DK161609B - Elektroforeseanordning - Google Patents

Description

DK 161609 B

o

Den foreliggende opfindelse angår en anordning til gennemførelse af elektroforetiske adskillelser.

Elektroforese er en anerkendt metode til adskillelse af biokemiske stoffer. Metoden er især anvendelig 5 ved analyse af proteiner, der findes som komplekse blandinger i fysiologiske fluida og væv. Elektroforesesy-stemer kan også anvendes til at adskille blandinger af DNA og RNA-fragmenter ved sekvensbestemmelse af macromo-lekyler.

10 Elektroforese gennemføres typisk i et skilleme dium, såsom en gel af agarose eller polyacrylamid. Sådanne geler er enten støbte i forme bestående af to glasplader til dannelse af en plade eller i glasrør til dannelse af en cylindrisk gel. Geler dannes i nærværelse af 15 puffere til regulering af pH-miljøet for adskillelsen samt gelens elektriske ledningsevne. Ved simpel zone-elektroforese adskilles molekyler under indvirkning af et elektrisk felt efter deres elektroforetiske bevægelighed, som er en kompleks funktion af proteinmacromole-20 kylets ladning og størrelse. Isoelektrisk fokusering er en elektroforetisk metode, ved hvilken der anvendes medier, som ikke virker begrænsende for proteinets passage og afhænger af funktionen af en pH-gradient, således at der opnås et middel til at adskille proteiner på basis 25 af deres isoelektriske punkter. Den gængse elektroforese-proces kan også modificeres ved at sætte et detergent til proteinblandingen og skillegelen, således at der opnås en belægning af proteinmolekylet for at få en ensartet ladning, således at adskillelsen forløber udeluk-30 kende på basis af molekylvægt. Molekylvægtsadskillelse kan også opnås ved at justere gelkompositionen, således at der dannes et netværk af porestørrelser, som giver en sigtevirkning til adskillelse af molekylerne.

I praksis kan ladnings- og størrelsesadskillelse 35 kombineres for at øge opløsningen ved adskillelsen af komponenterne i en proteinblanding. Denne proces, 2-dimensional

DK 161609 B

2 o elektroforese, kan skille hundredvis af komponenter fra fysiologiske fluida.

Til gennemførelse af elektroforetisk adskillelse kræves der et middel·' til at tilslutte et elektrisk felt 5 til skillegelen. Sædvanligvis sker dette ved at neddyp- j pe enderne af gelpladen eller gelcylinderen i beholdere med elektrisk ledende puffer. Disse tilsluttes med platin- eller carbonelektroder, der er neddyppet i væsken, til de positive og negative poler på en strømforsyning, 10 som skaber en spændingsgradient på fra 100-3000 volt hen over skillegelen, således at molekylerne i blandingen drives gennem gelmatricen. Denne metode, ved hvilken gelen forbindes til strømforsyningen, kræver store rumfang puffere til opfyldning af beholderne, 15 neddypning af gelen i puffer eller forbindelse via væger og uhåndterligt apparatur til elektroforese. Man skal desuden være forsigtig ved etablering af forbindelsen, fordi der frigives gasser under skilleprocessen. Disse gasser kan svække den elektriske forbindel-20 se til gelen.

I US-patentskrift nr. 3.865.712 har man forsøgt at afbøde problemet med uhåndterlighed og god elektrodekontakt ved at anbringe en væge af et filtrerpapir, der er mættet med en puffer, over gelen. Derefter er 25 der anbragt en elektrode oven på filtrerpapiret. Der opretholdes en god kontakt mellem elektroden og filtrerpapiret ved brug af et belastet element med tandlignende forhøjninger, som presser elektroden ind mod det porøse materiale. Dette har den fordel, at gassen let slipper 30 ud under elektroforesen, men i den situation, hvor det vægeagtige materiale bliver noget udtørret, bringes den elektriske kontinuitet i fare. Yderligere betyder dette arrangement en yderligere unødvendig udvidelse af det elektroforetiske system.

35 Ved et andet forsøg på at løse problemet med op nåelse af tilstrækkelig elektrodekontakt er der i US- 3

DK 16 1609 B

-patentskrift nr. 3.715.295 beskrevet et elektroforetisk apparat, i hvilket der dannes brønde i begge ender af gelen, og der anbringes en halvfast puffer i brøndene over trådelektroderne eller elektroder, som kan være ma-5 lede eller trykte i brønden. Selv om dette arrangement er en betydelig forbedring og unægtelig et trin i den rigtige retning, opnås der dog stadig ikke en kompakt, formindsket færdig enhed, i hvilken der altid opretholdes en god elektrisk kontakt med gelen. Desuden er dette ar-10 rangement ikke egnet til brug sammen med 2D gelelek-troforeseteknikker, som nu anvendes i stigende omfang.

US patentskrift nr. 3.826.734 angår en elektroforetisk celle, der har et aflangt elektrolyseområde, som er indesluttet mellem et overliggende lag og et underlag, hvor det 15 overliggende lag omfatter en lukkelig åbning, gennem hvilken en væskeprøve kan anbringes på et forud valgt sted på det aflange elektrolyseområde. Cellen giver adskillelse af prøvens bestanddele ved pålægning af en forud valgt spænding på celleelektroderne.

20 I US patentskrifrt nr. 4.148.703 beskrives en metode til elektrolytisk rensning af enzymer og peptider, hvorved der sker en adskillelse i et rektangulært tyndt lag af gel, der er anbragt mellem to separate uafhængige feltsystemer, der er vinkelrette på hinanden. De to elektriske feltsystemer 25 fungerer ikke samtidig, men drives i korte tidsrum og omskiftes automatisk ved hjælp af regulerede automatiske kontakter.

I FR-A-2.110.080 beskrives elektroder indlejret i en gel. Det anføres, at gas kan undslippe lettere, når elektroden anbringes bort fra enten bund- eller topoverfladen af 30 gelen, således at der muliggøres forbipassage over eller under elektroden, eller når elektroden perforeres.

I CH-A-576.140 beskrives anvendelse af to skillegeler med en deleanordning derimellem. Adskillelsen gennemføres i én retning ved anvendelse af én gel, når mellemrummet mellem 35 gelerne er fyldt med en elektrolyt, og en 900 1 s adskillelse gennemføres på de således adskilte komponenter.

DK 161609B

4

Den foreliggende opfindelse angår en elektroforesean-ordning som defineret i krav 1. En udførelsesform derfor er defineret i krav 2.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes 5 der en elektroforeseanordning med et støtteunderlag af en tynd film, skillegeler dannet på en overflade af underlaget samt midler til etablering af et elektrisk potential tværs hen over i det mindste en del af gelen, og etableringsmid- j lerne inkluderer elektroder anbragt med et indbyrdes mellem- 10 rum som en integrerende del af og i elektrisk ledende kontakt med gelen, hvorved anordningens omfang reduceres.

I forskellige udførelsesformer af opfindelsen er elektroderne fastgjort til den ene overflade af substratet, og elektroderne er dannet ud fra tynde film af le-15 dende materiale. Yderligere kan elektroderne være polymert bundet til gelen,· om ønsket, og kan være opstillet på forskellig måde, således at der opnås forskellige spændingsgradienter.

I en udførelsesform af opfindelsen, som især er 20 beregnet for 2D gelelektroforese, er der anbragt to forskellige geler på det samme underlag. Hver gel er forsynet med sine egne integrerede elektroder, idet elektrodeparrene for hver gel er anbragt på tværs af hinanden til 2D metoden. Ved en anden udførelsesform af 25 opfindelsen dannes der en anden gel på et første undert -—tag; som anbringes således, at den vender mod cel en oå et andet underlag med en afstandsfilm anbragt mellem gelerne. På denne måde kan man udføre. 2D elektroforesen ved at foretage en første dimensionselektroforese i den ene 20 gel, hvorpå afstandsfilmen fjernes, og derefter foretage elektroforesen i den anden gel.

En elektroforeseanordning ifølge opfindelsen konstrueres ved: dannelse af et pladelignende underlag af et kemisk indifferent materiale, afsætning af en tynd film af et elek-35 trisk ledende materiale i to områder med en indbyrdes afstand på underlaget, hvorpå filmen og substratet overtrækkes med

DK 161609 B

5 et polymert materiale, der er velegnet til gelelektroforese. Elektroforeseanordningen ifølge opfindelsen er fordelagtig ved, at den er kompakt og har elektroderne integreret i selve gelen, således at man undgår problemet med dårlig 5 elektrisk kontakt. De integrerede elektroder letter især 2D gelelektroforeseadskillelser. Dette reducerer behovet for pufferopløsninger og letter den rigtige anbringelse af elektroderne. Tyndtlagsgeler reducerer kravene til afkøling, tillader højere adskillelseshastigheder og øget opløsning 10 af komponenter.

Yderligere fordele og træk ved opfindelsen fremgår af følgende beskrivelse med henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser et billede af en udførelsesform af opfindelsen, ved hvilken der benyttes integrerede elek-15 troder i en elektroforeseanordning, fig. 2 er et delbillede af en foretrukken udførelsesform af anordningen ifølge fig. 1, ved hvilken der anvendes en væge for at opretholde pufferopløsning ved elektroderne, 20 fig. 3 er et billede af en yderligere elek troforeseanordning konstrueret i overensstemmelse med opfindelsen til gennemførelse af todimensional elek-troforeseadskillelse, fig. 4 er en todimensional elektroforeseanord-25 ning konstrueret i overensstemmelse med en alternativ udførelsesform af opfindelsen, fig. 5 er et billede af en todimensional elektroforeseanordning konstrueret i overensstemmelse med en yderligere udførelsesform af opfindelsen, og 30 fig. 6 er en del af et lodret snit af anordningen ifølge fig. 5.

De forskellige elektroforeseanordninger, der er konstrueret i overensstemmelse med opfindelsen, er udformet således, at der kan anvendes geler med et rela-

O C

tivt tyndt tværsnit dannet på et underlag af et passende filmagtigt materiale, typisk med en tykkelse på 50-500 pm.

6

O

DK 161609 B

Gelen dannes som et hele med elektroderne, der er anbragt på underlaget. Dette har den fordel, at der opnås en god elektrisk kontakt, og at det fylder lidt, samt at det ikke er nødvendigt at medtage pufferbeholdere, væger 5 og lignende.

En udførelsesform af en sådan tyndtlagsanordning er illustreret i fig. 1, som omfatter et tyndt filmunderlag 10. Underlaget kan være formet af et vilkårligt kendt materiale, som anvendes som underlag til elektroforese-10 gelmedier og have sådanne egenskaber som at være kemisk indifferent og desuden have en vis stivhed, der er tilstrækkelig til at beskytte gelen mod beskadigelse under håndtering og forsendelse. Det foretrækkes desuden, at substratet er transparent. Som eksempler på filmmaterialer, 15 der er egnede til dette formål, skal nævnes polystyren, polyethylen, ionomere film solgt under varemærket’ "Surlyn". Der foretrækkes imidlertid en polyesterfilm, som kan fås fra E.I. du Pont de Nemours and Company under varemærket "Mylar". Som underlag kan der desuden anvendes 20 glas.

I overensstemmelse med opfindelsen er der langs med begge kanter af underlaget 10 anbragt elektroder 12 og 14 med en indbyrdes afstand, således at de er indbyrdes parallelle. Disse elektroder er dannet af et tyndt 25 ledende, filmagtigt materiale og kan være anbragt på substratoverfladen 10 med et vilkårligt egnet middel, såsom ved vakuumaflejring, forstøvning (sputtering) eller elek-troløs plettering. Alternativt kan den ledende film være en fotopolymer, som dannes på kendt måde ved anvendelse 30 af et passende fotoredskab til polymerisering af de ønskede elektrodedele 12 under anvendelse af aktinisk stråling, og det uønskede overskud af fotopolymer bortvaskes.

Ved en yderligere alternativ måde kan der anvendes vilkårlige ledende pastaer eller sværter, som ønsket. Pa-35 staerne og sværterne kan afsættes på underlaget ved trykning eller silketrykning. Elektroderne kan også være ud-

O

7

DK 161609 B

formet som en sammensat struktur med et lag af en god leder (sølvledende pasta) påtrykt først og et andet lag kemisk indifferent leder (carbonledende pasta) trykt over sølvet. Herved virker sølvet som en samleskinne, 5 der giver en ens spænding over elektrodelængden.

Underlaget kan fortrinsvis være behandlet med et materiale til at styrke bindingen mellem underlaget og elektroforesegelen. P.eks. kan polyesterfilmen behandles med en bifunktionel carboxylsyre eller anhydrid eller en 10 silan eller et andet materiale, som copolymeriserer med gelen, hvorved den bindes til substratet. Elektroderne kan være behandlet tilsvarende.

Som det næste trin ved fremstillingen af elek-troforeseanordningen ifølge fig. 1 overtrækkes under-15 laget og elektroderne med en skillegel, hvorved der fås et system eller en anordning, hvori elektroderne er integreret i og i god elektrisk kontakt med gelen. Overtrækningen kan ske på gængs måde, hvorved en blanding af acryl-amid i monomer form og en passende initiator i pufferop-20 løsning hældes i en form, hvori underlagets overflade med elektroderne danner den ene væg, og får lov at polymeri-sere i form af en tynd plade. Gelerne dannes i nærværelse af puffere for at regulere pH miljøet ved adskillelsen samt gelens elektriske ledningsevne. Eftersom de forskel-25 lige geler, der anvendes til elektroforese, er kendte, anses det ikke for nødvendigt at diskutere yderligere særlige geler, der kan anvendes.

Efter overtrækningen af elektroderne 12 og 14 kan man etablere de elektriske forbindelser til elektroderne 30 ved hjælp af tråde 18, som er tilsluttet en passende jævnstrømsstrømforsyning 20. Der kan anvendes nåle ved enden af trådene 18 for at trænge ind i gelen og etablere elektrisk kontakt med elektroderne 12. I fig. 2 er vist en mere detaljeret afbildning af en foretrukken måde, på 35 hvilken trådene 18 forbindes til elektroderne. I fig. 2 ses det, at geldimensionerne er forkortet, således at 8

O

DK 161609 B

underlaget 10 har en større udstrækning end gelen i begge retninger, og elektroderne 12 også strækker sig ud over skillegelen 16, således at de er nær ved eller ved kanten af underlaget 10. På denne måde kander anvendes 5 simple alligatorklonmer eller andre forbindelsesmekanismer, såsom elektrodekantforbindelsesklemmer eller fjederkontakter af kendt type til at forbinde strømforsyningen med de forskellige elektroder. En anden form for elektrisk kontakt til elektroderne kan etableres med platinkontakter, 10 der er presset ind mod elektrodeenderne, som rager frem fra kanten af skillegelen.

Som det fremgår af fig. 2, kan det i mange tilfælde være ønskeligt, at der oven på gelen 16 i nærheden af elektroderne 12 er anbragt en papirvæge 22, 15 der er mættet med en passende pufferopløsning, for at sikre, at der er tilstrækkelig puffer (og fugt) til rådighed for den nødvendige elektriske kontinuitet.

Det foretrækkes, at elektroderne er dannet ved silketrykningsteknikker under anvendelse af tykfilm-20 elektronikteknologi. En typisk trykt elektrode kan have en tykkelse i størrelsesordenen 25 til 100 pm. Den dertil knyttede væge er typisk 3 mm bred og har en længde i størrelsesordenen 70 mm. Disse elektroder er som bekendt anbragt i parallelle områder af underlaget 10 og 25 er typisk ca. 70 mm lange. Der kan også anvendes andre dimensioner. Som eksempler på ledende materialer, der har været anvendt med gode resultater, skal nævnes Du Font's lederkomposition, sølv 4929, der hærder ved lav temperatur, og ikke-metalliske ledende materialer, 30 såsom carbon (Atchison "Electrodag" 423SS). Andre muligheder er f.eks. overtræk af ædelmetal, såsom platin, palladium og guld. Disse kan forenes i sammensatte lag som beskrevet tidligere. Yderligere har carbon vist sig at være et særligt anvendeligt elektrodemateriale, for-35 di det er kemisk indifferent. Under brug produceres der en lille smule gas ved elektroderne, og denne gas kan

DK 161609 B

O

9 enten diffundere ud til geloverfladen eller kan bortventileres via små huller, der er dannet i gelunderlaget.

I fig. 3 er afbildet en alternativ udførelsesform 5 af opfindelsen, som er særligt tilpasset efter 2D elek-troforese. I dette tilfælde dannes der et rektangulært tyndt filmunderlag 30 af den ovenfor beskrevne type med et første par korte elektroder 32 i den ene ende over for hinanden i underlagets breddedimension. Disse elek-10 troder overtrækkes med en gel 34, såsom en isoelektrisk fokuserende gel, således at der kan gennemføres isoelektrisk fokuserende adskillelser langs breddedimensionen. Desuden dannes der et andet par elektroder 36 på resten af substratet 30, parallelt med breddedimensionen og 15 langs med længdedimensionen. Disse elektroder 36 er overtrukket med en anden gel 38, som typisk anvendes til 2D elektroforeseadskillelser, såsom en porestørrelsegradient-gel med natriumdodecylsulfat (SDS). Mellem de to geler 34 og 38 fås der et område 40., hvor der ikke findes noget 20 bortset fra underlaget, hvorved der fås en elektrisk afspærring mellem de to geler. På dette sted kan der dannes en foldelinie 42 i underlaget 30 for at lette sammenfoldningen af den første gel 34, således at den kommer i kontakt med den anden gel 38. Sammenfoldningen fore-25 tages efter den første dimensionsadskillelse mellem elektroderne 32. Ved sammenfoldning af den første gel 34, således at den kommer i kontakt med den anden gel 38, kan de fraskilte proteiner komme i kontakt med gelen 38 og overføres hertil til den anden dimensionsadskillelse 30 mellem elektroderne 36.

I fig. 4 er afbildet en yderligere udførelsesform

af opfindelsen, som også er særligt tilpasset efter 2D

elektroforese. I denne udførelsesform er den ene af det andet par elektroder, i dette tilfælde betegnet 36", an-35

O

10 DK 161609 B

bragt i området med den første gel 34. En relatiyt lille gelgrænseflade eller spalte 44 er tilbage mellem de to geler. Når man ønsker at foretage andendimensionsadskillelse, fyldes grænsefladespalten 44 under disse beting-5 eiser blot med en pufferopløsning, og den elektriske gradient etableres mellem elektroderne 36 og 36'. Denne fremgangsmåde kræver ikke foldning eller bøjning af pladen.

På denne måde passeres komponenterne 46, der er fraskilt | under førstedimensionsadskillelsen, direkte gennem puf- i 10 feropløsningen under andendimensionsadskillelsen, således at der fås andendimensionsfraskilte komponenter 48.

Ved en yderligere udførelsesform af opfindelsen, jfr. fig. 5 og 6, dannes der.et nedre underlag 10 på samme 15 måde som beskrevet i forbindelse med fig. 1, med en gel 16 og elektroder 14 forbundet til det første underlag 10 til gennemførelse af adskillelse langs en første dimension.

Et andet substrat 10' med en andendimensionsgel 16' og tilsvarende andendimensionsgelelektroder 141, alt på 20 undersiden, er fastgjort i den modsatte ende af gelen 16' til den ene ende af det første underlag 10 med en klemme eller binding (ikke vist), hvorved der dannes en anordning som en bog. Sagt på anden måde, førstedimensionsgelen 16 og andendimensionsgelen 16' er vendt mod 25 hinanden. Disse geler adskilles med et afstandselement 50, således at gelerne ikke kommer i kontakt med hinanden. Afstandselementet 50 kan være W-formet og fleksibelt, som kan slippe og ikke klæber til gelerne. Po-lyethylen- og polyvinylchloridfilm er egnede til dette 30 formål. Ved anvendelse af denne anordning gennemføres førstedimensionsadskillelse på normal måde. Derefter fjernes afstandselementet 50 ved at gribe fat i og trække midterfolden ud og således rive det bort fra gelerne, hvorved gelerne kommer i kontakt med hinanden, og de 35 fraskilte komponenter overføres til den anden gel. Anden-

O

11 DK 161609 B

dimensionsadskillelsen gennemføres derpå på sædvanlig måde.

Det ses således, at elektroforeseanord-ningen ifølge opfindelsen har mange fordele. For det 5 første er de normale store pufferbeholdere, der er nød- vendige, erstattet af kombinationen af elektroder integreret i gelen, og om nødvendigt, immobiliseret puffer i vægerne. Gelunderlagene kan formes med elektrodeopstillinger, der tillader gennemførelse af forskellige 10 typer elektroforese i flere dimensioner i samme gellag.

Der kan fremstilles flerlagsstrukturer af geler og elektroder, således at prøver overføres fra en gel til en anden i flerdimensionsadskillelser. En anordning, der er udformet således, er komplet i sig selv og kræver kun 15 yderligere en strømforsyning til driften. Tyndtlagsan- ordningerne har reducerede krav til afkøling og tillader højere adskillelseshastigheder med øget komponentopløsning .

20 25 30 35

Claims (2)

1. Elektroforeseanordning med et tyndt filmstøtteun-derlag (30), skillegeler (34,38) dannet på den ene overflade af underlaget (30) samt midler til etablering af et elektrisk 5 potential tværs over mindst en del af gelerne (34,38), hvor midlerne til etablering af et elektrisk potential omfatter elektroder, der er anbragt med en indbyrdes afstand og er integreret i og i elektrisk ledende kontakt med geleri på underlaget (16), k e n d e t e g n e t ved, at elektroderne 10 udgøres af to på tværs anbragte par (32,36), og gelerne (34,38) udgøres af to forskellige geler, der ikke er i indbyrdes kontakt, som hver har forskellige adskillelsesegenska- i ber, og hvert af elektrodeparrrene er anbragt i en forskellig gel (34,38), og idet underlaget (30) definerer en foldelinie 15 (42) i området (40) mellem gelerne (34,38), således at sam menfoldningen af underlaget (30) for at bringe gelerne til indbyrdes kontakt lettes.

2. Elektroforeseanordning med et tyndt filmstøtteun-derlag (10), en skillegel (16) dannet på den ene overflade 20 af underlaget (10) samt midler til at etablere et elektrisk potential over mindst en del af gelen (16), hvor midlerne til etablering af et elektrisk potential omfatter elektroder (14), der er anbragt med indbyrdes afstand og er integreret i og i elektrisk ledende komtakt med gelen (16) på underlaget 25 (10), kendetegnet ved, at den omfatter et andet underlag (10’) med en anden skillegel (16') dannet på den ene overflade og andre elektroder (14') med indbyrdes afstand integreret i og i elektrisk kontakt med den anden gel (16'), hvorhos underlagenes (10,10·) geler vender mod hinanden, og 30 der mellem gelerne (16,16·) er anbragt en afstandsfilm (50), og elektroderne (14,14·) i hver gel (16,16·) er anbragt på tværs i forhold til hinanden.