FI78362C - Foerfarande och komposition foer isolering av vitcellskomponenter. - Google Patents

Description

1 78362

Menetelmä ja seos valkosolukomponenttien eristämiseksi. -Förfarande och komposition för isomering av vitcells-komponenter.

Esillä olevan keksinnön kohteena on yleisesti menetelmä ja seos, joilla erotetaan solujen alipopulaatioita heterogeenisistä solususpensioista. Tarkemmin sanoen esillä olevan keksinnön kohteena on lymfosyyttien ja lisäsolujen erottaminen ja eristäminen.

Veren suspendoituneet hiukkaset muodostavat noin 45 % veren kokonaistilavuudesta. Näitä suspendoituneita hiukkasia ovat punaiset verisolut (erytrosyytit), valkoiset verisolut (leukosyytit) ja verihiutaleet (trombosyytit). Vaikkakin suurin osa veren soluista on punasoluja, valkosolut ovat äärimmäisen tärkeitä, koska ne ovat kehon pääasiallinen suoja infektioita vastaan.

Valkoisia verisoluja on olemassa kolmea perustyyppiä: lymfosyytit, granulosyytit ja monosyytit. Lymfosyytit luokitellaan edelleen T-lymfosyyteiksi, B-lymfosyyteiksi ja nolla-lymfosyyteiksi. T-lymfosyytit voidaan edelleen luokitella auttaja-T-lymfosyyteiksi ja supressori-T-lymfosyyteiksi kutsutuiksi aiipopulaatioiksi. Granulosyytit myös luokitellaan edelleen neutrofiileiksi, eosinofiileiksi ja basofiileiksi. Valkoiset verisolut luokitellaan yleisesti myös lymfosyyteiksi ja lisäsoluiksi. Lymfosyytteihin kuuluvat T-, B- ja nolla-lymfosyytit. Granulosyytit ja monosyytit luokitellaan lisäsoluiksi.

Viime aikoina saavutettu ymmärryksemme valosolujen solu-immunologiasta ja tulevaisuudessa saavutettava ymmärryksemme valkoisista verisoluista riippuu kyvystämme erottaa ja eristää eri lymfosyytit ja lisäsolut niin, että ne voidaan identifioida ja analysoida. Valkosolujen alipopulaatioiden ja niiden luonteenomaisten ominaisuuksien erottamisen 2 78362 tärkeyden vuoksi on kehitetty hyvin erilaisia solujen erottamismenetelmiä. Tällä hetkellä yleisesti käytettyihin valkosolujen erottamis- ja eristämistekniikoihin kuuluu kiinnittämistyyppinen menetelmä, jossa yksi tai useampi valkosolutyyppi poistetaan kiinnittämällä erilaisiin aineisiin, kuten Sephadex-hartsiin ja nailonvillaan. Joissakin muissa menetelmissä on käytetty tiheysgradientteja erottamaan valkosolupopulaatiot vastaaviksi luokikseen koko- ja tiheys-erojen avulla.

Jotta solunerottamismenetelmä olisi hyödyllinen, tulee erotustekniikan olla yksinkertainen ja sillä tulee saada suuria ja tyypillisiä saantoja halutuista soluista niin, että muun tyyppiset valkosolut kontaktoivat vain vähän tai ei lainkaan. Erotustekniikan tulisi olla myös helposti toistettavissa ja sen ei tulisi vaikuttaa haitallisesti talteenotetun valkosolupopulaation käyttäytymiseen. Vaikkakin edellä mainitut solujen erotusmenetelmät ovat jokseenkin menestyksellisiä, näissä menetelmissä yhä tarvitaan huomattava määrä vaiheita, jotka eivät vain vie aikaa vaan myös lisäävät näytteiden sekaantumisvaaraa.

Äskettäin on kehitetty uusi solujen eristämis- ja erottamis-menetelmä, joka perustuu spesifisiin solupinnan markkereihin, joita on jokaisessa valkosolutyypissä. Menetelmän perusajatuksena on, että valkoisten verisolujen heterogeeninen populaatio (joka yleensä sisältää myös joitakin punasoluja) käsitellään yhdellä tai useammalla spesifisellä vasta-aineella, joka tunnistaa yhden tai useamman valkosolujen alipopulaation ja kiinnittyy tähän. Sen jälkeen vasta-aineiset solut lyysataan lisäämällä soluihin komplementtia. Lyysatut solut erotetaan tämän jälkeen jäljelle jääneestä lyysaantumattomasta heterogeenisestä valkosolupopulaatiosta. Tämä tyypiltään negatiivinen valintamenetelmä on osoittautunut melko lupaavaksi; haittoihin on kuitenkin kuulunut sopivien antiseerumi- ja komplementti-lähteiden löytäminen, joilla lyysataan valkosolujen alipopu- 78362 laatio, joka on tarkoitus poistaa heterogeenisestä valkosolu-populaatiosta. Lisäksi tarvitaan myös erilliset vaiheet, joissa suoritetaan vasta-ainekäsittely, lyysataan komplementilla solut ja erotetaan lyysatut solut solujen halutusta alipopulaatiosta.

Kun otetaan huomioon eri valkosolukomponenttien optimaalisen erottamisen ja eristämisen tärkeys, on suotavaa, että löydetään eristysmenetelmiä ja näissä eristysmenetelmissä hyödyllisiä reagensseja, jotka yksinkertaistavat solujen eristämismenetelmiä, parantavat solujen erottamista ja antavat optimaalisia saantoja haluttuja eläviä soluja.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuodaan esiin uusi aineseos ja tämän seoksen käyttömenetelmä, joilla yksinkertaisella ja yksivaiheisella menetelmällä erotetaan eri solukomponentit heterogeenisestä solususpensiosta. Esillä oleva keksintö perustuu havaintoon, että monoklonaalisia vasta-aineita voidaan yhdistää komplementin ja toksittoman tiheysgradientin kanssa aineseokseksi, joka on hyödyllinen erotettaessa solujen, joilla on spesifisiä markkereita, alipopulaatio heterogeenisestä solususpensiosta. Tätä aineseosta kutsutaan jäljempänä joko monoklonaaliseksi vasta-aineseokseksi tai monoklonaaliseksi vasta-ainecocktailiksi.

Monoklonaalinen vasta-aineseos sisältää periaatteessa yhden tai useamman monoklonaalisen vasta-aineen, joka spesifisesti tunnistaa solujen alipopulaatiossa, joka on tarkoitus poistaa heterogeenisestä solususpensiosta, olevan spesifisen immu-nogeenisen markerin tai antigeenin tai joka immunoreagoi tämän markerin tai antigeenin kanssa. Yleisesti on tunnettua, että tietyn solun monoklonaaliset vasta-aineet pystyvät immunoreagoimaan solun spesifisten markereiden kanssa niin, että muodostuu vasta-aineine tai vasta-aineilla leimattu solujen alipopulaatio. Monoklonaalinen vasta-aineseos sisältää lisäksi niin paljon komplementtia, että vasta-aineiset.

4 78362 alipopulaation solut lyysaantuvat lysaantuneiden solujen alipopulaatioksi, jonka tiheys on tyypillisesti pienempi kuin lyysaantunattomien solujen tiheys heterogeenisessä solususpensiossa. Monoklonaalinen vasta-aineseos sisältää lisäksi niin paljon toksitonta tiheysgradienttimediumia, että saadaan vesiliuos, jonka tiheys on suurempi kuin lyysaan-tuneiden alipopulaation solujen mutta pienempi kuin jäljelle jääneiden lyysaamattomien solujen tiheys.

Menetelmässä, jossa monoklonaalisen vasta-aineseoksen avulla erotetaan solujen, joissa on spesifisiä markereita, alipopu-laatio heterogeenisestä solususpensiosta, sekoitetaan heterogeenistä solususpensiosta monoklonaalisen vasta-aineseoksen kanssa niin kauan ja niin korkeassa lämpötilassa, että muodostuu lyysaantuneiden solujen alipopulaatio ja lyysaan-tumattomia soluja. Monoklonaalista vasta-aineseosta, lyysau-tuneita alipopulaatiosoluja ja lyysaantumattomia soluja sentrifugoidaan sen jälkeen tavanomaisin keinoin. Sentri-fugoinnin aikana lyysaantuneet solut siirtyvät pinnalle, josta ne myöhemmin poistetaan, kun taas lyysaantumattomat solut siirtyvät gradientin pohjalle. Lyysaantuneiden ja lyysaantumattomien solujen sentrifugointi tiheysgradient-timediumissa, kun mukana on monoklonaalista vasta-aineseosta, muodostaa helpon solujen erotusmenetelmän.

Esillä oleva keksintö merkitsee parannusta alan aikaisempiin tekniikoihin, joissa yhdessä tai useammassa erillisessä vaiheessa kiinnitetään vasta-aine, lyysataan komplementilla ja lopuksi erotetaan lyysaantumattomat solut lyysaantuneista soluista. Esillä olevassa keksinnössä voidaan solut eristää tai erottaa yhdessä ainoassa vaiheessa ja yhdessä ainoassa koeputkessa, jolloin vältetään näytteiden sekaantumismah-dollisuus, joka aina on olemassa, kun näyte on siirrettävä putkesta toiseen työskenneltäessä useiden näytteiden kanssa.

Esillä olevaa keksintöä voidaan erityisesti soveltaa valkoso- 78362 lujen erilaisten alipopulaatioiden erottamiseen ja eristämiseen heterogeenisestä valkosolujen suspensiosta. Mono-klonaalisen vasta-aineseoksen on havaittu huomattavasti yksinkertaistavan lymfosyyttien eristysmenetelmiä ja lyhentävän aikaa, joka aikaisemmin tarvittiin menetelmissä, joissa oli käytettävä enemmän kuin yksi solujen käsittelyvaihe .

Vaikkakin saattaa olla epäiltävissä, että yhteensekoitettuina monoklonaaliset vasta-aineet tai komplementti tai tiheysgra-dienttimedium saattaisivat vaikuttaa toisiinsa tai vaikuttaa haitallisesti myöhempään lymfosyyttien tai lisäsolujen reaktiivisuuteen, emme ole havainneet mitään eroa tämän keksintömme mukaisesti eristettyjen lymfosyyttien ja standardi-menetelmillä eristettyjen lymfosyyttien reaktiivisuudessa.

Edellä tarkastellut ja monet muut esillä olevan keksinnön mukaiset tunnusmerkit ja niihin liittyvät edut tulevat ilmeisiksi, kun keksintöä seuraavassa selvennetään yksityiskohtaisen kuvauksen avulla.

Esillä olevassa keksinnössä on periaattessa kyse yksivaiheisesta menetelmästä, jolla eristetään solujen haluttu alipopulaatio heterogeenisestä solupopulaatiosta. Solujen erotus- ja eristysmenetelmän lisäksi esillä oleva keksintö käsittää myös uuden aineseoksen, jota käytetään solujen erotusmenetelmän toteuttamisessa. Edellä jo mainittiin, että tätä aineseosta kutsutaan tässä julkaisussa mono-klonaaliseksi vasta-aineseokseksi tai monoklonaaliseksi vasta-ainecocktailiksi.

Esillä olevaa keksintöä voidaan laajasti soveltaa kaikkien sellaisten solujen tai muiden ainesten erottamiseen, jotka sisältävät vasta-aineiden kanssa immunoreaktiivisia anti-geenimarkereita. Esillä olevaa keksintöä voidaan erityisesti soveltaa valkosolukomponenttien erottamiseen ja eristämiseen.

6 78362

Seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa on rajoituttu valkosolukomponenttien erottamiseen ja eristämiseen, mutta on huomattava, että tämä keksintö ei rajoitu vain valkosolujen eristämiseen.

Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aineseos on seuraavien vesiliuos: (1) yksi tai useampi spesifinen vasta-aine, joka tunnistaa solujen alipopulaa-tiossa, joka on tarkoitus poistaa heterogeenisestä solusus-pensiosta, olevat spesifiset antigeenimarkerit ja sitoutuu niihin; (2) komplementti, jota on niin paljon, että alipo-pulaation solut lyysaantuvat, kun spesifinen vasta-aine on niihin kiinnittynyt; ja (3) ei-toksinen tiheysgradientti-medium, joka kykenee erottamaan lyysaantumattomat solut, jotka on tarkoitus eristää komplementilla lyysatuista alipopulaation soluista.

Spesifinen vasta-aine tai vasta-aineet, joita on monoklonaa-lisessa vasta-aineseoksessa, riippuvat kyseisestä solujen alipopulaatiosta, joka on tarkoitus lyysata ja erottaa heterogeenisestä solupopulaatiosta. Esillä olevan keksinnön mukaisesti on parhaana pidetty heterogeeninen solupopulaatio buffy coat-kerros, joka muodostuu kokoverta sentrifugoitaessa. Yleisesti on tunnettua, että kun kokoverta sentrifugoidaan riittävästi, se eroaa alempaan punasoluosaan ja ylempään plasmaosaan. Buffy coat-kerros erottaa tämän alemman puna-soluosan ja ylemmän plasmaosan. Buffy coat-kerros sisältää valkosolukomponentteja ja tyypillisesti myös joitakin punasoluja. Esillä olevan keksinnön mukainen suositeltu heterogeeninen solususpensio on buffy coat-kerroksen suspensio sopivassa vesipitoisessa mediumissa, kuten Hanks'in mediumissa tai tavallisessa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Sekä Hanks'in medium että PBS ovat yleisiä laborato-rioreagensseja, joita on yleisesti saatavissa ja joita yleisesti käytetään.

Buffy coat-kerroksesta valmistettu heterogeeninen suspensio 7 78362 sisältää mm: B-lymfosyyttejä, T-lymfosyyttejä, nolla-lymfosyyttejä, monosyyttejä ja kolmea granulosyyttityyppiä eli neutrofiilejä, eosinofiilejä ja basofiilejä.

Tietyssä vasta-aineseoksessa kulloinkin käytetty vasta-aine riippuu kyseisestä valkosolupopulaatiosta, joka on tarkoitus poistaa buffy coat-suspensiosta. Lymfosyyttien eristämiseksi buffy coat-kerroksesta sisältää esimerkiksi vasta-aineseos vasta-aineita punasoluja, monosyyttejä ja granulosyyttejä vastaan. Jos on tarkoitus eristää B-lymfosyyttejä, seokseen lisättäisiin T-lymfosyyteille spesifisiä vasta-aineita punasolujen, monosyyttien ja granulosyyttien vastaisten vasta-aineiden lisäksi. Jos taas on tarkoitus eristää T-lymfosyyttejä, punasolujen, monosyyttien ja granulosyyttien vastaisten vasta-aineiden kanssa tulisi yhdistää B-lymfosyyt-tien vastaisia vasta-aineita.

Auttaja-T-lymfosyyttien eristämiseksi supressori-T-lymfo-syyteistä tulisi supressori-T-lymfosyytin vasta-ainetta lisätä edellä kuvattuun, T-lymfosyyttien erottamiseen tarkoitettuun vasta-aineseokseen. Supressori-T-lymfosyyttien erottamiseksi auttaja-T-lymfosyyteistä lisättäisiin sen sijaan auttaja-T-lymfosyyttien vasta-ainetta.

Monosyyttien eristämiseksi sisältäisi vasta-aineseos punasolujen, lymfosyyttien ja granulosyyttien vasta-aineita. Granulosyyttien eristämiseksi sisältäisi vasta-aineseos punasolujen, monosyyttien ja lymfosyyttien vastaisia vasta-aineita. Tietyn tyyppisen granulosyytin eristämiseksi yhdistettäisiin punasolujen, lymfosyyttien ja monosyyttien vastaisten vasta-aineiden kanssa vasta-aineita, jotka kohdistuvat kahta ei-haluttua granulosyyttiä vastaan. Esimerkiksi basofiilien eristämiseksi vasta-aineseoksessa tulisi olla vasta-aineita eosinofiilejä, neutrofiilejä, lymfosyyttejä, monosyyttejä ja punasoluja vastaan. Eosino-fiilien eristämiseksi tulisi basofiilien ja neutrofiilien 8 78362 vasta-aineiden kanssa yhdistää lymfosyyttien, monosyyttien ja punasolujen vasta-aineita vasta-aineseoksessa. Neutrofii-lien eristämiseksi tulisi vasta-aineseoksessa yhdistää eosinofiilien ja basofiilien vastaisten vasta-aineiden kanssa lymfosyyttien, monosyyttien ja punasolujen vastaisia vasta-aineita. Nolla-lymfosyytit voidaan eristää valmistamalla vasta-aineseos, joka sisältää T- ja B-lymfosyyttien vastaisia vasta-aineita yhdessä monosyyttien, granulosyyttien ja punasolujen vasta-aineiden kanssa.

Vasta-aineen, jota käytetään esillä olevan keksinnön mukaisessa vasta-aineseoksessa, on oltava spesifinen sen tietyn valkosolukomponentin suhteen, joka tullaan poistamaan buffy coat-solususpensiosta. Vasta-aineen on lisäksi oltava niin voimakas tai immunoreaktiivinen, että vasta-aineinen solu lyysaantuu komplementilla käsiteltäessä. Vasta-aineen täytyy myös sopia yhteen komplementin ja tiheysgradientti-mediumin kanssa. Vaikkakin voidaan käyttää mitä tahansa näihin kriteereihin sopivaa vasta-ainetta, erityisen suositeltavaa on, että monoklonaalisia vasta-aineita käytetään spesifinä vasta-aineina esillä olevan keksinnön mukaisesti.

Monoklonaaliset vasta-aineet ovat yleisesti tunnettuja ja laajalti käytettyjä. Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen ja käyttö on tavanomaista. Sopivien monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka ovat spesifisiä eri valko-solukomponenteille, valmistaminen ja eristäminen eivät kuulu tähän keksintöön muutoin kuin sikäli, että monoklo-naalinen vasta-aine on eristettävä ja valmistettava vasta-aineseoksiin yhdistämistä varten. Tavanomaisia tekniikoita, joilla valmistetaan spesifisten solumarkereiden kanssa immunoreaktiivisia monoklonaalisia vasta-aineita, on esitetty julkaisuissa Kohler G. Milstein Nature 256:495 (1975),

Kohler G. Milstein, European Journal of Immunology, 6:511 (1976) ja S. Fazeks de St. Groth, Journal of Immunological Methods, 35:1-21 (1980).

9 78362 yleisesti tiedetään, että komplementti on monimutkainen joukko normaalissa seerumissa esiintyviä entsymaattisia proteiineja, jotka reagoivat keskenään ja yhdistyvät vasta-aineissa solussa olevan antigeeni-vasta-ainekompleksin kanssa ja aiheuttavat solun lyysaantymisen. Komplementti eristetään tyypillisesti erilaisista eläimistä, kuten kaniineista. Mistä tahansa lajista eristettyä komplementtia voidaan käyttää, mikäli se ei haitallisesti reagoi vasta-aineseoksessa olevien valittujen spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja mikäli se kykenee aiheuttamaan halutun solun lyysaantymisen. Komplementin ei tulisi myöskään vaikuttaa jäljelle jääneiden lyysaantymattomien solukomponenttien elinkykyyn tai reaktiivisuuteen eikä sen myöskään tulisi reagoida tiheysgradienttimediumin kanssa. Parhaana pidetään kaniineista eristettyä komplementtia.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti käytetyn tiheysgradienttimediumin tiheyden on oltava suurempi kuin lyysaattujen alipopu-laation solujen mutta pienemmän kuin lyysaantymatornien solujen tiheys. Parhaina pidetään sellaisia tiheysgradienttimediumeja kuin kesiumkloridi- ja kolloidaalinen silika-gradientit.

Erityisen hyvänä pidetään kolloidaalisesta silikasta olevia tiheysgradienttimateriaaleja. Kolloidaalisesta silikasta olevat tiheysgradienttimateriaalit ovat yleisesti tunnettuja, laajalti käytettyjä ja kaupallisesti saatavissa. Kolloidaalinen silikatiheysgradienttimateriaali sisältää polymeereillä päällystettyjä kolloidaalisia silikahiukkasia, mikä stabiloi hiukkaset suspensiossa ja tekee silikan soluille toksitto-maksi. Eräs sopiva polymeeripolypäällyste on polyvinyylipyr-rolidoni (PVP). PVPillä päällystettyä kolloidaalista silikaa on kaupallisesti saatavissa kauppanimellä PERCOLL ® (rekisteröity tavaramerkki; Pharmacia Ab, Ruotsi). PERCOLL on erityisen hyvänä pidetty tiheysgradienttimateriaali, koska kolloidaaliset silikahiukkaset ovat erikokoisia. Erikokoiset hiukkaset parantavat kevyempien lyysaantyneiden solujen ίο 7 8 3 6 2 erottamista raskaammista lyysaantumattornista soluista, kun vasta-aineseosta sentrifugoidaan. Tämän uskotaan johtuvan raskaampien tai suurempien kolloidaalisten silikahiukkasten kulkeutumisesta sentrifuugiputken pohjalle, jolloin ne luonnostaan muodostavat vasta-aineseoksen sentrifugoinnin aikana tiheysgradientin ja näin parantavat lyysaantuneiden solujen eroamista lyysaantumattomista soluista. Sellaiset tiheysgradienttimateriaalit, jotka muuttuvat tai tuhoutuvat inkuboinnin ja solujen lysaamiseen aikana, eivät ole sopivia.

Vasta-aineseoksen kolme perusainesta (monoklonaalinen vasta-aine tai -aineet, kaniinin komplementti ja PERCOLL) ovat parhaiten Hanks'in mediumin tai PBS:n isotonisessa vesiliuoksessa.

Spesifisen vasta-aineen ja komplementin todellinen määrä vasta-aineseoksessa vaihtelee riippuen vasta-aineen ja/tai komplementin voimakkuudesta ja tehosta. Vasta-aineseoksessa tai -cocktailissa kulloinkin tarvittu monoklonaalisen vasta-aineen tai kaniin komplementin määrä määritetään kokeellisesti. PERCOLL-silikan määrä vasta-aineseoksessa riippuu eristettävien solujen tyypistä. Parhaiten se on välillä 40 - 60 tilavuusprosenttia PERCOLL-perusliuosta, jolloin tämä PERCOLL-perusliuos valmistetaan sekoittamalla 9 osaa valmistajan kaupallisesti toimittamaa PERCOLL-silikaa ja yksi osa 10 X PBS (10 kertaa fysiologinen konsentraatio). Lymfosyyttien eristämistä varten parhaana pidetään vasta-aineseosta, joka sisältää noin 53 tilavuusprosenttia PERCOLL-perusliuosta .

Seuraavassa on annettu käytännön esimerkki:

Valmistettiin monoklonaalinen vasta-aineseos, jolla oli tarkoitus poistaa punasolut ja granulosyytit buffy coat-kerroksen solujen suspensioista ja eristää näin lymfosyytit. Balb/C-hiirten tuottamista askiiteista valmistettiin mono- 11 78362 klonaalisia vasta-aineita Kohler'in ja Milstein’in (1978) menetelmillä. Käytettiin immunisoiduista Balb/C-hiiristä saatuja pernasoluja yhdesäs myeloomasolujen kanssa käyttämällä polyetyleeniglykolia (PEG) ja näitä soluja kasvatettiin HAT-meoiumissa ei-hybridioistujen myleoomasolujen poistamiseksi. Tällä tavalla valmistetut kaksi vasta-ainetta olivat: (1) 70-2B4F7, punasolujen vastainen vasta-aine askiit-tinesteessä; tiitteri oli 1:2000. Tämä vasta-aine laimennettiin 1:4 BPS ennen vasta-ainecocktailiin lisäämistä; ja (2) 89-4C6A8, anti-granulosyytti askiittinesteessä; tiitteri oli 10”^. Tämä vasta-aine laimennettiin 1:4 PBS ennen vasta-ainecocktailiin lisäämistä. Käytettiin kaniinin komplementtia tyyppi PEL-FREEZE HLA-A, -B, -C) yhdessä PERCOLL (Pharmacia) tiheysgradientin kanssa. PERCOLL-perusliuos valmistettiin laimentamalla 9 osaa kaupallisesti saatavissa olevaa PERCOLL-gradienttia ja 1 osa 10 X fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta.

Vasta-ainecocktailin formulaatio oli seuraava: 1. 500 ml kaniinin komplementtia.

2. 10 ml monoklonaalista punasolujen vastaista vasta-ainetta (laimennettu 1:4).

3. 10 ml monoklonaalista granulosyyttien vastaista vasta-ainetta (laimennettu 1:4).

4. 350 ml PERCOLL-perusliuosta.

Tätä vasta-aineseosta käytettiin seuraavalla menetelmällä lymfosyyttien eristämiseen: 1. Sentriguoidasn 15 cm^ kokoverta (hepariini tai happosi traatti-dekstroosi ) 10 minuuttia/1000 g.

2. Buffy coat-kerrosta otetaan 0,1 cm^ (100 mikrolitraa) i2 78362

Fisher'in putkeen, joka sisältää 1 cm^ normaalia fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta (PBX), ja sekoitetaan hyvin.

Sentrifugoidaan Fisher’in sentrifuugissa 1 minuutti/1000 g.

3. Supernatantti heitetään pois ja suspendoidaan uudelleen 0,75 cm^riin monoklonaalista vasta-ainecocktailia ja sekoitetaan hyvin.

4. Seosta inkuboidaan 15 minuuttia 37°C lämpöisessä vesi-hauteessa tai kuumennuslaitteessa. Cocktailseoksen tulisi olla kirkas ja tummanpunaista hemoiyysistä johtuen.

5. Inkuboinnin jälkeen sekoitetaan hyvin pipetillä mahdollisten kokkareiden hajottamiseksi. Seoksen päälle laitetaan 0,2 cm^ PBS tai Hank'in mediumia ja sentrifugoidaan 2 minuuttia/ 2000 g· Saatu kelluva kuolleiden solujen kerros ja supernatantti poistetaan ja heitetään pois.

6. Lymfosyyttipel letti pestään kaksi kertaa PBSrllä, Hanks'in mediumilla tai McCoys'in mediumilla. Jokaisen pesun jälkeen soluja sentrifugoidaan 1 minuutti/1000 g.

7. Eristetyt solut suspendoidaan uudelleen McCoy'n mediumiin ja konsentraatio säädetään välillä 1,5 - 2,0 miljoonaa solua/cin .

43 terveeltä vapaaehtoiselta lahjoittajalta eristettiin lymfosyyttejä käyttämällä edellä kuvattua keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainecocktailseosta ja menetelmää ja Terasaki'in et ai. (197Θ) kuvaamaa erotusmenetelmää, joka tunnetaan Ficol1-hypaque/trombiini-erotustekniikkana. Kummallakin menetelmällä eristetyt lymfosyytit tyypitettiin rinnakkain monisynnyttäjiltä saaduilla paikallisilla HLA-A, -B, -C-reagensseilla. Esillä olevan keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-ainemenetelmän loppuun saattamiseen 7 8 3 6 2 tarvittiin keskimäärin 20 - 25 minuuttia, ja saanto oli 5 miljoonaan asti lymfosyyttejä yli 90 % puhtaudella.

Tämä kesti hyvin vertailun Ficoll-hypaque/trombiini-erotustekniikan kanssa, jonka loppuun suorittamiseen tarvitaan keskimäärin 30 minuuttia ja josta saadaan 3 miljoonaan asti lymfosyyttejä 0,1 emeistä buffy coat-kerrosta puhtauden ollessa viillä 50 - 90 5».

Rinnakkaisen testauksen tulokset osoittivat vain 2 % poikkeavuutta testatusta 2428 reaktioparista. Näiden kahden menetelmän välinen R-arvo 0,93 osoittaa, että esillä olevan keksinnön mukainen, monoklonaalista vasta-aineseosta käyttävä menetelmä ei vaikuttanut mikrosytotoksisuuskokeeseen.

Myöskään lymfosyyttien elinkelpoisuuteen ei vaikutettu. Kaikkien poikkeavuuksien uskotaan johtuvan pääasiassa serologisista ongelmista, kuten heikoista antiseerumeista ja heikoista kontaminoivista tai ristireagoivista vasta-aineista.

Esillä olevan keksinnön mukaisten esimerkkimäisten suoritusmuotojen kuvaamisen jälkeen tulee alan ammattimiesten huomata, että nämä ovat vain esimerkkimäisiä ja että tämän keksinnön piirissä voidaan tehdä erilaisia muita vaihtoehtoja, adaptaatioita ja modifikaatioita. Esillä oleva keksintö ei siten rajoitu tässä yhteydessä esitettyihin spesifisiin suoritusmuotoihin, vaan ainoastaan seuraaviin patenttivaatimuksiin .

Claims (21)

1. Aineseos, joka on tarkoitettu spesifisiä markkereita kantavien solujen alipopulaation erottamiseen heterogeenisestä solususpensiosta, tunnettu siitä, että aineseos käsittää vesiliuoksen, jossa on: spesifistä vasta-ainetta, joka tunnistaa spesifisen markkerin ja on immunoreaktiivinen solujen alipopulaation kanssa muodostaen vasta-aineisia alipopulaatiosoluja; komplementtia niin paljon, että vasta-aineiset alipopulaatio-solut lyysaantuvat, jolloin saadaan lyysaantuneita alipopulaatiosolu ja, joiden tiheys on pienempi kuin lyysaantymat-tomien solujen tiheys heterogeenisessä solususpensiossa; ja toksitonta tiheysgradienttimediumia niin paljon, että saadaan liuos, jonka tiheys heterogeenisen solususpension lisäämisen jälkeen on suurempi kuin lyysattujen alipopulaatio-solujen mutta pienempi kuin lyysaantumattomien alipopulaatiosolu jen tiheys.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että heterogeeninen solupopulaatio sisältää lymfosyyttejä, granulosyyttejä, punaisia verisoluja ja monosyyttejä, jolloin spesifinen vasta-aine sisältää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat punaisissa verisoluissa ja granu-losyyteissä olevat spesifiset markkerit.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että spesifinen vasta-aine sisältää lisäksi monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat monosyytit.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että heterogeeninen solupopulaatio sisältää B-lymfo-syyttejä ja T-lymfosyyttejä, jolloin spesifinen vasta-aine 15 7 8362 sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnista vat B-lymfosyytit.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että heterogeeninen solupopulaatio sisältää auttaja-T-lymfosyyttejä ja supressori-T-lymfosyyttejä, jolloin spesifinen vasta-aine sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat auttaja-T-lymfosyytit.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen seos, tunnettu siitä, heterogeeninen solupopulaatio sisältää auttaja-T-lymfo-syyttejä ja supressori-T-lymfosyyttejä, jolloin spesifinen vasta-aine sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat supressori-T-lymfosyytit.

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että heterogeeninen solupopulaatio sisältää B-lymfo-syyttejä ja T-lymfosyyttejä, jolloin spesifininen vasta-aine sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat T-lymfosyytit.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että spesifinen vasta-aine sisältää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat punaiset verisolut, granulo-syytit ja lymfosyytit.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että spesifinen vasta-aine sisältää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat punaiset verisolut, lymfosyytit ja monosyytit.

10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että lymfosyytit sisältävät B-lymfosyyttejä, T-lymfosyyttejä ja nolla-lymfosyyttejä, jolloin spesifinen vasta-aine 78362 sisältää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat punaiset verisolut, monosyytit, granulosyytit, T-lymfosyytit ja B-lytnfosyytit.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että granulosyytit sisältävät basofiilejä, eosinofii-lejä ja neutrofiilejä, jolloin spesifinen vasta-aine sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat neutro-fiilit ja basofiilit.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen aineseos, tunnettu siitä, granulosyytit sisältävät basofiilejä, eosinofiilejä ja neutrofiilejä, jolloin spesifinen vasta-aine sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat basofiilit ja eosinofiilit.

13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että granulosyytit sisältävät basofiilejä, eosinofii-lejä ja neutrofiilejä, jolloin spesifinen vasta-aine sisältää vielä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat eosio-fiilit ja eutrofiilit.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että tiheysgradienttimedium sisältää kolloidaalisia silikahiukkasia, jotka on päällystetty ei-toksisella polymeerillä.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen aineseos, tunnettu siitä, että polymeeripäällyste muodostuu oleellisesti poly-vinyylipyrrolidonista.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen seos, tunnettu siitä, että kolloidaaliset silikahiukkaset ovat erikokoisia. 17 78362

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen seos, tunnettu siitä, että tiheysgradienttimateriaali on polyvinyylipyrroli-donilla päällystettyjä erikokoisia kolloidaalisia silikahiuk-kasia.

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että koplementti on kaniinikomplementti.

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen seos, tunnettu siitä, että liuos sisältää 40 - 60 tilavuusprosenttia mainittuja päällystettyjä hiukkasia.

20. Menetelmä spesifisiä markereita kantavien solujen alipopu-laation erottamiseksi heterogeenisestä solususpensiosta, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu vaiheet, joissa: heterogeeninen solususpensio suspendoidaan patenttivaatimuksen 1 mukaiseen aineseokseen niin pitkäksi aikaa ja niin korkeassa lämpötilassa, että muodostuu solujen lyysaantunut alipopulaatio ja lyysaantumattomia soluja; ja aineseosta sentrifugoidaan niin kauan, että lyysaantuneet solut eroavat lyysaantymattomista soluista.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä lisäksi erotetaan lyysaantuneet solut ja aineseos lyysaantumattomista soluista. ie 7 8 3 6 2