DK151634B - Fremgangsmaade til rensning af langkaedet acyl-coenzym-a-syntetase - Google Patents

Description

i DK 1516348

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af langkædet acyl-coenzym-A-syntetase (herefter i beskrivelse og krav forkortet som acyl-CoA-syntetase).

Acyl-CoA-syntetase er et vigtigt enzym, som deltager i første oxi-5 dationstrin for fede syrer i levende organismer og katalyserer følgende reaktion: RCOOH + CoA + ATP -> RCOCoA + AMP + pyrophosphorsyre........(1) hvor R betegner mættet eller umættet alkyl.

10 Enzymet vides at forekomme i rottelever, forskellige bakterier og gærarter, f.eks. Escherichia coli og bacilli. Der er indtil nu blevet gjort mange forsøg på at rense enzymet, men det har hidtil ikke lykkedes at isolere enzymet som et rent præparat på grund af dets tendens til at bindes til membraner, samt dets instabilitet.

15 F.eks. har D. Samuel et al. i European Journal of Biochemistry, bind 12, side 576-582 (1970) beskrevet rensning af acyl-CoA-syntetase fra Escherichia coli, men det lykkedes ikke at rense enzymet som et helt rent homogent protein, idet det rensede produkt havde lav specifik aktivitet pr. mg protein.

20 Rensning af den langkædede acyl-CoA-syntetase fra mikrosomer fra rottelever er også forsøgt af J. Bar-Tana et al. ifølge Biochemical Journal, bind 122, side 353-362 (1971), men det rensede enzyms homogenitet var ikke tilstrækkelig ud fra de elektroforetiske data, og enzymets specifikke aktivitet var også lav.

25 Opfinderne til nærværende opfindelse har tidligere under deres studium af acyl-CoA-syntetase fra mikroorganismer fundet, at enzymet omfatter to adskilte enzymer, acyl-CoA-syntetase I og II, hvor acyl-CoA-syntetase I deltager i systemerne til direkte inkorporering af fedtsyrer i lipider, og acyl-CoA-syntetase II deltager i β-oxidations- 30 systemet for fedtsyrer (Mishina et al. European Journal of Biochemistry, bind 82, side 347-354 (1978)).

DK 151634 B

2

Acyl-CoA-syntetase I er det enzym, som renses ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. (Herefter angiver udtrykket "enzymet" acyl-CoA-syntetase I, såfremt intet andet er angivet).

Ved indgående undersøgelse af rensningen af langkædet acyl-CoA-5 syntetase I af mikroorganismeoprindelse er der nu fundet en særlig rensningsproces, som muliggør isolering af enzymet i en form, som er homogen ifølge elektroforese, og som har signifikant høj specifik aktivitet.

Den foreliggende opfindelse bygger på denne erkendelse, og frem-10 gangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del anførte.

I fig. 1 er illustreret sammenhængen mellem ATP-koncentrationen (mM) på abeissen og aktiviteten af acyl-CoA-syntetase (U/mg protein) på ordinaten i nærværelse af Mg ved koncentrationer på 5 mM (O), 15 10 mM (·) og 15 mM (□); i fig. 2 er illustreret eluering af acyl-CoA-syntetase fra B.S.-kolonnen i fremstillingseksemplet. Abeissen viser effluentrumfanget (ml); ordinaten viser aktiviteten af acyl-CoA-syntetase (U/ml til venstre) afbildet ved · og mængden af proteiner (mg/ml til højre) afbildet ved 20 O; og pilene a - c viser, at a) puffer A påføres kolonnen ved pil a, b) puffer A indeholdende 10 mM ATP påføres ved pil b, og c) at gradientelueringen begyndes ved pil c; fig. 3 viser eluering af acyl-CoA-syntetase fra g-100-kolonnen ved fremstillingen. Abeissen viser effluentvolumenet (ml), og ordinaten 25 viser aktiviteten af acyl-CoA-syntetase (U/ml til venstre) afbildet ved • og mængden af proteiner (mg/ml til højre) afbildet ved O; fig. 4 viser et polyacrylgelelektroforesespor af acyl-CoA-syntetase i nærværelse (A) eller fraværelse (B) af natriumdodecylsulfat; og fig. 5 viser sammenhængen mellem mængden af en fedtsyre (nanomol) 30 på abeissen og Δ O.D.-værdien ved 334 nanometer på ordinaten vundet ifølge referenceeksempel 1.

DK 151634 B

3

Et vigtigt aspekt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til rensning af enzymet er en kombination af solubilisering af enzymet med et overfladeaktivt middel for at frigøre det fra membranerne og affini-tetschromatografi for at isolere det fra andre kontaminerende prote-5 iner. Ingen tidligere beskrevet fremgangsmåde har udnyttet affinitets-chromatografi med henblik på rensning af acyl-CoA-syntetase. Det har nu vist sig, at affinitetschromatografi kan anvendes til meget heldig rensning af enzymet.

Et aspekt af fremgangsmåden er, at enzymet er afledt af mikroorga-10 nismer. Når det ønskes let og billigt at fremskaffe store mængder af et enzym, er mikroorganismer udmærkede kilder dertil. Af denne grund stiller den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til produktion af acyl-CoA-syntetase i kommerciel målestok til rådighed.

Et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse er, at enzymet fra 15 Candida lipolytica, der renses ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er af høj renhed og af yderst høj specifik aktivitet i størrelsesordenen ca. 50 - 100 gange højere end den kendte teknik. Mere specifikt kan den ovennævnte acyl-CoA-syntetase fra Escherichia coli, selv i den mest rensede form, ikke betragtes som homogen ifølge elektrofor-20 ese og har en specifik aktivitet så lav som 106 mll/mg protein, og det rensede enzym fra rottelever har en specifik aktivitet på 250 mll/mg protein. I modsætning hertil er det ovennævnte enzym fra Candida lipolytica, som er renset ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, helt homogent ifølge elektroforese og har ca. 50 - 100 gang større specifik 25 aktivitet.

Som anført i den ovenstående reaktionsligning udnytter enzymet frie fedtsyrer og frigør således AMP i en mængde, der svarer til mængden af frie fedtsyrer. Derfor kan koncentrationen af frie fedtsyrer i blodet bestemmes ved en enzymatisk proces ved måling af det frigjorte 30 AMP under anvendelse af nedenstående reaktionssystem (jfr. Rinsho Kagaku, bind 4, nr. 2, side 179 (1975), Nippon Rinsho Kenkyukai,

Japan):

DK 151634 B

4 AMP + ATP myok,nas>e 2 ADP 2 ADP + 2 phosphoenolpyruvat PYruvat-kinase 2 ATP + 2 pyruvat

2 pyruvat * 2 NADH * 2 H* '«tat-dehydrogenase 5 2 lactat + 2 NAD

Det omhandlede enzym virker således tilfredsstillende som et diagnostisk enzym til anvendelse ved bestemmelse af frie fedtsyrer i blod.

Enzymet kan også anvendes til fremstilling af et mærket acyl-CoA, som er et vigtigt biokemisk reagens. Dette reagens kan fordelagtigt 10 fremstilles ud fra en mærket fedtsyre under anvendelse af enzymet.

Yderligere detaljer ved den foreliggende opfindelse fremgår af nedenstående beskrivelse:

De til fremstilling af enzymet anvendte mikroorganismer er ikke kritiske og kan være en hvilken som helst af de mikroorganismer, som i 15 deres celler indeholder langkædet acyl-CoA-syntetase, der er fremstillet konstitutivt eller induktivt. Enzymet optræder i mange forskellige mikroorganismer, hvorfra det kan ekstraheres og renses. Ud fra et kommercielt synspunkt foretrækkes de mikroorganismer, som vokser hurtigt, har høj enzymaktivitet og er let ekstraherbare. Sådanne 20 mikroorganismer er f.eks. gærarter og bakterier.

Eksempler på foretrukne mikroorganismer er gærarter hørende til Candida eller Saccharomyces og bakterier hørende til Escherichia,

Bacillus eller Pseudomonas. Mere specifikt omfatter de foretrukne mikroorganismer gærstammer hørende til Candida lipolytica, Candida 25 tropicalis og Saccharomyces cerevisiae og bakteriestammer hørende til Escherichia coli og Bacillus megaterium. Blandt disse er de mest foretrukne Candida lipolytica stamme NRRL Y-6795 valgt blandt Candida lipolytica og en kommercielt tilgængelig bagegær fra Saccharomyces cerevisiae.

DK 151634 B

5

Fremgangsmåden til dyrkning af disse mikroorganismer er ikke kritisk og kan udføres på et hvilket som helst sædvanligt medium indeholdende carbonkilder (f.eks. glucose) og kilder til nitrogen, phosphat, kalium og magnesium, under normale dyrkningsbetingelser med hensyn 5 til temperatur og tid. Når de anvendte mikroorganismer producerer enzymet induktivt, kan der til mediet sættes et inducerende stof (f.eks. én fedtsyre).

De dyrkede mikroorganismeceller isoleres ved f.eks. centrifugering eller filtrering. Cellerne sønderdeles med mekaniske midler, f.eks. i 10 en homogenisator, ved ultralydbehandling eller ved formaling med glaskugler, eller ved kemisk behandling, f.eks. behandling med et cellevægsspaltende enzym, og fragmenter af cellerne fjernes ved centrifugering.

Den isolerede overstående væske, som indeholder den særlige fraktion 15 af cellerne, behandles derefter med et overfladeaktivt middel til frigørelse af enzymet fra partiklerne. Alternativt kan den overstående væske, før denne behandling, ultracentrifugeres for at udfælde den særlige fraktion, som derefter suspenderes i en egnet pufferopløsning og behandles med et overfladeaktivt middel.

20 De anvendte overfladeaktive midler omfatter galdesyrer såsom natrium-cholat og natriumdeoxycholat; og ikke-ioniske overfladeaktive stoffer såsom polyoxyethy lenal kylethere, polyoxyethylenalkylphenolethere, polyoxyethylenalkylestere, sorbitanalkylestere og polyoxyethylensorbi-tanalkylestere. Blandt disse foretrækkes ikke-ioniske overfladeaktive 25 midler, f.eks. polyoxyethylenalkylphenolethere. Der foretrækkes især "Triton" X-100 (Rohm & Haas; hovedsagelig indeholdende isooctylphe-nylpolyethoxyalkohol; herefter kaldet "surfactant T". Surfactant T antages at have en gennesnitlig molekylvægt på 628).

Den anvendte mængde overfladeaktivt middel ligger sædvanligvis i 30 området mellem 0,1 og 1,0 vægt/volumenprocent, alt afhængig af den pågældende mikroorganisme og det anvendte overfladeaktive middel.

DK 151634 B

6

Soiubiliseringsbehandlingen af enzymet med et overfladeaktivt middel udføres typisk i 0,5 - 2 timer ved relativt lav temperatur, f.eks. mellem 0 og 10°C, fortrinsvis ved 0 - 4°C. For at forhindre deaktivering af enzymet, som kan forekomme samtidig med solubilseringen, 5 kan der til den suspension, som behandles, sættes en phosphatpuffer, et enzymbeskyttelsesmiddel såsom mercaptoethanol, EDTA eller andre passende additiver.

Efter solubilisering af enzymet under disse betingelser ultracentri-fugeres suspensionen til adskillelse af enzymet, som nu findes i den 10 overstående væske, fra den partikulære fraktion. Den overstående væske renses derefter ved affinitetschromatografi. Den overstående væske kan fortrinsvis forbehandles ved en yderligere egnet rensningsprocedure før affinitetschromatografien.

En sådan fremgangsmåde er ionbytningschromatografi på phospho-15 cellulose, hvorved der kan fjernes anioniske proteiner og andre forurenende bestanddele. Ved udførelse af phosphocellulosesøjlechro-matografien elueres enzymet sædvanligvis fra søjlen med en phosphat-pufferopløsning, og i dette tilfælde demineraliseres eluatet fortrinsvis før næste trin med affinitetschromatografi.

20 Derefter renses den enzymholdige opløsning ved affinitetschromatografi på en adsorbent, der som ligand indeholder en forbindelse med den almene formel I

" O NH2

Ri o nh-Q-nh-Qn 1 SO^Na W Cl 2 25 hvor det ene af symbolerne R og R betegner hydrogen, og det andet betegner et radikal-SO^Na. Forbindelsen med formlen I er tilgængelig fra Ciba Geigy under handelsnavnet "Cibacron Blue" F3G-A (dette produkt kaldes herefter ligand C).

7

DK 151634B

Med henblik på rensning af enzymet indeholder den anvendte adsorbent i affinitetschromatografien liganden bundet til et bærestof på en sådan måde, at den strukturelle analogi for liganden ikke påvirkes.

Det er ikke nødvendigt med excipiens, men en sådan kan, om ønsket, 5 anvendes.

Bærestoffet til den ovennævnte ligand er ikke kritisk, men som bærestof anvendes hensigtsmæssigt et polysaccharid eller en porøs glasart på grund af den store porestørrelse og høje mekaniske styrke, de milde betingelser, som er nødvendige ved bindingen af liganden Ί0 hertil, og kun ringe ikke-selektiv adsorption af proteinet derpå.

Særligt foretrukne polysaccharider er dextran, agarose og de tvær-bundne produkter deraf, og disse polysaccharider i form af kugler håndteres let.

Den særligt foretrukne adsorbent til anvendelse ved affinitetschroma-15 tografitrinnet er et stof med den almene formel II

O NHo ·, fVVV°3Na w* NH-^ \>-R2 °

SO^Iia O-X

1 2 hvor det ene af symbolerne R og R betegner hydrogen, og det andet betegner et radikal -SO^Na; og X betegner en polysaccharidrest. Eksempler på adsorbenter af denne type, som er kommercielt tilgænge-20 lige, er "Blue-Sepharose" CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals; herefter kaldet B.S.), som består af den ovennævnte ligand C som liganden og "Sepharose" CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, overvejende bestående af tværbundet agarose) som bærestof.

Til udførelse af affinitetschromatografien påføres den ovennævnte 25 enzymholdige opløsning på en kolonne, som er pakket med affinitets- 8

DK 151634B

absorbenten som ovenfor beskrevet for at udføre adsorptionen. Derefter ledes en pufferopløsning indeholdende ATP, ADP, AMP, CoA og lignende gennem kolonnen for at udvaske nogle proteiner, og disse protein hol dige fraktioner har ingen aktivitet. Kolonnen behandles 5 derefter med en opløsning til gradienteluering indeholdende natrium-chlorid i den ovennævnte ATP-holdige pufferopløsning til dannelse af en gradient fra 0 til 1,5M NaCI. Under gradientelueringen elueres yderligere proteiner separat fra kolonnen, og enzymet elueres i en enkelt spids i de fraktioner, som har en NaCI-koncentration i området 10 mellem 0,05 og 0,5M.

Det antages ud fra de ovennævnte resultater, at den chromatografiske isolering af enzymet i denne kolonne delvis skyldes et ionbytningsfænomen foruden affiniteten til adsorbenten.

Den således vundne enzymopløsning har en betydelig høj specifik 15 aktivitet. Den kan, om nødvendigt, imidlertid renses yderligere.

Egnede midler til yderligere rensning af enzymet er typisk behandling med "Sephadex" G-100 (Pharmacia Fine Chemicals; herefter kaldet G-100) og påfølgende hydroxyapatitchromatografi.

Den på den ovenfor beskrevne måde vundne acyl-CoA-syntetase har 20 ekstremt høj renhed og viser et enkelt bånd i en SDS-elektroforetisk test.

I tidligere beskrevne fremgangsmåder til rensning af acyi-CoA-synte-tase er det blevet foreslået af solubilisere enzymet med overfladeaktiv deoxycholsyre. Når solubiliseringsbehandlingen imidlertid efterfølges 25 af sædvanlige rensningsfremgangsmåder såsom udsaltning med ammoniumsulfat, ionbytningschromatografi eller lignende, har det vist sig, at det rensede enzyms kvalitet ikke er tilfredsstillende med hensyn til renhed og specifik aktivitet. Det har nu overraskende nok vist sig, at solubiliseringsbehandlingen med det ovennævnte overfladeaktive 30 middel i forbindelse med affinitetschromatografisk rensning let resulterer i isolering af enzymet i meget ren form.

I de senere år er affinitetschromatografi blevet udbredt anvendt til rensning af enzymer og efterhånden anvendt ved rensning af de 9

DK 151634B

enzymer, som deltager i lipidmetabolismen. Ifølge opfindernes viden har ingen imidlertid forsøgt at rense enzymet acyl-CoA-syntetase ved hjælp af affinitetschromatografi tidligere. Som resultat af dette forsøg har det nu vist sig, at enzymet meget let skilles ved affin itetschroma-5 tografi fra andre proteiner, herunder sådanne proteiner som ATP-ase, som har lignende fysiske egenskaber og derfor er vanskelige at fjerne fra acyl-CoA-syntetase ved sædvanlige rensningsteknikker.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen rensede og isolerede enzym, acyl-CoA-syntetase, har nedenstående fysiske og kemiske 10 egenskaber: i) substratspecificitet: indvirker primært på ligekædede fedtsyrer med 14 - 18 carbonatomer og indvirker i det væsentlige ikke på ligekædede fedtsyrer med mere end 18 eller^mindre end 14 carbonatomer; 15 ii) optimal pH-værdi: 7,1 - 9,6; iii) pH-stabilitet: 6,1 - 9,0 (ved 4°C, 36 timer);

iv) optimal temperatur: 35 - 45°C

v) termisk stabilitet: 45°C eller derunder; ++ ++

vi) aktivator: Mg inhibitor: Cu og EDTA

20 vii) molekylvægt: ca. 84.000 (ved SDS-pladeelektroforese), ca.

105.000 (ved gelfiltrering) vii) aminosyresammensætning: 13,2% lysin, 2,0% histidin, 4,6% argi-nin, 9,1% asparaginsyre, 5,5% threonin, 7,8% serin, 10,5% gluta-minsyre, 7,5% prolin, 8,1% glycin, 6,5% alanin, 6,0% valin, 1,6% 25 methionin, 5,0% isoleucin, 7,0% leucin, 2,9% tyrosin og 2,6% phe- nylalanin (i molprocenter baseret på en totalmængde på seksten aminosyrer).

DK 151634B

ίο

De fysiske og kemiske egenskaber af enzymet langkædet acyl-CoA-syntetase diskuteres nedenfor mere detaljeret.

Enzymets fysiske og kemiske egenskaber.

(1) Enzymvirkning: 5 Enzymet katalyserer den ovennævnte reaktion (1). Dette er påvist på følgende måde:

Et radioaktivt vandopløseligt produkt fremstillet ved at omsætte enzymet med · U-14C-mærket kaliumpalmitat som substrat i nærværelse af + +

CoA, ATP og Mg blev undersøgt ved tyndtlagschromatografi, og 10 dannelsen af palmitoyl-CoA blev bekræftet ud fra de tyndtlagschroma-tografiske data.

Ved gentagelse af den ovennævnte reaktion i samme reaktionssystem med den undtagelse, der blev tilsat hydroxylamin (substratet var kaliumpalmitat), blev dannelsen af palmitoylhydroxamsyre bekræftet 15 ved silicagelchromatografi af reaktion s produktet. Ud fra disse faktorer blev det ene af reaktion s produkterne identificeret som palmitoyl-CoA.

Når myokinase på den anden side blev udeladt fra standardreaktionssystemet anvendt i metode 2 til bestemmelsen af den i afsnit (4) beskrevne aktivitet, fandt der ikke oxidation af NADH sted, hvilket 20 viser, at AMP var et reaktionsprodukt. En støkiometrisk relation ved et molforhold på 1:1 blev iagttaget mellem mængden af tilsat palmitin-syre eller CoA og mængden af dannet af AMP som målt spektrofotome-trisk i den tid, hvor reaktionen var under sådanne betingelser, at mængden af palmitinsyre eller CoA var en begrænsende faktor.

25 Det blev bekræftet ud fra de ovennævnte resultater, at acyl-CoA-syn-tetase I katalyserer den ovennævnte reaktion (1).

(2) Substratspecificitet:

Substratspecificiteten er anført nedenfor i tabel I. Enzymet udnytter specifikt ligekædede fedtsyrer med 14 - 18 carbonatomer, uanset 11

DK 151634B

graden af umættethed, medens ligekædede fedtsyrer, med mere end 18 eller mindre end 14 carbonatomer samt 16-hydroxypalmitinsyre og hexadecandionsyre i det væsentlige er uvirksomme.

(3) Optimale og stabile pH-områder: 5 Aktiviteten af standardreaktionssystemet, der blev anvendt ved bestemmelsen af aktiviteten som beskrevet i afsnit (4) nedenfor, blev undersøgt på samme måde med den undtagelse, at pH-værdien blev varieret med kafiumphosphatpuffere (pH-puffere 6,2 - 7,1), tris-HCI-puffere (pH-værdi 7?1 - 8,8) eller glycin-NaOH-puffere (pH-værdi 10 8,8 - 10,2). Som et resultat viste det sig, at enzymet havde et bredt pH-optimumområde mellem 7,1 og 9,6.

For, på den anden side, at bestemme enzymets pH-stabilitet blev en opløsning af enzymet dialyseret ved 4°C i 36 timer mod 0,1M kalium-phosphatpufferopløsninger (pH-værdi 6,1, 7,4, 8,0 og 9,0) indehol-15 dende 2 mM surfactant T og 2 mM mercaptoethanol, og aktiviteten i den indre opløsning blev derefter bestemt under standardbetingelser. Resultaterne viste, at der ikke optrådte nogen deaktivering af enzymet i de ovennævnte pH-områder.

(4) Aktivitetsbestemmelse: 20 Metode 1

Bestemmelsen af enzymaktiviteten blev udført ved Banis og Tove's metode (jfr. Biochemical et Biophysica Acta, bind 348, side 210 - 220 (1974)). Ifølge denne metode indeholdt reaktionsopløsningen 20 ymol tris-HCI-puffer (pH-værdi 7,5), 3 ymol ATP, 2 ymol MgC^, 1,0 ymol 25 dithiothreitol, 0,2 ymol [U-14C] kaliumpalmitat (0,2 millicurie/millimol) 0,32 ymol surfactant T, 0,2 ymol CoA og en alikvot af enzymopløsningen i et totalrumfang på 0,2 ml. Efter 5 minutters forinkubering blev enten CoA eller enzymopløsningen, som var holdt væk fra reaktionsopløsningen, tilsat for at initiere reaktionen (ved 25°C). Efter en 10 30 minutters reaktionsperiode blev 2,5 ml af en 40:10:1 isopropanol-n-heptan-1M svovlsyre-blanding tilsat for at standse reaktionen. Opløsningen blev derefter ekstraheret med heptan til fjernelse af eventuelt

DK 151634 B

12 ikke-omsat fri fedtsyre. Efter vask af den vandige fase to gange med hver gang 2 ml heptan indeholdende 8 mg palmitinsyre blev den vandige fases radioaktivitet målt.

Den mængde enzym, som katalyserer dannelsen af 1 ymol palmitoyl-5 CoA pr. minut under de ovennævnte betingelser defineres som én enhed O U) aktivitet.

Metode 2

Den mængde AMP, der dannes ifølge den ovennævnte reaktionsligning (1), blev bestemt ved en enzymatisk proces på følgende måde: 10 Standardopløsningen indeholdt 100 ymol tris-HCI-buffer (pH-værdi 7,4), 5 ymol dithiothreitol, 1,6 ymol surfactant T, 7,5 ymol ATP, 10 ymol MgC^, 0,25 ymol kaliumoleat, 1 ymol CoA, 0,2 ymol kaliumphos-phoenolpyruvat, 0,15 ymol NADH, 20 yg myokinase, 30 yg pyruvat-ki-nase, 30 yg lactatdehydrogenase og en bestemt mængde acyl-CoA-syn-15 tetase pr. ml opløsning. En reaktionsopløsning indeholdende alle de ovenfor nævnte komponenter med undtagelse af CoA blev forinkuberet ved 25°C i 1 minut. Reaktionen blev derefter initieret ved tilsætning af CoA, og nedgangshastigheden i optisk densitet ved 340 nm, som var knyttet til en nedgang i NADH-mængden, blev bestemt.

20 Den mængde enzym, som katalyserer dannelsen af 1 ymol AMP/minut Under de ovennævnte betingelser, blev defineret som en aktivitet på 1 U. Forholdet mellem aktiviteten bestemt ved metode 2 og den, som er bestemt ved metode 1, er 1,6.

(5) Optimalt temperaturområde: 25 Enzymet blev omsat ved forskellige temperaturer i 5 minutter under anvendelse af den under metode 1 beskrevne fremgangsmåde. Enzymets aktivitet var 190 ved 35°C og 210 ved 45°C i sammenligning med aktiviteten ved 25°C, som arbitrært var sat til 100. Således ligger et temperaturområdeoptimum for den emzymatiske virkning mellem 35°C 30 og 45°C.

13

DK 151634B

(6) Termisk stabilitet:

Efter at en opløsning af enzymet i puffer A (jfr. nedenfor) indeholdende 10 mM ATP blev holdt ved forskellige temperaturer i 15 minutter, blev enzymets aktivitet bestemt. Når aktiviteten ved 25°C blev 5 sat arbitrært til 100, var aktiviteterne ved 35°C, 45°C og 52°C henholdsvis 100, 100 og 55.

(7) Aktivator og inhibitor: + + ++ 0

Enzymet aktiveres med Mg , medens Cu -ion i en koncentration pa 15 mM helt inhiberer enzymvirkningen, ligesom EDTA også inhiberer 10 den.

(8) Rensningsproces:

Enzymet blev isoleret og renset generelt på følgende måde:

Fra homogenatet efter sønderdeling af mikroorganismecellerne blev den particulære fraktion isoleret ved ultracentrifugering og behandlet med 15 surfactant T til frigørelse af enzymet fra membranerne. Derefter blev den resulterende enzymholdige opløsning successivt underkastet kationbytterchromatografi på phosphorcellulose, demineralisering og affinitetschromatografi (f.eks. på B.S.). Eluering af affinitetschroma-tografi kolonnen blev udført ved en ATP-koncentration på 10 mM og 20 med en NaCI-gradientkoncentration varierende fra 0 til1,5M efterfulgt af demineralisering og gelfiltrering med en kolonne af "Sephadex" G-100. Yderligere detaljer fremgår af de nedenfor anførte fremstillings-eksempler.

(9) Molekylvægt: 25 Molekylvægten blev bestemt med en opløsning af enzymet indeholdende 2 mM surfactant T. Molekylvægten, som blev bestemt ud fra den elektroforetiske mobilitet af enzymet efter behandling med natrium-dodecylsulfat og 2-mercaptoethanol, var 84.000 (R^-værdi = 0,4), medens den ved gelfiltrering under anvendelse af "Sephadex" G-200

DK 151634 B

14 var 105.000. Det antages, at denne forskel skyldes binding af en betydelig del surfactant T til enzymet.

(10) Analyse af aminosyrekomponenter:

Efter at enzymet var nedbrudt med 6N saltsyreopløsning ved 110°C i 5 20 timer, blev aminosyrerne undersøgt. Resultaterne er følgende: 13,2% lysin, 2,0% histidin, 4,6% arginin, 9,1% asparaginsyre, 5,5% threonin, 7,8% serin, 10,5% glutaminsyre, 7,5% prolin, 8,1% glycin, 6,5% alanin, 6,0% valin, 1,6% methionin, 5,0% isoleucin, 7,0% leucin, 2,9% tyrosin og 2,6% phenylalanin.

10 De ovennævnte værdier er molprocenter baseret på den totale mængde af de ovennævnte seksten aminosyrer, hvor værdien for serin er korrigeret for 10%'s nedbrydning, og værdierne af threonin og tyrosin for 5%'s nedbrydning.

(11) Krystalstruktur: 15 Enzymets krystalstruktur er ikke kendt, da det ikke er vundet i krystallinsk form.

(12) Andre egenskaber: i) Specificitet for acylacceptorer:

Vmax-Vær'd'er °9 de tilsyneladende Km-værdier var følgende: 20 Acylacceptor V Km (mM) max

CoA angivet som 0,042 100% dephospho-CoA 70% 0,11 1 :^N-etheno-CoA 40% 0,5 25 4’-phosphopantethein 63% 3,3 panthethein 57% 2,5 N-acetylcysteamin ikke udnyttet ved koncentratio

ner op til 5 mM

L-cy stein " 30 glutathion dithiothreitol " 15

DK 151634B

ii) Specificitet for nucleosid-5'-triphosphat: Kun ATP og a-ATP var virksomme. Ved koncentrationer på 7,5 mM og 15 mM var de målte aktiviteter med a-ATP henholdsvis 78 og 61% af de med ATP målte værdier. Ved samme koncentrationer var GTP, UTP, CTP, a-TTP, 5 adenylyl-(0,1f-methylen)diphosphonat og adenyl-imidodiphosphonat i det væsentlige uvirksomme.

Forholdet mellem koncentrationen af ATP og aktiviteten af acyl-CoA- + + syntetase i nærværelse af en forudbestemt mængde Mg er anført i fig. 1.

10 Tabel I - Substratspecificitet for acyl-CoA-syntetase.

Fedtsyre Koncentration Aktivitet (ymol (mM) acyl-CoA/min.) laurinsyre 0,25 1,0 15 tridecansyre 0,125 1,3 myristinsyre 0,25 20,8 pentadecansyre 0,25 18,0 palmitinsyre 0,25 20,4 heptadecansyre 0,125 22,3 20 stearinsyre 0,125 11,3 nonadecansyre 0,25 1,7 arachidinsyre 0,25 0,6 palmitolsyre 0,125 19,8 oliesyre 0,25 23,8 25 linolsyre 0,25 19,7 linolensyre 0,25 22,0 arachidonsyre 0,125 1,3 16-hydroxypaImitinsyre 0,25 1,5 hexadecandisyre 0,25 0,6 30 I sammenligning med den kendte acyl-CoA-syntetase, f.eks. den af animalsk oprindelse som beskrevet i den ovennævnte artikel af J.

Bar-Tana et al. i "Methods in Emzymoiogy" redigeret af J.M. Lowenstein, Academic Press (1975), bind 35, side 117 - 122, er 16

DK 151634B

enzymet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tydeligt forskellig med hensyn til molekylvægt, optimal pH-værdi og substratspecificitet. Det antages derfor, at de to enzymer er helt forskellige fra hinanden.

5 Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1

Candida lipotylica stamme NRRL Y-6795 blev rystedyrket i 24 timer i 2-liters kolber hver indeholdende 500 ml af et medium med pH-værdi 5,2 og indeholdende 2% glucose, 0,5% NH^h^PO^, 0,25% KH^PO^, 0,1% 10 MgSO^. 71^0, 0,002% FeCIg^h^O og 0,1% Bacto gærekstrakt (Difco, USA). In kuberingstemperaturen var 25°C, og rystehastigheden var 72 frem- og tilbagegående bevægelser/minut. Gærcellerne blev indhøstet i den middellogaritmiske vækstfase ved centrifugering, og på denne måde blev der fremstillet 250 g våde gærceller.

15 Derefter blev gærcellerne vasket med 0,1M phosphatpufferopløsning (pH-værdi 6,5), og derefter suspenderet i samme phosphatpufferopløsning indeholdende 5 mM 2-mercaptoethanol og 1 mM EDTA, hvorefter de blev sønderdelt med en Braun cel lehomogen izer (Melsungen, Vesttyskland) under afkøling med flydende CO2 (hvorefter al teknik 20 blev udført ved en temperatur mellem 0 og 4°C).

Det resulterende homogenisat blev centrifugeret ved 8.000 G i 15 - 20 minutter for at isolere den overstående væskefraktion, som derefter blev ultracentrifugeret ved 230.000 G i 1 time for at opsamle præcipi-tatsfraktionen. Denne fraktion (herefter kaldet den partikulære frak-25 tion) blev suspenderet i samme phosphatpufferopløsning som ovenfor indeholdende 2-mercaptoethanol og EDTA ved samme koncentrationer til dannelse af en totalmængde på 72 ml af en suspension med en protein koncentration på 46 mg/ml.

Suspensionen blev derefter blandet med en opløsning indeholdende 30 surfactant T, en phosphatpuffer med pH-værdi 7,4, 2-mercaptoethanol

DK 151634 B

17 og EDTA, hvis endelige koncentrationer i blandingen var henholdsvis 5 mM, 50 mM, 5 mM og 0,5 mM, til dannelse af en protein koncentration på 11 mg/ml. Blandingen blev hensat i 1 time og derefter ultracentrifugeret ved 230.000 G i 1 time. Den resulterende overstå-5 ende væske i en mængde på 265 ml blev isoleret.

Efter fortynding af den overstående væske med 1,5 volumendele af en vandig opløsning indeholdende 2 mM surfactant T og 5 mM 2-mer-captoethanol, blev den fortyndede opløsning påført en 52 mm x 75 mm kolonne af "phosphocellulose" P-11 (Whatman), som i forvejen var 10 ækvilibreret med 20 mM phosphatpufferopløsning indeholdende 2 mM surfactant T og 5 mM 2-mercaptoeth.anol (denne opløsning herefter kaldt pufferopløsning A). Efter vask af adsorbentkolonnen med 2 kolonnerumfang pufferopløsning A, blev gradientelueringen udført med en eluent, i hvilken der var etableret en lineær koncentrationsgradi-15 ent mellem 2,5 kolonnerumfang pufferopløsning A og samme rumfang 0,5M phosphatpufferopløsning (pH-værdi 7,4) indeholdende 2 mM surfactant T og 5 mM mercaptoethanol. Strømningshastigheden ved elueringen var ca. 90 ml/time, og der blev opsamlet fraktioner på hver 15 ml. Da det ønskede enzym forekom i en enkelt spids ved en 20 phosphatkoncentration i området mellem 0,05M og 0,15M, blev fraktioner med specifikke aktiviteter på 0,28 U/mg eller derover isoleret og sammenhældt (90 ml).

Med henblik på demineralisering blev de samlede fraktioner ledt gen-nem en 38 mm x 350 mm kolonne af "Sephadex" G-50 (Pharmacia Fine 25 Chemicals), som var ækvilibreret med pufferopløsning A, og alle de proteinholdige fraktioner, der blev udtaget fra kolonnen, blev sammen hældt.

De samlede fraktioner blev derefter ført på en B.S.-kolonne (16 mm x 100 mm), hvor forbindelsen med formel I anvendes som ligand (jfr.

30 side 7), og som var ækvilibreret med pufferopløsning A. Efter vask af kolonnen med 1 kolonnerumfang pufferopløsning A og derefter med 2 kolonnerumfang pufferopløsning A indeholdende 10 mM ATP, blev gradientelueringen udført med en strømningshastighed på 30 ml/time under en lineær koncentrationsgradient, som blev etableret mellem 18

DK 151634B

3,75 kolonnerumgang pufferopløsning A og samme rumfang pufferopløsning A indeholdende 1,5M NaCI, og der blev opsamlet fraktioner på hver 10 mL Elueringsprofilen er vist i fig. 2. Under denne elue-ring kom det ønskede enzym ud fra kolonnen i en enkelt spids ved en 5 NaCI-koncentration i området mellem 0,1M og 0,3M. Fraktionerne med specifik aktivitet på 2,6 U/mg eller derover blev isoleret og sammenhældt (50 ml) ·

De samlede fraktioner blev koncentreret til 10 ml ved ultrafiltrering med "Diaflo" membranfilter PM-30 (Amicon Far East, Tokyo, Japan) og 10 derefter hældt på en G-100-kolonne (27 mm x 870 mm) ækvilibreret med pufferopløsning A.

Derefter blev kolonnen elueret med pufferopløsning A med en strømningshastighed på 30 ml/time, og der blev opsamlet fraktioner på hver 10 ml. Elueringsprofilen er angivet i fig. 3. Enzymaktiviteten faldt 15 sammen med den anden proteinspids. Fraktioner med specifik aktivitet på mindst 9 U/mg blev isoleret og sammenhældt (40 ml).

I nedenstående tabel II er angivet de data, der er opnået ved forskellige rensningstrin ved denne fremstilling.

Tabel II.

* 20 Fraktion Protein Total ak- Specifik Udbytte (mg) tivitet aktivitet (%) (U) (U/mg)

Partikulær fraktion 3,312 311 0,094 100 25 Overstående væske efter solubilisering 1,574; 238 0,151 77

Phosphocellulose behandlet 96,0 63,8 0,665 21 B. S.-behandlet 10,1 54,8 5,43 18 30 G-100-behandlet 3,5 37,8 10,8 12 * Mængden af proteiner blev bestemt ifølge Lowry's metode.

Homogeniteten af den ved den ovenfor beskrevne måde rensede acyl-CoA-syntetase fremgår klart af dens polyacrylamidgel-elektroforese-spor (fig. 4). Det blev desuden immunokemisk påvist, at det rensede

DK 151634 B

19 enzym ved denne fremstilling, som var afledt af glucosedyrkede celler, ikke kunne skelnes fra acyl-CoA-syntetase I afledt af samme gaerstamme dyrket på et medium indeholdende oliesyre som carbonkilde i stedet for glucose, men kunne skelnes fra acyl-CoA-syntetase II, 5 som deltager i β-oxidationssystemer i fedtsyrer.

Referenceeksempel 1

Ifølge dette eksempel blev variationen i mængde af en fedtsyre bestemt i nærværelse af acyl-CoA-syntetase, som var renset som beskrevet i eksempel 1.

10 En reaktionsopløsning indeholdende en forudbestemt mængde af kalium-oleat, 100 ymol tris-HCI-puffer pH-værdi 7,4, 5 ymol dithiothreitol, 1,6 ymol surfactant T, 7,5 ymol ATP, 10 ymol MgC^, 0,2 ymol kalium-phosphoenolpyruvat, 0,15 ymol NADH, 20 yg myokinase, 30 yg pyru-vat-kinase, 30 yg lactat-dehydrogenase og 4 yg af det rensede acyl- 15 CoA-syntetase pr. ml opløsning blev anbragt i en spektrofotometer- celle (Eppendorf, model Π01Μ) og forinkuberet ved 25°C i 1 minut.

En opløsning indeholdende 0,5 ymol CoA i et totalrumfang på 0,5 ml blev derefter tilsat for at initiere reaktionen, og variationen i optisk densitet (O.D.) ved 334 nanometer, som var knyttet til nedgangen i 20 mængde af NADH, blev aflæst på en skriverstrimmel. Som anført i figur 5 kunne der iagttages god lineær relation mellem mængden af kaliumoleat i opløsningen og ΔΟ.D.-værdien ved 334 nanometer, når mængden af oliesyre var i området mellem 0 og 25 nanomol.

Referenceeksempel 2 25 Under anvendelse af 10 nanomol af forskellige langkædede fedtsyrer blev ΔΟ.D.-værdierne bestemt på samme måde som beskrevet i referenceeksempel 1.

Resultaterne er sammenstillet i Tabel III. Det fremgår af tabel III, at de forsøgsdata, som er opnået i dette eksempel, er i god overens-30 stemmelse med den teoretiske værdi, 0,246, for AO.D. ved 334 nanometer angivet af H.U. Bergmeyer i Zeitschrift fiir Klinische Chemie und Klinische Biochemie, bind 13, side 507-508 (1975).

20

DK 151634B

Tabel III

Fedtsyre AO.D. ved 334 nanometer

Myristinsyre 0,210 5 Palmitinsyre 0,245

Palmitolsyre 0,235 *

Stearin syre 0,230

Oliesyre 0,240

Li noisy re 0,240 10 Linolensyre 0,250 * Reaktionsperiode 20 minutter.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til isolering og rensning af langkædet acyl-CoA-syntetase, kendetegnet ved, at mikroorganismeceller indeholdende 5 langkædet acyl-CoA-syntetase sønderdeles, hvorefter enzymet, som er bundet til membranerne, solubiliseres med et overfladeaktivt middel; og den opnåede ekstrakt, eventuelt efter rensning underkastes affinitets-chromatografi på en adsorbent, der som ligand indeholder en forbin-10 delse med den almene formel I S NH2 1 OQ0rj“ , SO^Na Cl hvor ét af symbolerne R1 og R2 betegner hydrogen, og det andet betegner et radikal -SOgNa.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at mikroorganismerne er gærarter eller bakterier.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mikroorganismerne er bakterier, der tilhører slægterne Escherichia, Bacillus eller Pseudomonas.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mikroorganismerne er gærarter, der tilhører slægterne Candida eller Saccharomyces. t DK 151634B

5. Fremgangsmåde ifølge hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den i affin itetschromatografien anvendte adsorbent er et stof med den almene formel 11 O NH~y y-NH-^ v SO^Na ΤΛ-Χ 5 hvor det ene af symbolerne R1 og R2 betegner hydrogen, det andet betegner et radikal -SO^Na, og X betegner en polysaccharidrest.