DK149620B - Fremgangsmaade til adskillelse af blod opdelt i serum og sedimentat og apparat til brug herved - Google Patents

Description

149S20

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til at adskille en i serumoverfase og cellulært sedimentat under centrifugering opdelt blodprøve og et apparat til anvendelse ved fremgangsmådens udøvelse.

Biomedicinske laboratorier og hospitalslaboratorier har stigende behov for at køre rutinemæssige såvel som specialiserede diagnostiske analyser på blodprøver. Til disse formål har man udviklet automatisk udstyr, hvori blodprøver underkastes programmerede analyser, der udskrives på båndskriver. Dog består fortsat problemet at fraskille serum i ren og kvantitativ form til analyse. Hertil benyttes sedimentation af celler fra en serumoverfase ved centrifugering, idet man anvender centrifugeglas med forskellige typer 149620 2 indsatsrør forsynet med afspærringsorganer. Fra USA patentskrift nr. 3.512.940 kendes et sådant rør med filter i enden til at indsætte i et andet større rør indeholdende blodprøven, som filtreres under centrifugeringen. I USA patentskrift nr. 3.508.653 beskrives et centrifugeglas udstyret med stempel af fast stof, der som en prop drives gennem blodprøven under centrifugeringen og lejrer sig mellem serumoverfasen og det cellulære sedimentat. Brugen af to rør inden i hinanden ifølge USA patentskrift nr. 3.512.940 er dog for kostbar til engangsbrug, mens brug af fast prop ifølge USA patent nr. 3.508.653 har den ulempe, at når proppen udsættes for væsentlig centrifugalkraft, vil den også udvikle radialkræfter, rettet mod reagensglassets side og skabe fare for brud. Faktisk har systemet vist så høje brudprocenter, at det er praktisk ubrugeligt. Hertil kommer, at disse indsatser kræver løs tilpasning for at kunne glide under centrifugering og derfor ikke tilvejebringer fuldstændig effektiv adskillelse i rene kvantitative faser.

Fra Cancer, bind 12, side 590-95 (1959) kendes en metode til isolation af fritflydende cancerceller fra blod ved flotation på et lag flydende silicone under centrifugering til opdeling af helt blod i serumoverfase og cellulært sedimentat. Herved tilpasses det flydende siliconeadskillelsesmediums massefylde efter massefylden på de cancerceller, der ønskes fraskilt, og som fås i et lag græn-sende umiddelbart op til siliconelaget. Af dette litteratursted fremgår tydeligt, hvor vanskeligt det er efter selve centrifugeringstrinet at skille de opnåede faser ad for at få fat i de ønskede fraktioner. Specielt anføres, at centrifugeringen ikke må være for hård og for langvarig, nemlig for ikke at Ødelægge de komponenter, som ønskes isoleret.

Fra Blood, bind 18, side 89-94 (1961) kendes en metode til fraskillelse af blodplader fra helt blod ved simpel centrifugering under anvendelse af en blanding af flydende siliconer valgt specielt med henblik på deres massefylde, således at der under centrifugeringstrinet tilvejebringes en flydende adskillelsesmembran, oven på hvilken de søgte blodplader svømmer. Også herved foreskrives kort centrifugering for at undgå uheldig beskadigelse af de ømfindtlige blodplader. Endvidere foreskrives en ret vanskelig afpipettering med henblik på at isolere den Ønskede fraktion. En anden metode er itufiling af centrifugeglasset i umiddelbar nærhed af det ønskede plasmalag, som opsamles, efter at centrifugeglasset er knækket på det filede sted.

149620 3 I begge ovennævnte litteratursteder foreskrives anbringelse af siliconeadskillelsesmediet i væskeform i bunden af centrifugeglasset, og blodprøven anbringes ovenpå. Ved centrifugering skal de cellulære komponenter synke ned gennem siliconevæsken, som altså ikke må være for tykflydende for at sikre en blot nogenlunde effektiv adskillelse i de to ovennævnte hovedfraktioner. Det ses endvidere, at man netop på grund af adskillelsesmediets flydende natur har meget vanskeligt ved at adskille de efter centrifugeringen fremkomne fraktioner rent fysisk, i hvert fald under opnåelse af kvantitative udbytter af de rene fraktioner, såfremt man benytter sig af simple metoder beregnet på masseproduktion i rene analyselaboratorier, dvs. i fabriksmålestok.

Den foreliggende opfindelse sigter på at tilvejebringe en rationel fremgangsmåde til at foretage den ønskede opdeling, specielt under fraskillelse af kvantitative udbytter af rene serumfraktioner, på en måde, der er velegnet til gennemførelse i industriel målestok og helt ved fuldautomatiserede metoder og/eller til udøvelse af ikke fagtrænet personale. Endvidere sigter opfindelsen på at tilvejebringe et organ til afgivelse af adskillelsesmedium, der er tilstrækkeligt billigt at tillade éngangsbrug, og som er velegnet til montering i centrifugeglas ved aflevering fra automater, hvilket også letter steril operation.

Ingen af de fra ovennævnte litteratursteder kendte flydende siliconskillemedier er velegnede til dette formål, for det første på grund af ovennævnte flydende tilstand, som besværliggør adskillelse efter centrifugering ved simpel dekantering, og for det andet fordi de kan være besværlige at dosere nøjagtigt og i hvert fald kræver særligt afgivelsesudstyr til brug på stedet for deres aflevering i centrifugalglassene. For det tredje er de ifølge litteraturstederne normalt anvendte ret tyndtflydende siliconer og blandinger heraf ved en lidt hårdere centrifugering med henblik på tilvejebringelse af mere effektiv adskillelse stærkt tilbøjelige til at dispergeres i serumfasen, således at der ikke fås et veldefineret grænselag.

Det har nu imidlertid vist sig, at såfremt man i stedet blander sådanne flydende siliconer (specielt de lidt mere viskose blandt disse) med findelte indifferente fyldstoffer, specielt fin-pulveriseret siliciumoxid, bentonit, aluminiumoxid eller talk, kan man frembringe en halvstiv gelagtigt konsistens, og at det herved tilvejebragte forseglingsmateriale tåler centrifugering uden at 149620 4 vise tegn på dispersion i den ved centrifugeringen fremkomne serumoverfase. Tværtimod lejres laget roligt som en effektiv adskillelse mellem serumoverlaget og det cellulære sedimentat. De pågældende halvstive gelagtige forseglingsmidler udviser tixo-tropi, idet de bliver mere tyndtflydende ved forskydningspåvirkning, men påny antager halvstiv form, når de er i ro.

Dette fænomen er specielt udnyttet ved den foreliggende opfindelse, idet spærremediet anbringes i et særligt afgivelsesorgan og opbevares deri i halvstiv tilstand uden fare for at løbe ud, da afgivelsesorganet er udformet som en dyse med lille åbning.

Denne dyse og specielt åbningen er dimensioneret således, at organets indhold af tixotropt spærremedium, når det underkastes den under centrifugeringen normalt forekommende tyngdeacceleration, vil presses igennem åbningen, fordi hele massen af tixotropt middel befinder sig på et sted i tyngdefeltet over det, der svarer til lejringen ifølge dets naturlige massefylde. Når det presses ud gennem den snævre dyse og åbningen, underkastes spærremediet en forskydningspåvirkning, som får det til at antage flydende form.

Således vil spærremediet afgives gradvis fra adskillelsesorganet, samtidig med at blodet under centrifugeringens første fase adskilles effektivt i serumoverfase og cellulært sedimentat. Herved opnås, at de cellulære og fibrøse dele ikke skal passere igennem adskillelsesmediet med fare for at blive standset på dettes overflade på grund af adskillelsesmediets ret seje konsistens. Da adskillelsesmediet imidlertid på dette trin stadig er flydende, vil det efter lejring ifølge sin massefylde løbe sammen til dannelse af et sammenhængende lag, som efter at være kommet i ro på ny antager en halvstif gelagtig konsistens og derved tilveje-bringer en effektiv afspærring mellem de to hovedfraktioner, hvori blodet nu er opdelt ved centrifugeringen. Herefter kan serumover-fasen uden vanskelighed dekanteres praktisk taget kvantitativt fra i praktisk taget ren tilstand, dvs. uden at forurenes med hverken skillemedium eller cellulære eller fibrøse dele fra sedimentat.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man som spærrelag anvender et thixotropt, vanduopløseligt, ugif-tigt medium med massefylde på 1,026-1,092 g/cm bestående af en tyktflydende silicone og et deri ensartet dispergeret, findelt, indifferent fyldstof til dannelse af en halvstiv gel anbragt i et afgivelsesorgan, som monteres på et centrifugeglas, der rummer blod 149620 5 prøven, at spærremediet indføres gradvis i blodet under selve centrifugeringstrinet ved udpresning fra afgivelsesorganet i flydende tilstand under centrifugalaccelerationens påvirkning og afleveres inde i blodvæsken på et niveau over spærrelagets endelige placering, at centrifugering fortsættes, indtil total afspærring er etableret under gendannelse af en sammenhængende halvstiv gel, idet spærremediet sedimenterer, og at serumoverfasen skilles fra efter centrifugeringen, fortrinsvis ved dekantering.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udgør en simpel og sikker metode til frembringelse af en effektivt isoleret serumprøve direkte efter centrifugering. Til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes endvidere et spærremiddelafgivelsesorgan, der er ejendommeligt ved, at det består af en beholder, som er udformet med en krave og anlægsflade dimensioneret til let indføring i og sikker fastholdelse på centrifugeglasset under centrifugeringstrinet, og som er forsynet med en langstrakt dysedel, der ved organets anbringelse i centrifugeglasset strækker sig ind i blodprøven til det valgte afgivelsesniveau, og forneden er forsynet med en åbning dimensioneret til gradvis dosering af en tixotrop væske med den i krav 1 angivne massefylde under centrifugeringstrinet.

Det foretrækkes, at spærremiddelafgivelsesorganet gøres så billigt, at det uden videre kan bortkastes efter éngangsbrug. Fremgangsmåden gennemføres hensigtsmæssigt således, at det indifferente fyldstof er siliciumoxid.

Til nærmere forståelse af opfindelsen henvises til tegningen , hvor fig. 1 viser et tværsnitsbillede af et reagensglas og et afgivelsesorgan ifølge opfindelsen adskilt fra hinanden, fig. 2 viser et tværsnitsbillede af et reagensglas og et delvis gennemskåret afgivelsesorgan ifølge opfindelsen, hvor afgivelsesorganet er monteret i reagensglasset og rager ned i en blodprøve, fig. 3 viser et tværsnitsbillede ligesom i fig. 2, under første del af centrifugeringen, fig. 4 viser et lignende billede som i fig. 2, efter centrifugeringen, fig. 5 viser et tværsnitsbillede af reagensglasset, hvori spærrelaget befinder sig på plads oven på det cellulære sediment, idet serumoverfasen allerede er fjernet, f.eks. ved simpel dekantering, 149620 6 fig. 6 viser et forstørret tværsnitsbillede af spærremiddel-afgivelsesorganet ifølge opfindelsen, der indeholder det tixotrope medium, fig. 7 viser et billede af det i fig. 6 viste afgivelsesorgan set ovenfra, og fig. 8 viser et billede af afgivelsesorganet i fig. 6 set nedenfra.

Der henvises nu til tegningen, hvor der på de forskellige .figurer ses en beholder 10, som rummer en blodprøve og er illustreret som et reagensglas med lige vægge og åbent i den øverste ende 11. Ned i den åbne ende er indsat et afgivelsesorgan 12. Dette organ 12 har en flangedel 14, som rager ud over den øverste kant 16 af beholderens sidevæg 18. Afgivelsesorganet 12 (se fig. 6) indbefatter en masseopbevaringsdel bestående af tre ringformede afdelinger 20, 22 og 24. Fra delen rager en afgangsdyse- eller ventildel 26 frem, og ved enden af dysen 26 findes en spids 28 med en åbning 30 i. Formålet med de tre ringe 20, 22 og 24 er at tillade, at afgivelsesorganet 12 kan anvendes i beholdere med forskellige diametre. Ringen 20 har en skulder 32 og en sidevæg 33, ringen 22 har en skulder 34 og en sidevæg 35, og ringen 24 har en skulder 36 og en sidevæg 37. Når der benyttes en snæver beholder, er afgivelsesorganet lejret på den øverste kant af beholderens sidevæg, idet det hviler på den ene af skuldrene 32, 34 eller 36, og sidevæggen for den næste smallere ring er parallel med sidevæggen i beholderen, som den rager ned i. Under centrifugeringen sikrer dette anlæg mellem beholderens indre overflade og ringens sidevæg afgivelsesorganets stabilitet.

Ved anvendelse af afgivelsesorganet således som her illustreret er det således muligt at anvende et enkelt afgivelsesorgan til beholdere med diametre varierende inden for et interval svarende til de tre ringes bredde.

Hoveddelen af afgivelsesorganet har en åben ende 37, o-ver hvilken er anbragt et lukke 38. I lukket 38 er en lille åbning 40. Lukket 38 anbringes først over den åbne ende, når forseglingsmidlet 42 er anbragt i afgivelsesorganet.

Forseglingsmidlet 42 består i det væsentlige af en tyktflydende silicone med et deri dispergeret indifferent fyldstof såsom siliciumoxid. Forseglingsmidlet skal have en specifik massefylde 3 på mindst 1,026 g/cm og fortrinsvis i intervallet fra 1,030 til 3 1,050 g/cm .

149620 7

Blods normale specifikke massefylde som bestemt ved pyknome- termetoden regnes for at ligge i intervallet fra 1,048 til 1,066 3 3 g/cm og med gennemsnit fra 1,052 til 1,063 g/cm . Efter centrifugering foreligger det fra resten af blodet adskilte blod-serum med en massefylde på mindst 1,026 g/cm og sædvanligvis i 3 området fra 1,026 til 1,031 g/cm . Den specifikke massefylde for 3 de tungere dele såsom erythrocyterne er 1,092 til 1,095 g/cm .

Ved udvælgelse af et forseglingsmiddel er det nødvendigt at vælge et sådant, som har en specifik massefylde, der er større end serumoverfasens. Følgelig må forseglingsmidlet have en specifik 3 massefylde på mindst 1,026 g/cm . Dets specifikke massefylde må imidlertid ikke være for høj, da det i så tilfælde ville lejres som lag et sted inde i det cellulære sedimentat. En sådan lejring vil være uden praktisk anvendelighed med hensyn til opnåelse af opfindelsens formål kvantitativ fraskillelse af ren serumoverfase. Dette opnås navnlig let og effektivt, når ifølge opfindelsen spærre-mediet hensigtsmæssigt har en massefylde fra 1,030 til 1,050 g/cm .

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved specielt at angive foretrukne sammensætninger for spærremediet, der er særlig velegnede til anvendelse i forbindelse med det ovenfor gennemgåede afgivelsesorgan ifølge opfindelsen.

Eksempel 1

Der fremstilles et spærremedium ved grundig sammenblanding af følgende bestanddele

Komponent Vægtdele

Tyktflydende silicone (dimethylpolysiloxan) 100 3

Siliciumoxid (specifik massefylde 2,65 g/cm ) 8 3

Siliciumoxid (specifik massefylde 2,3 g/cm ) 6

Den i det foreliggende eksempel anvendte tyktflydende silicone indeholder en dimethylpolysiloxanpolymer fremstillet af Union Carbide Corporation og markedsført under handelsnavnet "L-45". Den har en viskositet på 12.500 centistoke og en specifik massefylde på ca. 0,973 g/cm^ ved 25°C. Siliciumoxidet med specifik massefylde på 2,65 g/cm er et amorft siliciumoxid med en partikelstørrelse på mindst 75% under 5,0 μ. Det fremstilles af Whittaker,

Clark & Daniels og markedsføres under handelsnavnet "No. 31 Lo Micron".

3 8 149620

Siliciumoxidet med specifik massefylde på 2,3 g/cm er et hydrofobt amorft siliciumoxid med en gennemsnitlig partikelstørrelse på ca.

20 mp. Det fremstilles af Degussa Inc. og markedsføres under registreret varemærke "Aerosil R 972".

Siliconen og siliciumoxiderne sammenblandes, hvilket giver en thixotrop masse med en specifik massefylde fra 1,045 til 1,050 g/crn^.

Spærremidlet anbringes derpå i et afgivelsesorgan af den på tegningen i fig. 6 illustrerede særlige type. Flangens diameter er 18 mm og dens totale længde er 45 mm, idet dysespidsen er 28 mm. Åbningen i denne spids er 0,8 mm. Det fyldte afgivelsesorgan anbringes i et standard-reagensglas med en total længde på 10 cm, idet skulderen 32 af den første ring hviler på reagensglassets munding. Reagensglasset er i forvejen fyldt med en prøve af helt blod til en afstand af 28 mm fra reagensglassets åbne ende. Strækningen fra afgivelsesorganets skulder 32 til enden af dysespidsen er 38 mm. Afgivelsesorganets spids og en del af dysen strækker sig således et godt stykke ned i blodprøven.

Reagensglasset med blodprøve og afgivelsesorgan centrifugeres i ca. 10 minutter. Efter 5 minutters centrifugering er praktisk talt hele mængden af spærremiddel løbet ud fra afgivelsesorganet'. Spærremidlet dispergeres ikke, men forholder sig tværtimod homogent og lejres i ro som et lag mellem serumoverfasen og det cellulære sedimentat, hvori blodet nu er opdelt. Det konstateres at spærremidlet lægger sig roligt som et jævnt lag mellem de to dele, da dets specifikke massefylde på 1,045 til 1,050 g/cm er mindre end de sedimentatets og større end serumoverfasens specifikke massefylder. Spærremidlet danner et tæt lukke mod reagensglassets indervæg. Det konstanteres også, at der i spærremidlet, især i nærheden af sedimentatet, er iblandet fibrøst stof, som er filtreret ud fra serumdelen, efterhånden som spærremidlet er faldet til ro og har lejret gig på et niveau bestemt ved dets egen specifikke massefylde.

Anvendelsen af afgivelsesorganet, der strækker sig ned i blodprøven, fremskynder adskillelsen, da det ikke er nødvendigt, at spærremidlet skal overvinde blodprøvens overfladespænding, og da det indføres dråbevis på et niveau svarende til dets massefylde.

Med spærremidlet på plads, dvs. når dråberne er flydt sammen til et helt lag og midlet i ro har antaget stiv gelform påny, er det muligt blot at afdekantere serumoverfasen, idet det cellulære 149620 9 sedimentat er fanget eller indespærret under det sammenhængende stive lag spærremiddel.

Spærremidlets specifikke massefylde bestemmes ved anvendelse af en kobbersulfatmetode. Denne metode består i, at man lader dråber af spærremidlet falde ned i en række graduerede opløsninger af kobbersulfat med kendt specifik massefylde og konstaterer, om dråberne stiger eller falder deri. De her anvendte serier er gradueret med intervaller på 0,005 g/cm . Ved blot at iagttage dråberne er det således muligt at bestemme, at spærremidlet har en oftest ønsket specifik massefylde på ..mellem 1,045 og 1,050 g/cm .

Eksempel 2

Der fremstilles et spærremiddel med nedenstående sammensætning:

Komponent Vægtdele

Tyktflydende silicone (dimethylpolysiloxan) 100 3

Siliciumoxid (specifik massefylde 1,95 g/cm ) 14 I det foreliggende eksempel benyttes som tyktflydende silicone den samme dimethylpolysilioxanpolymer som i eksempel 1.

O

Siliciumoxidet med specifik massefylde 1,95 g/cm har en gennemsnitlig partikelstørrelse på 16 nya. Det fremstilles af Henlig & Co. og forhandles under betegnelsen "TRI-SIL 404". Det herved tilvejebragte spærremiddel fås med en specifik massefylde i intervallet fra 1,045 til 1,050 g/cm^.

Eksempel 3

Der fremstilles endnu et spærremiddel, nemlig med følgende sammensætning:

Komponent Vægtdele

Tyktflydende silicone (ethyltriethoxysilan) 100 3

Siliciumoxid (specifik massefylde 2,65 g/cm ) 8 3

Siliciumoxid (specifik massefylde 2,3 g/cm ) 20 I det foreliggende eksempel benyttes som tyktflydende silicone en ethyltriethoxysilanmonomer fremstillet af Union Carbide Corporation og markedsført under handelsnavnet "A-15". De anvendte siliciumoxider er de samme som benyttet i eksempel 1.

149620 ίο

Fyldstoffet tjener det dobbelte formål at gøre siliconen thixotropt og at indstille det herved fremkomne spærremiddels specifikke massefylde på den ønskede værdi. I stedet for siliciumoxid kan andre indifferente fyldstoffer benyttes i finpulveriseret form såsom bentonit, aluminiumoxid og talk. Andre muligheder vil være indlysende for fagfolk.

En anden anvendelig tyktflydende silicone fremstilles af Dow Corning Corporation og markedsføres under handelsnavnet "200 Fluid" ® .

Ved udvælgelsen af siliconer og fyldstoffer bør man vælge materialer, som ved sammenblanding vil tilvejebringe et medium med ønsket specifik massefylde, er praktisk talt ikke-toksisk, er uopløseligt i vand og er praktisk talt kemisk indifferent med hensyn til bestanddelene, i det mindste i serumfasen.

Afgivelsesorganet tjener til gradvis dosering af forseglingsmidler, idet der kræves en vis centrifugeringspåvirkning før end spærremidlet afgives, og denne gradvise afgivelse tilvejebringer tilstrækkelig omflytningstid til, at opdelingen i serum-overfase og cellulært sedimentat kan finde effektivt sted, før spærremidlet er på plads som et sammenhængende lag med gelkonsistens påny. Hvis spærremidlet nemlig fik lov til at gå i stilling for tidligt, ville en del uønsket stof såsom røde blodceller eller fibrillære og lignende materialer eventuelt indfanges og forblive indespærret i serumdelen, fordi de ikke kan trænge igennem spærremidlet, når det er flydt sammen og har genantaget gelform. Herved ville den ønskede kvantitative fraskillelse af ren serum ikke kunne opnås.