DK142879B - Fremgangsmåde til fremstilling af enkeltcelle protein ved aerob dyrkning af en kultur af thermofile bakterier. - Google Patents

Description

i 142879 o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af enkeltcelle protein ved aerob dyrkning af en

O

kultur af thermophile bakterier ved en temperatur mellem 45 C og 65°C i et vandigt medium indeholdende en eller flere alko-5 holer med 1-7 carbonatomer som carbon- og energikilde, en nitrogenkilde og et mineralnæringsstof.

Forsøg på at afhjælpe mangel på protein har omfattet biosyntese dvs. biologisk fremstilling af enkeltcelle protein (SCP) ved dyrkning af mikroorganismer på carbonholdige sub-10 strater.

Carbon- og energikilderne, der anvendes som substrater, skal være tilgængelige i vid udstrækning, forholdsvis billige, ensartede, og det skal være sikkert, at de ikke efterlader skadelige remanenser i proteinproduktet, der fås ved mikrobielle 15 omdannelser, Jordoliecarbonhydrider er blevet anvendt som carbon-og energikilde, men har mødt praktiske vanskeligheder på grund af ringe vandopløselighed, højt oxygenbehov og påståede spor af potentielt kræftfremkaldende stoffer hidrørende fra jordolierå-materialet, der kommer ind i eller klæber til proteinproduktet.

20 Ved andre fremgangsmåder har man anvendt oxygenerede carbonhydridderivater som råmateriale, da de er vandopløselige og følgelig lette at håndtere, fordi de mikrobielle omdannelsesprocesser hovedsageligt udføres under vandige betingelser.

Sådanne råmaterialer er let tilgængelige ud fra jordolie, natur-25 gas, forskellige affaldsomdannelser og omsætning af methan, fermentering af forskellige kornarter og destruktiv destillering af træ. Sådanne oxygenerede carbonhydrider er tilgængelige i vid udstrækning og udgør forholdsvis billige råmaterialer til fermentering. Det er fordelagtigt, at oxygenbehovet herved er 30 ret lille.

En anden vanskelig og begrænsende faktor ved kommerciel fremstilling af enkeltcelle-protein har været nødvendigheden af at gennemføre fermenteringen ved lav temperatur dvs. fra 20 til 50°C, men fortrinsvis ikke over 35°C. Sådanne oxidative mikrobi-35 elle omdannelser er eksoterme og giver store mængder varme, der skal fjernes kontinuerligt og fuldstændigt fra fermenterings- 142879

O

2 blandingen, tryis man ikke skal risikere overophedning af systemet, så mikroorganismerne dør eller deres vækst begrænses alvorligt ved temperaturstigningen med deraf følgende tab i ydeevne.

Mange har især koncentreret sig om anvendelsen af gærar-5 ter som mikroorganisme, navnlig da gærceller generelt er lidt større end bakterieceller og lettere at fraskille fra fermenteringsmediet.

' Bakterier har dog den fordel, at deres råproteinindhold i cellen er større end hos gær i almindelighed, idet gær har 10 højere indhold af proteinfrit strukturmateriale i cellen. Hertil kommer, at bakterier sædvanligvis har et betydeligt højere ægte proteinindhold, navnlig af de ernæringsmæssigt vigtige svovlholdige aminosyrer og lysin.

Anvendelse af bakterier med evne til hurtig vækst og høj 15 produktivitet ved forholdsvis høj temperatur til en sådan fermentering ville være klart fordelagtig. Høj væksttemperatur betyder, at der skal fjernes mindre varme, dvs. benyttes mindre afkølingsapparatur, og bagefter kræves forholdsvis mindre mængder varme for at hæve temperaturen i mediet til sterilisering, 20 koagulering og fraskillelse. I øvrigt vil faren for inficering med andre mikroorganismer formindskes betydeligt, når der anvendes fermentering ved høj temperatur. Brugen af thermofile bakterier er således en nødvendig forudsætning for kommerciel forsvarlig biosyntese af enkeltcelle protein.

25 Det har nu vist sig, at en hidtil ukendt blandingskultur af bakterier lader sig anvende med stort held til ovenstående formål.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at bakteriekulturen er en blandingskultur med deponeringsbe-30 tegneisen NRRL B-8158. Denne blandingskultur af thermofile bakterier udviser netop disse meget ønskelige egenskaber, dvs. forbedret vækst ved højere temperaturer end de hertil konventionelt benyttede temperaturer, idet den giver højere celleudbytter med formindsket opskumning under fermentering, hvilket be-35 tinger fremgangsmådens rationelle udførelse. Blandingskulturen er thermofil, gror effektivt under høj produktion på lavere

O

3 142879 alkoholer, især methanol eller ethanol, ved temperaturer, hvor andre kendte bakteriearter enten er forholdsvis uproduktive eller simpelt hen ikke kan overleve på eller tolerere dette substrat, 5 Denne særlige blandingskultur betegnes som følger:

Kulturnavn Stammebetegnelse Deponerinqsbetegnelse

Me HTB-53 NRRL B-8158

Betegnelsen NRRL B-8158 viser, at den thermofile blandingskultur er deponeret i officielt depot hos United States 10 Department of Agriculture, Agricultural Research Service, North Central Region, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, nemlig i form af 30 lyophiliserede præparater, som fra depotet har modtaget NRRL-betegnelsen B-8158. Denne blandingskultur med deponerings-15 betegnelsen NRRL B-8158 omfatter A) en aerob, grampositiv, motil, sporedannende, krum stavformet, kædedannende bakterie af klassen Schizomycetes, orden Eubac-teriales, B) en aerob, gramnegativ, motil, sporedannende, lang stavformet 20 bakterie af slægten Bacillus og C) en aerob gramnegativ, motil, ikke-sporedannende, kort stavformet, delings-bakterie af klassen Schizomycetes.

Denne thermofile blandingskultur er kompositionelt stabil og fås efter isolering fra en fermentering og lyophilise-25 ring under sædvanlige betingelser, scan omfatter hurtig afkøling af de mikrobielle celler ved meget lav temperatur, efterfulgt af hurtig dehydratisering under højt vakuum og oplagring ved - stuetemperatur. Til bestemmelse af levedygtighed reakt^Lveres nogle af de lyophiliserede prøver derefter og underkastes vækst 30 af den herved tilvejebragte blandingskultur under samme betingelser som anvendt tidligere. Sådanne fermenteringer under anvendelse af reaktiveret Mc~kultur giver i det væsentlige samme resultater angående højt celleudbytte osv. og tilsyneladende sammensætning af fermenteringskulturen, som de oprindelige kul-35 turer har givet før lyophilisering. Mikroskopisk undersøgelse af den reaktiverede Mc~kultur viser de samme tre organismer i 142879

O

4 samme form og sammenhæng i den rekonstruerede kultur som i den oprindelige kultur.

Som lavere alkohol anvendes især methanol eller ethanol, idet for tiden methanol eller et hovedsageligt methanol-holdigt 5 substrat foretrækkes som billigst og effektivt.

Der er tydelige fordele ved anvendelse af den thermofile blandingskultur M i sammenligning med anvendelsen af en ren kul-tur af thermofile bakterier ved fermenteringen af methanol eller ethanol. Først og fremmest opnås et højere celleudbytte under an-10 vendelse af blandingskulturen. Celleudbytte som her beskrevet defineres som gram celler fremstillet pr. 100 gram anvendt carbon-og energikildemateriale, f.eks. methanol. Det højere celleudbytte er en vigtig praktisk, kommerciel, økonomisk fordel.

En anden fordel ved blandingskulturen i sammenligning med 15 en renkultur af en thermofil bakterie er, at skumudviklingen er væsentligt mindre end hos de undersøgte renkulturer, som almindeligvis har en tendens til at udvikle store mængder skum i løbet af fermenteringen. Medens skum kan være ønskeligt i visse apparater som hjælpemiddel ved varmeoverførsel og ved 2o tilvejebringelse af de ønskede mængder molekylært oxygen til den aerobe fermentering, er mange typer fermenteringsapparater ikke udformet eller udstyret til at rumme eller behandle de store mængder skum, der udvikles ved nogle ren-stamme mikroorganismer. Derfor er de moderate mængder skum, der udvikles ved den 25 her omhandlede blandingskulturs brug, en tydelig fordel.

En anden fordel ved blandingskulturen er, at den naturligt producerer enkeltcelle protein som en blanding af flere slags celler, og derfor vil sammensætningen af aminosyrer i disse mikrobielle celler udvundet fra M blandingskulturen være mere stabil 30 end den sammensætning, der fås ved dyrkning af hver enkelt som ren-kultur, i den forstand, at der er mindre sandsynlighed for mangel på en eller flere bestemte, essentielle aminosyrer.

Den thermofile blandingskultur blev fundet ved arbejdet med at finde og udvikle en art kultur, der er egnet til sådanne 35 mikrobielle omdannelser. En jordprøve er udtaget 61 cm under jordens overflade over en dampledning ved Bartlesville, Oklahoma,

O

5 142879

Research Center of Phillips Petroleum Company. Konventionel berigelsesteknik i nærværelse af methanol blev anvendt for at isolere separate kulturer fra de mange oprindelige organismer.

I løbet af arbejdet, hvor adskillige rene thermofile kulturer 5 isoleredes, blev det klart, at en af kulturerne udgjorde en i sammensætning usædvanlig stabil blandingskultur af thermofile organismer.

Blandingskulturen er sammensat af tre særegne thermofile mikroorganismer, der kan beskrives taxonomisk som nedenfor an-10 ført under A, B og C.

6 142879 NKRL B-8158 q Taxonomisk beskrivelse

Kulturegenskab/ prøveresultat_A B_C_

Kultur Bacillus Bacillus Ukendt (sandsynligvis __pseudomonas)_

Sporedannelse ja ja nej 5 Aerob ja ja ja

Gennemsnitsstørrelse (ji) 0,5xl-2,5 O,6x1-5 0,5x1

Motilitet ja ja ja

Optimum temp. 55°C 55°C 55°C

Foretrukket temp. 50-65°C 50-65°C 45-60°C

10 pH interval 5-9 5-9 5-9

Optimum pH 6,2-6,8 6,2-6,5 6-7 Vækst faktorer ingen ingen - (Kultur C synes at kræve de to andre organismers tilstedeværelse, når vækst skal ske på methanol-substrat)

Pigmenter i IM2 lysbrun H^O opl. gul H^O opl. lyserød H_0 opl.

medium + 1,5% CH^OH uopl. i organi- uopl. i orga- ske oplm. niske oplm.

Celleudseende store krumme stave store stave små stave til lange kæder ingen kæder

Kolonindseende i cirkulær hævet cirkulær hævet lille, nålespids 20 IM2 medium + 1,5% svagt brunlig brækket hvid

CHjOH

o Vækst ved 55 C pa; næringsbouillon - - + næringsbouillon + 1,5% CH OH - + 25 _ + IM„+0,5% CH OH + + + IM +1,5% CH.jOH + + 1 J + IM2+1,5% glucose - - IM2+1,5% CH3CH2OH + + - IM2+1,5% HCHO + + NR* 30 BiM+1,5% CH OH +

0,1% NaCl 6 + + NR

BHM+5% CH3OH + + NR

Pladetælling +1,5% CH30H translucent translucent udspilede kanter glinsende små 35 IM2~medium se eksempel 2 BHM-medium: KH2P04: 2,0 g/1, K2HP04: 3,0 g/1, MgSO^^O: 0,4 g/1,

CaCl2’2H20: 0,04 g/1, (NH4)2S04: 2 g/1, spormineralopløsning: 10 ml/1 indeholdende FeS04*7H20: 0,11 g/1, ZnS04*7H20: 0,03 g/1, CuS04'5H20: 0,02 g/1, MnS04-H20: 0,02 g/1, H2S04 (kone.): 1 ml/1.

O

7 142879

Gentagne forsøg på adskillelse er blevet udført på denne blandingskultur for at isolere disse mikroorganismer for sig og rendyrke hver enkelt. F.eks. resulterede stregkultur på et mineralagarmedium indeholdende methanol i dannelsen af isole-5 rede kolonier af alle tre organismer. Når de isolerede kolonier overførtes til vandigt medium til yderligere dyrkning med methanol som carbon- og energikilde, sker der imidlertid overraskende nok ikke nogen vækst, heller ikke efter gentagne forsøg.

]_q Denne blandingskulturs samvækst angiver et symbiotisk forhold mellem de tre mikroorganismer. Det synes muligt, at et eller flere stofskifteprodukter fra mindst en af mikroorganismerne tjener som nødvendigt substrat for den ene eller anden af de andre mikroorganismers vaskst. Skønt en sådan metabolits -L5 nøjagtige natur ikke kendes, synes det muligt, at den kan være toksisk over for mikroorganismen, som producerer den, hvorved der fås en forklaring på, at den ene eller begge de øvrige mikroorganismer skal være til stede for at tilintetgøre en sådan toksisk metabolit, for at den første mikroorganisme kan fort-20 sætte med at vokse tilstrækkeligt.

En yderligere antydning af denne symbiotiske sammenhæng er, at ved fermenteringer under anvendelse af M frembringes

C

betydeligt mindre skum under typisk aerobe betingelser end normalt konstateret under tilsvarende typiske aerobe betingelser 25 under anvendelse af en rendyrket thermofil bakterie af slægten Bacillus. Da blandingskulturen Mc således ikke producerer den sædvanlige store mængde skum, antages det, at der konsumeres et ekstracellulær produkt, sandsynligvis proteinholdigt, af mindst en af de symbiotiske mikroorganismer, idet mængden af 2Q et sådant produkt herved kontinuerligt holdes lav og derved tillige skumfremkaldelsen i fermenteringsblandingen.

Carbon- og energikilden er en eller flere alkoholer med 1-7 carbonatomer pr. molekyle. Sådanne alkoholer omfatter både lineære og forgrenede alkoholer, primære, sekundære og terti-25 ære monohydroxy og polyhydroxy.

142879

O

8

Eksempler på alkoholer er methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, 1,7-heptandiol, 2-heptanol, 2-methyl-4-pentanol, 2-pentanol, 2-methanol-4-butanol, 2-methy1-3-butanol, 2-butanol, 2-methyl-l-propanol, 2-methyl-5 -2-propanol, 2-propanol, glyceral, ethylenglycol, propylengly- col, omfattende blandinger af to eller flere.

De mest foretrukne alkoholer er de alkoholer, der indeholder 1-4 carbonatomer pr. molekyle, især monohydroxyalkoho-ler, på grund af let tilgængelighed, vandopløselighed og lav 10 pris.

Methanol er særlig foretrukken på grund af relativt lav pris, let tilgængelighed og total vandopløselighed.

Et kommercielt tilgængeligt materiale betegnet "Methyl Fuel" (C&EN, September 17, 1973, side 23] er et eksempel på 15 en kommercielt tilgængelig blanding af methanol og nogle få procent højere alkoholer indeholdende indtil ca. 4 carbonatomer pr. molekyle, der kan anvendes som et hensigtsmæssigt substrat,

Aerob formentation er velkendt inden for teknikken, og 20 midler til at sætte oxygen til fermentationsblandinger er også velkendte. Almindeligvis kan tilsætningen af molekylært oxygen til den vandige fermentationsreaktionsblanding gennemføres ved at lede passende mængder luft eller oxygenmættet luft og eventuelt yderligere ren oxygen gennem fermentations-2g beholderen. Affaldsgasser kan genvindes, om ønsket recirkule-• res, til maksimal udnyttelse af oxygen, f.eks. ved at fjerne carbondioxid fra affalds- og recirkulationsgassen. Almindeligvis skal der tilføres 0,1 til 10 eller mere almindeligt 0,7 til 2,5, rumfang luft pr. minut til fermentationsblandingen 20 pr. rumfang væske i fermentoren, eller 0,02 til 2,1 og især 0,14 til 0,55 rumfang oxygen pr. rumfang væske pr. minut.

De anvendte tryk kan varieres bredt, for eksempel fra 0,1 til 100 atmosfærer (10,33-10,132 kPa), mere almindeligt fra 1 til 30 atmosfærer (101,3-3.3039 kPa), men helst 1-5 at-35 mosfærer (101,3-506,5 kPa]. Tryk større end atmosfærisk tryk forøger det opløste oxygenindhold i det vandige fermentations-

O

9 142879 medium og dermed hurtigere mikrobiel vækst. Overatmosfærisk tryk anvendes især, fordi de højere temperaturer (thermofil fermentation) nedsætter oxygenopløseligheden i det vandige fermenteringsmiddel.

5 Dyrkning af M -blandingskulturen gennemføres ved 45-65°C, men især til optimal vækst mellem 50 og 60°C. Lavere temperaturer har en tendens til at hindre væksten.

Høje koncentrationer af nogle af de beskrevne carbon-og energikildesubstrater, f.eks. methanol, kan være hæmmende 10 for en tilfredsstillende mikrobiel vækst eller endog virke toksisk over for mikroorganismerne ved fermentation af blandingskulturen og bør undgås.

Fermentationsprocessen kan gennemføres portionsvis eller kontinuerligt. En kontinuerlig fremgangsmåde er især eg-15 net, når carbon- og energikilden er en af de lavere alkoholer methanol eller ethanol, som let egner sig til kontrollabel tilførsel ved høj effektivitet. Når fermentoren er inokuleret med blandingskulturarten, tilføres alkoholen som en særskilt strøm eller blandet med vand som en vandig strøm til sterilisation 20 af denne, eller med et mineralsk middel til sterilisation af dette eller et hvilket som helst af disse. Sædvanligvis tilføres alkohol separat til let kontrol af koncentrationen deraf i fødestrømmen til fermentoren i området 2,5 til 35 vægtprocent, mere hyppigt og hensigtsmæssigt 10-15 vægtprocent.

25 Dyrkning gennemføres i et vandigt vækstmedium omfattende et vandigt mineralsaltmiddel, carbon- og energikildematerialet, molekylært oxygen og et begyndelses-podestof af Mc~blandings-kulturen.

Fermentationsvækstraterne kan indstilles ved fødemateria-30 let, hvis tilførselshastighed styres, så de mængder, der føres til fermentoren, i det væsentlige er de samme som organismens forbrug. Herved undgås ophobning i fermentoren, især af toksiske materialer. En tilfredsstillende kontrol kan også opnås ved at holde indholdet af fødemateriale i fermentorafløbet på O 35 til 0,2 vægtprocent.

10 U2879 o

Almindeligvis er mikrobielle cellers opholdstid i fermentoren ved en kontinuerlig proces af en størrelsesorden på 2 til 4 timer under sådanne betingelser, skønt dette ikke er kritisk.

5 Kulturen Mc kraver mineralnæringsstoffer og en kilde for assimilerbart nitrogen, foruden molekylært oxygen og de beskrevne carbon- og energikilder. Nitrogenkilden kan være en hvilken som helst nitrogenholdig forbindelse, der er i stand til at frigøre nitrogen i en form, der er egnet til metabolisk 10 anvendelse af organismen. Medens en varietet af organiske ni-trogenkildeforbindelser, f.eks. andre proteiner, urinstof eller lignende, kan anvendes, er uorganiske nitrogenkildematerialer sædvanligvis mere økonomiske og praktiske. Sådanne uorganiske nitrogenholdige forbindelser skal typisk omfatte det 15 for tiden foretrukne ammoniak eller ammoniumhydroxid, såvel som forskellige andre ammoniumsalte, f.eks. ammoniumcarbonat, ammoniumertrat, ammoniumphosphat, ammoniumsulfat og ammonium-pyrophosphat. Ammoniakgas er hensigtsmæssig og kan anvendes ved simpelt hen at boble den gennem det vandige fermentations-20 medium i passende mængder.

Den vandige mikrobielle formenteringsblandings pH-vær-di skal ligge fra 5,5 til 7,5, fortrinsvis fra 6 til 7. Tilsætningen af ammoniak hjælper med til at overholde den ønskede pH-v®rdi, fordi det vandige medium ellers har en tilbøje-25 lighed til at blive let surt. Naturligvis er de foretrukne pH-værdiområder for mikroorganismer i almindelighed i nogen grad afhængige af det anvendte medium, og således kan det foretrukne pH-område skifte i det mindste lidt, hvis mineralmediet forandres.

30 Foruden oxygen, nitrogen og carbon og energikilden er det nødvendigt at sætte udvalgte mineralnæringsstoffer i nød-yendige mængder og forhold til fødematerialet for at sikre passende mikroorganismevækst og for at gøre cellernes assimilation af alkohol maksimal ved fremgangsmåden.

35 En kilde til phosphat eller andre phosphor-, magnesium-, calcium-, natrium-, mangan-, molybden- og kobberioner har vist 142879 11 o sig at tilvejebringe de nødvendige mineraler. Et sådant mine-ralnaaringsmedium betegnet "FM-12" er anført nedenfor sammen med spormineralopløsningen, som udgør en del af FM-12-nærings-mediet: 5 Medium FM-12

Komponent Mængde H3P04 (85%) 2 ml KC1 1 g

MgS04-7H20 1,5 g 10 CaCl2-2H20 0,2 g

NaCl 0,1 g

Spormineralopløsning 5 ml

Destilleret vand op til 1 liter 15 Spormineralopløsning

CuS04*5H20 0,06 g

Kl 0,08 g

FeCl-j·6Η20 4,80 g

MnS04-H20 0,30 g 20 Na2Mo04*2H20 0,20 g

ZnS04*7H20 2,00 g H3B03 0,02 g H2S04 (kone.) 3 ml

Destilleret vand op til 1 liter 25 Andre mineralmediumkoncentrationer kan også anvendes, jfr. eksemplerne nedenfor.

Ved portionsvis eller kontinuerlig drift steriliseres alt udstyr, reaktor eller fermenteringsorganer, kedel eller beholder, rør, medfølgende cirkulerings- eller afkølingsorga-20 ner og lignende sædvanligvis ved anvendelse af damp med en temperatur på ca. 121°C i adskillige minutter, f.eks. ca.

15 minutter. Den steriliserede reaktor podes med en kultur af den angivne mikroorganisme i nærværelse af alle de nødvendige næringsstoffer omfattende oxygen og alkohol.

35 Der skal opretholdes instrumentering til at måle celle- tætheden, pH-værdien, indhold af opløst oxygen, alkoholkoncen- 142879

O

12 tration i fermenteringsblandingen, temperatur, fødemateriale-hastighed og lignende. Det foretrækkes, at de materialer, der sættes til fermenteringsbeholderen, først steriliseres ved, at f.eks. ethanol eller methanol sættes til de andre strømme, 5 f.eks. mineralmediet, i steriliserende mængder, således at særskilt varmesterilisering undgås.

Tilsætning af antiskummiddel til fermenteringsblandingen skal undgås, fordi antiskummidler, f.eks. siliconer, kan være skadelige for det opløste oxygenindhold ved de anbefalede høje 10 fermenteringstemperaturer, og kan bevirke, at organismerne vokser langsommere og endog dræbes. Skum udviklet af I! -kulturen er ikke skadelig over for væksten og er afgørende fordelagtig ved opretholdelse af organismerne i et system med højt indhold af opløst oxygen. Skum hjælper med til at tilvejebringe rela-15 tivt store arealer af gas/væske-kontakt-grænseflader. Således kan fermentering forbedres, og varmeoverførsel kan forbedres til bedre styring, større ensartethed og undgåelse af lokal overhedning.

Naturligvis kan man om ønsket anvende et skum-fremkal-20 dende stof, f.eks. med visse detergenter, fortrinsvis ikke-io-niske, til hjælp ved yderligere skumdannelse, skønt dette normalt ikke er nødvendigt eller ønskeligt.

Genvinding af mikrobielle celler kan gennemføres ved sædvanlig teknik, f.eks. syrning af fermenteringsafløb til en 25 pH-værdi på ca. 4, og opvarmning af det syrnede afløb til en temperatur, der er i stand til at dræbe mikroorganismerne, f.eks. ca. 80°C, men er lav nok til ikke at beskadige proteinproduktet. Afløbet kan derpå centrifugeres, vaskes og gencentrifugeres til genvinding af de mikrobielle celler fra fermenterings-30 afløbet. Cellerne kan behandles til celleopløsning til genvinding af protein og andre materialer fra cellen. Fermenteringen giver også et antal ønskelige biprodukter, der kan udvindes fra fermenteringsafløbet. Disse ekstracellulære produkter kan forbedre fremgangsmådens økonomi som helhed, da de om-35 fatter værdifulde stoffer, f.eks. polysaccharider, aminosyrer, f.eks, glutaminsyre, enzymer, vitaminer og lignende.

O

13 142879

Enkeltcelleproteinproduktet er en værdifuld proteinkilde til brug som foder for dyr, navnlig i kraft af dets høje nucleinsyreindhold. Nærværende patent omfatter ikke fremgangsmådens anvendelse ved tilvirkning af næringsmidler.

5

Eksempel 1

Et kontinuerligt fermenteringsforsøg gennemføres under anvendelse af den thermofile blandingskultur NRRL B-8158. En 7-liters fermenteringsbeholder udstyret med en aerator, omrø-10 rer, opløst oxygenkontrolanordning og udstyr til at måle og styre temperatur og pH-værdi for fermenteringsblandingen, påfyldes ca. 500 ml af en fermenteringsreaktionsblanding fra et tidligere fermenteringsforsøg under anvendelse af den thermofile blandingskultur og 10 ml methanol aom podestof. Reakto-15 ren chargeres også med 2 liter fermenteringsmineralmiddel FM-12.

Omrøringshastigheden holdes ved 1.000 opm i løbet af forsøget, og pH-værdien holdes på 6,2 til 6,35 ved tilsætning af ammoniumhydroxidopløsning. Luft føres ind i fermenteringsbeholderen med en hastighed på 2 liter pr. minut under fremgangsmå-20 dens drift. Efter 6 timers forløb indføres også i det væsentlige rent oxygen i fermenteringsbeholderen ved en tilsætning på 0,5 liter pr. minut, derpå forøges til 0,75 liter pr. minut efter 118 timer, til 1,5 liter pr. minut efter 174 timer og 2 liter pr. minut efter 190 timer.

25 Efter 22 timer ændres mineralmidlet til en vandig blan ding indeholdende 7,5 volumen% methanol foruden medium FM-12 plus 0,75 gram kaliumchlorid, to gange det normale spormineral-indhold, tre gange det normale mangankomponentindhold (alt pr. liter basis) og med udelukkelse af natriumchlorid. Efter 166 ti-30 mer ændres fødematerialet til en vandig blanding indeholdende 10 volumenprocent methanol, 2,5 ml phosphorsyre (85%) pr. liter, 2 gram pr. liter kaliumchlorid, 1,75 gram pr. liter magnesium-sulfat*7H20, 0,25 gram pr. liter calciumchiorid · 2^0, 20 ml pr. liter af en vandig opløsning af mangansulfat · H20 (0,3 g/-35 liter), og 35 ml pr. liter spormineralopløsning som tidligere beskrevet.

142879

O

14

Tilsætningshastigheden af mediet er i området fra 700 ml pr. time efter 22 timer til 817 ml pr. time efter 118 timer, 781 ml pr., time efter 166 timer og 763 ml pr. time efter 382 timer.

5 Prøver fra fermenteringsafløbet udtages fra time til ti me til udvinding af celler derfra. Værdier opnået for celleindholdet betegnet som tørvægt celler i gram pr. liter og de beregnede udbytter er angivet i tabel I. I tabellen er også angivet værdier beregnet for produktivitet betegnet som gram cel-]_0 ler pr. liter pr. time.

Ved ca. 126 timer udtages prøver fra fermenteringsblandingen og forberedes til lyophilisation af de mikrobielle celler ifølge kendte fremgangsmåder. Disse lyophiliserede prøver opbevares derpå til efterfølgende anvendelse ved senere fermen-15 tering og til tilvejebringelse af prøver af HTB-53 til et depot for mikroorganismer, der betjenes af the United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratory i Peoria, Illinois.

Periodiske prøver udtages også fra fermenteringsreak-20 tionsblandingen til mikroskopisk undersøgelse af mikrobielle celler med hensyn til deres brutto-morfologi. En sådan mikroskopisk undersøgelse viser, at M -kulturen er sammensat af en stor grampositiv krummet stav, en stor gramnegativ stav og en lille gramnegativ stav. Undertiden konstateres også en stor 25 grampositiv stav (ikke krummet), men denne antages for at være en kortvarig variant af den store krummede grampositive stav, jfr, i øvrigt den ovenfor anførte taxonomiske beskrivelse.

O

15 U2ST9

Tabel I

Tid, timer 46 118 166 190 286 358

Opholdstid, timer 2,36 2,27 2,38 2,83 2,33 2,43 5 Celler (a) g/liter 26,86 27,13 27,04 35,21 35,53 35,57

Faststoffer ^ g/liter 26,82 27,66 27,87 35,5 35,66 36,76

Celleud- 10 bytte (c] % 44,7 46,1 46,47 44,4 45,8 45,9

Produktivitet (d> g/liter/timer 11,4 12,2 11,7 12,5 15,7 15,1 (al Værdi bestemt ved at inddampe en 10 ml prøve af fermen-15 teringsafløb natten over ved 100°C og fratrækning af vægten af mineralfaststoffer indeholdt i 10 ml medium.

(bl Værdi bestemt ved at centrifugere 100 ml prøve af fermenteringsafløb, gensuspendere faststoffer i destilleret vand og ved igen at centrifugere til gen-20 vinding af faststoffer, som tørres natten over ved 100°C.

(cl Værdi bestemt som udvundne faststoffer (g/liter} divideret med tilført methanol (g/liter} x 100.

(dl Værdi bestemt som udvundne faststoffer (g/liter) di-25 videret med opholdstid (timer).

Eksempel 2

Efter ca, 1 måned åbnes et enkelt praparatglas med lyo-philiseret HTB-53 mikrobiel kultur fra fermenteringsforsøget i 3q eksempel 1 aseptisk på sædvanlig måde og sættes til 100 ml fermenteringsmedium betegnet scan IM2, scan også indeholder 5% methanol. Sammensætningen af medium IM2 er vist nedenfor.

142879

; 16 O

Medium IM2

Komponent Mængde, g KH2P04 2,0 K2HP04 3,0 5 MgS04*7H20 0,4

CaCl2*2H20 0,04

NaCl 0,1 (NH4)2S04 '2,0

Spormineralopløsning 0,5 ml 10 Destilleret vand op til 1 liter

Kolben med den genaktiverede kultur inkuberes under rystning ved 55°C. Efter 24 timers forløb viser kulturen god vaskst, og 5 ml af blandingen overføres til 100 ml medium IM2, der også indeholder 1,5 volumenprocent methanol. God vækst ud-15 vikles i løbet af 24 timer, og en tredje overførsel gennemføres til samme medium i to kolber, der hver indeholder 500 ml medium IM2 plus 1,5 volumenprocent methanol. Denne tredje overførsel medfører, at 100 ml af kulturen sættes til hver af de to kolber. Kulturen får lov til at vokse i 32 timer og an-20 vendes derpå som podestof for en kontinuerlig fermentering i apparatet beskrevet ovenfor i eksempel 1. Fermenteringsbeholderen påfyldes 1.000 ml medium FM-12 og 1.000 ml podestof, hvortil der sættes 10 ml methanol. Temperaturen holdes ved 55°C, og pH-værdien indstilles på 6,25 til 6,4 ved kontinuer-25 lig tilsætning af ammoniumhydroxidopløsning som før nævnt. I begyndelsen arbejder opirøreren ved 300 opm, og luft tilføres med en hastighed på 0,5 liter pr. minut, medens kulturen får lov lov til at rodfæste sig i fermenteringsbeholderen. Efter 7 timers forløb indføres kontinuerligt fødemateriale med sammen 30 sammensætning som det sidstnævnte fødemateriale i eksempel 1.

Yderligere forøges lufthastigheden til 2 liter pr. minut, medens omrøreren sættes til 1.000 opm. Efter 30 minutters forløb nedsættes lufthastigheden til 1,75 liter pr. minut, medens oxygen indføres med 0,75 liter pr. minut, senere med 1 liter pr. mi-35 nut ved 54 timer, og 1,5 liter pr. minut ved 198 timer. Fermenter ingsaf løbet afprøves atter fra tid til anden for celleindhold « 142879

O

17 udtrykt i gram pr. liter baseret på tørvagt og for fermenteringsudbytte og produktivitet. De data, der opnås i løbet af forsøget, er angivet i nedenstående tabel II.

5 Tabel II 1

Tid, timer 70 166 190 214

Opholdstid, timer 2,60 2,70 2,63 2,64

Celler 10 g/liter 34,33 33,56 33,87 34,84

Faststoffer g/liter 34,44 35,4 34,55 35,52

Celleudbytte, % 43,6 44,2 43,2 44,2

Produktivitet 15 g/liter/timer 13,2 13,1 13,1 13,5 (a) se fodnoter til tabel I.

Prøver af kulturen udtages i løbet af fermenteringen til mikroskopisk undersøgelse som beskrevet i eksempel 1. I dette tilfælde konstateres der også store grampositive kfummede sta-20 ve og store og små gramnegative farvende stave. Efter at forsøget har kørt i 238 timer, ødelægges kulturen ved at fødematerialets alkoholkoncentration forsøges hævet.

Nedenfor i tabel III er angiver analytiske data, scan er karakteristiske for den mikrobielle kultur, der benyttes i ek-25 sempel 1, og viser kemisk analyse af de mikrobielle celler. I tabel IV er også angivet en analyse af aminosyreindholdet i mikrobielle celler udvundet fra et andet fermenteringsforsøg under anvendelse af den thermofile blandingskultur. Til sammenligning angives i tabel IV også en aminosyreanalyse af en ther-3q mofil mikroorganismerenkultur frembragt ved isolering fra samme jordprøver som ovenfor beskrevet, *

O

18 162879

Tabel III

Kemisk analyse af mikrobielle celler opnået i et forsøg med HTB-53 Bestanddel Vægtprocent 5 Rå protein ^ 83,63

Aske 9,19

Aminonitrogen 13,4

Carbon 44,7

Hydrogen 6,79 10 Nitrogen 13,7

Phosphor 1,71

Kalium 0,91

Magnesium 0,26

Calcium 0,1 15 Natrium \ 0,01

Sporstof ppm

Jern 1300

Zink 55,8 20 Mangan 126

Kobber 20 1

Nitrogenindhold (13,7) x 6,25

O

19 142879

Tabel IV

Aminosyreindhold af thermofile kulturer dyrket på methanol: gram pr. 100 gram produkt: 5 Kem. Kem.

måle.-W <2> måle- ^

Essentielle aminosyrer Rene værdier Blandede værdier (HTB-7) (HTB-42) leucin 5,37 75 5,76 104 10 isoleucin 4,56 83 4,90 118 lysin 5,54 96 5,67 141

methionin 1,50 f 1,22 C

cystin x "|_34 x (_,36 threonin 2,95 90 2,79 88 15 phenylalanin 2,68 J80 2,78 J gg tyrosin 2,55 L 2,72 tryptophan 0,60 43 0,89 90 valin 5,13 91 5,46 121 20 (» = ikke påvist) 0 142879 20

Tabel IV (forts.)

Aminosyreindhold af thermofile kulturer dyrket på methanol: gram pr. 100 gram produkt_ 5 Ikke-essentielle aminosyrer_ Rene Blandede (HTB-7) (HTB-42) alanin 5,65 6,19 arginin 3,39 3,01 10 asparaginsyrer 6,50 6,26 glycin 3,71 4,19 glutaminsyre 10,47 10,69 histidin 1,26 1,22 prolin 2,32 2,38 15 serin 2,09 1,75

Totale essentielle aminosyrer 30,88 32,19

Totale aminosyrer 66,27 67,88 20 Rå protein 85,63 84,4 (11 Kemiske måleværdier: baseret på essentiel amino-syreindhold af æg som 100 for samme vægt protein.

(2) Baseret på gennemsnit fra fem forsøg med thermo-25 file renkulturer.

Det skal bemærkes, at procentdelen af totale aminosyrer, som er essentielle, er lidt højere for blandingskulturen (47%) end for renkulturen (46%). Hvis de essentielle svovlholdige aminosyrer bestemmes ved tilsætning af syn-30 tetisk methionin, viser de kemiske måleværdier, at den her dyrkede blandingskultur er dobbelt så god set fra et ernæringsmæssigt standpunkt som den dyrkede renkultur baseret på den næstlaveste kemiske måleværdi for essentielle aminosyrer.