DK160782B - Middel til isolering af subpopulationer af hvide blodlegemer og fremgangsmaade til anvendelse af midlet - Google Patents

Description

i

DK 160782 B

Den foreliggende opfindelse angår et middel til isolering af en subpopulation af hvide blodlegemer, der bærer specifikke markører, fra en heterogen callesus-pension af hvide blodlegemer, der eventuelt er forurenet 5 med røde blodlegemer.

De suspenderede partikler i blod udgør ca. 45% af det totale blodvolumen. De suspenderede partikler indbefatter røde blodlegemer (erythrocyter), hvide blodlegemer (leukocyter) og blodplader (thrombocyter). Selv om 10 størstedelen af cellerne i blod er røde blodlegemer, er de hvide blodlegemer yderst vigtige, da de er legemets primære forsvar mod infektioner.

Der findes grundlæggende tre typer hvide blodlegemer: lymfocyterne, granulocyterne og monocyterne. Lym-15 focyterne klassificeres yderligere som T-lymfocyter, B-lymfocyter og nul-lymfocyter. T-Lymfocyterne kan yderligere klassificeres i subpopulationer, der betegnes som hjælper-T-lymfocyter og supressor-T-lymfocyter. Granulocyterne klassificeres også yderligere som neutrofiler, 20 eosinofiler og basofiler. De hvide blodlegemer klassificeres også generelt som lymfocyter og hjælpeceller. Lymfocyterne omfatter T-, B- og nul-lymfocyterne. Granulocyterne og monocyterne klassificeres som hjælpeceller.

Tidligere fremskridt med hensyn til at forstå den 25 cellulære immunologi hos de hvide blodlegemer og fremtidige fremskridt med hensyn til yderligere forståelse af de hvide blodlegemer afhænger af vor færdighed til at fraskille og isolere de forskellige lymfocyter og hjælpeceller til muliggørelse af identifikation og analyse 30 deraf. Som følge af betydningen af at fraskille og skelne mellem subpopulationer af hvide blodlegemer er der blevet udviklet mange forskellige cellefraskillelsespro-cedurer. Almindelige metoder, der anvendes for nærværende til fraskillelse og isolering af populationer af hvi-35 de blodlegemer, indbefatter fremgangsmåder af adhæsionstypen, ved hvilke en eller flere af typerne af hvide blodlegemer fjernes ved adhæsion til forskellige materialer, såsom Sephadej^ og nylonuld. Ved andre procedurer 2

DK 160782 B

har man anvendt densitetsgradienter til adskillelse af populationerne af hvide blodlegemer i deres respektive klasser på grundlag af størrelses- og densitetsforskelle.

For at en cellefraskillelsesmetode skal være nyt-5 tig, må fraskillelsesteknikken være enkel og give høje, repræsentative udbytter af de ønskede blodlegemer med kun ringe eller ingen forurening med andre typer hvide blodlegemer. Fraskillelsesmetoden skal også være let reproducerbar og ikke i skadelig retning påvirke opførslen 10 af den udvundne population af hvide blodlegemer. Selv om de ovennævnte cellefraskillelsesmetoder er nogenlunde vellykkede, kræver disse metoder stadig et betydeligt antal trin, som ikke blot er tidsrøvende, men forøger ri- / sikoen for sammenblanding af prøver.

15 For nylig er der blevet udviklet en ny celleiso lations- og -adskillelsesmetode, som er baseret på de specifikke celleoverflademarkører, der er til stede i hver af typerne af hvide blodlegemer. Metoden indebærer grundlæggende, at man behandler den heterogene populati-20 on af hvide blodlegemer (der almindeligvis også vil omfatte en vis mængde røde blodlegemer) med et eller flere specifikke antistoffer, som genkender og bliver bundet til en eller flere af subpopulationerne af hvide blodlegemer. Derefter sættes der komplement til blodlegemerne 25 til lysering af de med antistof mærkede blodlegemer. De lyserede celler skilles derefter fra den tilbageblevne ikke-lyserede heterogene population af hvide blodlegemer. Denne metode af den negative udvælgelsestype ser ret lovende ud, men af ulemper er der dog problemer med at fin-30 de egnede kilder for antisera og komplement, som giver den ønskede lysering af den subpopulation af hvide blodlegemer, der skal fjernes fra den heterogene population af hvide blodlegemer. Desuden kræves der særskilte trin omfattende antistofbehandling, komplementlysering af 35 blodlegemerne og fraskillelse af de lyserede blodlegemer fra den ønskede subpopulation af blodlegemer.

I betragtning af vigtigheden af fraskillelsen og isoleringen af de forskellige elementer af hvide blodle-

DK 160782B

3 j gemer er det ønskeligt at tilvejebringe isolationsfremgangsmåder og ved sådanne fremgangsmåder nyttige midler , som forenkler blodlegemeisoleringsprocedurerne, for- i bedrer blodlegemefraskillelsen og giver optimale udbytter 5 af ønskede levedygtige celler.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et sådant, nyt middel til isolering af forskellige celleelementer fra en heterogen cellesuspension af hvide blodlegemer ved en enkel ettrinsprocedure. Den 10 foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at monoklonale antistoffer kan kombineres med komplement og ikke-toksisk densitetsgradientmedium til tilvejebringelse af et middel, som er nyttigt til isolering af en subpopulation af hvide blodlegemer, der bærer 15 specifikke markører, fra en heterogen cellesuspension af hvide blodlegemer, der eventuelt er forurenet med røde blodlegemer.

Midlet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter en vandig opløsning af: 20 specifikt, monoklonalt antistof, der genkender den specifikke markør og er immunoreaktiv med subpopulationen af celler til dannelse af med antistof mærkede subpopulationsceller, komplement i en tilstrækkelig mængde til fremkal-25 delse af lysering af de med antistof mærkede subpopulationsceller til tilvejebringelse af lyserede subpopulationsceller med en mindre densitet end densiteten af de ik-ke-lyserede celler i den heterogene cellesuspension, og en tilstrækkelig mængde af et ikke-toksisk densi-30 tetsgradientmediiim til opnåelse af en opløsning, efter tilsætning af den heterogene cellesuspension, med en større densitet end de lyserede subpopulationsceller, men en mindre densitet end de ikke-lyserede subpopulationsceller .

35 Der kan benyttes forskellige hensigtsmæssige ud førelsesformer for midlet ifølge opfindelsen som angivet i krav 2-19.

DK 160782 B

4

Midlet ifølge opfindelsen betegnes i det følgende som enten en monoklonal antistofblanding eller en mono-klonal antistofcocktail.

Den monoklonale antistofblanding indeholder grund-5 læggende et eller flere monoklonale antistoffer, som specifikt genkender eller er immunoreaktive over for en specifik immunogen markør eller antigen på den subpopulation af celler, der skal isoleres fra den heterogene cellesuspension. Som det er velkendt, er monoklonale an-10 tistoffer mod en given celle i stand til immunoreaktion med specifikke markører på cellen til dannelse af en med antistof mærket subpopulation af celler. Den monoklonale antistofblanding indeholder endvidere komplement i en tilstrækkelig mængde til opnåelse af lysering af den med 15 antistof mærkede subpopulation af celler til dannelse af en subpopulation af lyserede celler, som typisk har en mindre densitet end de ikke-lyserede celler i den heterogene cellesuspension. Den monoklonale antistofblanding indeholder endvidere en tilstrækkelig mængde af et ikke-20 toksisk densitetsgradientmedium til tilvejebringelse af en vandig opløsning, der har en større densitet end den lyserede subpopulation af celler, men en mindre densitet end de tilbageblevne ikke-lyserede celler.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til an-25 vendelse af midlet ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man suspenderer den heterogene cellesuspension af hvide blodlegemer i midlet i et tilstrækkeligt tidsrum og ved en tilstrækkelig temperatur til dannelse af den 30 nævnte lyserede subpopulation af celler og de nævnte ikke-lyserede celler og centrifugerer det nævnte middel i et tilstrækkeligt tidsrum til fraskillelse af de lyserede celler fra de ikke-lyserede celler.

35 Under centrifugeringen bevæger de lyserede celler sig til overfladen til efterfølgende fjernelse, medens de ikke-lyserede celler bevæger sig til bunden af gradienten. Centrifugering af de lyserede og ikke-lyse- 5

DK 160782 B

rede celler i det i den monoklonale antistofblanding tilstedeværende densitetsgradientmedium udgør et bekvemt middel til adskillelse af cellerne.

En hensigtsmæssig udførelsesform for fremgangs-5 måden ifølge opfindelsen omfatter yderligere det trin, at man skiller nævnte lyserede celler og resterende middel ifølge opfindelsen fra nævnte ikke-lyserede celler.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er en forbedring i 10 forhold til kendte fremgangsmåder, ved hvilke antistof- mærkning, komplement-induceret lysering og endelig ad- skillelse af ikke-lyserede celler fra lyserede celler udføres i to eller flere særskilte trin. Den foreliggende opfindelse gør det muligt at udføre celleisolering 15 eller -adskillelse i et enkelt trin og i et enkelt rørglas, hvorved man undgår den mulighed for prøvesammenblanding, der er til stede hver gang prøven må overføres fra et rørglas til et andet, når man arbejder med flere prøver.

20 Opfindelsen tager, som det vil fremgå, sigte på fraskillelse og isolering af forskellige subpopulationer af hvide blodlegemer fra en heterogen suspension af hvide blodlegemer. Den monoklonale antistofblanding har vist sig i udpræget grad at forenkle lymfocytisole-25 ringsprocedurerne og at nedsætte den tid, der tidligere krævedes ved procedurer, hvor der kræves mere end ét cellebehandlingstrin.

Selv om man kunne have haft en formodning om, at de monoklonale antistoffer eller komplementet eller den-30 sitetsgradientmedierne, når de sammenblandedes, kunne forstyrre hinanden eller i skadelig retning påvirke den efterfølgende reaktivitet af lymfocyter eller hjælpeceller, har man ikke fundet nogen påviselig forskel i reaktivitet mellem lymfocyter isoleret ifølge den foreliggen-35 de opfindelse og lymfocyter isoleret ved standardmetoder.

De ovenfor omtalte og mange andre træk og deraf følgende fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den efterfølgende detaljerede beskrivelse.

6

. DK 16Q7&2B

Den foreliggende opfindelse omhandler grundlæggende en éttrins fremgangsmåde til isolering af en ønsket subpopulation af celler fra en heterogen cellepopulation.

Den foreliggende opfindelse omfatter ikke blot procedu-5 ren til fraskillelse og isolering af cellerne, men omfatter også et nyt middel til nævnte isolering. Som tidligere nævnt betegnes midlet i beskrivelsen som en mono-klonal antistofblanding eller en monoklonal antistofcocktail.

1 0 Den monoklonale antistofblanding ifølge den foreliggende op findelse er en vandig opløsning af: (1) et eller flere specifikke antistoffer, son genkender og bindes til specifikke antigene markører på den' cellesubpopulation, der skal fjernes fra en heterogen cellesuspension, (2} kcmpleoaent i en tilstrækkelig mængde til 15 fremkaldelse af lysering af subpopulationscellerne, når de er mærket med detspecifikke antistof, og (3) et ikke-toksisk densitetsgradientmedium, som er i stand til at skille de ikke-lyserede celler, der isoleres, fra de komplement-lyserede subpopulationsceller.

20 Det eller de specifikke antistoffer, der er til stede i den monoklonale antistofblanding, vil afhænge af den særlige subpopulation af celler, der skal lyseres og skilles fra den heterogene cellepopulation. Den foretrukne heterogene cellepopulation, på hvilken midlet ifølge opfindelsen 25 anvendes, er det brungule lag, der dannes, når helblod centrifugeres. Når helblod centrifugeres i tilstrækkelig grad, skilles det, som det er almindelig kendt, i en nedre del med røde blodlegemer og en øvre plasmadel. Den ned're del med røde blodlegemer og den øvre plasmadel er adskilt af 30 et ’brungult lag. Det brungule lag omfatter elementer af hvide blodlegemer og vil typisk også indeholde en vis mængde røde blodlegemer En foretrukken heterogen cellesuspension, på hvilken midlet ifølge opfindelsen anvendes, er en suspens ion af det brunigule lag i et passende vandigt 35 medium, såsem Hanks medium eller normal phosphatpufret saltopløsning (PBS). Både Hanks medium og PBS er almindelige laboratoriereagenser, der er meget let tilgængelige og anvendes i udstrakt grad.

7

DK 160782 B

Den ud fra det brungule lag fremstillede heterogene suspension vil bl.a. indeholde: B-lymfocyter, T-lymfocyter, nul-lymfocyter, monocyter og de tre typer granulocyter, neutrofiler, eosinofiler og basofiler.

5 Det i en given antistofblanding anvendte særlige antistof vil afhænge af den særlige population af hvide blodlegemer, der skal fjernes fra suspensionen af det brungule lag. Til isolering af lymfocyter fra det brungule lag vil antistofblandingen f.eks. indeholde anti-10 stoffer mod røde blodlegemer, monocyter og granulocyter-ne. Hvis der skal isoleres B-lymfocyter, skal der foruden antistoffer mod røde blodlegemer, monocyter og granulocyter sættes antistoffer, som er specifikke mod T-lymfocyter/ til blandingen. Hvis der omvendt skal isole-15 res T-lymfocyter, skal antistoffer mod B-lymfocyter kombineres med antistoffer mod røde blodlegemer, monocyter og granulocyter.

Til isolering af hjælper-T-lymfocyter fra suppres-sor-T-lymfocyter skal antistof mod suppressor-T-lymfocyt 20 sættes til den ovenfor beskrevne antistofblånding til fraskillelse af T-lymfocyter. Til isolering af suppres-sor-T-lymfocyter fra hjælper-T-lymfocyter skal der omvendt tilsættes antistof mod hjælper-T-lymfocyter.

Til isolering af monocyter skal antistofblandin-25 gen indeholde antistoffer mod røde blodlegemer, lymfocyter og granulocyter. Til isolering af granulocyter skal antistofblandingen indeholde antistoffer mod røde blodlegemer, monocyter og lymfocyter. Til isolering af en specifik type granulocyt skal antistoffer rettet mod de to 30 ikke-ønskede granulocyter kombineres med antistoffer mod røde blodlegemer, lymfocyter og monocyter. F.eks. til isolering af basofiler vil antistoffer mod eosinofiler, neutrofiler, lymfocyter, monocyter og røde blodlegemer være nødvendige i antistofblandingen. Til isolering af 35 eosinofiler skal antistoffer mod basofiler og neutrofiler kombineres med antistoffer mod lymfocyter, monocyter og røde blodlegemer i antistofblandingen. Til isolering af neutrofiler skal antistoffer mod eosinofiler og baso- 8

DK 160782 B

filer kombineres med antistoffer mod lymfocyter, mono-cyter og røde blodlegemer i antistofblandingen. Nul-lymfocyterne kan isoleres ved fremstilling af en antistofblanding, der indeholder antistoffer mod T- og B-5 lymfocyter sammen med antistoffer mod monocyter, granu-locyter og røde blodlegemer.

Det antistof, der skal anvendes i antistofblan-dingen ifølge den foreliggende opfindelse, må være specifikt for det bestemte.element af hvide blodlegemer, der 10 skal fjernes fra cellesuspensionen af det brungule lag. Endvidere må antistoffet være tilstrækkelig stærkt eller immunoreaktivt til at fremkalde lysering af den med antistof mærkede celle, når der behandles med komplement. Antistoffet må også være forligeligt med komplement 15 og densitetsgradientmediet.

Monoklonale antistoffer er velkendte og anvendes i stor udstrækning. Fremstilling og anvendelse af monoklonale antistoffer er konventionel. Fremstillingen og isoleringen af egnede monoklonale antistoffer, der er 20 specifikke for de forskellige elementer af hvide blodlegemer, indgår ikke i den foreliggende opfindelse, bortset fra den omstændighed at det monoklonale antistof må isoleres og tilberedes til inkorporering i antistofblandingen. Konventionelle fremgangsmåder til fremstilling 25 af monoklonale antistoffer, der er immunoreaktive med specifikke cellemarkører, er beskrevet i Kohier og Milstein, Nature 256:495 (1975), Kohier og Milstein, European Journal of Immunology, 6:511 (1976) og S. Fazeks de St. Groth, Journal of Immunological Methods, 35:1-21 30 (1980).

Som det er velkendt,er komplement en i normalt serum optrædende kompleks aaekke enzymatiske proteiner, som reagerer til kombinering med det på en antistofmærket celle tilstedeværende antigen-antistof-kompleks til

DK 160782 B

9 fremkaldelse af lysering af cellen. Komplement isoleres typisk fra forskellige dyr, såsom kaniner. Der kan benyttes komplement isoleret fra en vilkårlig art, så længe det ikke reagerer på ugunstig måde med de valgte speci-5 fikke monoklonale antistoffer i antistofblandingen og er i stand til at fremkalde den ønskede cellelysering. Komplementet må desuden ikke påvirke levedygtigheden eller reaktiviteten af de tilbageblevne ikke-lyserede celleelementer og må desuden ikke reagere med densitetsgradi-10 entmediet. Komplement isoleret fra kaniner foretrækkes.

Det i midlet ifølge opfindelsen anvendte densitetsgradientmedium må have en større densitet end de lyserede subpopulationsceller, men en mindre densitet end de ikke-lyserede celler. Densitetsgradientmedier så-15 som caesiumchlorid- og kolloid-silica-gradienter foretrækkes .

Kolloid-silica-densitetsgradientmaterialer er særlig foretrukne. Kolloid-silica-densitetsgradientmateri-aler er velkendte, anvendes i vid udstrækning og er let 20 tilgængelige i handelen. Kolloid-silica-densitetsgradient-materialet omfatter grundlæggende kolloide silicapartik-ler overtrukket med polymere til stabilisering af partiklerne i suspension og for at gøre silicaen ikke-tok-sisk over for celler. Et egnet polymerovertræk er poly-25 vinylpyrrolidon (PVP). Kolloid silica overtrukket med PVP fås i handelen fra Phamacia Corp. under handelsbetegnelsen "PERCOLli^'. "PERCOLI^ er et særlig foretrukket densitetsgradientmateriale, da de kolloide silicapartik-ler har forskellige størrelser. De i forskellig størrel-30 se foreliggende partikler giver en forbedret adskillelse af lettere, lyserede celler fra de tungere ikke-lyserede celler, når antistofblandingen centrifugeres. Dette antages at skyldes vandringen af de tungere eller større kolloide silicapartikler til bunden af centrifugerørglas-35 set til naturlig dannelse af en densitetsgradient under centrifugering af antistofblandingen til opnåelse af forbedret adskillelse af lyserede celler fra ikke-lyserede celler. Densitetsgradientmaterialer, der ændres eller / 10

DK 160782 B

ødelægges under inkubering og cellelysering, er ikke egnede .

De tre i antistofblandingen indgående grundbe-standdele (et eller flere monoklonale antistoffer, kanin-5 komplement og "PERCOLL ") foreligger fortrinsvis i en isotonisk vandig opløsning af Hanks medium eller phos-phatpufret saltopløsning (PBS).

Den faktiske mængde af i antistofblandingen tilstedeværende specifikt antistof og komplement vil varie-10 re afhængigt af styrken og effektiviteten af antistoffet og/eller komplementet. Den i antistofblandingen eller -cocktailen krævede mængde af et bestemt monoklonalt antistof eller af kaninkomplement bestemmes eksperimentelt. Mængden af "PERCOLK^1 i antistofblandingen vil afhænge af 15 den type celler, der isoleres, og ligger fortrinsvis fra 40 til 60 vol% "PErCOLL®-®tamopløsning, hvor "PERCOLL®'-stamopløsningen fremstilles ved at blande 9 dele af det fra fabrikanten leverede handelsprodukt "PERCOLlr*' med 1 del 10 X PBS (10 gange fysiologisk koncentration). Til 20 isolering af lymfocyter foretrækkes en antistofblanding indeholdende ca. 53 vol% .af "PERCOL^'-stamopløsningen.

Et udførelseseksempel er anført i det følgende:

Der fremstilledes en blanding af monoklonale antistoffer til fjernelse af røde blodlegemer og granulocy-25 ter fra en suspension af celler fra det brungule lag for derved at isolere lymfocyter og monocyter. Monoklonale antistoffer fremstilledes ud fra ascites produceret i Balb/C mus efter de metoder, der er angivet af Kohier og Milstein (1978). Miltceller fra immuniserede Balb/C mus anvendtes 30 sammen med myelomaceller under anvendelse af polyethylen-glycol (PEG) og dyrkedes i HOT-medium (medium indeholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin) til eliminering af ikke-hybridiserede myelomaceller. De på denne måde fremstillede to antistoffer var: (1) 70-2B4F7, et anti-rød-35 blodlegeme-antistof i ascitesvæske med en titer på 1: 2000. Dette antistof fortyndedes 1:4 i PBS, før det sattes til antistofcocktailen; og (2) 89-4C6A8, en anti-granulocyt i ascitesvæske med en titer på 10 ^. Dette \ 11

DK 160782 B

! antistof fortyndedes 1:4 i PBS, før det sattes til antistof cocktailen. Der anvendtes kaninkomplement (PEL-FREEZE HIA-A, -B, -C typebestemmelse), sammen ired "PER3DLL·®"-densitetsgradient (Pharmacia). Der fremstilledes en stamop-5 løsning af "PERCOLI^ ved fortynding af 9 dele af det i ! handelen gående "PERCOLL®'med 1 del 10 X phosphatpufret saltopløsning.

Formuleringen til antistofcocktailen var som følger: 10 1. 500 ml kaninkomplement.

2. 10 ml af det monoklonale anti-rød-blodlegeme- '

antistof (fortyndet 1:4). I

3. 10 ml af det monoklonale anti-granulocyt-anti-stof (fortyndet 1:4).

15 4. 350 ml af "PERCOL^'-stamopløsningen.

Den ovennævnte antistofblanding anvendtes til isolering af lymfocyter/monocyter ved den nedenfor be- ! skrevne procedure:

O

1. Man centrifugerer 15 cnr helblod (heparin eller 20 surt citrat-dextrose) ved 1000 G i 10 minutter.

3 2. Man trækker 0,1 cm (100 mikroliter) af brun- 3 gult lag op i et Fisher-rørglas indeholdende 1 cm normal phosphatpufret saltopløsning (PBS) og blander godt.

Man centrifugerer i en Fisher-centrifuge i 1 mi-25 nut ved 1000 g.

3. Man kaster supernatanten væk og resuspenderer 3 i 0,75 cm af cocktailen af monoklonalt antistof og blander godt.

4. Man inkuberer blandingen i et 37°C vandbad el-30 ier varmeblok i 15 minutter. Cocktailblandingen skal være klar, mørkerød fra hæmolyse.

5. Efter inkubering blander man godt med en pipette til itubrydning af eventuelle klumper. Man anbringer et lag af 0,2 cm PBS eller Hank's medium oven på blan- 25 dingen og centrifugerer ved 2000 G i 2 minutter. Man fjerner og bortkaster det fremkomne lag af flydende døde celler og supernatanten.

' ' /

DK 160782 B

12 6. Lymfocyt/monocyt-pelleten vaskes to gange med PBS, Hanks eller McCoys medium. Cellerne centrifugeres ved 1000 G i 1 minut efter hver vaskning.

7. De isolerede celler resuspenderes i McCoys me-5 dium, og koncentrationen indstilles til mellem 1,5 og

O

2,0 millioner celler pr. cm .

Lymfocyter/monocyter fra 43 sunde frivillige donorer isoleredes under anvendelse af den ovenfor beskrevne cocktailblanding af monoklonale antistoffer og den ovenfor 10 beskrevne procedure ifølge den foreliggende opfindelse og en separationsmetode, der er beskrevet af Terasaki et al. (1978) og betegnes som Ficoll~hypaque/thrombin-se-parationsmetoden. De ved begge procedurer isolerede lymfocyter/monocyter typebestemtes parallelt med lokale 15 HLA-A, -B, -C reagenser opnået fra kvinder, der havde født flere gange. Fremgangsmåden med monoklonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse krævede i gennemsnit 20-25 minutter til fuldendelse og gav op til 5 millioner lymfocyter/monocyter med over 90% renhed. Dette står godt 20 mål med Ficoll-hypaque/thrombin-separationsmetoden, der tager i gennemsnit 30 minutter til fuldendelse og giver op til 3 millioner lymfocyter/monocyter ud fra

O

0,1 cm brungult lag med en renhed i området fra 50 til 90%.

25 Resultaterne af den parallelle afprøvning viste en afvigelse på kun 2% for de afprøvede 2428 reaktionspar. En R-værdi på 0,93 mellem de to metoder viser, at fremgangsmåden med den monoklonale antistofblanding ifølge den foreliggende opfindelse ikke påvirkede mikrocyto-30 toksicitetsprøven. Endvidere var levedygtigheden af lym-focy.ter/monocyterne upåvirket. Alle uoverensstemmelser antages primært at skyldes serologiske problemer, såsom svage antisera og svage forurenende eller krydsreagerende antistoffer.

Claims (20)

1. 2. Middel ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den heterogene cellepopulation indbefatter lymfocyter, granulocyter, røde blodlegemer og monocyter, og 25 at det specifikke antistof omfatter monoklonale antistoffer, der genkender specifikke markører på de røde blodlegemer og granulocyterne, således at midlet er nyttigt til fjernelse af de røde blodlegemer og granulocyterne fra den heterogene cellesuspension til isolering af lym-30 focyterne og monocyterne.
2. 3. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det specifikke antistof yderligere omfatter monoklonale antistoffer, der genkender monocyter, således at midlet er nyttigt til fjernelse af de røde blodlege- 35 mer, granulocyterne og monocyterne fra den heterogene cellesuspension til isolering af lymfocyterne.
3. 4. Middel ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den heterogene cellepopulation indbefatter B- DK 160782 B / / lymfocyter og T-lymfocyter, og at det specifikke antistof yderligere omfatter monoklonale antistoffer, der genkender B-lymfocyter, således at midlet er nyttigt til fjernelse af de røde blodlegemer, granulocyterne, mono-5 cyterne og B-lymfocyterne fra den heterogene cellesuspension til isolering af T-lymfocyterne.
4. 5. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den heterogene cellepopulation indbefatter hjæl-per-T-lymfocyter og suppressor-T-lymfocyter, og at det 10 specifikke antistof yderligere omfatter monoklonale antistoffer, der genkender hjælper-T-lymfocyter, således at midlet er nyttigt til fjernelse af de røde blodlegemer, granulocyterne, monocyterne og B-lymfocyterne og hjælper-T-lymfocyterne fra den heterogene cellesuspensicn 15 til isolering af suppressor-T-lymfocyterne.
5. 6. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den heterogene cellepopulation indbefatter hjælper-T- lymfocyter og suppressor-T-lymfocyter, og at det specifikke antistof yderligere omfatter monoklonale an- 20 tistoffer, der genkender suppressor-T-lymfocyter, således at midlet er nyttigt til fjernelse af de røde blodlegemer, granulocyterne, monocyterne og B-lymfocyterne og suppressor-T-lymfocyterne fra den heterogene cellesuspension til isolering af hjælper-T-lymfocyterne.
6. 7. Middel ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den heterogene cellepopulation indbefatter B-lymfocyter og T-lymfocyter, og at det specifikke antistof yderligere onfatter monoklonale antistoffer, der genkender T-lymfocyter, således at midlet er nyttigt til fjer-30 nelse af de røde blodlegemer, granulocyterne, monocyterne og T-lymfocyterne fra den heterogene cellesuspension til isolering af B-lymfocyterne.
7. 8. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det specifikke antistof omfatter monoklonale an-35 tistoffer, der genkender røde blodlegemer, granulocyter og lymfocyter, således at midlet er nyttigt til fjernelse af de røde blodlegemer, lymfocyterne og granulocyter-ne fra den heterogene cellesuspension til isolering af monocyterne. V DK 160782 B
8. 9. Middel ifølge krav 2,kendetegnet ved/ at det specifikke antistof omfatter monoklonale antistoffer, der genkender røde blodlegemer, lymfocyter ! og monocyter, således at midlet er nyttigt til fjernelse 5 af de røde blodlegemer, lymfocyterne og monocyterne fra , den heterogene cellesuspension til isolering af granulo- cyterne.
9. 10. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at lymfocyterne omfatter B-lymfocyter, T-lymfocy- 10 ter og nul-lymfocyter, og at det specifikke antistof j omfatter monoklonale antistoffer, der genkender røde ΐ i blodlegemer, monocyter, granulocyter, T-lymfocyter og B- : lymfocyter, således at midlet er nyttigt til isolering ! i af nul-lymfocyterne fra den heterogene cellesuspension.
10. 11. Middel ifølge krav 9, kendetegnet ved, at granulocyterne omfatter basofiler, eosinofiler og neutrofiler, og at det specifikke antistof yderligere omfatter monoklonale antistoffer, der genkender neutrofiler og basofiler, således at midlet er nyttigt til i- 20. solering af eosinofiler fra den heterogene cellesuspension.
11. 12. Middel ifølge krav 9,kendetegnet ved, at granulocyterne omfatter basofiler, eosinofiler og neutrofiler, og at det specifikke antistof yderligere 25 omfatter monoklonale antistoffer, der genkender basofiler og eosinofiler, således at midlet er nyttigt til isolering af neutrofiler fra den heterogene cellesuspension.
12. 13. Middel ifølge krav 9, kendetegnet ved, at granulocyterne omfatter basofiler, eosinofiler 30 og neutrofiler, og at det specifikke antistof yderligere omfatter monoklonale antistoffer, der genkender eosinofiler og neutrofiler, således at midlet er nyttigt til isolering af basofiler fra den heterogene cellesuspension.
13. 14. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at densitetsgradientmediet omfatter kolloide sili-capartikler overtrukket med en ikke-toksisk polymer. DK 160782 B Jf
14. 15. Middel ifølge krav 14, kendetegnet ved, at polymerovertrækket i det væsentlige består af polyvinylpyrrolidon.
15. 16. Middel ifølge krav 14, kendetegnet 5 ved, at de kolloide silicapartikler er af forskellig størrelse.
16. 17. Middel ifølge krav 16, kendetegnet ved, at densitetsgradientmaterialet er overtrukket med polyvinylpyrrolidon.
17. 18. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at komplementet er kaninkomplement.
18. 19. Middel ifølge krav 17, kendetegnet ved, at opløsningen indeholder fra 40 til 60 vol% af de overtrukne partikler.
19. 20. Fremgangsmåde til anvendelse af midlet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man suspenderer den heterogene cellesuspension af hvide blodlegemer i midlet i et tilstrækkeligt tidsrum og ved en tilstrækkelig temperatur til dannelse af den 20 nævnte lyserede subpopulation af celler og de nævnte ikke-lyserede celler og centrifugerer det nævnte middel i et tilstrækkeligt tidsrum til fraskillelse af de lyserede celler fra de ikke-lyserede celler.
20. 21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendeteg net ved, at den yderligere omfatter det trin, at man skiller nævnte lyserede celler og resterende middel ifølge krav 1 fra nævnte ikke-lyserede celler.