DK154266B

DK154266B - Fremgangsmaade til fremstilling af et haem-koncentrat fra en blanding af haem og blodsubstans opnaaet ved spaltning af haemoglobin

Info

Publication number: DK154266B
Application number: DK530181AA
Authority: DK
Inventors: Paul Goeran Sigvard Lindroos
Original assignee: Lindroos Paul Goran Sigvard
Priority date: 1980-04-03
Filing date: 1981-11-30
Publication date: 1988-10-31
Also published as: IE51040B1; IN152639B; EP0056025A1; DK530181A; SE8002591L; DK154266C; US4431581A; WO1981002834A1; EP0056025B1; JPS57500431A; SU1660573A3; IE810644L; SE440596B; JPH0134204B2

Description

i

DK 154266 B

Slagteblod indeholder værdifulde komponenter, navnlig proteiner med høj næringsværdi og funktionelle egenskaber, som gør dem værdifulde som textureringsmiddel for næringsmidler, samt hæm, der er et efterspurgt jernholdigt 5 præparat.

Hæmoglobinet, der indeholder hovedparten af proteinet i blodet, har en jernsmag på grund af indholdet af hæm.

Det har derfor betydning af udvikle en metode til spaltning af hæmoglobinet i jernfrit globin og et hæm-koncen-10 trat på en sådan måde, at de funktionelle egenskaber ved proteinet og hæm bevares og derved giver disse produkter høj værdi.

Som bekendt kan proteiner let denatureres og derved miste deres funktionelle egenskaber, f.eks. når de be-15 handles ved en høj pH-værdi (over 9 til 10). Denature ringen kan modarbejdes ved at operere ved lav temperatur, såsom under 0°C.

For at hæm kan være velegnet som pharmaceutisk middel, dvs. for at jernet kan foreligge i en let absorberbar 20 form, må hæm-stoffet foreligge i nativ form. I hæmoglo binet findes hæm i nativ form, hvorfra jernet som bekendt er let absorberbart.

Fra konventionelle jernpræparater, såsom jernsulfat, absorberes kun en brøkdel af jernet, fordi visse stoffer 25 i føden (f.eks. phytater) hindrer absorptionen. Denne ulempe er ikke til stede for det i hæm indeholdte jern.

Hæm har en udtalt tilbøjelighed til at polymerisere og til at danne tungt opløselige aggregater, hvorfra jern ikke kan absorberes. Kendte metoder til spaltning 30 af hæmoglobin i hæm og globin og til fraspaltning af hæm ved ekstraktion med acetone eller methylethylketon 2

DK 154266 B

resulterer i et polymeriseret hæm.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af et hæm-koncentrat fra en blanding af hæm og blodsubstans, dannet ved spaltning af hæmoglobin.

5 Hæm, jern-hæm, er sammensat af jern og protoporphyrin (se f.eks. Textbook of Biochemistry, West & Todd, MacMillan Co., 1961, p. 533) og udgør den prostetiske gruppe i hæmoglobin og beløber sig til 3,8 % efter vægt, baseret på hæmoglobin.

10 Som udgangsmateriale anvendes fortrinsvis et hæm-produkt, der er dannet ved spaltning af hæmoglobin til hæm og globin.

Spaltningen kan udføres på forskellige måder, f.eks. ved behandling af hæmoglobin i surt eller alkalisk miljø.

15 Råmaterialet kan f.eks. bestå af helblod, røde blodlege mer eller hæmoglobin i et andet miljø.

Et særligt egnet udgangsmateriale er det hæm-produkt, som fås ved fremgangsmåden beskrevet i svensk patentskrift nr. 389596 og i DE offentliggørelsesskrift nr. 2656157.

20 Ifølge denne metode spaltes hæmoglobin i en vandig ethanol- opløsning med et ethanolindhold på mindst 40 % efter rumfang og ved en pH-værdi på mindre end 4,5. Det derved dannede bundfald af hæm-produkt fraskilles. Den resterende globinopløsning er praktisk taget fri for hæm.

25 Det dannede kendte produkt indeholder ca. 10 vægt-% hæm, medens resten består af andre blodsubstanser, formentlig dog hovedsagelig af proteiner. Hæm-produktet indeholder efter al sandsynlighed yderligere blod-sub- 3

DK 154266 B

stanser, såsom lipoproteiner, lipider, phosphatidyl-for-bindelser og cholesterol.

Ifølge den omhandlede fremgangsmåde fås et hæm-koncentrat med et hæm-indhold på ca. 40 vægt-%. Sammensætningen er ikke kendt. Dette hæm-koncentrat er beregnet til 5 anvendelse som pharmaceutisk middel over for anæmi og som et jernholdigt kosttilskud.

Blodproteinet, hovedsageligt globin, der udvindes samtidigt, er beregnet til fødevarer og foder.

Metoden er teknisk og økonomisk velegnet i industriel 10 skala.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den nævnte hæm-blodsubstansblanding ekstraheres med en alkohol med 1-4 C-atomer eller en blanding af alkoholer, fortrinsvis ethanol i en koncentration på over 15 40 rumfangs-ίο, fortrinsvis 60-80 rumfangs-%, idet eks traktionen sker enten a) ved en pH-værdi på mindst 8,0 til 10,7, fortrinsvis 9,0 til 10,5, eller b) i nærværelse af et middel, som fremskynder separa- 20 tionen af hæm-koncentrat og blodsubstans, i form af imidazol eller et imidazolderivat, ved pH 6,0-8,5, fortrinsvis 6,5-8,5, og idet der eventuelt tilsættes midler til stabilisering af udfældning af proteiner f.eks. natrium-, kalium-25 eller ammonium-, -chlorid, -sulfat, -phosphat, -citrat eller -tartrat, ved en temperatur mellem +25 °C og -20 °C, fortrinsvis mellem -5 og -20 °C, hvorefter den uop-løste, faste blodsubstans fraskilles, og hæm-koncentratet udvindes fra den resterende opløsning.

DK 154266 B

il

Fremgangsmåden omfatter således at ovennævnte blanding af hæm og blodsubstans ekstraheres med lavere alkohol eller en blanding af lavere alkoholer i alkalisk miljø eller ved tilsætning af imidazol eller derivat deraf 5 i neutralt miljø. Adskillelsen kan ikke gennemføres i surt miljø.

På denne måde fås et hæm-produkt, som ikke er et rent hæm-pigment, men en blanding af hæm og andet blodsubstans. Dette hæm-produkt, her betegnet hæm-koncentratet, har 10 særlige egenskaber: Den foreligger i nativ form, opløseligheden i vand ved pH 6-7 er god, og jernabsorptionen hos mennesker er god. Tidligere kendte hæm-pigmenter har ikke disse egenskaber. Et oversigtsskema over den omhandlede fremgangsmåde er angivet i fig. 1.

15 Det er tidligere kendt at spalte hæmoglobin til hæm og globin i et alkalisk miljø, samtidig med at man ekstra-herer hæm-produktet, f.eks. i acetone eller methylethyl-keton for på denne måde at skille det fra globinet.

Denne ekstraktion udføres i 100 % acetone til dannelse 20 af et rent hæm uden indhold af andre blodsubstanser.

Dette hæm har dog vist sig at polymerisere og har en ringe opløselighed (se fig. 2).

Ued den omhandlede nye fremgangsmåde skilles hæm-koncentratet fra den øvrige blodsubstans, dvs. hovedsageligt 25 protein, således at hæm-koncentratet omdannes til den opløste form, medens de resterende substanser er til stede i uopløst form.

Egnede ekstraktionsmidler er ethanol, methanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, ethylenglycol og glyce-30 rol. Ethanol foretrækkes, fordi det er ugiftigt.

Indholdet af ekstraktionsmiddel skal være over 40 vægt-%,

DK 154266 B

5 fortrinsvis over 60 vægt-%.

pH-værdien, i nærværelse af imidazol eller et derivat deraf skal være mindst 6,0, fortrinsvis 6,5 til 8,5, ellers bør pH-værdien være mindst 8,0, fortrinsvis 9,0 5 til 10,5.

For at hindre denaturering af proteinet holdes temperaturen lavt, fortrinsvis under -5°C.

Temperaturen påvirker ikke reaktionen, kun graden af denaturering af proteinet.

10 For at forhindre, at blodsubstansen i hæm-blodsubstans- blandingen opløses samtidigt med hæm-koncentratet i ekstraktionsopløsningen, kan blodsubstansen, hovedsageligt globin, udfældes før ekstraktionen. Udfældningen kan gennemføres ved f.eks. at indstille pH-værdien af 15 blandingen til 7 til 8, det isoelektriske pH-område for globulin, og/eller ved tilsætning af forskellige salte.

Egnede salte er f.eks. Na-, K-, NH^-, -chlorid, -sulphat, -citrat, -phosphat, -tartrat.

Salttilsætningen har den sædvanlige udsaltningseffekt 20 på proteinerne, men har ingen speciel indvirkning på opløsningen af hæm-koncentratet.

Salttilsætningen er især afgørende, når ekstraktionen udføres på en hæm-blanding, hvorfra globin-delen ikke tidligere er fraskilt.

25 Endvidere kan der tilsættes andre midler, der fremmer separationen, såsom en aminosyre, f.eks. glycin, glutamin eller lysin.

Glycin har den effekt, at den forhøjer udbyttet af hæm-

DK 1S4266B

έ koncentrat indtil ca. 99%, se eksempel 8, når andre betingelser samtidig er de ideelle. Uden tilsætning af glycin bliver udbyttet på 93 til 95%.

Uopløst stof fraskilles, f.eks. ved centrifugering el-5 ler filtrering.

Hæm-koncentratet udfældes af den resterende opløsning, dvs. den ovenstående væske eller filtratet, ved at sænke pH-værdien til under 6,5, fortrinsvis 4,0 til 6,0. Derved udfældes et sort fnugagtigt bundfald.

10 Udfældningen bliver mere kvantitativ, når pH-værdien er mindre end 5.

Udfældningen er temmelig uafhængig af temperaturen, men for at opnå en mere kvantitativ udfældning og for at give koncentratet en skånsom behandling udføres ud-15 fældningen fortrinsvis ved en temperatur under 0 °C.

pH-værdien sænkes, f.eks. med 0,1 M saltsyre. Bundfaldet fraskilles, f.eks. ved centrifugering eller filtrering, og vaskes frit for ethanol, salt og imidazol med isvand.

Bundfaldet opløses i vand ved at hæve pH-værdien, f.eks.

20 til 8, og opløsningen kan fryses og frysetørres.

Udbyttet af hæm fra ekstraktionsopløsningerne udgør ca. 90 %.

Da adskillelsen af hæm-koncentratet kan udføres ved en pH-værdi under 10,5 og ved en temperatur under 0 °C, 25 fås proteinet i ikke-denatureret eller kun i delvist denatureret form, hvorved dets funktionelle egenskaber er bevaret. Dette har betydning til fødevarer, hvor man tilstræber proteiner med textureringsegenskaber.

Proteinet vil blive særligt tilfredsstillende, når det

DK 154266 B

7 udvindes ved en pH-værdi mindre end ca. 9.

Det ved den omhandlede fremgangsmåde dannede hæm-kon-centrat har sædvanligvis et hæm-indhold på ca. 35-40 %; i særlige tilfælde kan fås produkter med et lavere 5 (15 %) og også et højere (op til 55 %) hæm-indhold.

Hæm-koncentratet er formentlig en hidtil ukendt kemisk forbindelse bestående af hæm og blod-substans. Sammensætningen af den del, der her omtales som "blodsubstans", er ikke kendt. Hæm-koncentratet kan ikke adskilles fysisk 10 i dets komponenter, f.eks. ved gel-filtrering. Forbindel sen er øjensynligt dannet under de betingelser, der forekommer når hæm-stoffet spaltes fra hæmoglobinet.

I en vandig ethanolopløsning med et ethano lindhold på mere end 40 rumfangsprocent og pH-værdier højere end 15 6,0 frigøres forbindelsen fra de andre blodsubstanser.

Da opløseligheden er god, skilles den let fra andre blodsubstanser, som ikke er opløselige under disse betingelser.

Tilstedeværelsen af imidazol eller et derivat deraf, 20 letter separeringen af hæm-koncentratet fra vedhængende blodsubstans, således at der kan opnås en kvantitativ adskillelse allerede ved en pH-værdi på 7.

Hæm-koncentratets gode opløselighed tyder på, at hæmet findes i nativ form, ikke-polymeriseret. Derfor har 25 jernet mulighed for at absorberes fra hæm-koncentratet, og det kan anvendes som et jernholdigt kosttilskud og som et lægemiddel over for anæmi.

Opløseliqheden af hæm-koncentratet

Fig. 2 illustrerer opløseligheden af hæm-koncentratet 30 ved forskellige pH-værdier. Hæm-koncentratet 1 er typisk

DK 154266 B

8 for det produkt, der kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Når man behandler koncentratet med et proteolytisk enzym, f.eks. med trypsin, spaltes koncentratet i mindre 5 enheder, og opløseligheden forbedres noget; hæm-koncentra- tet 2 anskueliggør dette.

Til sammenligning er optegnet opløselighedskurven for hæmin (fremstillet af Nishida, Porphyrins and Metallopor-phyrins, Kevin M. Smith, 1975, side 809).

10 Som nævnt ovenfor skal hæm-præparatet være opløseligt ved en pH-værdi lavere end eller lig med den pH-værdi, 7,5 til 8,2, der forekommer i tarmene, hvor absorptionen af jern finder sted.

Absorptionen af .jern fra hæm-koncentratet 15 Absorptionen af jern blev bestemt ved kliniske eksperimen ter .

Ti forsøgspersoner fik serveret en vandig opløsning af hæm-koncentratet, mærket med isotopen ^Fe. Til sam- 59 menligning anvendtes blod mærket med isotopen Fe.

20 Den absorberede jernmængde blev bestemt ved radioaktiv måling. Resultaterne er anført i tabel I.

Resultaterne viser, at absorptionen af jern fra hæm-koncentratet var tilnærmelsesvis af samme størrelsesorden, ofte endog noget højere, end fra blod. Dette kan fortol-25 kes på den måde, at hæm-koncentratet foreligger i nativ form, hvilket er forudsætningen for en absorption af jern.

9 DK 154266 B

-p æ

P

-P

cn c E ro w o c

DO C\IONr'NCO'sl-'SfCOl/NCNl<l· Η 1Λ O

ΝΟΙΛ-Ν(·<ΝΙΛ<ίΝΟΐΓ\ΟΟΐΛ ιΛΟ O' II oooooaaooa aa o E a

-P

ω

Cj

Q) ΟΟΗΗΓ^ίΑΙΛΓ-'-ίΜνΟίΛ ΙΛΙΛ LA

_Q “O Γ'^’νΓ'νΓΓΝίΙΑνΓνΟΓΑίΑΓΑ <t O ΓΆ f-l O ·ν^τν»\·ν»ν*ν·-ν·ν+ν *<· oaaaaooaaa a o a a < -Ρ ro ρ -p <t

C rAf^vOVOCOr^lAOsrACO r-HO

^ *\ *% -O ^ £ ΙΝΓ^·α3ΐΑνΟΟΟ(Λθνοα om

Dom i—i i—i >—i >—i m p

-p c I

c o E

® £ Jj o-

0 Q_ ιΛ(ΛίΗΓΛΟιΛΙ^<Τ>Ηνθ O O

Op Λ Λ ° °"5 ΙΛΟΟΟΟιΛΓ'~ΟΟΙ'ίΝΝΟΜΝΟ ON h

•f a° ή MM

g < CO

a jr ro

1-1 P

_i u CO c < p i i- ro 5 o

u- M

rø NffltMNMVOOvWINO

O "U SS -r EP

^ ^aO Mi—ti—li—1'—IMi—li—li—I '—I

1 tn

° PM

M (U cn

"Ρ Ό O

P- -o P .. Ό ° " O O UN On ON CO On a NO NO O KN o ro i: 8) -J* LrNNO-iriANocDr~cooNr~ οό

^ > '-S PC

ro ro

Q.-P

cn c

CD C

CD O

XJ ^ CNlON<riAOMI''NO-d'NO P

•ME NOI^.nOnOI^COOOCOCOI'- O tP

.S U ,—|i—|i—|rHi—IM'—IMMM P CD

s? cna E O- ρ m— ° “

η ρ Ν0ΙΛΙ'~θν0ΙΛ<Τ<1·Ν0Ο "OP

MaCO Γ\ΙΙΛΙΛΙΛΓΛΓΛ£ΜΙΛ(ΝΙΛ ON CD

< w C JO

æ ρ

.. e o -P

m cn ro a pop ρ ro ro ro o æ ρ a.

° > <d -p æ

" c M J3 Μ P

J) 3 (D p ro Q.

clj: a ·· o e c -ρ \ ό s: cn ρ p ?, E CpEtpti-EEEEEE MLJ JDO0

lir Jc s: ui < c -M

DK 154266 B

ία

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler.

EKSEMPEL 1

En blanding 4 ml 96 rumfang-Si ethanol og 0,8 ml 1 M 5 HC1 ved en temperatur på -8 °C tildryppedes under om røring og afkøling til 2,2 g af en blanding af blodceller ued en temperatur på -5 °C. Efter tilsætningen var pH-værdien på 3,1, og temperaturen var -5 °C. 3 ml isvand og 1,8 ml 0,5 M NaOH i 70 rumfang-?£ ethanol til-10 sattes under omrøring og afkøling; temperaturen af blandingen uar -5 °C, og pH-uærdien var 7,5. Efter 5 minutter tilsattes 10 ml 96 rumfang-Si ethanol, 10 ml 70 rumfang-Si ethanol, 1 ml 1 M glycin i en vandig opløsning og 2,2 ml 0,5 M NaOH, medens blandingen hold-15 tes under omrøring og afkøling. Blandingen indeholdt nu 67 rumfang-Si ethanol, pH-værdien var 10,3, og temperaturen -5 °C. Blandingen centrifugeredes ved 3000 x g i 5 minutter, hvorved 38 ml af en rød supernatant og en brunrød pasta fremkom. Supernatanten inde-20 holdt 0,18 mg hæm/ml (61,5 Si af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet ) . Pastaen blev blandet i 10 ml 70 rum-fang-Si ethanol ved en temperatur på -5 °C, pH-vær-dien blev indstillet på 10,3, og blandingen centrifugeredes som ovenfor anført. Supernatanten inde-25 holdt 0,13 mg hæm/ml (11,7 Si af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet). Pastaen blev behandlet for tredje gang på samme måde som ovenfor angivet, hvorved der fremkom 0,06 mg hæm/ml (5,4¾ af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet). Det totale udbytte af hæm-koncen-30 tratet var 78,6 %. Pastaen, der hovedsagelig består af globin, var brun og vejede i tør tilstand 0,27 g (protein-udbytte 79,5 Si).

Ovennævnte blanding af blodceller kan fås på følgende måde:

DK 154266 B

11

Slagteblod med natriumcitrat som antikoagulant blev separeret ved centrifugering, hvorved der fremkom plasma og en pasta af røde blodlegemer. Til denne pasta af blodlegemer sattes natriumchlorid og ethanol, så-5 ledes at 2,2 g af blandingen indeholdt 0,34 g protein, 0,16 g natriumchlorid, 0,26 g 100¾ ethanol og 1,44 g vand samt opløselige stoffer fra blodet. Proteinet, hovedsageligt hæmoglobin, blev bestemt ved udfældning med ethanol. 2,2 g af blandingen af blodceller 10 indeholdt 11,1 mg hæmin, bestemt ved pyridin-metoden.

EKSEMPEL 2 På samme måde som angivet i eksempel 1 blev pH-værdien sænket til 3,1 og derefter indstillet til 7,5. Blandingen ekstraheredes som angivet i eksempel 1 med den 15 tilføjelse, at der tilsattes 1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-Λ ethanol. pH-værdien indstilledes på 8,4. Supernat an terne indeholdt henholdsvis 79¾, 12¾ og 4¾ af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentratet var 95 %. Pastaen var lysebrun og 20 repræsenterede 85 ?o af proteinindholdet af udgangsmaterialet .

EKSEMPEL 3

En blanding af 2 ml vand og 0,7 ml 1 M HC1 ved en temperatur på +1 °C tildryppedes under omrøring og afkøling 25 til 2,2 g af en blanding af blodceller ved en temperatur på -8 °C. Efter tilsætningen var pH-værdien 3,2 og temperaturen -5 °C. 4 ml 96 rumfang-?^ ethanol, 10 ml 70 rumfang-?i ethanol, 1 ml 1 M glycin i en vandig opløsning, 1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol og 30 1,5 ml 0,5 M NaOH i 70 rumfang-/°o ethanol tilsattes under omrøring og afkøling. Temperaturen af blandingen var -5 °C og pH-værdien 8,0, medens ethanolindholdet var 56

DK 154266 B

12 rumfang-?i. Blandingen centrifugeredes efter 5 minutter som angivet i eksempel 1 og gav en supernatant indeholdende 59¾ af hsm-indh'oldet fra udgangsmaterialet og en brun pasta. Pastaen ekstraheredes 2 gange med 5 10 ml 70 rumfang-?^ ethanol, hver gang ved en pH-vær- di på 8,0, og der fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 18¾ og 8¾ af hæm-indhaldet fra udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 85¾. Pastaen var brun og repræsenterede 72¾ af pro-10 tein-indholdet af udgangsmaterialet.

EKSEMPEL 4

En blanding af 3 ml 96 rumfang-?i ethanol og 0,35 ml 0,5 M NaOH i 70 rumfang-?^ ethanol ved en temperatur på -10 °C tildryppedes under omrøring og afkøling 15 til 2,2 g af en blanding af blodceller ved en tempe ratur på -10 °C. Efter tilsætningen var pH-værdien 10,2 og temperaturen -10 °C. En blanding af 2 ml isvand, 3 ml 50 rumfang-?o ethanol og 0,15 ml 1 M HC1 tilsattes ved en temperatur på -10 °C. Blandingens pH-20 værdi var nu 7,5 og temperaturen -10 °C. En blanding af 5 ml 96 rumfang-?o ethanol, 5 ml 70 rumfang-?i ethanol og 2 ml 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol tilsattes ved en temperatur på -10 °C. Blandingens pH-værdi var 10,3, temperaturen -10 °C og ethanolindholdet ca.

25 64 rumfang-?^. Blandingen centrifugeredes efter 5 mi nutter som angivet i eksempel 1 og gav en supernatant indeholdende 46¾ af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet og en mørkebrun pasta. Pastaen ekstraheredes 2 gange med 10 ml 65 rumfang-?o ethanol, hver gang ved en pH-vær-30 di på 10,3 og en temperatur på -10 °C og gav superna- tanter indeholdende henholdsvis 14¾ og 7¾ af hæm-ind-holdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 67 %. Pastaen var brun og repræsenterede 71 % af proteinindholdet af udgangsmaterialet.

DK 154266 B

13 EKSEMPEL 3 På samme måde som angivet i eksempel 4 hævedes pH-værdien af blandingen af blodceller til 10,2, medens temperaturen opretholdtes ved 0 °C. En blanding af 5 1,5 ml isvand, 3 ml 50 rumfang-% ethanol, 1 ml 2 M imi- dazol i 70 rumfang-% ethanol og 2,2 ml 1 M HC1 tilsattes ved en temperatur på 0 QC. Blandingens pH-værdi var 8,2 og temperaturen 0 °C. Herefter tilsattes en blanding af 5 ml 96 rumfang-% ethanol og 10 ml 10 70 rumfang-% ethanol ved en temperatur på 0 °C. Blan dingens pH-værdi var 8,2, temperaturen 0 °C og ethanol-indholdet 66 rumfang-%. Blandingen centrifugeredes efter 5 minutter som angivet i eksempel 1 til dannelse af en supernatant indeholdende 52% af hæm-indholdet af 15 udgangsmaterialet og en mørkebrun pasta. Pastaen eks- traheredes 2 gange med 10 ml 65 rumfang-% ethanol og 0,2 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol, hver gang ved en pH-værdi på 8,2 og en temperatur på 0 °C, hvorved der fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 20 28% og 12% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet.

Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 52 %. Pastaen var brun og repræsenterede 85% af proteinindholdet af udgangsmaterialet.

EKSEMPEL 6 25 En blanding af 1 ml vand og 0,8 ml 0,5 M NaOH ved en temperatur på +10 °C tildryppedes under omrøring til 2,2 g af en blanding af blodceller ved en temperatur på +10 °C. Efter tilsætningen var pH-værdien 11,0 og temperaturen +10 °C. 4 ml af en 96 rumfang-% etha-30 nol, 1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol, 1 ml 30% natriumcitrat i en vandig opløsning og 0,5 ml 1 M HC1 tilsattes. Blandingens pH-værdi var 7,5 og temperaturen +10 °C. Herefter tilsattes 3 ml 96 rumfang-%

DK 154266 B

14 ethanol og 10 ml 70 rumfang-% ethanol. Blandingens pH-v/ærdi var 7,5, temperaturen +10 °C og ethanolind-holdet ca. 64 rumfang-%. Blandingen centrifugeredes efter 5 minutter som angivet i eksempel 1 og gav en 5 supernatant indeholdende 53¾ af ham-indholdet af ud gangsmaterialet og en mørkebrun pasta. Pastaen ekstra-heredes 2 gange med 10 ml 65 rumfang-?o ethanol og 0,1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-ίά ethanol, hver gang ved en pH-værdi på 7,5 og en temperatur på +10 °C, hvor-10 ved der fremkom supernatanter indeholdende henholds vis 26¾ og 13¾ af ham-indholdet af udgangsmaterialet.

Det totale udbytte af ham-koncentratet var 92 %. Pastaen var brun og repræsenterede 74¾ af proteinindholdet af udgangsmaterialet.

15 EKSEMPEL 7

En blanding af 5,5 ml 96 rumfang-ίί ethanol og 1,0 ml 1 M HC1 ved en temperatur på -18 °C tildryppedes unde omrøring og afkøling til en blanding af 2,2 g af en blanding af blodceller, 0,1 ml 1 M glycin i en vandig op- 20 løsning, 0,1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol og 2 ml 50 rumfang-?^ ethanol ved en temperatur på -18 °C. Ef- j ter tilsætningen var pH-værdien 3,0 og temperaturen -18 °C.

3 ml 40¾ ammoniumsulfat i vandig opløsning tilsattes under omrøring og afkøling. Efter 5 minutter tilsattes 25 en blanding af 10 ml 96 rumfang-ίό ethanol, 20 ml 70 rumfang-ία' ethanol og 4 ml 0,5 ml M NaOH i 70 rumfang-ίό ethanol ved en temperatur på -18 °C under omrøring og afkøling. Efter tilsætningen var pH-værdien 7,5 og temperaturen -18 °C, medens ethanolindholdet var ca.

30 69 rumfang-ίό. Blandingen centrifugeredes som angivet i eksempel 1. Pastaen ekstraheredes 2 gange med 20 ml 70 rumfang-ίο ethanol, 0,1 ml 1 M glycin i en vandig opløsning 0,1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-ίό ethanol, hver gang ved en pH-værdi på 7,5 og en tempera- /; Ϊ i

DK 154266 B

15 tur på -18 °C. Supernatanten indeholdt henholdsvis 69%, 14?o og 5% af hæm-indholdet af udgangsmate.rialet.

Det totale udbytte af Ihæm-koncentrat var 88 %,. Pastaen var lysebrun og repræsenterede 81% af udgangsmaterialets 5 proteinindhold.

EKSEMPEL 8

En blanding af 8 ml 96 rumfang-% ethanol og 0,® ml 1 M HC1 ved en temperatur .på -5 °C tildryppedes under omrøring og afkøling til 2,2 g af en blanding af blod-10 celler ved en temperatur på -5 °C. Efter tilsætning var ipH-værdien 3,1 og temperaturen -5 °C. Der tilsat-tes 0,8 ml 0,2 M NaOH i 50 rumfang-% ethanol o;g 10 ml 50 rumfang-% ethanol, medens pH-værdien var 3,5 og temperaturen -5 °C. Blandingen centrifugeredes ved 15 9000 x g i 5 minutter, ihvorved der fremkom en igullig

supernatant og en sort pasta. Fra supernatanten blev der efter tilsætning af 8 ml ved en pH-værdi pa 7,5 udfældet et gråt protein-bundfald indeholdende 0,21 g tørstof. Den sorte ham-pasta blev blandet med e:n 20 blanding af 30 ml 70 rumfang-% ethanol, 0,5 ml 1 M

glycin i en vandig opløsning, 0,5 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol og 2,5 ml 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol. pH-værdien var 8,6, temperaturen -5 °C og ethanolindholdet 70 rumfang-%. Blandingen blev cen-25 trifugeret ved 3000 x g i 5 minutter, og der fremkom en supernatant indeholdende 72% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet og em brun pasta. Pastaen ekstrahere-des to gange med 30 ml 70 rumfang-% ethanol og 0,1 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol, hver gang ved en 30 pH-værdi på 8,6 og en temperatur på -5 °C, hvorved fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 19% og 8% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 99 %. Pastaen var gråligbrun og vejede i tør tilstand 0,1 g. Det to-

DK 154266 B

16 tale proteinindhold -,var 91%.

EKSEMPEL 9 a) På den i eksempel 8 angivne måde blev den sorte hæm-pasta skilt fra 2,2 g af en blanding af blodceller.

5 Pastaen blev blandet med 30 ml 50 rumfang-?o ethanol, og pH-værdien indstilledes på 8,5 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-?o ethanol ved en temperatur på -1 °C. Etha-nolindholdet var ca. 50 rumfang-*!. Blandingen centrifugeredes som angivet i eksempel 8 og gav en superna-10 tant indeholdende 33¾ af hæm-indholdet af udgangsma terialet og en mørkebrun pasta. Pastaen ekstraheredes tre gange med 30 ml 50 rumfangs-* ethanol, hver gang ved en pH-værdi på 9,0 og en temperatur på -1 °C, hvorved fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 24?ί, 15 13/0 og 9% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet.

Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 79 ,¾. Pastaen var brun og vejede i tør tilstand 0,1 g. Det totale udbytte af protein var 91¾.

b) På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den 20 sorte hsm-pasta fraskilt af en 2,2 g blanding af blodceller. Pastaen blev blandet med 30 ml 40 rumfang-* ethanol, og pH-værdien indstilledes til 10,7 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-?é ethanol. Temperaturen var -40 °C og ethanolindholdet ca. 40 rumfang-*. Blandingen cen-25 trifugeredes som angivet i eksempel 8, og der fremkom en supernatant indeholdende 71¾ af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet og en brun pasta. Pastaen blev ekstraheret to gange med 50 ml 40 rumfang-* ethanol, hver gang ved en pH-værdi på 10,7 og en temperatur på 30 -4 °C, hvorved fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 7,2¾ og 4,8¾ af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 83¾. Pastaen var lysebrun og vejede i tør tilstand

DK 154266B

17 0,0 8 g. Det totale udbytte af protein var 85¾..

EKSEMPEL 10 På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den sorte hæm-pasta separeret fra 2,2 g af en blanding saf blod-5 celler. Pastaen blev Iblandet med en blanding -af 20 ml 60 Tumfang.-Λ ethanol, 0,2 ml 2 M imidazol i 7® rumfang-?^ ethanol og 1 ml 40 rumfang-% ammoniumsulfat i en vandig opløsning. pH-værdien blev indstillet på 6,8:mad 0,5 M NaQIM i 70 rumfang-?o ethanol. Temperaturen var +25°C og 10 ethanolindholdet ca. 60 rumfang-?i. Blandingen biev cen trifugeret som angivet i eksempel 8 og gav en supernatant indeholdende 63¾ af hæm-indholdet af udgangsmaterialet og en brunrød pasta. Pastaen blev ekstiraiheret to gange med 60 rumfang-?o ethanol, imidazol og ammonium-15 sulfat i de ovenfor angivne mængder, hver gang vied en pH-værdi på 6,8 og en temperatur på +25°C, og deir fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 14¾ og 8¾ af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totalre udbytte af hæm-koncentratet var 85 %. Pastaen var brum og vejede 20 i tør tilstand 0,07 g. Det totale udbytte af protein var 83¾.

EKSEMPEL 11 På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den sorte hæm-pasta fraskilt fra 2,2 g af en blanding af blod-25 celler. Pastaen blandedes med en blanding af 30 ml 96 rumfang-/^ ethanol og 0,2 ml 1 M glycin i en vandig opløsning. pH-værdien indstilledes til 10,4 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-?o ethanol. Temperaturen var -20°C og ethanolindholdet ca. 90 rumfang-?i. Blandingen centrifuge-30 redes som anført i eksempel 8 og gav en supernatant in deholdende 61¾ af hæm-indholdet af udgangsmaterialet og en mørkebrun pasta. Pastaen blev ekstraheret ‘to gange med

DK 154266 B

18 90 rumfang-^ ethanol og glycin i samme mængder som ovenfor angivet, hver gang ved en pH-værdi på 10,4 og en temperatur på -20°C, hvorved fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 20% og 9% af hæm-indhal det 5 af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm- koncentrat var 90%. Pastaen var lysebrun og vejede i tør tilstand 0,1 g. Det totale proteinudbytte var 91%.

EKSEMPEL 12 På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den sorte 10 hæm-pasta fraskilt fra 2,2 g af en blanding af blod celler. Pastaen blev blandet med en blanding af 30 ml 40 rumfang-% ethanol og 0,2 ml M imidazol i 70 rumfang-% ethanol. pH-værdien blev indstillet på 7,0 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol. Temperaturen var -5°C og 15 ethanolindholdet ca. 42 rumfang-%. Blandingen blev cen trifugeret som angivet i eksempel 8 og gav en supernatant indeholdende 58% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet og en mørkerød pasta. Pastaen blev ekstraheret to gange med 70 rumfang-% ethanol og imidazol i mængder 20 som ovenfor angivet, hver gang ved en pH-værdi på 7 og en temperatur på -5°C, og der fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 26% og 5% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 89%. Pastaen var lysebrun og vejede i tør tilstand 25 0,1 g. Det totale udbytte af protein var 91%.

EKSEMPEL 13 På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den sorte hæm-pasta fraskilt fra 2,2 g af en blanding af blodceller. Pastaen blev blandet med en blanding af 20 ml 30 70 rumfang-% methanol og 0,2 ml 2 M imidazol i 70 rum fang-% ethanol. pH-værdien blev indstillet på 8,5 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol. Temperaturen var -5°C,

DK 154266B

19 methanolindholdet ca- 60 rumfang-%. Blandingen blev centrifugeret som angivet i eksempel 8 til opnåelse af en supernatant indeholdende 67% af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet og en brunrød pasta. Pastaen blev 5 ekstraheret to gange smed 70 rumfang-% methanol og imidazol i mængder soim angivet ovenfor, hver gang ved en pH-værdi på 8,5 og en temperatur på -5°C, >og der fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 18% og 7% af hæm-indholdet af.udgangsmaterialet. iDet to-10 tale udbytte af hæm-koncentrat var 92 %. Pastaen var lysebrun og vejede i tør tilstand 0,1 g. Det -totale udbytte af protein var 91¾.

EKSEMPEL 14 På samme måde som anført i eksempel 8 blev den sorte 15 hæm-pasta fraskilt fra 2,2 g af en blanding af blod celler. Pastaen blev blandet med en blanding ;af .20 ml 70 rumfang-% propanol og 0,2 ml 2 M imidazol i 7Ό rumgang-% ethanol. pH-værdien blev indstillet på 8,0 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol. Temperaturen 20 var -5°C og propanolinailholdet ca. 60 rumfang-%. Blan dingen blev centrifugeret som angivet i eksempel 8, og der fremkom en supernatant indeholdende 66% af hæm-indholdet fra udgangsmaterialet og en brunrød pasta.

Pastaen blev ekstraheret to gange med 70 rumfang-% pro-25 panol og imidazol i mængder som ovenfor angivet, hver gang ved en pH-værdi på 8,0 og en temperatur på -5°C, og der fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 16% og 9% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentratet var 91%. Pastaen 30 var lysebrun og vejede i tør tilstand 0,1 g. Det totale proteinindhold var 91%.

DK 154266 B

20 EKSEMPEL 15 På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den sorte hæm-pasta fraskilt fra 2,2 g af en blanding af blodceller. Pastaen blev blandet med en blanding af 20 ml 5 70 rumfang-% isopropanol, 0,2 ml 1 M glycin og 0,2 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-?i ethanol. pH-værdien blev indstillet på 7,5 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol. Temperaturen var -10°C og isopropanolindholdet ca. 60 rumfang-%. Blandingen blev centrifugeret som anført i 10 eksempel 8 og gav en supernatant indeholdende 69% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet og en brunrød pasta.

Pastaen blev ekstraheret to gange med 70 rumfang-% isopropanol, glycin og imidazol i de ovenfor angivne mængder, hver gang ved en pH-værdi på 7,5 og en temperatur 15 på -10°C, og der fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 17% og 9% af hæm-indholdet: af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 95 %. Pastaen var lysebrun og vejede tørret 0,1 g. Det totale udbytte af protein var 91%.

20 EKSEMPEL 16 På samme måde som angivet i eksempel 8 blev den sorte hæm-pasta separeret ud fra 2,2 g af en blanding af blodceller. Pastaen blev blandet med en blanding af 20 ml 70 rumfang-% ethanol, 7 ml 70 rumfang-% glycerol og 0,2 ml 25 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol. pH-værdien blev ind stillet til 8,0 med 0,5 M NaOH i 70 rumfang-% ethanol. Temperaturen var -5°C og ethanolindholdet ca. 52 rumfang-%, og glycerolindholdet var ca. 17 rumfang-%. Blandingen blev centrifugeret som angivet i eksempel 8, og 30 der fremkom en supernatant indeholdende 64% af hæm- indholdet fra udgangsmaterialet og en brunrød pasta. Pastaen blev ekstraheret to gange med 70 rumfang-% ethanol, 70 rumfang-% glycerol og imidazol i de ovenfor angivne

DK 154266 B

21 mængder, hver gang ved en pH-værdi på 8,0 og en temperatur på -5°C, og der fremkom supernatanter Indeholdende henholdsvis 14% og 7% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncen- - 5 trat var 85%. Pastaen var brun og vejede i tør tilstand efter vaskning med vaand 0,1 g. Det totale udbytte af protein var 91%.

På samme måde som ovenfor angivet udførtes en ekstraktion med 70 rumfang-% ethylenglycol i stedet for gly-10 cerol. Resultatet var ;det samme som ovenfor anført.

EKSEMPEL 17

En blanding af 6 ml 96 rumfang-% ethanol og 1 ml 1 M HC1 ved en temperatur ;på -8°C blev tildryppet .under omrøring og afkøling til 2,7 g totalblod ved «η iempe-15 ratur på +0,5°C. Efter tilsætningen var pH-værdien 3,0 og temperaturen -5°C. Derefter tilsattes 2 ml af 40% ammoniumsulfat i en vandig opløsning og en blanding af 20 ml 70 rumfang-% ethanol, 0,2 ml 1 M glycin i en vandig opløsning og 0,2 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% 20 ethanol ved en temperatur på -8°C, idet der omrørtes under samtidig afkøling. pH-værdien blev indstillet til 8,0 med 0,5 M NaOH i 7tG) rumfang-% ethanol. Temperaturen var -8°C og ethanolindholdet ca. 65 rumfang-%. Blandingen blev centrifugeret som angivet i eksempel 8, og der 25 fremkom en supernatant indeholdende 66% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet samt en brunrød pasta. Pastaen blev ekstraheret to gange med 70 rumfang-% ethanol, ammonium-sulfat og imidazol i de ovenfor nævnte mængder, hver gang ved en pH-værdi på 8,0 og en temperatur på -8°C, og der 30 fremkom supernatanter indeholdende henholdsvis 16% og 7% af hæm-indholdet af udgangsmaterialet. Det totale udbytte af hæm-koncentrat var 89 %. Pastaen var gråbrun efter vask med 50 rumfang-% ethanol og repræsenterede 85% af det totale proteinindhold.

DK 154266 B

22 EKSEMPEL Ϊ8

Ekstraktion af hæm-pasta ud fra 22 g af en blanding af blodceller gav ved en pH-værdi på 10,4, en temperatur på -5 °C og med 70 rumfang-% ethanol en første 5 ekstraktionsopløsning på 199 ml med et hæm-indhold på 0,38 mg hæm/ml, svarende til 68,1 % af hæm-indholdet 1 udgangsmaterialet, en anden ekstraktionsopløsning på 121 ml med et hæm-indhold på 0,17 mg hæm/ml, svarende til 18,6 % af hæm-indholdet, og en tredje ekstraktions-10 opløsning på 118 ml med hæm-indhold på 0,08 mg hæm/ml, svarende til 8,5 % af hæm-indholdet. Ekstraktionsopløsningerne blev forenet og gjort sur til en pH-værdi på 5.1 med 87 ml 0,1 M HC1 ved en temperatur på -5 °C.

Det derved dannede sorte fnugagtige bundfald blev fraskilt 15 i en centrifuge ved 3000 x g og vejede 4,5 g. Pastaen blev vasket tre gange i 15 ml isvand hver gang, suspenderet i 15 ml isvand, pH-værdien blev indstillet på 8.2 med 3 ml 0,2 M NaOH, blev frosset og frysetørret.

Herved fremkom 265 mg af et sort pulver med et hæm-indhold 20 på 36 %. Det totale udbytte af hæm-koncentratet var 86 %.

Analyse: C 46,17%, H 5,30%, Cl 10,53%, P 2,8%, Fe 3,57%, N 9,6%, K 3,5% og Na 4,1%.

EKSEMPEL 19 25 En ekstraktion af hæm-pasta ud fra 50 g af en blanding af blodceller gav ved en pH-værdi på 8,2, en temperatur på +1 °C og ved hjælp af 60 rumfang-% ethanol og 4 ml 2 M imidazol i 70 rumfang-% ethanol en første ekstraktionsopløsning på 494 ml med et hæm-indhold på 0,32 mg hæm/ml, 30 svarende til 62,8 % af hæm-indholdet af udgangsmaterialet, en anden ekstraktionsopløsning med tilsvarende data på 467 ml, 0,11 mg hæm/ml, 20,4 % af en tredje ekstrak-

DK 154266B

23 tionsopløsning med tilsvarende data på 479 ml, 0,06 mg hæm/ml, 11,4 %. Ekstraktionsopløsninger blev forenet og gjort sure til en pH-værdi på 4,0 med 240 ml 0,1 M HC1 ved en temperatur på +1 °C. Bundfaldet blev fraskilt 5 som ovenfor angivet og vejede 8,5 g. Pastaen blev vasket tre gange i 25 ml isvand hver gang, suspenderei i 25 ml isvand, pH-værdien blev indstillet på 8,5, og suspensionen blev frosset og frysetørret. Herved fremkom 510 mg af et sort pulver mred et hæm-indhold på 42 li. Det 10 totale udbytte af hæm-skoncentratet var 85 %.

EKSEMPEL 20 På samme måde som angi'J/et i eksempel 18 opnåedes tre ekstraktionsopløsningeT 1, 2 og 3. Den tredje fekstraktionsopløsning blev separat gjort sur til en pH-værdi på 15 5,1 og gav en mindre mængde bundfald, der efterr fryse tørring udgjorde et hæm-koncentrat med et hæm-indhold på 17,7 58. Analyse: C 29,43 %, H 3,52 %, Cl 23.,77 58, P 1,2 58 , Fe 2,28 %, N B,'8 SB, K 13,4 % og Na 15,,7 %.

EKSEMPEL 21 20 På samme måde som angivet i eksempel 19 ekstraheredes opløsning 1. Denne blev gjort sur separat til <en ,pH-værdi på 4,0 og gav et surt toiuindf aid, som blev isoleret., vasket og frysetørret på samms måde som anført i eksempel 19.

Det således opnåede hæm-koncentrat havde et hæm-indhold 25 på 55 58 .

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et hæm-koncentrat ud fra en blanding af hæm og blodsubstans opnået ved spaltning af hæmoglobin, kendetegnet ved, 5 at den nævnte hæm- blodsubstansblanding ekstraheres med en alkohol med 1-4 C-atomer eller blanding af alkoholer fortrinsvis ethanol i en koncentration på over 40 vol-?i, fortrinsvis 60-80 vol-%, idet ekstraktionen sker enten 10 a) ved en pH-værdi på mindst 8,0 til 10,7, fortrinsvis 9,0 til 10,5, eller b) i nærværelse af et middel, som fremskynder separationen af hæm-koncentrat og blodsubstans i form af imidazol eller et imidazolderivat, ved en pH-værdi på 6,0 til 15 8,5, fortrinsvis 6,5 til 8,5, og idet der eventuelt tilsættes midler til stabilisering af udfældning af proteiner, f.eks. natrium-, kalium- eller ammonium-, -chlorid, -sulfat, -phosphat, -citrat eller -tartrat, ved en temperatur mellem +25 °C og -20 °C, fortrinsvis 20 mellem -5 og -20 °C, hvorefter den uopløste faste blod substans fraskilles, og hæm-koncentratet udvindes fra den resterende opløsning.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at blandingen af hæm og blodsubstans består af 25 en hæm-pasta, som er opnået ved spaltning af hæmoglobin substans og ved fraskillelse af globinopløsningen på i og for sig kendt måde.

3. Fremgangsmåde ifølge krav log2, kendetegnet ved, at der som midler til fremme af separationen 30 tilsættes aminosyrer, fortrinsvis glycin, glutamin eller lysin. DK 154266 B

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pH i de,, nævnte blanding til udfældning af blodsubstans først indstilles til 7-8 eller, i tilfælde af, at der anvendes et middel til fremskyndelse af se- 5 parationen, på 6,5 til 8, hvorefter der tilsættes en alkohol fortrinsvis ethanol, og pH hæves, og/ellver der tilsættes et middel, der fremmer adskillelsen og hæm-kon-centrat og blodsubstans.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved at man til nævnte blanding først sætter et e'ller flere salte, såsom natrium-, kalium- eller ammonium-, -chlorid, -sulphat, -phaøsphat, -citrat eller -tartrat, hvorefter en alkohol med 1-4 C-atomer fortrinsvis ethanol tilsættes, og pH-værdxe-n indstilles på over 6.,JO, -eller, 15. tilfælde af, at der i=kke tilsættes noget separations-fremmende middel, til over 8,0.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til 5, kendetegnet ved, at alkoholen er ethanol, methanol, ethylen-glycol, glycerol, propanol, isopropanol, butanol eller 20 isobutanol eller blandinger deraf.