DK150813B - Fremgangsmaade til fremstilling af stabiliserede insulinoploesninger - Google Patents

Description

i 150813

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af stabiliserede insulinopløsninger, der er 5 specielt tilpasset til anvendelse i pumpeudstyr til kontinuerlig insulinindgift.

Der har i de senere år været ydet en stadig stigende indsats med henblik på udviklingen af bærebare eller implanterbare systemer til kontinuerlig infusion af insulin. 10 Hovedformålet med disse bestræbelser har været at give dia-betespatienten mulighed for at administrere insulin på en måde, som er lettere at tilpasse til de døgnmæssige variationer i patientens fysiologiske insulinbehov, end det har været muligt ved konventionel behandling med insulin.

15 Den mekaniske del af en anordning til kontinuerlig insulinindgift omfatter i det væsentlige sådanne elementer som et insulinreservoir, et pumpesystem og et katheter tilpasset efter den valgte administrationsmetode, som sædvanligvis er subkutan, intravenøs eller intraperitoneal.

20 Pumpesystemet kan være automatisk aktiverbart og kan også forsynes med en yderligere manuel regulering af indgiften af insulin, når der er et særligt behov herfor.

Hvis insulinopløsningen tilføres fra en sprøjte, vil denne også sædvanligvis fungere som insulinreservoir.

25 Anordninger af sprøjtetypen bæres sædvanligvis udenpå kroppen. Der er imidlertid også blevet udviklet betydelig mere komplicerede systemer, i hvilke hele den mekaniske enhed er konstrueret med henblik på implantering, sædvanligvis subkutant. Insulinreservoiret vil sædvanligvis være tilpasset til 30 perkutan genopfyldning.

Insulinets tilbøjelighed til udfældning i kommercielt tilgængelige opløsninger, hvorved både de mekaniske dele og infusionskatheteret tilstoppes, har vist sig at udgøre en væsentlig hindring for videreudvikling og klinisk 35 anvendelse af pumpeudstyr til kontinuerlig infusion. Herudover bestræber man sig af nærliggende grunde på at udvikle stadig mindre typer af insulinpumper. Derved opstår der et 2 150813 behov for mere koncentrerede insulinopløsninger end de, der hidtil har været tilgængelige, hvilket formentlig yderligere medvirker til at forværre de ovennævnte problemer.

Det antages almindeligvis, at forklaringen på 5 udfældningsfænomenet skal søges i insulinets tendens til at danne uopløselige fibriller, især hvis insulinopløsninger anvendes ved højere temperaturer i længere tid. Visse kendsgerninger tyder også på, at enhver art af bevægelse af eller i opløsningen, herunder f.eks. den turbulens, der induceres 10 ved opløsningens passage gennem et lille tværsnit eller en snæver åbning, bevirker insulinfibrillering. Det er indlysende, at insulinopløsninger udsættes for de fleste af eller alle sådanne påvirkninger i enhver form for insulinpumpeud-styr. De kendte insulinpræparaters generelle mangler i så 15 henseende er fyldestgørende dokumenteret i litteraturen, f.eks. i en publiceret oversigtsartikel af W.D. Lougheed et al. (Diabetologia vol. 19 (1980), s. 1 - 9).

For at løse dette problem har det været foreslået at anvende sure insulinopløsninger, der indeholder glutamin-20 syre eller asparaginsyre, se Diabetes 3£, (1981), 83, eller neutrale insulinpræparater, der indeholder en sukkerart, såsom glucose (D.S. Schade et al.: Satelite-Symposium to 16th European Association for the Study of Diabetes-Meeting, Greece, 22. - 23. sept., 1980, side 107). Det er yderligere 25 blevet foreslået at anvende et ikke-ionisk overfladeaktivt middel (H. Thurow: Tysk offentliggørelsesskrift nr.

29 52 119).

Insulin er imidlertid kemisk ustabil i syre selv under legemstemperatur, og kan reversibelt eller irreversi-30 belt reagere med kulhydrater, jfr. J. Brange and S. Havelund, "Properties of Insulin in Solution", in Artificial Systems for Insulin Delivery, Assisi 20. - 23. september, 1981, Editors: P. Brunetti et al. Raven Press, 1983. Endvidere må ovenfor nævnte ikke fysiologiske, overfladeaktive 35 middel betragtes som uønsket i lægemidler til parenteral anvendelse.

3 150813

Den foreliggende opfindelse afhjælper de ovenfor nævnte ulemper og vedrører en fremgangsmåde til fremstilling af insulinopløsninger, i hvilke insulinet i sammenligning med konventionelle insulinpræparater udviser en væsentlig 5 formindsket tilbøjelighed til udfældning under de betingelser, der hersker i insulinpumpeudstyr.

Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at zinkioner i visse koncentrationer udøver en høj stabiliserende effekt på neutrale insulinopløsniner.

10 Zink er blevet anvendt i årevis som krystallisati onsfremmende metal ved fremstillingen af insulinkrystaller. Insulinkrystaller anvendt til fremstilling af neutrale insulinopløsninger indeholder derfor sædvanligvis zink, jfr. f.eks. britisk patentskrift nr. 840.870, der svarer til 15 dansk patentskrift nr. 95007, og dansk patentskrift nr. 116.527.

Det fremgår imidlertid af det ovennævnte danske patentskrift nr. 95007, at insulinopløsningen bør have et indhold af zinkioner til rådighed for insulin på mindre end -3

20 13 x A x 10 milli-ækvivalenter zinkioner pr. liter, hvor A

angiver antallet af internationale insulinenheder pr. ml, svarende til et indhold af zinkioner på mindre end ca. 1 vægt% (beregnet på basis af tørinsulinkrystaller).

I nærværelse af forbindelser, der danner letoplø-25 selige forbindelser eller kompleksforbindelser med zink, kan præparaterne indeholde betydeligt mere zink, hvis blot mængden af zinkioner til rådighed for insulinet, og følgelig ikke bundet af sådanne forbindelser, ikke overstiger den ovennævnte øvre grænse.

30 Hvis indholdet af zinkioner til rådighed for insu lin overstiger den ovennævnte øvre grænse på ca. 1 vægtpro- 2+ cent, svarende til ca. 5 Zn /hexamer insulin, udfælder zinkinsulinkomplekser fra opløsningen.

Da langt den overvejende del af insulin i neutrale 35 opløsninger forekommer som insulinhexamere, er det i nærværende beskrivelse valgt at udtrykke zinkmængden pr. 6 molekyler monomer insulin. Det er uden betydning for denne 4 150813 beregningsmetode, om der er mere eller mindre mængder af andre associeringsformer af insulin til stede, såsom dimere 2+ eller hexamere. Sammenhængen mellem zink /hexamer insulin og % zink fremgår af følgende ligning: 5 „2+,, . , . % zink x MW. x 6

Zn /hexamer insulin = _ ms_ MW x 100 hvor MW står for molekylvægt1? 10 For at sikre sig, at en udfældning af zinkinsulin- komplekser undgås, har zinkinsulinindholdet i kommercielle insulinpræparater altid været holdt et godt stykke under den ovennævnte øvre grænse, og en undersøgelse af alle af ansøgerne kendte, kommercielle, neutrale insulinpræparater har 15 vist, at zinkionkoncentrationen i kendte præparater er ca. 2 - 3,5 Zn /hexamer insulin. Også de i ovennævnte danske patentskrift nr. 95007 fremstillede præparater har et zinkindhold væsentligt under den øvre grænse for udfældning af zink-insulinkomplekser, idet det højeste indhold af zink er 20 på 0,7% zink baseret på tørstofinsulin, hvilket svarer til 2+ ca. 3,7 Zn /hexamer.

Det fremgår imidlertid af fig. 1, at insulinpræparater med et zinkionindhold på 2 og endog op til 4 2+

Zn /hexamer insulin er ustabile under betingelser, der 25 efterligner forholdene for en kontinuerlig insulinindgift, fordi insulin udfælder i løbet af få dage. De i ovennævnte danske patentskrift nr. 95007 beskrevne insulinpræparater er derfor uegnede til kontinuerlig indgift, da de ligger inden for det ustabile område i fig. 1. Dette er yderligere 30 bekræftet ved forsøg, hvor det af ansøgerne er påvist, at et præparat fremstillet som beskrevet i eksempel 2 i dansk patentskrift nr. 95007 og indeholdende 0,7% zink har en stabilitetsfaktor på kun 2,5, hvilket betyder, at præparatet er for ustabilt til at kunne anvendes til kontinuerlig 35 indgift.

Det er derfor en overraskende erkendelse, at en forøgelse af zinkioner til visse specifikke koncentrationer 5 150813 netop under den øvre grænse for zinkinsulinudfældning på ca. 5 Zn /hexamer insulin udøver en stabiliserende effekt på insulinopløsninger under de ovenfor beskrevne betingelser for kontinuerlig insulinindgift.

5 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en insulinopløsning med en pH-værdi mellem ca. 7 og ca. 8, egnet til anvendelse ved kontinuerlig insulinindgift ved at være fysisk stabil under betingelser for en sådan indgift, og eventuelt omfattende et konserve-10 ringsmiddel, et middel, der gør opløsningen isotonisk, en puffer og et kompleksdannende middel, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der i nævnte insulinopløsning inkorporeres et i det væsentlige ioniseret zinksalt i en koncentration svarende til et indhold af zinkioner til rådighed 15 for insulin på mere end 4 Zn /hexamer insulin, men under grænsen for udfældning af zink-insulinkomplekser.

Med udtrykket "zinkioner til rådighed for insulin" skal der forstås zinkioner, der ikke er bundet til andre forbindelser, som danner kompleksforbindelser med zink, 20 f.eks. citrat, glycin eller phosphat.

Den øvre grænse for zinkionindholdet er den mængde zink, der bevirker udfældning af zinkinsulinkomplekser, 2+ d.v.s. ca. 5 Zn /hexamer insulin, som nævnt ovenfor.

Ifølge en foretrukket udførelsesform for den fore-25 liggende opfindelse overstiger indholdet af zinkioner til rådighed for insulin ikke 4,8 Zn /hexamer insulin, og indholdet af zinkioner til rådighed for insulin ligger for-trinsvis i området fra ca. 4,2 - ca. 4,5 Zn /hexamer insulin.

30 Foretrukne zinksalte er zinkacetat og zinkchlorid.

Ifølge en yderligere foretrukket udførelsesform for opfindelsen anvendes der fenol som konserveringsmiddel og glycerol som middel til at gøre opløsningen isotonisk.

Som nævnt tidligere refererer indholdet af zink 35 til zinkioner, der er til rådighed for insulin. I nærværelse af zinkkompleksdannende midler bindes noget af zinken til det kompleksdannende middel. Da imidlertid indholdet af 6 150813 zinkioner, der er til rådighed for insulin, stadig skal være over 4 Zn /hexamer insulin, må der tilsættes mere zink. Det totale indhold af zink i insulinpræparater, der omfatter et zinkkompleksdannende middel, ligger derfor mere eller mindre 5 over de ovenfor nævnte grænser afhængig af mængden af det anvendte kompleksdannende middel og dettes komplekskonstant.

Det foretrækkes ofte af anvende et zinkkompleksdannende middel, hvorved der sikres et større operabelt område for det totale zinkindhold baseret på insulinindhol-10 det. Hvis f.eks. noget af det udstyr, der anvendes til reservoir, pumpesystem, slanger etc., binder eller frigør zink, vil tilstedeværelsen af et zinkkompleksdannende middel sikre, at indholdet af zinkioner til rådighed for insulin vil ligge indenfor området ifølge den foreliggende opfindel-15 se.

Når insulinopløsningen indeholder et zinkkompleksdannende middel har det vist sig, at opløsningen for at være fysisk stabil under betingelserne for en kontinuerlig insulinindgift skal udvise et totalt zinkionindhold på mindst 5 2+ 20 Zn /hexamer insulin, og i en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse, indstilles det totale zinkind- 2+ hold til mindst 6 Zn /hexamer insulin.

De zinkkompleksdannende midler, der anvendes i de hidtil ukendte insulinopløsninger, bør være opløselige og 25 fysiologisk akceptable.

Egnede zinkkompleksdannende midler er aminosyrer, f.eks. glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, phenylalanin, prolin, tryptophan, asparagin, glu-taminsyre og histidin, og oligopeptider, såsom diglycin.

30 En anden gruppe af egnede zinkkompleksdannende midler er carboxylsyrer, såsom eddikesyre, eller hydroxycar-boxylsyrer, såsom citronsyre, 3-hydroxysmørsyre og mælkesyre .

Foretrukne zinkkompleksdannende midler er glycin 35 og citronsyre. Også foretrukne er diglycin og histidin.

Den mindste totale zinkionkoncentration til opnåelse af en væsentlig stabiliserende effekt, d.v.s. en stabi- 7 150813 litetsfaktor (som defineret i den detaljerede del af beskrivelsen) i området fra 5-10, afhænger af hvilket kompleksdannende middel, der anvendes. Imidlertid foretrækkes en stabilitetsfaktor over 10.

5 Hvis der anvendes et svagt kompleksdannende mid del, f.eks. glycin 10 mM, opnås der en tydelig stabilisering ved et totalt zinkindhold på ca. 5 Zn /hexamer insulin, jfr. tabel I og fig. II, og det foretrukne område for det 2+ totale zinkindhold er fra ca. 5 til ca. 8 Zn / hexamer 10 insulin.

Tabel I -2 40 IU svinemsulxn per ml i en 10 molær opløsning af glycin med zinkkoncentrationen varieret, fremstillet analogt 15 med eksempel 7.

2+

Zinkkoncen- Zn per * Stabilitets- tration hexamer faktor (M) insulin 20 _________ 1.0 10~4 2,4 1 1.8 10~4 4,4 4 2.0 10"4 4,9 7 2,2 10"4 5,4 45 25 2,6 10~4 6,4 49 3,4 10"4 8,4 8 3.8 10“4 9,4 10 4.0 10~4 9,9 15 30 * Totalt indhold af zinkioner.

2+

Sammenhængen mellem total Zn /hexamer insulin, den molære zinkkoncenration og internationale insulinenheder 35 kan beregnes som følger: (Zn) = X·0,99·10 Ymol/liter, hvor 8 150813 (Zn) er den molære zinkkoncentration udtrykt i mol/liter, X = internationale insulinenheder pr. ml. og 2+ Y = Zn /hexamer insulin 5 Hvis der anvendes et stærkere zinkkompleksdannen de middel, f.eks. citronsyre, kræves der et totalt zinkind- 2+ hold på fra ca. 40 til 200 Zn /hexamer insulin for at opnå en betydelig stabilisering, jfr. den følgende tabel II.

Når citronsyre anvendes som kompleksmiddel kan det 10 foretrukne totale zinkindhold ved pH 7,4 i millimol udtrykkes som 0,004 xA+kxB, hvor A er internationale insulinenheder pr. ml og B er den millimolære citratkoncentration, k ligger indenfor området fra 0,5 - 1,0, idet en k-værdi på ca. 0,7 - 0,8 foretrækkes.

15 Tabel II

40 IU svineinsulin pr. ml med varierende zink- og citratkoncentrationer, fremstillet analogt med eksempel 8.

é I »I—I— i —11 I |— I

2+ 20 Zinkkoncen- Zn pr. * Stabili- tration hexamer Citrat tetsfak- (M) insulin (M) tor 25 1,0 10"4 2 10~2 1 0,6 10-2 150 10~2 6 0,8 10-2 200 10-2 10 0,9 10~2 225 10-2 10 0,95 10-2 238 10-2 19 30 1,0 10~4 2 2,0 10-3 1 1,6 10“3 40 2,0 10-3 6 1,8 10-3 45 2,0 10~3 30 2,0 10-3 50 2,0 10-3 19

--I I

35 * Totalt indhold af zinkioner.

9 150813 Når der anvendes et zinkkompleksdannende middel, er den øvre grænse for det totale zinkindhold den mængde zink, der bevirker en udfældning af zinkinsulinkomplekset, d.v.s. når indholdet af zinkioner, der ikke er bundet af det 2+ 5 kompleksdannende middel, overstiger ca. 5 Zn /hexamer insulin.

Den i det følgende beskrevne stabilitetstest kan anvendes som et middel til at sikre sig, at der med de anvendte kompleksdannende midler tilvejebringes det 10 foretrukne interval på 4,2 - 4,5 Zn /hexamer insulin til rådighed for insulinet. Det totale zinkindhold i insulinopløsninger, der indeholder kompleksdannende middel, kan for-ventes at ligge mellem 5 og 10 Zn /hexamer insulin, når der anvendes svage kompleksdannende midler, og kan forventes at 15 ligge fra ca. 10 til ca. 200 Zn /hexamer insulin, når der anvendes stærke kompleksdannende midler.

Foruden stabilitetstesten kan den øvre grænse for det totale zinkindhold, d.v.s. det zinkindhold, der bevirker en udfældning af zinkinsulinkomplekser, anvendes til at 20 bestemme den mængde totalt zink i en insulinopløsning indeholdende kompleksmiddel, ved hvilken der opnås en væsentlig forøgelse i stabiliteten.

Det har vist sig, at den totale mængde af zinkioner i en insulinopløsning indeholdende kompleksdannende 25 middel kan forventes at være fra ca. 50 til ca. 90% af den mængde zinkioner, der ville bevirke en udfældning af zinkinsulinkomplekser .

Den totale mængde af zinkioner er fortrinsvis fra ca. 60 til ca. 90% og mere foretrukket fra ca. 75 til ca.

30 90% af den mængde zinkioner, der ville bevirke udfældning af zinkinsulinkomplekser.

Neutrale insulinpræparater indeholdende kompleksdannende midler eller puffere, der danner komplekser med zink, er kendt fra beskrivelsen til det ovennævnte danske 35 patent nr. 116.527 og fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1851/80. Det højeste, beskrevne zinkindhold er imidlertid 1% Zn beregnet på vægten af tørinsulin svarende 2+ 150813 10 til ca. 5,5 Zn /hexamer insulin. Ansøgerne har reproduceret eksempel 2 og 6 i dansk patentskrift nr. 116 527, jfr. de efterfølgende eksempler 9 og 10. Det fremgår heraf, at de kendte præparater udviser en stabilitetsfaktor på kun hen- 5 holdsvis 3,5 og 1. Det kan derfor indirekte sluttes, at disse præparaters indhold af zink til rådighed for insulin, d.v.s. zink, der ikke er bundet til det kompleksdannende 2+ middel, ligger under 4 Zn /hexamer insulin. Dette skyldes, at de kendte præparater begge indeholder kompleksdannende 10 midler, nemlig henholdsvis phosphatpuffer og citratpuffer.

En del af zinken vil derfor være bundet til det kompleksdannende middel og er derfor ikke til rådighed for insulinet, og de kendte præparater er som påvist uegnede til kontinuerlig insulin indgift, idet de har for ringe fysisk stabilitet 15 til en sådan indgift. De øvrige eksempler i dansk patentskrift nr. 116.527 beskriver præparater med et zinkindhold på mellem 0,1 og 0,5% zink (total zink). Disse præparater ligger derfor uden for det ifølge den foreliggende opfindelse foretrukne område.

20 Koncentrationen af insulin i opløsningen fremstil let ifølge den foreliggende opfindelse ligger fortrinsvis i området fra 5 - 750 I.U. og især fra 40 - 500 I.U. pr. ml. Insulinopløsningerne kan f.eks. fremstilles ved at opløse krystallinsk zinkinsulin, f.eks. en højtrenset form for 25 insulin, såsom "monokomponent" insulin (jfr. britisk patentskrift nr. 1.285.023) i vand i nærværelse af en syre, f.eks. saltsyre. En vandig opløsning af konserveringsmidlet, f.eks. fenol eller en alkylfenol, såsom cresol, eller methylparahy-droxybenzoat, fremstilles særskilt og kan om ønsket også 30 indeholde et middel til regulering af osmotisk tryk, såsom glycerol, fortrinsvis i en mængde beregnet til at gøre den endelige opløsning isotonisk, og om ønsket et zinkkompleks-dannende middel, såsom citrat eller glycin. Denne opløsning sættes derpå til den sure insulinopløsning efterfulgt af 35 tilsætning af en base, f.eks. natriumhydroxidopløsning, til indstilling til en neutral pH-værdi. I nærværende ansøgning forstås der ved neutral pH-værdi en pH-værdi i området fra 11 150813 ca. 7 - ca. 8. Den beregnede mængde af zinksaltet, f.eks. zinkacetat, pufferen (om ønsket) f.eks. TRIS, og det zink-kompleksdannende middel kan tilsættes på dette trin, hvorefter pH-værdien genjusteres. Zinksaltet kan alternativt 5 inkorporeres i den sure insulinopløsning før dennes neutralisation. Den fremkomne opløsning fyldes til slut op til det ønskede rumfang med vand, steriliseres ved filtrering og overføres derpå til sterile ampuller.

10 Stabilitetstest

De således fremstillede insulinopløsninger underkastes en stabilitetstest under forcerede betingelser på følgende måde:

Ampuller med et rumindhold på 12,5 ml, der hver 15 indeholder en 10 ml prøve af opløsningen og er forsynet med en gummihætte, anbringes lodret på en rysteplatform (Type 01 T623TBSH02, indkøbt hos HETO, Birkerød, Danmark), som er fuldstændig neddyppet i et vandbad, der holdes ved en temperatur på 41°C ± 0,1°C. Platformen udsættes for en vandret 20 rystebevægelse med en frekvens på 100 rpm og en amplitude på 50 mm.

Opalescensen af prøverne måles med regelmæssige tidsintervaller på et Fischer DRT 1000 nephelometer udstyret med en ampuladaptor. Fibrilleringstiden defineres som den 25 tid, der hengår, indtil prøven udvikler en turbiditet på 10 nephelometriske turbiditetsenheder (NTU).

Hver test udføres med testprøver og kontrolprøver uden tilsat zinksalt (4-5 ampuller af hver), der behandles side om side. Kontrolprøverne svarer til testprøverne bort- 2 + 30 set fra, at kontrolprøverne indeholder ca. 2 Zn /hexamer insulin, idet zinkindholdet i kontrolprøverne stammer fra krystalliseringen af insulinet. Stabilitetsfaktoren beregnes som forholdet mellem de gennemsnitlige fibrilleringstider for henholdsvis testprøver og kontrolprøver: 35 Opfindelsen skal forklares i yderligere detaljer under henvisning til tegningen, på hvilken 12 150813

Fig. 1 viser stabilitetsfaktoren ved 40°C som en funktion af zinkionkoncentrationen (100 I.U. svineinsulin pr. ml, fremstillet ifølge eksempel 1), og

Fig. 2 viser stabilitetsfaktoren ved 41°C som en 5 funktion af det totale indhold af zinkioner i nærværelse af et svagt kompleksdannende middel (40 I.U. svineinsulin pr. ml. i 10 mM glycin fremstillet analogt med eks. 7).

Det fremgår af fig. 1, at stabiliteten af insulinopløsningen forøges drastisk, når zinkionindholdet er over 4 2+ 10 Zn /hexamer insulin.

I nærværelse af et svagt kompleksdannende middel opnås en væsentlig forøgelse af stabiliteten ved et højere 2+ zinkionindhold, f.eks. over 5 Zn /hexamer insulin, fordi noget af zinken er bundet til det kompleksdannende middel og 15 følgelig ikke er til rådighed for insulinet.

Yderligere detaljer angående udøvelsen af den foreliggende opfindelse fremgår af de efterfølgende eksempler.

I eksemplerne blev vandige opløsninger og vand 20 steriliseret førstnævnte ved filtrering, og de efterfølgende operationer blev udført under aseptiske betingelser.

Eksempel 1 100 I.U. svineinsulin pr. ml indeholdende 4,2 2+ 25 Zn /hexamer insulin.

Krystallinsk monokomponent svineinsulin (264 mg) med et zinkindhold på 0,4% og en total aktivitet på 10.000 30 I.U. blev opløst i vand (50 ml) indeholdende saltsyre (325 μΐ normal), hvorpå der blev tilsat en vandig opløsning (25 ml) indeholdende 1,6 g glycerol og 200 mg fenol. pH-værdien af opløsningen blev indstillet til 7,5 ved hjælp af en natriumhydroxidopløsning. Zinkacetat (1,56 ml 10 mM opløs-35 ning) blev tilsat, og pH-værdien blev genjusteret til 7,5, og det totale rumfang blev fyldt op til 100 ml med vand. Den 13 150813 fremkomne opløsning blev steriliseret ved filtrering og derpå overført aseptisk til ampuller (10 ml).

Stabilitetsfaktor: > 15.

5

Eksempel 2 500 I.U. svineinsulin pr. ml indeholdende 4,2 2+

Zn /hexamer insulin.

10

Krystallinsk monokomponent svineinsulin (20,75 g) indeholdende 0,4% zink og med en total aktivitet på 550.000 I.U. blev opløst i 550 ml vand indeholdende saltsyre (10 ml normal).

15 Til en prøve af denne opløsning (50 ml) blev der sat zinkacetat (78 μΐ molær opløsning) efterfulgt af tilsætning af 25 ml af en vandig opløsning indeholdende 1,6 g glycerol og 200 mg fenol. pH-værdien af opløsningen blev indstillet til 7,4 ved hjælp af natriumhydroxidopløsning, og 20 det totale rumfang blev indstillet til 100 ml med vand. Den fremkomne opløsning blev steriliseret ved filtrering og derpå aseptisk overført til ampuller (10 ml).

Stabilitetsfaktor: 5.

25

Eksempel 3 100 I.U. humaninsulin pr. ml indeholdende 4,3 2+

Zn /hexamer insulin.

30 ___________________

Krystallinsk monokomponent humaninsulin (1,67 g) indeholdende 0,4% zink og med en total aktivitet på 45.000 I.U. blev opløst i 225 ml vand indeholdende saltsyre (1,46 35 ml normal). Til en prøve af denne opløsning (25 ml) blev der sat zinkacetat (100 μΐ 0,1 molær opløsning), hvorpå der blev tilsat 10 ml af en vandig opløsning indeholdende 0,8 g gly- 14 150813 cerol og 0,1 g fenol. pH-værdien af opløsningen blev indstillet til 7,4 ved hjælp af natriumhydroxidopløsning, og rumfanget blev indstillet til 50 ml med vand. Den fremkomne opløsning blev steriliseret ved filtrering og derpå aseptisk 5 overført til ampuller (10 ml).

Stabilitetsfaktor: 26.

Eksempel 4 10 100 I.U. svineinsulin pr. ml indeholdende 4,5 2+

Zn /hexamer insulin.

15 Proceduren var analog med den i eksempel 1 beskrevne med undtagelse af, at 1,89 ml af en 10 mM zinkace- 2+ tatopløsning blev tilsat for at tilvejebringe 4,5 Zn /hexamer insulin.

20 Stabilitetsfaktor: > 33.

Eksempel 5 40 I.U. humaninsulin pr. ml indeholdende 4,2 2+ 25 Zn /hexamer insulin.

Krystallinsk monokomponent humaninsulin (741 mg) indeholdende 0,4% zink og med en total aktivitet på 20.000 30 I.U. blev opløst i 60 ml vand indeholdende saltsyre (640 μΐ normal) og zinkacetat (3,96 ml 0,01 M). 400 ml af en vandig opløsning indeholdende 1 g fenol og 8 g glycerol blev tilsat, hvorpå pH-værdien blev indstillet til 7,45 ved hjælp af en natriumhydroxidopløsning, og rumfanget blev fyldt op til 35 500 ml med vand. Opløsningen blev steriliseret ved filtrering og derpå overført aseptisk til ampuller (10 ml).

15 150813

Stabilitetsfaktor: 34,

Eksempel 6 5 100 I.U. humaninsulin pr. ml indeholdende 4,2 2+ -2 Zn /hexamer insulin i 10 molær TRIS.

Krystallinsk monokomponent humaninsulin (1852 mg) 10 indeholdende 0,4% zink og med en total aktivitet på 50.000 I.U. blev opløst i 60 ml vand indeholdende saltsyre (1600 μΐ normal) og zinkacetat (99 μΐ molær). 400 ml af en vandig opløsning indeholdende 1 g fenol og 8 g glycerol blev tilsat, hvorpå pH-værdien blev indstillet til 7,45 med TRIS 15 (606 mg) og natriumhydroxidopløsning, og rumfanget blev indstillet til 500 ml med vand. Den fremkomne opløsning blev steriliseret ved filtrering og derpå aseptisk overført til ampuller (10 ml).

20 Stabilitetsfaktor: 16.

Eksempel 7 40 I.U. svineinsulin pr. ml i 2,6*10 ^ og 10 2 2 + 25 molær opløsning af henholdsvis zink og glycin. Zn /hexamer insulin = 6,4.

Krystallinsk monokomponent svineinsulin (1,49 g) 30 indeholdende 0,4% zink og med en total aktivitet på 40.000 I.U. blev opløst i 120 ml vand indeholdende saltsyre (1280 μΐ normal) efterfulgt af tilsætning af 730 ml af en vandig opløsning indeholdende 2 g fenol, 8 g glycerol og 75.1 mg glycin. pH-værdien blev indstillet til 7,5 ved hjælp af 35 natriumhydroxidopløsning. Zinkacetat (160 μΐ molær) blev tilsat, pH-værdien blev indstillet til 7,5, og rumfanget blev indstillet til 1000 ml med vand. Opløsningen blev ste- 16 150813 riliseret ved filtrering og derpå overført aseptisk til ampuller (10 ml).

Stabilitetsfaktor: 49.

5

Eksempel 8 -3 -3 40 I.U. svinemsulm pr. ml i 1,8’10 og 2*10 2+ molaer opløsning af henholdsvis zink og citrat. Zn /hexamer 10 insulin = 45

Krystallinsk monokomponent svineinsulin (746 mg) indeholdende 0,4% zink og med en total aktivitet på 20.000 15 I.U. blev opløst i 60 ml vand indeholdende saltsyre (640 μΐ normal). 400 ml af en vandig opløsning indeholdende 1 g fenol og 8 g glycerol blev tilsat, og pH-værdien blev indstillet til 7,5 med natriumhydroxidopløsning. Citronsyre (210 mg monohydrat) og zinkacetat (850 μΐ molær) blev til-20 sat, og pH-værdien blev indstillet til 7,5. Opløsningen blev steriliseret ved filtrering og derpå overført aseptisk til ampuller (10 ml).

Stabilitetsfaktor: 30.

25

Eksempel 9 (sammenligning) 40 I.U. okseinsulin pr. ml i 13,3 mM natriumphos- 2+ phatopløsning. (Total zink 1% 5,5 Zn /hexamer insulin).

30 ________________

Eksempel 2 i dansk patentskrift nr. 116.527 blev reproduceret. Zinkindholdet blev indstillet til ca. 5,5 2+

Zn /hexamer insulin ved tilsætning af zinkacetat, og pH-35 værdien blev indstillet til 6,91. Opløsningen blev steriliseret ved filtrering og derpå overført aseptisk til ampuller (10 ml).

17 150813

Stabilitetsfaktor: 3,5 Eksempel 10 (sammenligning) 5 40 I.U. okseinsulin pr. ml i 10 mM citratopløs- 2+ ning. (Totalt zink 1% Λ/ca. 5,5 Zn /hexamer insulin).

Eksempel 6 i dansk patentskrift nr. 116.527 blev 10 reproduceret. Zinkindholdet blev indstillet til ca. 5,5 2+

Zn /hexamer insulin ved tilsætning af zinkacetat, og pH-værdien blev indstillet til 7,5. Opløsningen blev steriliseret ved filtrering og derpå overført aseptisk til ampuller (10 ml).

15

Stabilitetsfaktor: 1

Claims (4)

150813 - 18 - 5 PATENTKRAV

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en insulinopløsning med en pH-værdi mellem ca. 7 og ca. 8 egnet til 10 anvendelse ved kontinuerlig insulinindgift ved at være fysisk stabil under betingelser for en sådan indgift og eventuelt omfattende et konserveringsmiddel, et middel til at gøre opløsningen isotonisk, en puffer og et kompleksdannende middel, kendetegnet ved, at der i nævnte 15 insulinopløsning inkorporeres et i det væsentlige ioniseret zinksalt i en koncentration svarende til et indhold af zink-ioner til rådighed for insulin på mere end 4 Zn /hexamer insulin, men under grænsen for udfældning af zink-insulin-komplekser. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der inkorporeres et i det væsentlige ioniseret zinksalt i en koncentration svarende til et indhold af zinkioner til rådighed for insulinet på mere end 4 Zn /he- 2+ 25 xamer insulin og mindre end ca. 4,8 Zn /hexamer insulin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der inkorporeres et i det væsentlige ioniseret zinksalt i en koncentration svarende til et indhold af 30 zinkioner til rådighed for insulinet på fra ca. 4,2 til ca 2+ 4,5 Zn /hexamer insulin.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det anvendte zinksalt 35 er zinkacetat eller zinkchlorid.