensure sufficient buffer (and moisture) for available for the necessary electrical continuity.

Det foretrækkes, at elektroderne er dannet ved silketrykningsteknikker under anvendelse af tykfilm-20 elektronikteknologi. En typisk trykt elektrode kan have en tykkelse i størrelsesordenen 25 til 100 pm. Den dertil knyttede væge er typisk 3 mm bred og har en længde i størrelsesordenen 70 mm. Disse elektroder er som bekendt anbragt i parallelle områder af underlaget 10 og 25 er typisk ca. 70 mm lange. Der kan også anvendes andre dimensioner. Som eksempler på ledende materialer, der har været anvendt med gode resultater, skal nævnes Du Font's lederkomposition, sølv 4929, der hærder ved lav temperatur, og ikke-metalliske ledende materialer, 30 såsom carbon (Atchison "Electrodag" 423SS). Andre muligheder er f.eks. overtræk af ædelmetal, såsom platin, palladium og guld. Disse kan forenes i sammensatte lag som beskrevet tidligere. Yderligere har carbon vist sig at være et særligt anvendeligt elektrodemateriale, for-35 di det er kemisk indifferent. Under brug produceres der en lille smule gas ved elektroderne, og denne gas kanIt is preferred that the electrodes be formed by screen printing techniques using thick film electronics technology. A typical printed electrode may have a thickness in the range of 25 to 100 µm. The associated wall is typically 3 mm wide and has a length of the order of 70 mm. As is well known, these electrodes are placed in parallel regions of the substrate 10 and 25 are typically approx. 70 mm long. Other dimensions can also be used. Examples of conductive materials that have been used with good results include Du Font's conductive composition, low temperature tempering silver 4929, and non-metallic conductive materials, such as carbon (Atchison "Electrodag" 423SS). Other options are e.g. precious metal coatings such as platinum, palladium and gold. These can be combined into composite layers as described previously. Furthermore, carbon has been found to be a particularly useful electrode material because it is chemically inert. During use, a small amount of gas is produced at the electrodes and this gas can

DK 161609 BDK 161609 B

OISLAND

9 enten diffundere ud til geloverfladen eller kan bortventileres via små huller, der er dannet i gelunderlaget.9 either diffuse out to the gel surface or can be vented through small holes formed in the gel substrate.

I fig. 3 er afbildet en alternativ udførelsesform 5 af opfindelsen, som er særligt tilpasset efter 2D elek-troforese. I dette tilfælde dannes der et rektangulært tyndt filmunderlag 30 af den ovenfor beskrevne type med et første par korte elektroder 32 i den ene ende over for hinanden i underlagets breddedimension. Disse elek-10 troder overtrækkes med en gel 34, såsom en isoelektrisk fokuserende gel, således at der kan gennemføres isoelektrisk fokuserende adskillelser langs breddedimensionen. Desuden dannes der et andet par elektroder 36 på resten af substratet 30, parallelt med breddedimensionen og 15 langs med længdedimensionen. Disse elektroder 36 er overtrukket med en anden gel 38, som typisk anvendes til 2D elektroforeseadskillelser, såsom en porestørrelsegradient-gel med natriumdodecylsulfat (SDS). Mellem de to geler 34 og 38 fås der et område 40., hvor der ikke findes noget 20 bortset fra underlaget, hvorved der fås en elektrisk afspærring mellem de to geler. På dette sted kan der dannes en foldelinie 42 i underlaget 30 for at lette sammenfoldningen af den første gel 34, således at den kommer i kontakt med den anden gel 38. Sammenfoldningen fore-25 tages efter den første dimensionsadskillelse mellem elektroderne 32. Ved sammenfoldning af den første gel 34, således at den kommer i kontakt med den anden gel 38, kan de fraskilte proteiner komme i kontakt med gelen 38 og overføres hertil til den anden dimensionsadskillelse 30 mellem elektroderne 36.In FIG. 3 is depicted an alternative embodiment 5 of the invention which is particularly adapted to 2D electrophoresis. In this case, a rectangular thin film substrate 30 of the type described above is formed with a first pair of short electrodes 32 at one end opposite each other in the width dimension of the substrate. These electrodes are coated with a gel 34, such as an isoelectric focusing gel, so that isoelectric focusing separations can be performed along the width dimension. In addition, a second pair of electrodes 36 is formed on the remainder of the substrate 30, parallel to the width dimension and 15 along the length dimension. These electrodes 36 are coated with another gel 38 typically used for 2D electrophoresis separations, such as a pore size gradient gel with sodium dodecyl sulfate (SDS). Between the two gels 34 and 38 an area 40 is obtained, where there is no 20 except for the substrate, whereby an electric barrier is obtained between the two gels. At this location, a fold line 42 can be formed in the substrate 30 to facilitate the folding of the first gel 34 so that it comes into contact with the second gel 38. The folding is performed after the first dimensional separation between the electrodes 32. By folding the the first gel 34 so that it contacts the second gel 38, the separated proteins can contact the gel 38 and are transferred thereto to the second dimensional separation 30 between the electrodes 36.

I fig. 4 er afbildet en yderligere udførelsesformIn FIG. 4 shows a further embodiment

af opfindelsen, som også er særligt tilpasset efter 2Dof the invention, which is also particularly adapted to 2D

elektroforese. I denne udførelsesform er den ene af det andet par elektroder, i dette tilfælde betegnet 36", an-35electrophoresis. In this embodiment, one of the other pair of electrodes, in this case designated 36 ", is -35

OISLAND

10 DK 161609 BDK 161609 B

bragt i området med den første gel 34. En relatiyt lille gelgrænseflade eller spalte 44 er tilbage mellem de to geler. Når man ønsker at foretage andendimensionsadskillelse, fyldes grænsefladespalten 44 under disse beting-5 eiser blot med en pufferopløsning, og den elektriske gradient etableres mellem elektroderne 36 og 36'. Denne fremgangsmåde kræver ikke foldning eller bøjning af pladen.brought into the region of the first gel 34. A relatively small gel interface or slot 44 is left between the two gels. In order to make second-dimensional separation, the interface gap 44 under these conditions is simply filled with a buffer solution and the electrical gradient is established between the electrodes 36 and 36 '. This method does not require folding or bending of the plate.

På denne måde passeres komponenterne 46, der er fraskilt | under førstedimensionsadskillelsen, direkte gennem puf- i 10 feropløsningen under andendimensionsadskillelsen, således at der fås andendimensionsfraskilte komponenter 48.In this way, the components 46 which are separated are passed during the first-dimensional separation, directly through the buffer solution under the second-dimensional separation, so as to obtain second-dimension separated components 48.

Ved en yderligere udførelsesform af opfindelsen, jfr. fig. 5 og 6, dannes der.et nedre underlag 10 på samme 15 måde som beskrevet i forbindelse med fig. 1, med en gel 16 og elektroder 14 forbundet til det første underlag 10 til gennemførelse af adskillelse langs en første dimension.In a further embodiment of the invention, cf. FIG. 5 and 6, the lower support 10 is formed in the same manner as described in connection with FIGS. 1, with a gel 16 and electrodes 14 connected to the first substrate 10 for effecting separation along a first dimension.

Et andet substrat 10' med en andendimensionsgel 16' og tilsvarende andendimensionsgelelektroder 141, alt på 20 undersiden, er fastgjort i den modsatte ende af gelen 16' til den ene ende af det første underlag 10 med en klemme eller binding (ikke vist), hvorved der dannes en anordning som en bog. Sagt på anden måde, førstedimensionsgelen 16 og andendimensionsgelen 16' er vendt mod 25 hinanden. Disse geler adskilles med et afstandselement 50, således at gelerne ikke kommer i kontakt med hinanden. Afstandselementet 50 kan være W-formet og fleksibelt, som kan slippe og ikke klæber til gelerne. Po-lyethylen- og polyvinylchloridfilm er egnede til dette 30 formål. Ved anvendelse af denne anordning gennemføres førstedimensionsadskillelse på normal måde. Derefter fjernes afstandselementet 50 ved at gribe fat i og trække midterfolden ud og således rive det bort fra gelerne, hvorved gelerne kommer i kontakt med hinanden, og de 35 fraskilte komponenter overføres til den anden gel. Anden-A second substrate 10 'having a second-dimensional gel 16' and corresponding second-dimensional gel electrodes 141, all on the underside, is attached at the opposite end of the gel 16 'to one end of the first substrate 10 with a clamp or bond (not shown), a device is formed like a book. Stated another way, the first dimension gel 16 and the second dimension gel 16 'are facing each other 25. These gels are separated by a spacer member 50 so that the gels do not contact each other. The spacer member 50 can be W-shaped and flexible, which can release and not adhere to the gels. Polyethylene and polyvinyl chloride films are suitable for this purpose. Using this device, the first-dimensional separation is carried out in the normal manner. Then, the spacer 50 is removed by grasping and pulling out the center fold, thus tearing it away from the gels, whereby the gels come into contact with each other and the separated components are transferred to the second gel. Other-

OISLAND

11 DK 161609 B11 DK 161609 B

dimensionsadskillelsen gennemføres derpå på sædvanlig måde.the dimensional separation is then carried out in the usual manner.

Det ses således, at elektroforeseanord-ningen ifølge opfindelsen har mange fordele. For det 5 første er de normale store pufferbeholdere, der er nød- vendige, erstattet af kombinationen af elektroder integreret i gelen, og om nødvendigt, immobiliseret puffer i vægerne. Gelunderlagene kan formes med elektrodeopstillinger, der tillader gennemførelse af forskellige 10 typer elektroforese i flere dimensioner i samme gellag.Thus, it is seen that the electrophoresis device of the invention has many advantages. First, the normal large buffer containers required are replaced by the combination of electrodes integrated into the gel and, if necessary, immobilized buffer in the wicks. The gel substrates can be formed with electrode arrays that allow for different types of electrophoresis to be performed in multiple dimensions in the same gel layer.

Der kan fremstilles flerlagsstrukturer af geler og elektroder, således at prøver overføres fra en gel til en anden i flerdimensionsadskillelser. En anordning, der er udformet således, er komplet i sig selv og kræver kun 15 yderligere en strømforsyning til driften. Tyndtlagsan- ordningerne har reducerede krav til afkøling og tillader højere adskillelseshastigheder med øget komponentopløsning .Multilayer structures of gels and electrodes can be prepared so that samples are transferred from one gel to another in multi-dimensional separations. A device thus designed is complete in itself and requires only 15 additional power supplies for operation. Thin-layer devices have reduced cooling requirements and allow higher separation rates with increased component resolution.

20 25 30 3520 25 30 35

Claims

An electrophoresis device with a thin film support support (30), separating gels (34,38) formed on one surface of the support (30) and means for establishing an electrical potential across at least a portion of the gels (34,38) , the means for establishing an electrical potential comprising electrodes spaced apart and integrated into and in electrically conductive contact with gelling on the substrate (16), characterized in that the electrodes 10 are made up of two transversely arranged pairs ( 32,36), and the gels (34,38) are two different non-contact gels, each having different separation characteristics, and each of the electrode pairs being arranged in a different gel (34,38), and wherein the substrate (30) defines a fold line 15 (42) in the region (40) between the gels (34, 38) so that the folding of the substrate (30) to bring the gels into contact with one another is facilitated.

An electrophoresis device with a thin film support support (10), a separating gel (16) formed on one surface 20 of the support (10) and means for establishing an electrical potential over at least a portion of the gel (16), wherein the means for establishing an electrical potential comprises electrodes (14) spaced apart and integrated into and in electrically conductive contact with the gel (16) on the substrate 25 (10), characterized in that it comprises a second substrate (10 '). ) with another separating gel (16 ') formed on one surface and other electrodes (14') integrally spaced into and in electrical contact with the other gel (16 '), with the gels of the substrates (10,10 ·) facing and a spacer film (50) is disposed between the gels (16,16 ·) and the electrodes (14,14 ·) in each gel (16,16 ·) are arranged transversely to each other.