DK142147B - Fremgangsmaade til rensning af serumproteinkonjugater - Google Patents

Description

142147 o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af serumproteiner eller serumprotein-blandinger, der er kovalent bundet til fluoresceinisothiocyanat, såkaldte serumprotein-konjugater. Da det se-5 rumprotein-konjugat, der skal udvindes, adskiller sig fra ikke-ønskede konjugationsprodukter og det til konjugationen anvendte fluoresceinisothiocyanat i sine elektroforetiske egenskaber, beror fremgangsmåden til udvinding af de ønskede præparater på, at den foreliggende 10 blanding efter endt konjugationsreaktion underkastes en præparativ elektroforese, og at den zone, der indeholder de ønskede præparater, fraskilles fra sådanne med uønskede serumprotein-konjugater og det frie fluoresceinisothiocyanat .

15 Opfindelsen angår i overensstemmelse hermed en frem gangsmåde til rensning af serumprotein-konjugater, der adskiller sig fra det til konjugationen anvendte fluoresceinisothiocyanat i deres elektroforetiske egenskaber, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at rå-20 konjugatet underkastes en præparativ elektroforese til fraskillelse af uønskede biprodukter og ikke-omsat fluoresceinisothiocyanat .

På grund af de elektroforetiske egenskaber af udgangsmaterialerne og omsætningsprodukterne muliggør den 25 her omhandlede fremgangsmåde fraskillelse af det rene serumprotein-konjugat af en bestemt omsætningsgrad fra det ikke-omsatte serumprotein og det til konjugationen anvendte fluoresceinisothiocyanat.

Som det vises nedenfor, har serumprotein-fluo-resceinisothiocyanat-konjugater, især konjugerede, antistof holdige immunsera, deres særlige betydning inden for den såkaldte immunfluorescensteknik.

Dette gælder i ganske særlig grad for ^-globulin--fraktioner, og en særlig vigtig udførelsesform for den 35 her omhandlede fremgangsmåde er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at der renses antistofholdige ^-globulin--fraktioner.

Den her omhandlede fremgangsmådes idé skal illustreres ved hjælp af disse repræsentative eksempler.

2 142147

Den teknik vedrørende immunfluorescens, der blev indført af A.H. Coons i 1942, tillader den kombinerede undersøgelse af den serologisk-immunologiske specificitet og den morfologiske karakteristik af det materia-5 le, der skal analyseres. Grundlaget for denne metode er den såkaldte antigen-antistof-reaktion, ved hvilken en af de to immunologiske partnere - som regel antistoffet - er konjugeret med et fluorescerende farvestof.

Synliggøreisen af antigen-antistof-reaktionsforbindel-10 sen i det mikroskopiske præparat sker ved stimulering af den synlige fluorescens ved bestråling i det ul-traviolette område.

Immunfluorescensen har vakt stor diagnostisk opmærksomhed til identificering af såvel bundne som 15 frie antigener.og antistoffer.

Ifølge den kendte teknik omsættes antistofrige fraktioner som såkaldte immunsera med fluorescensfarvestof - fortrinsvis med fluoresceinisothiocyanat.

Den yderligere rensning af omsætningsproduktet sker 20 først og fremmest ved gelfiltrering og ved ionbytter--chromatografi på diethyl-aminoethyl-cellulose. Derved isoleres de fluoresceinkonjugerede immungiobuliner.

Disse fremgangsmåder har den ulempe, at man ved forsøget på at fjerne det ikke-kovalent bundne 25 farvestof fra den fluoresceinkonjugerede proteinpræparation ved gelfiltrering eller dialyse iagttager en ufuldstændig fraskillelse af farvestoffet, især fjernes det adsorptivt til proteinet bundne eller det hydro-lytisk relativ let fraspaltelige, svagt kovalent bundne 30 farvestof ikke. Desuden elimineres farvestof, der opnår højere molekylvægte som følge af egenpolymerisation eller egenkondensation, ligeledes kun ufuldstændigt.

Anvendelsen af sådanne præparater, der indeholder frit farvestof, fører til uspecifikke fluores-35 censfarvninger af det mikroskopiske præparat og dermed til forkerte angivelser.

3 142147

Ved den fremgangsmåde, der først og fremmest anvendes ved den kendte teknik, til udvinding af den anti-stofholdige konjugerede proteinfraktion ved ionbytter--chromatografi på DEAE-cellulose udvindes praktisk taget 5 kun den antistofandel, der hører til IgG-klassen. Ved de eluerings- og adskillelsesbetingelser, der anvendes derved, fjernes antistoffer af IgM- og IgA-klassen kun ufuldstændigt eller overhovedet ikke, således at det udvundne præparat delvis har et væsentligt tab af ønskede 10 specifikke antistoffer. Ved ændring af elueringsbe- tingelsen for udvinding af fluoresceinkonjugerede IgM-og IgA-antistoffer medelueres også uønskede γ-globu-liner samt basofile proteiner. På grund af deres stærkt sure karakter fører disse proteinandele ved immuno-15 logiske reaktioner til den uspecifikke binding med en række basiske proteiner i undersøgelsesmaterialet og dermed ligeledes til fejlfortolkninger af den fremkomne fluorescens.

Den her omhandlede fremgangsmåde er ikke behæf-20 tet med de angivne ulemper. Den fortrinsvis i en indifferent bærer gennemførte elektroforetiske rensning af fluoresceinisothiocyanatkonjugerede serumproteinpræ-parationer, efter konjugationsreaktionen frembyder nedenstående fordele: 25 1) Fremgangsmåden muliggør en optimal målret tet antistofholdig zoneudvinding. Uønskede, f.eks. antistoffrie, ballast-protein-frektioner kan bortkastes uden vanskeligheder ved elimineringen af den ønskede fraktion. Udbyttet af de antistofholdige, konjugerede 30 serumproteinpræparationer er optimalt. I det fremdragne eksempel på den fluoresceinisothiocyanatmarkerede γ-globulin-fraktion genvindes 70-90% af den anvendte mængde.

2) Som følge af konjugationen af serumprote-35 iner med sure organiske molekyler ændrer det isoelek-triske punkt sig ved alle proteiner, der er trådt i 4 U2U7 reaktion med de organiske molekyler, til lavere værdier med den følge, at de under betingelserne for elektrofo-resen vandrer stærkere anodisk end ikke-konjugerede proteiner. Fjernelsen af proteiner, der er blevet sure, som 5 følge af stærk reaktion med det til konjugationen anvendte molekyle volder ingen vanskeligheder, da disse vandrer stærkere mod anoden. Dette resultat har særlig vægt ved de proteiner, der er konjugerede med fluores-ceinisothiocyanat (quinoidt system med fri carboxyl-10 gruppe).

3) Den optimale fjernelse af det ikke (eller adsorptivt) bundne sure organiske molekyle, hvis tilstedeværelse i fluoresceinisothiocyanatkonjugerede præparationer fører til uønskede, uspecifikke fluores- 15 censfarvninger, er sikret ved den her omhandlede fremgangsmåde. Grunden til den lette fjernelse af denne farvestofandel ligger i, at det sure molekyle selv vandrer stærkt mod anoden. Belastningen ved hjælp af den elektriske spænding ved betingelserne for den præ-20 parative zoneelektroforese fører til en fraspaltning af relativ svagt til protein bundne molekyler og fremkalder en god kvalitet af de elektroforetisk udvundne serumprotein-konjugater. Ved de med fluoresceiniso-thiocyanatkonjugerede proteiner iagttages en stabi-25 litetsstigning hos sådanne præparater ved opbevaring i vandig opløsning i forhold til de præparater, der er udvundet ved den kendte teknik.

4) Anvendes der antistoffer som serumproteiner til konjugationen, muliggør den her omhandlede frem- 30 gangsmåde udvinding af alle fluoresceinisothiocyanatkon-jugerede antistofklasser, f.eks. IgG, IgA og IgM. Dette har især betydning ved anvendelsen af antistoffer fra sera fra f.eks. mennesker, geder, får og heste, ved hvilke udover antistofferne fra IgG-klassen også an-35 tistofferne fra andre immunglobulinklasser udgør en relativ høj andel af den samlede antistofmængde. Denne faktor har også en væsentlig økonomisk interesse, fordi antistofholdige sera ikke er til rådighed i ubegrænset 5 142147 mængde.

Overført på rensningen af antistoffer, der er konjugerede med fluoresceinisothiocyanat, fører den her omhandlede fremgangsmåde til en forhøjelse af forholdet 5 mellem specifikke antistoffer (Ab) og det samlede protein (P), den såkaldte Ab/P-kvotient, hvilket bevirker en stigning i den ønskede specifikke fluorescens.

5) Den fremgangsmåde, der giver afkald på anvendelsen af dyre chromatografiske hjælpemidler, inde- 10 bærer en væsentlig billiggørelse ved fremstillingen af rene serumprotein-konjugater.

6) Fremgangsmåden muliggør en fuldstændig rensning ved kun ét trin, nemlig elektroforese, hvor kendt teknik ville kræve to trin, nemlig chromatogra- 15 fi på DEAE-cellulose til fraskillelse af uønskede høj-molekylære serumprotein-konjugat-andele og molekyl-sigte-chromatografi til fraskillelse af ligeledes uønskede, lavmolekylære organiske bestanddele, først og fremmest ikke-konjugeret fluoresceinisothiocyanat.

20 Dette er et indlysende teknisk fremskridt, og det er tillige overraskende, fordi nok er elektroforese til fraskillelse af uønskede højmolekylære bestanddele i.proteinblandinger kendt, men det kunne ikke forudses, at også fraskillelsen af lavmolekylære bestandde- 25 le ville være mulig ved elektroforese. I denne sammenhæng må man i øvrigt ikke glemme, at et så relativt kompliceret molekyle som fluoresceinisothiocyanat er meget lavmolekylært i sammenligning med selv de simplest opbyggede serumproteiner.

30 Foretrukket som elektroforetisk fremgangsmåde er bærer-elektroforesen, især den elektroforese, der indeholder den indifferente bærer i et vandret trug.

Ved anvendelse af f.eks. polyvinylchloridgranulat som bærermateriale kan man herved efter fraskillelsen 35 af de antistofholdige, fluoresceinisothiocyanatkon- jugerede protein-fraktioner udskære den ønskede præparation svarende til de synlige bånd og dernæst eluere den fra bæreren med simple opløsningsmidler.

142147 6

O

Hyppigt anvendte elektroforetiske bærematerialer er foruden polyvinylchlorid polyacrylamid, cellulose, stivelse, glasperler og sand for at nævne nogle eksempler.

Man kan imidlertid også anvende elektroforese-an-5 ordninger i lodret udformning. Der opnås også særdeles gode rensningsvirkninger med kontinuerligt arbejdende elektroforeseapparater.

Ved den foreliggende fremgangsmåde opdeles antistof-præparationer af en hvilken som helst oprin-10 delse, der er kovalent bundet med farvestoffet fluoresceinisothiocyanat, der har sur karakter.

I stedet for antistoffer kan man også anvende andre serumproteiner af dyre-, plante- eller mikrobiel oprindelse, når de som konjugater har en 15 elektroforetisk egenskab, der afviger fra udgangsproteinet og det til konjugationen anvendte fluoresceinisothiocyanat .

Det væsentlige kendetegn ved ovenstående fremgangsmåde består i anvendelsen af præparative 20 elektroforetiske fremgangsmåder til fremstillingen af rene serumprotein-konjugater, især af γ-globulin--fraktioner, der er omsat med fluoresceinisothiocyanat. Ved omsætningen af γ-globulin-fraktioner med de gængse fluorescensfarvestoffer kan der ikke for-25 ventes et elektroforetisk ensartet produkt, da strukturen af de immunglobulinklasser, der kommer i betragtning til omsætningen, som bekendt er forskellig og langt snarere har et forskelligt antal aminogrup-per, der er tilgængelige for omsætningen. Selv om 30 en relativ ensartet vandrende zone af ikke-omsatte γ-globuliner er kendt ved elektroforetiske fremgangsmåder, skal den ensartede vandring af de med fluoresceinisothiocyanat omsatte immunglobuliner af de forskellige klasser anses for overraskende. Det kan 35 7 142147 endvidere ikke forventes, at det adsorptivt til proteinmolekyler bundne fluoresceinisothiocyanat skilles fra proteinet i det elektriske spændingsfelt. Ud fra den kendte intensive binding af fluorescensfarvestof-5 fer til ionbyttermaterialet, således som dette anvendes ifølge den kendte teknik, kunne det endelig ikke forventes, at det frie fluoresceinisothiocyanat viser en særlig stor vandringsstrækning i sammenligning med serumprotein-konjugaterne ved elektroforetiske frem-10 gangsmåder, især under anvendelse af bæreren poly-vinylchlorid.

Ved anvendelsen af den kendte fremgangsmåde for elektroforese opnås et produkt af væsentlig højere renhed end det produkt, der kan opnås ved 15 chromatografi. Det fremkomne produkt viser som overraskende teknisk virkning en højere specificitet ved dets anvendelse som immunologisk reagens end produkter fremstillet ifølge den kendte teknik.

Opfindelsen skal belyses nærmere ved hjælp 20 af nedenstående udførelseseksempler.

Eksempel 1

En 3%'s antistofholdig serumproteinopløsning 25 fra geder omsættes med fluoresceinisothiocyanat på kendt måde i alkalisk miljø. Det konjugerede antiserum adskilles i 3,6 liter PVC-pulver ("Geon X 427" fra firmaet Serva, Heidelberg) indeholdt i et vandret elektroforeseapparatur (mål: længde 65,0 cm, bred-30 de 76,0 cm og højde 1,2 cm) ved en pH-værdi på 8,1, en feltstyrke på 6 V pr. cm, en strømstyrke på 0,6 A i en løbetid på 15 timer. Den antistofholdige γ--globulin-fraktion, der uden konjugation til fluoresceinisothiocyanat som regel bliver liggende i 35 påføringsrillen eller endog vandrer katodisk, er tydeligt vandret i retning af anoden. Den lysegule til grønlige farvning af den antistofholdige 8 142147

O

γ-globulin-fraktion aftegner sig tydeligt mod de øvrige protein-fraktioner og de frie farvestofandele, der er farvet mørkegule til rødligbrune. Den ønskede antistofholdige, med fluoresceinisothiocyanat konjugerede γ-globulin-frak-5 tion med optimal Ab/P-kvotient, der i øvrigt kan bestemmes båndvis umiddelbart efter opdelingen, udskæres som PVC-zone og udvaskes fra bæreren ved hjælp af 0,9%'s kogsaltopløsning. Eluatet koncentreres til ca. 1% protein ved ultrafiltrering.

Derefter kan slutindstillingen og kvalitetskontrol-10 len ske.

Ved anvendelse af 3,6 g af en fluoresceinkonjugeret antistofholdig proteinopløsning (svarende til 120 ml antiserum) udvindes 0,5 g af en fluoresceinkonjugeret antistofholdig γ-globulin-fraktion, hvilket svarer til et udbytte 15 på ca. 14% eller, hvis γ-globulin-indholdet (0,72 g) lægges til grund, på ca. 70%.

Hvis man anvender antistofholdige serumproteiner fra kaniner, får man 1,0 g af en fluoresceinkonjugeret antistofholdig γ-globulin-fraktion ved anvendelse af 8 g af et fluo-20 resceinkonjugeret antistofholdigt antiserum (svarende til 120 ml antiserum), hvilket svarer til et udbytte på ca.

12,5% eller, hvis γ-globulin-indholdet (1,6 g) lægges til grund, på ca. 63%.

Lignende udbytter opnår man også ved udvinding af 25 antistoffer fra humansera. I betragtning af, at andelen af γ-globulin-fraktionen i et antiserum udgør 15-18%, må udbytterne, beregnet på denne γ-globulin-fraktion, betegnes som optimale.

30 Eksempel 2

En 3%'s human-transferrin-opløsning omsættes med fluoresceinisothiocyanat på kendt måde i alkalisk miljø.

Det konjugerede protein adskilles i 3,6 liter PVC-pulver ("Geon X 427" fra firmaet Serva, Heidelberg) indeholdt i 35 et vandret elektroforeseapparatur (mål: længde 65,0 cm, bredde 76,0 cm, højde 1,2 cm) ved en pH-værdi på 8,1, en feltstyrke på 6 V pr. cm, ved en strømstyrke på 0,6 A i en løbetid på 15 timer.

U2147 9

Transferrin-konjugatet er tydeligt vandret i retning af anoden. Den gulbrune farvning af den transferrinholdige zone aftegner sig tydeligt mod de frie farvestofandele, der er forskelligt farvet og vandret endnu længere mod 5 anoden. Transferrin-konjugatet med optimal Ab/P-kvo-tient, der i øvrigt kan bestemmes båndvis umiddelbart efter opdelingen, udskæres som PVC-zone og udvaskes fra bæreren ved hjælp af 0,9%'s kogsaltopløsning. Eluatet koncentreres til 1% protein ved ultrafiltrering.

10 Derefter kan slutindstillingen og kvalitets kontrollen ske.

Ved anvendelse af 3,6 g human-transferrin udvindes ca. 3,0 g af det tilsvarende fluoresceinkon-jugerede protein.