DK160566B

DK160566B - Fremgangsmaade til mikrobiel oxidation af organisk substrat

Info

Publication number: DK160566B
Application number: DK549281A
Authority: DK
Inventors: Theodorus Antonius Ben Bolsman; Maureen Linda Bailey
Original assignee: Shell Int Research
Priority date: 1980-12-12
Filing date: 1981-12-10
Publication date: 1991-03-25
Also published as: DK549281A; EP0054987A1; DK160566C; JPS57132889A; DE3176978D1; EP0054987B1; JPH0424036B2

Description

i

DK 160566 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til mikrobiel oxidation af et i det væsentlige med vand ikke-blandbart organisk substrat.

Mikroorganismer vides at være i stand til at udføre en række kommer-5 cielt nyttige kemiske omdannelser på en meget selektiv måde ved eller nær stuetemperatur og atmosfæretryk. Imidlertid er størsteparten af de industrielt attraktive råstoffer meget ikke-polære og derfor i det væsentlige ikke-blandbare med vand, medens mikroorganismerne selv kræver et vandigt miljø og ikke kan overleve i et organisk ikke-10 polært medium. Hidtil er dette behov for to ikke-blandbare faser blevet løst ved anvendelsen af et immobiliseret mikrobielt system, i hvilket mikroorganismen er lokaliseret i de vandfyldte porer på en porøs partikelformet bærer, og hvilket frembyder en række fordele.

Det har nu imidlertid overraskende vist sig, at oxidation af sub-15 stratet ved hjælp af visse mikroorganismer og under oxygenbegrænsende betingelser (hvilket ofte vil gælde) påvirkes af oxygenkoncentrationen i den omgivende atmosfære, som kultursystemet er udsat for, og at der, selv om en forøgelse af oxygenpatialtrykket giver en forøget omdannelse af substrat til oxideret produkt, er en grænse for denne 20 effekt, ud over hvilken forhøjet oxygenkoncentration bliver inhi-berende.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til oxidation af et i det væsentlige med vand ikke-blandbart organisk substrat, hvor en mikroorganismeart, der er i stand til at udføre den 25 ønskede omdannelse af substratet, anbringes på en porøs, vandholdig, partikelformet inert bærer, hvis porestørrelse er større end mikroorganismens middeldiameter, hvorved der dannes et immobiliseret system, i hvilket mikroorganismen har et vandigt miljø, og det immobiliserede system bringes i kontakt med substratet og en oxygenkilde, hvilken 30 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at mikroorganismen er en Pseudomonas sp., og oxygenkilden er en gasformig blanding indeholdende over 21 volumenprocent men ikke over 75 volumenprocent oxygen.

Fra Russ. Chem. Reviews 49, 737-770 (1980) er det kendt at benytte immobiliserede enzymer, der er båret på en porøs bærer, til omdannel- 2

DK 160566 B

se af organiske substrater i 2-fasesystemer. Det kan imidlertid ikke af modholdet ses, at der eksisterer et særligt oxygenkoncentrations-interval for den omgivende atmosfære, som kan anvendes til at opnå en forøget produktivitet fra en immobiliseret mikroorganisme ved en 5 oxidationsproces.

Med hensyn til valget af mikroorganisme vil dette i praksis dikteres af arten af substratet og den omdannelse, som ønskes udført. Én nyttig anvendelse for den her omhandlede fremgangsmåde er til oxidation af et aliphatisk carbonhydrid, og en mikroorganisme, der er 10 egnet til* sådanne oxidationer, er den kendte art Pseudomonas aeruginosa 473, der er i stand til at oxidere en alkan til den tilsvarende 1-alkanol og en 1-alken til den tilsvarende 1,2-epoxyalkan.

Denne organisme er først beskrevet af Thijsse og van der Linden i 1958 (Ant. v. Leeuwenhoek 24, 298 (1958)) og har nedenstående morfo-15 logiske og biokemiske karakteristika:

Cellemorfologi Mediumstave

Kolonimorfologi Off-white med en grønlig tone.

Flad, glat, hel med en svag kant, cirkulær, gennemskin-20 nelig.

°C vækst 45°C + 50° C -

Katalyse +

Oxidase, Kovacs + 25 O-F glucose Oxidativ

Gram Negativ

Pyocyanin +

Fluorescens +

Penicillin G

30 Streptomycin +

Chlorphenicol +

Tetracyclin +

Novobiocin

Polymyxin B + 35 0/129

Levan 3

DK 160566 B

Bærematerialet bør naturligvis være kemisk og biologisk inert tinder anvendelsesbetingelserne og egnede materialer omfatter uorganiske oxider såsom siliciumdioxid, aluminiumoxid, zirconoxid og magnesia og blandinger deraf. Opnåelsen af en effektiv aktivitet i de immobilise-5 rede mikrobielle celler er afhængig af, at størrelsen af porerne i bærepartiklerne er over et kritisk minimum, og som nævnt ovenfor bør dette være større end mikroorganismens middeldiameter, hvilket normalt kræver en porestørrelse på over 0,5 μια. Bærepartiklernes størrelse påvirker ofte det immobiliserede systems aktivitet, idet større 10 partikler giver en højere aktivitet. Den nøjagtige kombination af porestørrelse og partikelstørrelse, der kræves for at opnå maksimal mikrobiel biokemisk aktivitet, vil naturligvis afhænge af den pågældende mikroorganisme, bærematerialets nøjagtige kemi og morfologi og arten af substratet; for Pseudomonas aeruginosa anbragt på alumini-15 umoxid og anvendt til oxidation af methylcyclohexan har det vist sig, at de højeste aktivitetsniveauer og den længste levetid opnås, når partikelstørrelsen er mindst 1 mm, især mindst 6 mm.

Det har i mange tilfælde også vist sig, at aktiviteten og levetiden for de celler, der er anbragt på en bærer, kan forøges, når bærer-20 overfladen har et lipofilt overtræk. For siliciumdioxidbærere kan et sådant overtræk påføres ved syrebehandling efterfulgt af silylering af de derved frigjorte hydroxygrupper. Bæreren kan alternativt imprægneres med polymer såsom polystyren.

Cellernes anbringelse på bæreren kan udføres ved en række forskellige 25 teknikker, men to procedurer har vist sig at være generelt egnede.

Ved én teknik dyrkes de mikrobielle celler ved etablerede metoder i en fermenteringsbeholder til dannelse af en pasta af de ønskede celler. Bærepartiklerne underkastes reduceret tryk, cellepastaen anbringes på bæreren, medens det reducerede tryk holdes, hvorefter 30 atmosfærisk tryk genskabes for at tvinge pastaen ind i porerne. En alternativ teknik er vækst in situ, ved hvilken den partikelformede bærer suspenderes i et egnet vækstmedium, som derefter inokuleres med den ønskede organisme. Det inokulerede, bærerholdige vækstmedium inkuberes derefter under hensigtsmæssige betingelser til sikring af 35 organismens vækst, og efter en passende periode fjernes de frie 4

DK 160566 B

celler ved vask, hvorved det celleholdige immobiliserede system bliver tilbage. Ved en variation af denne teknik kan frisk vækstmedium, som indeholder en assimilerbar kilde til carbon og nitrogen, kontinuerligt ledes ind i reaktionsbeholderen under immobiliseringen 5 for at give egnede betingelser for fastgørelsen.

Udbyttet af det ønskede produkt kan ofte forøges ved til den organiske fase at sætte en forbindelse, der reducerer mikroorganismens evne til at fortsætte omdannelsen ud over det ønskede stadium. Således kan oxidation af et carbonhydrid til en alkanol forbedres ved 10 tilsætning af en anden alkohol til den organiske fase; uden at være begrænset til nogen særlig mekanisme formodes det, at alkoholen tjener til at mætte det aktive sted i mikroorganismens dihydrogena-seenzym og derved minimere yderligere oxidation af det ønskede alko-holprodukt. Egnede alkoholer til denne inhiberingsfunktion omfatter 15 nonanol og methanol, selv om koncentrationen i det sidste tilfælde ikke bør være så høj, at det fører til en inhibering af mikroorganismen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

20 EKSEMPEL 1

Pseudomonas aeruginosa 473 dyrkes i en Biotec fermenteringsbeholder under anvendelse af enten en chargevis kultur i ASM-medium med hep-tandamp som carbonkilde eller en kontinuerlig kultur i AM-2-medium med 0,33 g/1 polypropylenglycol 2000 som antiskummiddel, heptandamp 25 som carbonkilde og en omrøringshastighed på 600 rpm. Organismen immobiliseres derefter på en partikelformet bærer ved yderligere vækst i nærværelse af bæreren under anvendelse af følgende fremgangsmåde

Mediernes sammensætning er som følger:

DK 160566B

5

Sammensætning af medium ASM

g/liter NH4CI 0,535 KH2P04 0,531 5 Na2HP04 0,866 K2S04 0,174

MgS04.7H20 0,037

CaCl2.2H20 0,00735

FeS04.7H20 0,006 g 10 sammen med 1 ml/1 af følgende mineralsaltopløsning g/5 liter

ZnS04.7H20 1,44

MnS04.4H20 1,12 H3BO3 0,309 15 CuS04.5H20 0,624

Na2Mo04.2H20 0,242

CoCl2.6H20 0,238

Kl 0,415 IM H2S04 5 ml 20 Sammensætning af medium AM-2 g/liter (NH4)2S04 1,45 H3P04 (90X) 1,09

MgS04.7H20 0,099 25 CaCl2.2H20 0,015

FeS04.7H20 0,02 sammen med 2 ml/1 af den ovenfor definerede mineralsaltopløsning.

50 ml ASM-medium indeholdende 20 g af de valgte bærerpartikler i en centralrørskolbe inokuleres med Pseudomonas aeruginosa og inkuberes i 30 3 dage ved 30eC i en Grant-ryster med 100 slag pr. minut. Efter denne vækstperiode vaskes bæreren med 0,1M phosphatpuffer (pH-værdi 6,8), 6

DK 160566 B

bærerpartikleme fjernes, og overskydende ydre vand fjernes ved tørring på silkepapir.

Den tilstedeværende cellemængde i det resulterende immobiliserede cellesystem bestemmes ved opvarmning af 1 g celleholdige partikler 5 til 80°C i 5 ml 2%'s natriumcarbonat i 0,1N vandigt natriumhydroxid i 2 1/2 time efterfulgt af proteinanalyse ved fremgangsmåden ifølge Folin-Ciocalteu (Methods in Enzymology Ed. Colowick & Kaplan, bind III, side 447, Acad. Press Inc. N.Y. (1957)).

10 g af det således vundne immobiliserede cellesystem sættes til 15 10 ml methylcyclohexan mættet med vand i en 250 ml's konisk kolbe forsynet med prop. Dette rystes på en orbitalryster ved 105 rpm og 30eC, 0,1 ml's prøver udtages med faste intervaller, og efter tilsætning af 0,5 ml af en 0,3 g/1 opløsning af 1-(1-hydroxy)ethylcyclohexan i isooctan som intern standard analyseres ved glc under anvendelse af 15 en "Chromosorb" WHP-glaskolonne på 6 fod (182 cm) ved 75eC med nitrogen som bærergas ved 30 ml/minut og en flammeioniseringsdetektor.

De med et udvalg af bærermaterialer vundne resultater er anført i nedenstående tabel I. Tallene 1-10 i første kolonne betegner: 1 - bærermateriale, 2 - kemisk sammensætning, 3 - porestørrelse (/tm), 20 4 - tilsyneladende porøsitet (%), 5 — overfladeareal (m^/g), 6 — slidresistens (%), 7 * immobiliseringstid (dage), 8 = cellemængde (xl0'3), 9 - dannelse af produkt (xl0‘^) og 10 - biokatalysatorlevetid (timer).

Tabel I

25 1 SA 5202 SA 5205 SA 5221 SA 5239 SS 5231 2 99,6% A1203 86% Al203 89% A1203 86% Al203 95% Si02 3 0,5-4 50-300 10-30 1-2/50-200 1-2/15-100 4 54-60 49-55 47-52 53-65 34-38 30 5 0,7-1,3 0,005-0,05 0,02-0,07 0,15-0,45 0,1-0,4 6 68 0 3 2 8

DK 160566 B

7

Tabel I fortsat 76 36 36366 8 0,4 0,4 0,8 0,54 1 0,6 1 0,13 5 9 4 7 1 3,4 1,8 3,0 1,0 2,0 10 110 80 120 100 120 50 90 20

Alle bærermaterialer er leveret fra Norton Company og er identificeret med det referencenummer, som er tildelt af Norton.

10 Slidresistens bestemmes som vægtprocentdelstabet efter 6 dage i Grant-ryster ved 180 slag pr. minut i vand.

Cellemængden udtrykkes som g tørre celler pr. g bærer.

Produktdannelsen udtrykkes som g methylcyclohexanol dannet pr. g tørre celler pr. time, integreret over en periode på 50 timer.

15 EKSEMPEL 2 Påvirkningen af bærermaterialets partikelstørrelse bedømmes ved at udvælge snævert definerede partikelstørrelsesområder og bestemme cellemængden og den opnåede aktivitet under anvendelse af procedurer som beskrevet i eksempel 1. De opnåede resultater er anført i neden-20 stående tabel II.

Tabel II

Bærer Partikelstør- Mængde, g Aktivitet, g Levetid, relse, mm tørre celler produkter/ timer pr. g bærer timer/g tørre 25 celler SA 5221 6-7 1,2x1ο'3 6x10'3 >140 SA 5221 1-2 0,65x10'3 2,2x10'3 100 SA 5221 0,6-1 l,5xl0'3 4,2x10'3 >140

Tabel II fortsat 8

DK 160566 B

SA 5221 0,3-0,6 l.lxlO*3 3,6xl0*3 100 SA 5205 7-8 0,28xl0*3 4x10*3 80 SA 5205 1-2 0,39x10*3 2xl0-3 50 5 SA 5205 0,6-1 0,5xl0-3 2,4xl0-3 100 SA 5205 0,3-0,6 Ο,ΙχΙΟ*3 10x10" 130 EKSEMPEL 3

Indvirkningen af den procedure, der anvendes til at belægge bærer-10 partiklerne med mikroorganismecellerne vurderes ved at sammenligne in situ-vækstproceduren som beskrevet i eksempel 1 med følgende alternativer. I alle tilfælde er bærermaterialet Norton alumina SA 5221 med en partikelstørrelse på 6-7 mm, og mikroorganismen er Pseudomonas aeruginosa.

15 a) Adsorption fra koncentreret cellesuspension. 50 ml 0,1M phos-phatpuffer (pH-værdi 6,8) indeholdende ca. 10 g tørre celler/1 rystes sammen med 20 g bærerperler i 2-3 dage i en Grant-ryster med 100 slag pr. minut.

b) Vakuumimmobilisering. 30-40 g bærerperler evakueres i en 300 20 ml's membranforseglet Buchner-kolbe til ca. 0,7 kPa. 0,2 ml pr. g bærer af en koncentreret suspension af mikroorganisme-celler i 0,1M phosphatpuffer (pH-værdi 6,8) indføres derefter med en kanyle gennem membranen. Efter grundig rystning af blandingen udløses vakuumet pludseligt.

25 I hvert tilfælde aftørres de belagte bærerpartikler overfladisk med silkepapir og vurderes for deres evne til at oxidere methylcyclohexan til den tilsvarende alkohol som beskrevet i eksempel 1.

Resultaterne er anført i nedenstående tabel III.

9

Tabel III

DK 160566 B

Immobiliseringsmetode Vækst Adsorption fra Vakuumad- in situ koncentreret sorption suspension 5 _

Produktdannelses- hastighed (μιηοΐ/time/g 4,4 17,5 13,2 tørre celler) 10 EKSEMPEL 4

Anvendeligheden af det immobiliserede cellesystem til omdannelse af forskellige med vand ikke-blandbare organiske substrater bedømmes ved at erstatte methylcyclohexanet fra eksempel 1 med n-heptan eller 1-octen. Den anvendte mikroorganisme er Pseudomonas aeruginosa 473.

15 For nogle af disse systemer udføres sammenligningsforsøg under anvendelse af frie celler som 2 ml cellesuspension i phosphatpuffer (0,1M, pH-værdi 6,8) i 5 ml af den pågældende organiske fase. Der udføres også nogle forsøg, i hvilke det organiske substrat anvendes som en opløsning i isooctan. I disse tilfælde, hvor der anvendes et 20 immobiliseret system, er bærermaterialet Norton alumina SA 5221 belagt ved vakuumimmobilisering, så at der fås en cellemængde på ca.

7x10*3 g tørre celler pr. g bærer. Forsøgsbetingelserne og procedurerne er ellers som beskrevet i eksempel 1.

De vundne resultater er anført i nedenstående tabel IV.

Tabel IV

10

DK 160566 B

Substrat(er)* Produkt Reakti- c) Katalysa- onssy- torlevetid, stem timer 5 _ heptan 100% 1-heptanol a) 16 >200 1-octen 100% 1,2-epoxyoctan a) 22 300 1-octen 20% 1,2-epoxyoctan a) 29 300 10 1-octen 100% 1,2-epoxyoctan b) 0 <5 1-octen 20% 1,2-epoxyoctan b) 24 300 * - substrat anvendt enten rent (100%) eller i isooctanopløsning, idet procentangivelser - volumenprocent i isooctan 15 a) - immobiliseret b) - frit c) - produktdannelseshastighed (μπιοΐ/time/g tørre celler, integreret over første 50 timer) EKSEMPEL 5 20 Ved oxidationen af et aliphatisk carbonhydrid til den tilsvarende alkohol bestemmes indflydelsen af en anden alkohol i den organiske fase på produktiviteten ved to forsøg. Pseudomonas aeruginosa va-kuumimmobiliseres på Norton SA 5221 aluminiumoxid (partikelstørrelse 1-2 mm) efter en procedure, der ligner den, der er beskrevet i ek-25 sempel 3 b), hvorved der fås et immobiliseret system med en cellemængde på 0,86x10*3 g tørre celler/g bærer. Dette bedømmes derefter under anvendelse af den generelle procedure, der er beskrevet i eksempel 1 og under anvendelse af heptan indeholdende forskellige mængder 1-nonalol som substrat. Et lignende forsøg udføres også under 30 anvendelse af methylcyclohexan indeholdende forskellige mængder methanol som substrat. Resultaterne af disse to forsøg er vist i henholdsvis tabel V og VI.

Tabel V

DK 160566 B

11

Nonalolkoncentration Initial produktdannelses- Levetid hastighed (g/time/g terre celler)* (timer) 5 0,1X 0,4x10"3 50 0,5¾ 1,4x10-3 >150 1,0X 3,7xl0-3 >150 * * integreret over de første 50 timer

Tabel VI

10 Tilsat methanol (X) Produktdannelse Levetid (g/time/g tørre celler) (timer) 0 3xl0“3 100 0,05 5,8x10-3 90 15 0,1 5,8xl0-3 90 0,2 4,0xl0-3 90 0,23 2,6xl0-3 60 0,5 l,9xl0-3 20 1 l,05xl0-3 20 20 _ EKSEMPEL 6

Indvirkning af oxygenkoncentrationen af den gas, som det immobili-serede system bringes i kontakt med, på systemets produktivitet vurderes under anvendelse af Pseudomonas aeruginosa vakuumimmobiliseret 25 på Norton SA 5221 aluminiumoxid (cellemængde 3,2xl0"3 g tørre cel-ler/g bærer). Dette system vurderes for evnen til at oxidere methyl-cyclohexan til den tilsvarende alkohol under anvendelse af en procedure, der ligner den, der er beskrevet i eksempel 1, men under anvendelse af forskellige oxygenniveauer; resultaterne er anført i 30 tabel VII.

Tabel VII

12

DK 160566 B

Oxygenkoncentration, Initial produktdannelses- Levetid X hastighed (g/time/g (timer) tørre celler)1 5 _ 21 1,8x10"3 120 50 3,0xl0"3 120 75 4,6x1013 120 100 2,7x1013 120 10 1 - integreret over de første 50 timer EKSEMPEL 7

Virkningen af et lipofilt barerovertræk vurderes som følger.

a) Syrebehandling af siliciumdioxid 100 g Norton siliciumdioxid (SS 5131) med en perlestørrelse på 15 7-8 mm opvarmes under tilbagesvaling i 150 ml 0,6M svovlsyre i 24 timer. Efter forøgelse af surheden til 1,2M opvarmes blandingen til kogning under tilbagesvaling i yderligere 3 dage.

Efter afkøling vaskes perlerne med ledningsvand i 48 timer og tørres derefter ved 100°C i 17 timer. Denne procedure giver et 20 overfladehydroxyleret siliciumdioxid med ca. 3 hydroxygrupper pr. nm^ (bestemt ved differentiel termisk analyse) og et overfladeareal på 0,7 m^/g (bestemt ved BET).

b) Sily lering af rehydratiseret siliciumdioxid 30 g rehydratiseret siliciumdioxid opvarmes til kogning under 25 tilbagesvaling med 3,55x10mol af en forbindelse med den almene formel R1 R2-Si-OC2H5 3 13

DK 160566 B

i 30 ml toluen i 19 timer under en nitrogenatmosfære. Derefter vaskes bæreren med toluen i et Soxhlet-apparat i 24 timer.

Efter tørring ved 100°C i 24 timer bestemmes carbonindholdet i bæreren ved mikroelementaranalyse.

5 c) Polystyren-belægning af bærer 40 g Norton siliciumdioxid SS 5131 opvarmes til kogning under tilbagesvaling i 1 time i 100 ml toluen indeholdende 4 g (ekspanderbar) polystyren. Efter afkøling og overfladisk tørring med silkepapir tørres dette materiale ved 100eC i 24 10 timer. Dette materiales carbonindhold (bestemt ved mikroele mentaranalyse) svarer til 16 molekyler styren/nm^. Et identisk forsøg med 16 g ekspanderbart polystyren i 100 ml toluen giver en bærer, der indeholder 280 molekyler styren/nm^.

d) De modificerede bærerpartikler, der er fremstillet ved de 15 ovenstående fremgangsmåder, belægges derefter med Pseudomonas aeruginosa under anvendelse af vakuumimmobiliseringsteknikken, der er beskrevet i eksempel 3b), og de resulterende immobil!-serede systemer vurderes for deres evne til at oxidere met-hylcyclohexan til den tilsvarende alkohol som beskrevet i ek-20 sempel 1. Resultaterne er anført i nedenstående tabel VIII.

Claims

10 OC2H5 (CH2)7CH3 OC2H5 4,3 »120 1,0x10"3 OC2H5 (CH2)11CH3 0C2H5 8,5 »120 l,8xl0*3 OC2H5 (CH2)17CH3 OC2H5 6,5 »120 2,2x10*3 phenyl -CH-CH2 phenyl 2,2 >140 l,9xl0'3 polystyren- 15 overtrukket 4,8 »140 1,8x10-3 polystyren- overtrukket 7,5 »140 1,1x10*3 A - Produktdannelseshastighed (pmol/time/g tørre celler). 20 B - Cellemængde, g tørre celler/g bærer.

1. Fremgangsmåde til mikrobiel oxidation af et i det væsentlige med vand ikke-blandbart organisk substrat, hvor en mikroorganismeart, der er i stand til at udføre den ønskede oxidation af substratet, er 25 anbragt på en porøs, vandholdig, partikelformet inert bærer, hvis porestørrelse er større end mikroorganismens middeldiameter, hvorved dannes et immobiliseret system, i hvilket mikroorganismen har et vandigt miljø, og det immobiliserede system bringes i kontakt med substratet og en oxygenkilde, 30 kendetegnet ved, at mikroorganismen er en Pseudomonas sp., og oxygenkilden er en gasformig blanding indeholdende over 21 volumenprocent men ikke over 75 volumenprocent oxygen. DK 160566 B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at substratet er et aliphatisk carbon-hydridsubstrat.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 5. endetegnet ved, at oxidation længere end til den tilsvarende alkanol inhiberes ved tilsætning af en anden alkohol.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Pseudomonas aeruginosa.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den inerte bærers partikelstørrelse er mindst 1 mm.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den inerte bærer er et uorganisk oxid.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den inerte bærers porestørrelse er større end 0,5 μπι.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at bæreroverfladen er udstyret med et 20 lipofilt overtræk.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at anbringelsen af mikroorganismerne på bæreren udføres ved at underkaste bærerpartiklerne reduceret tryk, påføre en pasta af mikroorganismerne på bæreren, medens det reduce- 25 rede tryk opretholdes, og derefter genskabe atmosfæretryk.