CH618985A5 - Process for the purification of protein conjugates. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Protein-Konjugaten, die sich gegenüber den zur Konjugation eingesetzten organischen Verbindungen in ihren elektrophoretischen Eigenschaften unterscheiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Rohkonjugat zur Abtrennung von unerwünschten Nebenprodukten und nicht umgesetzten Konjugationspartnern einer präparativen Elektrophorese unterwirft. The invention relates to a process for the purification of protein conjugates which differ in their electrophoretic properties from the organic compounds used for conjugation, which is characterized in that the crude conjugate is subjected to a preparative electrophoresis in order to separate unwanted by-products and unreacted conjugation partners.
Auf diese Weise können Protein-Konjugate, d.h. mit organischen Verbindungen kovalent verbundene Proteine oder Proteingemische, in reiner Form aus den bei der Konjugationsreaktion anfallenden Rohkonjugaten, die allgemein sowohl unerwünschte Konjugationsprodukte als auch nicht umgesetzte Konjugationspartner enthalten, gewonnen werden. Die Abtrennung kann nach Durchführung der Elektrophorese in einfacher Weise geschehen, indem man die Zone, welche die gewünschten Protein-Konjugate enthält, von den Zonen, welche die unerwünschten Konjugate bzw. die nicht umgesetzten Konjugationspartner enthalten, abtrennt. In this way protein conjugates, i.e. Proteins or protein mixtures covalently linked to organic compounds are obtained in pure form from the raw conjugates obtained in the conjugation reaction, which generally contain both undesired conjugation products and unreacted conjugation partners. After electrophoresis has been carried out, the separation can be carried out in a simple manner by separating the zone which contains the desired protein conjugates from the zones which contain the undesired conjugates or the unreacted conjugation partners.
Voraussetzung für die Durchführbarkeit des erfindungsge-mässen Verfahrens ist es, dass sich die unerwünschten Protein-Konjugate vom nicht umgesetzten Protein und dem zur Konjugation verwendeten organischen Molekül in ihren elektrophoretischen Eigenschaften, d.h. ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit, unterscheiden. A prerequisite for the feasibility of the method according to the invention is that the undesired protein conjugates differ from the unreacted protein and the organic molecule used for conjugation in their electrophoretic properties, i.e. their electrophoretic mobility.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich insbesondere zur Reinigung von Protein-Farbstoff-Konjugaten, vorzugsweise von antikörperhaltigen Immunsera bzw. Proteinfraktionen, nach erfolgter Konjugationsreaktion mit Farbstoffen, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen, beispielsweise mit Fluo-resceinisothiocyanat. The method according to the invention is particularly suitable for cleaning protein-dye conjugates, preferably antibody-containing immune sera or protein fractions, after the conjugation reaction with dyes, in particular with fluorescent dyes, for example with fluorescein isothiocyanate.
Die Erfindung betrifft weiterhin nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Protein-Konjugate und deren Verwendung in der immunologischen Diagnostik. The invention further relates to protein conjugates purified by the described method and their use in immunological diagnostics.
Protein-Farbstoff-Konjugate, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierte antikörperhaltige Immunsera haben, wie nachstellend gezeigt wird, ihre besondere Bedeutung in der sogenannten Immunfluoreszenztechnik. Protein-dye conjugates, in particular antibody-containing immune sera conjugated with fluorescent dyes, have, as will be shown below, their particular importance in the so-called immunofluorescence technique.
Die von A.H. Coons 1942 eingeführte Technik der Immunfluoreszenz gestattet die kombinierte Untersuchung der serologisch-immunologischen Spezifität und der morphologischen Charakteristik des zu analysierenden Materials. Grundlage dieser Methode ist die sogenannte Antigen-Antikörper-Reak-tion, bei der einer der beiden immunologischen Partner - in der Regel der Antikörper - mit einem fluoreszierenden Farbstoffkonjugiert ist. Die Sichtbarmachung der Antigen-Antikörper-Reaktionsverbindung im mikroskopischen Präparat erfolgt durch Anregung der sichtbaren Fluoreszenz mittels Strahlung im ultravioletten Bereich. The A.H. Coon's technique of immunofluorescence, introduced in 1942, allows the combined investigation of the serological-immunological specificity and the morphological characteristics of the material to be analyzed. This method is based on the so-called antigen-antibody reaction, in which one of the two immunological partners - usually the antibody - is conjugated to a fluorescent dye. The antigen-antibody reaction compound is made visible in the microscopic preparation by excitation of the visible fluorescence by means of radiation in the ultraviolet range.
Die Immunfluoreszenz hat zur Identifizierung von gebundenen wie freien Antigenen und Antikörpern grosse diagnostische Beachtung gefunden. Immunofluorescence has received great diagnostic attention for the identification of bound and free antigens and antibodies.
Hierzu wird beispielsweise auf die folgenden Publikationen verwiesen: P.K. Nakane und G.B. Pierce, J. Histochem. Cytochem. 14 (1966) 929; M. Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York (1968); und Standardiza-tion in Immunofluorescence, herausgegeben von E. J. Hol-borow, Blackwell Scientific Pubblications, Oxford and Edinburgh (1970). For example, reference is made to the following publications: P.K. Nakane and G.B. Pierce, J. Histochem. Cytochem. 14 (1966) 929; M. Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York (1968); and Standardization in Immunofluorescence, edited by E. J. Holborow, Blackwell Scientific Pubblications, Oxford and Edinburgh (1970).
Gemäss diesem Stand der Technik werden antikörperreiche Fraktionen als sogenannte Immunsera mit Fluoreszenzfarbstoff - vorzugsweise mit Fluoresceinisothiocyanat — umgesetzt. Die weitere Reinigung des Umsatzproduktes erfolgt vorwiegend mittels Gelfiltration und mittels Ionenaustau-scher-Chromatographie an Diäthyl-Aminoäthyl-Cellulose. Dabei werden die fluoresceinkonjugierten Immunglobuline isoliert. According to this prior art, antibody-rich fractions are reacted as so-called immune sera with fluorescent dye - preferably with fluorescein isothiocyanate. The further purification of the conversion product takes place predominantly by means of gel filtration and by means of ion exchange chromatography on diethyl aminoethyl cellulose. The fluorescein-conjugated immunoglobulins are isolated.
Diese Verfahren haben den Nachteil, dass man beim Versuch der Entfernung des nicht kovalent gebundenen Farbstoffes aus der fluoresceinkonjugierten Proteinpräparation mittels Gelfiltration oder Dialyse eine unvollständige Abtrennung des Farbstoffes beobachtet, insbesondere wird der adsorptiv an das Protein gebundene oder der hydrolytisch relativ leicht abspaltbare, schwach kovalent gebundene Farbstoff nicht entfernt. Ausserdem wird Farbstoff, der infolge Eigenpolymerisation bzw. Eigenkondensation höhere Molekulargewichte erreicht, ebenfalls nur unvollständig eliminiert. These processes have the disadvantage that when attempting to remove the non-covalently bound dye from the fluorescein-conjugated protein preparation by means of gel filtration or dialysis, an incomplete separation of the dye is observed; in particular, the weakly covalently bound bound to the protein by adsorption or the hydrolytically relatively easily removable Dye not removed. In addition, dye which achieves higher molecular weights as a result of self-polymerization or self-condensation is also only incompletely eliminated.
Die Anwendung solcher, freien Farbstoff enthaltender, Präparate führt zu unspezifischen Fluoreszenzfärbungen am mikroskopischen Präparat und damit zu falschen Aussagen. The use of such preparations containing free dye leads to unspecific fluorescence staining on the microscopic preparation and thus to incorrect statements.
Bei dem gemäss dem Stand der Technik vorwiegend angewandten Verfahren zur Gewinnung der antikörperhaltigen konjugierten Proteinfraktion mittels Ionenaustauscher-Chromatographie an DEAE-Cellulose wird im wesentlichen nur der Antikörperanteil, der zur IgG-Klasse gehört, gewonnen. Unter den dabei angewandten Elutions- und Trennbedingungen werden Antikörper der IgM- und IgA-Klassen nur unvollständig bzw. überhaupt nicht abgelöst, so dass das gewonnene Präparat zum Teil einen erheblichen Verlust an gewünschten spezifischen Antikörpern aufweist. Bei Änderung der Elu-tionsbedingung zur Gewinnimg fluoresceinkonjugierter IgM-ünd IgA-Antikörper werden sogenannte «übermarkierte» Y-Globuline wie auch basophile Proteine miteluiert. Aufgrund ihres stark sauren Charakters führen diese sogenannten «übermarkierten» Proteinanteile bei immunologischen Reaktionen zur unspezifischen Bindung mit einer Reihe basischer Proteine im Untersuchungsmaterial und damit ebenfalls zu Fehlinterpretationen der erhaltenen Fluoreszenz. In the method mainly used according to the state of the art for obtaining the antibody-containing conjugated protein fraction by means of ion-exchange chromatography on DEAE cellulose, essentially only the antibody portion belonging to the IgG class is obtained. Under the elution and separation conditions used, antibodies of the IgM and IgA classes are only incompletely or not removed at all, so that the preparation obtained in some cases shows a considerable loss of the desired specific antibodies. When the elution conditions for the acquisition of fluorescein-conjugated IgM and IgA antibodies change, so-called “over-labeled” Y-globulins as well as basophilic proteins are co-eluted. Due to their strongly acidic character, these so-called "overlabeled" protein components in immunological reactions lead to non-specific binding with a number of basic proteins in the test material and thus also to misinterpretation of the fluorescence obtained.
Das erfindungsgemässe Verfahren weist die angegebenen Nachteile nicht auf. Die nach der Konjugationsreaktion, vorzugsweise imter Verwendung inerter Träger, durchgeführte elektrophoretische Reinigung farbstoffkonjugierter Proteinpräparationen, vorzugsweise fluoresceinkonjugierter Proteinpräparationen, bietet folgende Vorteile: The method according to the invention does not have the disadvantages indicated. The electrophoretic cleaning of dye-conjugated protein preparations, preferably fluorescein-conjugated protein preparations, carried out after the conjugation reaction, preferably using inert carriers, offers the following advantages:
1. Das Verfahren ermöglicht eine optimale «massgerechte» antikörperhaltige Zonengewinnung. Unerwünschte, beispielsweise antikörperfreie Ballast-Protein-Fraktionen können bei der Eliminierung der gewünschten Fraktion ohne Schwierig2 1. The method enables an optimal "tailored" antibody-containing zone extraction. Unwanted, e.g. antibody-free, ballast protein fractions can easily be eliminated in the elimination of the desired fraction2
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keiten verworfen werden. Die Ausbeute der antikörperhaltigen farbstoffkonjugierten Proteinpräparationen ist optimal. Im herangezogenen Beispiel der fluoresceinmarkierten 7-GI0-bulin-Fraktion werden 70 bis 90% der eingesetzten Menge wiedergewonnen. discarded. The yield of the antibody-containing dye-conjugated protein preparations is optimal. In the example of the fluorescein-labeled 7-GI0-bulin fraction used, 70 to 90% of the amount used is recovered.
2. Infolge der Konjugation von Proteinen mit sauren organischen Molekülen ändert sich der isoelektrische Punkt bei allen mit den organischen Molekülen in Reaktion getretenen Proteinen zu niedrigen Werten mit der Folge, dass sie unter den Bedingungen der Elektrophorese stärker anodisch wandern als nicht konjugierte Proteine. Die Entfernung zu sauer gewordener Proteine infolge starker Reaktion mit dem zur Konjugation eingesetzten Molekül bereitet keine Schwierigkeiten, da diese stärker anodenwärts wandern. Besonderes Gewicht hat dieses Ergebnis bei den mit dem sauren Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (chinoides System mit freier Carboxylgruppe) konjugierten Proteinen. 2. As a result of the conjugation of proteins with acidic organic molecules, the isoelectric point changes to low values for all proteins which have reacted with the organic molecules, with the result that they migrate more anodically under the conditions of electrophoresis than non-conjugated proteins. The removal of proteins that have become too acidic as a result of a strong reaction with the molecule used for conjugation presents no difficulties since they migrate more anode-wise. This result is particularly important for the proteins conjugated with the acid fluorescent dye fluorescein isothiocyanate (quinoid system with free carboxyl group).
3. Die optimale Entfernung des nicht (oder adsorptiv) gebundenen sauren organischen Moleküls, dessen Präsenz in fluoresceinkorijugierten Präparaten zu unerwünschten, unspe-zifisChen Fluoreszenzfärbungen führt, ist bei dem erfindungs-gemässen Verfahren gewährleistet. Der Grund für die leichte Entfernung dieses Farbstoffanteils liegt darin, dass das saure Molekül selbst stark anodenwärts wandert. Die Belastung durch die elektrische Spannung bei den Bedingungen der präparativen Zonenelektrophorese führt zu einer Abspaltung von relativ schwach an Protein gebundenen Molekülen und verursacht eine gute Qualität der elektrophoretisch gewonnenen Protein-Konjugate. Im Falle der mit Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Proteine wird eine Stabilitätssteigerung solcher Präparate bei Aufbewahrung in wässriger Lösung gegenüber denen, die nach dem Stand der Technik gewonnen wurden, beobachtet. 3. The optimal removal of the non-(or adsorptively) bound acidic organic molecule, the presence of which in fluorescein-conjugated preparations leads to undesired, unspecific fluorescent stains, is ensured in the method according to the invention. The reason for the easy removal of this dye component is that the acidic molecule itself migrates strongly towards the anode. The stress caused by the electrical voltage under the conditions of the preparative zone electrophoresis leads to the elimination of relatively weakly bound molecules and causes a good quality of the protein conjugates obtained electrophoretically. In the case of the proteins conjugated with fluorescent dye, an increase in the stability of such preparations when stored in aqueous solution compared to those obtained according to the prior art is observed.
4. Werden für die Konjugation als Proteine Antikörper eingesetzt, so gestattet das erfindungsgemässe Verfahren die Gewinnung aller farbstoffkonjugierter Antikörperklassen, z.B. IgG, IgA, IgM. Dies ist insbesondere bei der Verwendung von Antikörpern aus Seren, beispielsweise von Mensch, Ziege, Schaf oder Pferd, bei denen ausser den Antikörpern der IgG-Klasse auch die Antikörper anderer Immunglobulinklassen einen relativ hohen Anteil an der gesamten Antikörpermenge ausmachen, von Bedeutung. Dieser Faktor hat auch ein erhebliches wirtschaftliches Interesse, da antikörperhaltige Seren nicht in unbeschränkter Menge zur Verfügung stehen. 4. If antibodies are used as proteins for the conjugation, the method according to the invention allows the extraction of all dye-conjugated antibody classes, e.g. IgG, IgA, IgM. This is particularly important when using antibodies from sera, for example from humans, goats, sheep or horses, in which, in addition to the antibodies of the IgG class, the antibodies of other immunoglobulin classes also make up a relatively high proportion of the total amount of antibodies. This factor is also of considerable economic interest since serums containing antibodies are not available in unlimited quantities.
Wird das erfindungsgemässe Verfahren auf die Reinigung von mit Fluoresceinfarbstoffen konjugierten Antikörpern übertragen, so führt dies zu einer Erhöhung der Relation von spezifischen Antikörpern (Ab) zu Gesamteiweiss (P), des sogenannten Ab/P-Quotienten, was eine Steigerung der gewünschten spezifischen Fluoreszenz bewirkt. If the method according to the invention is applied to the purification of antibodies conjugated with fluorescein dyes, this leads to an increase in the ratio of specific antibodies (Ab) to total protein (P), the so-called Ab / P quotient, which increases the desired specific fluorescence .
5. Das erfindungsgemässe Verfahren, bei dem auf den Einsatz teurer chromatographischer Hilfsmittel verzichtet werden kann, beinhaltet eine wesentliche Verbilligung bei der Herstellung reiner Protein-Konjugate. Das vorzugsweise verwendete inerte Trägermaterial kann wiederholt eingesetzt werden. 5. The method according to the invention, in which the use of expensive chromatographic aids can be dispensed with, entails a substantial reduction in the cost of producing pure protein conjugates. The inert carrier material preferably used can be used repeatedly.
Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens empfiehlt sich insbesondere die Träger-Elektrophorese, wobei man sich bevorzugt einer Elektrophorese-Anordnung bedient, bei der der inerte Träger in einer horizontalen Wanne angeordnet ist. Carrier electrophoresis is particularly recommended for carrying out the method according to the invention, an electrophoresis arrangement preferably being used in which the inert carrier is arranged in a horizontal trough.
Wird beispielsweise Polyvinylchloridgranulat als Trägermaterial verwendet, so lässt sich nach Auftrennung der antikörperhaltigen fluorescein-konjugierten Proteinfraktionen die gewünschte Präparation entsprechend den sichtbaren Banden herausschneiden und danach aus dem Träger mit einfachen Lösungsmitteln eluieren. If, for example, polyvinyl chloride granulate is used as the carrier material, the desired preparation can be cut out according to the visible bands after the antibody-containing fluorescein-conjugated protein fractions have been separated and then eluted from the carrier with simple solvents.
Ist das Konjugat ungefärbt, kann die Position von Protein, If the conjugate is undyed, the position of protein,
Reaktionspartner und Protein-Konjugat indirekt, beispielsweise über einen Papierabklatsch, der anschliessend nach bekannten Methoden eingefärbt wird, nachgewiesen werden. Reaction partners and protein conjugate can be detected indirectly, for example via a paper copy, which is then colored using known methods.
Häufig verwendete elektrophoretische Trägermaterialien neben Polyvinylchlorid sind um einige Beispiele zu nennen Polyacrylamid, Cellulose, Stärke, Glasperlen und Sand. Die Aufzählung dieser Beispiele ist nicht abschliessend aufzufassen, sie könnte vielmehr beliebig fortgesetzt werden. Frequently used electrophoretic carrier materials in addition to polyvinyl chloride are to name a few examples polyacrylamide, cellulose, starch, glass beads and sand. The list of these examples is not exhaustive, but could be continued as desired.
Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens lassen sich jedoch auch Elektrophorese-Anordnungen in vertikaler Bauart mit und ohne Trägermaterial verwenden. Sehr gute Reinigungseffekte werden auch mit kontinuierlich arbeitenden Elektrophoresegeräten erhalten. For carrying out the method according to the invention, however, vertical-type electrophoresis arrangements with and without a carrier material can also be used. Very good cleaning effects are also obtained with continuously operating electrophoresis devices.
Nach dem vorliegenden Verfahren können Antikörper-Präparationen jeden Usprungs, die mit Farbstoffen sauren Charakters kovalent gebunden worden sind, aufgetrennt werden. Ein besonders geeigneter Farbstoff ist dabei Fluoresceinisothiocyanat. Antibody preparations of any origin covalently bound with acidic dyes can be separated by the present method. A particularly suitable dye is fluorescein isothiocyanate.
Es können jedoch auch nicht fluoreszierende Farbstoffe mit Proteinen umgesetzt werden und die infolge der Konjugationsreaktion gefärbten Proteine nach dem vorliegenden Verfahren abgetrennt werden, sofern die benutzten Farbstoffe ein unterschiedliches elektrophoretisches Wanderungs verhalten aufweisen. However, non-fluorescent dyes can also be reacted with proteins and the proteins stained as a result of the conjugation reaction can be separated off using the present method, provided the dyes used have different electrophoretic migration behavior.
Anstelle von Antikörpern können auch andere Proteine tierischen, pflanzlichen und mikrobiellen Ursprungs eingesetzt werden, wenn sie als Konjugate vom Ausgangsprotein und dem zur Konjugation verwendeten organischen Molekül abweichende elektrophoretische Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise werden als organische Moleküle für die Konjugation solche Verbindungen eingesetzt, bei denen der jeweilige isoelektrische Punkt im sauren pH-Bereich liegt. Instead of antibodies, other proteins of animal, vegetable and microbial origin can also be used if, as conjugates, they have different electrophoretic properties than the starting protein and the organic molecule used for conjugation. Compounds in which the respective isoelectric point is in the acidic pH range are preferably used as organic molecules for the conjugation.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist darin zu sehen, dass es mit seiner Hilfe gelingt, reine Protein-Konjugate, insbesondere von mit Fluoreszenz-Farb-stoffen umgesetzten Gammaglobulin-Fraktionen zu gewinnen. A particular advantage of the method according to the invention can be seen in the fact that it enables pure protein conjugates, in particular gamma globulin fractions reacted with fluorescent dyes, to be obtained.
Bei der Umsetzung von Gammaglobulin-Fraktionen mit den üblichen Fluoreszenz-Farbstoffen ist kein elektrophoretisch einheitliches Produkt zu erwarten, da die Struktur der für die Umsetzung in Frage kommenden Immunglobulinklassen bekanntlich verschieden ist und sehr viel eher eine unterschiedliche Anzahl von für die Umsetzung zugänglichen Ami-nogruppen besitzt. Obwohl eine relativ einheitlich wandernde Zone von nicht umgesetzten Gammaglobulinen bei elektrophoretischen Verfahren bekannt ist, muss die einheitliche Wanderung der mit Farbstoff umgesetzten Immunglobuline der verschiedenen Klassen als überraschend angesehen werden. Es war zudem nicht zu erwarten, dass die adsorptiv an .. Eiweissmolekülen gebundenen Farbstoffe im elektrischen Spannungsfeld vom Eiweiss abgetrennt werden. Schliesslich konnte aus der bekannten intensiven Bindung der Fluoreszenz-Farbstoffe an Ionenaustauschermaterial, welches gemäss dem Stand der Technik Verwendung findet, nicht erwartet werden, dass der freie Farbstoff bei elektrophoretischen Verfahren, insbesondere unter Verwendung des Trägers Polyvinylchlorid, eine besonders grosse Wanderungsstrecke im Vergleich zu den Protein-Konjugaten zeigt. When reacting gamma globulin fractions with the usual fluorescent dyes, no electrophoretically uniform product is to be expected, since the structure of the immunoglobulin classes that are suitable for the reaction is known to be different and very much rather a different number of amino groups accessible for the reaction owns. Although a relatively uniformly migrating zone of unreacted gamma globulins is known in electrophoretic processes, the uniform migration of the immunoglobulins of the different classes reacted with dye must be regarded as surprising. In addition, it was not to be expected that the dyes adsorptively bound to protein molecules would be separated from the protein in the electric voltage field. Finally, it could not be expected from the known intensive binding of the fluorescent dyes to ion exchange material which is used in accordance with the prior art that the free dye in electrophoretic processes, in particular using the carrier polyvinyl chloride, has a particularly long migration path in comparison with the Protein conjugates shows.
Durch die Anwendung der präparativen Elektrophorese wird ein Produkt erhalten, welches eine wesentlich höhere Reinheit aufweist, als das durch Chromatographie erhältliche Produkt. Das mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens erhaltene Produkt weist als überraschenden technischen Effekt eine höhere Spezifität bei seiner Verwendung als immunologisches Reagens auf als das Produkt nach dem Stand der Technik. By using preparative electrophoresis, a product is obtained which has a significantly higher purity than the product obtainable by chromatography. As a surprising technical effect, the product obtained with the aid of the method according to the invention has a higher specificity when used as an immunological reagent than the product according to the prior art.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail below on the basis of the exemplary embodiments.
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Beispiel 1 example 1
Eine 3%ige antikörperhaltige Serumeiweisslösung von der Ziege wird mit Fluoresceinisothiocyanat auf bekannte Weise im alkalischen Milieu umgesetzt. Das konjugierte Antiserum wird in einer mit 3,61 PVC-Pulver (Geon X 427 der Firma s Serva, Heidelberg) fassenden horizontalen Elektrophorese-Apparatur (Masse: 1 = 65,0 cm, b = 76,0 cm, h = 1,2 cm) bei pH-Wert 8,1, einer Feldstärke von 6 V pro cm, bei einer Stromstärke von 0,6 A während einer Laufzeit von 15 Stunden aufgetrennt. Die antikörperhaltige y-Globulin-Fraktion, die io ohne Konjugation an Fluoresceinisothiocyanat in der Regel in der Auftragsrille liegenbleibt bzw. sogar kathodisch wandert, ist deutlich in Richtung Anode gewandert. Die hellgelbe bis grünliche Färbung der antikörperhaltigen y-Globulin-Frak-tion zeichnet sich deutlich ab von den übrigen Protein-Frak- 15 tionen und von den freien Farbstoffanteilen, die dunkelgelb bis rötlich-braun gefärbt sind. Die gewünschte antikörperhaltige y-Globulin-Fraktion mit optimalem F/P-Quotienten, der übrigens unmittelbar nach der Auftrennung bandenweise bestimmt werden kann, wird als PVC-Zone herausgeschnitten zo und mittels 0,9%iger Kochsalzlösung aus dem Träger ausgewaschen. Das Eluat wird durch Ultrafiltration auf etwa 1 g % Ei-weiss eingeengt. A 3% goat's serum protein solution containing antibodies is reacted with fluorescein isothiocyanate in a known manner in an alkaline environment. The conjugated antiserum is in a horizontal electrophoresis apparatus (mass: 1 = 65.0 cm, w = 76.0 cm, h = 1), containing 3.61 PVC powder (Geon X 427 from s Serva, Heidelberg). 2 cm) at pH 8.1, a field strength of 6 V per cm, at a current of 0.6 A for a period of 15 hours. The antibody-containing y-globulin fraction, which usually remains in the application groove or even moves cathodically without conjugation to fluorescein isothiocyanate, has migrated clearly in the direction of the anode. The light yellow to greenish color of the antibody-containing y-globulin fraction clearly stands out from the other protein fractions and from the free dye components, which are dark yellow to reddish-brown in color. The desired antibody-containing y-globulin fraction with an optimal F / P ratio, which incidentally can be determined in bands immediately after the separation, is cut out as a PVC zone and washed out of the carrier with 0.9% saline solution. The eluate is concentrated to about 1 g% egg white by ultrafiltration.
Danach kann die Endeinstellung und Qualitätskontrolle erfolgen. 25 The final setting and quality control can then be carried out. 25th
Beim Einsatz von 3,6 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen Eiweisslösung (120 ml Antiserum) werden 0,5 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen y-Globulin-Fraktion gewonnen. When 3.6 g of a fluorescein-conjugated antibody-containing protein solution (120 ml of antiserum) are used, 0.5 g of a fluorescein-conjugated antibody-containing y-globulin fraction are obtained.
Werden antikörperhaltige Serumproteine vom Kaninchen 30 eingesetzt, so erhält man beim Einsatz von 8 g eines fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen Antiserums (120 ml) If rabbit 30 antibody-containing serum proteins are used, 8 g of a fluorescein-conjugated antibody-containing antiserum (120 ml) are obtained.
1,0 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen y-Globulin-Fraktion. 1.0 g of a fluorescein-conjugated antibody-containing y-globulin fraction.
Ähnliche Ausbeuten erhält man auch bei der Gewinnung von Antikörpern aus Humanseren. Unter Berücksichtigung, dass der Anteil der y-Globulin-Fraktion in einem Antiserum ca. 15 bis 18% ausmacht, sind die Ausbeuten, bezogen auf diese y-Globulin-Fraktion, als optimal zu bezeichnen. Similar yields are also obtained when antibodies are obtained from human sera. Taking into account that the proportion of the y-globulin fraction in an antiserum is approximately 15 to 18%, the yields based on this y-globulin fraction can be described as optimal.
Beispiel 2 Example 2
Eine 3%ige Human-Transferrin-Lösung wird mit Fluoresceinisothiocyanat auf bekannte Weise im alkalischen Milieu umgesetzt. Das konjugierte Protein wird in einer mit 3,61 PVC-Pulver (Geon X 427 der Firma Serva, Heidelberg) fassenden horizontalen Elektrophorese-Apparatur (Masse: 1 = 65,0 cm, b = 76,0 cm, h = 1,2 cm) bei pH-Wert 8,1, einer Feldstärke von 6 V pro cm, bei einer Stromstärke von 0,6 A während einer Laufzeit von 15 Stunden aufgetrennt. Das Transferrin-Konjugat ist deutlich in Richtung Anode gewandert. Die gelb-braune Färbung der Transferrin-haltigen Zone zeichnet sich deutlich ab von den freien Farbstoffanteilen, die unterschiedlich gefärbt und noch weiter anodenwärts gewandert sind. Das Transferrin-Konjugat mit optimalem F/P-Quotienten, der übrigens unmittelbar nach der Auftrennung bandenweise bestimmt werden kann, wird als PVC-Zone herausgeschnitten und mittels 0,9%iger Kochsalzlösung aus dem Träger ausgewaschen. Das Eluat wird durch Ultrafiltration auf etwa 1 g % Eiweiss eingeengt. A 3% human transferrin solution is reacted with fluorescein isothiocyanate in a known manner in an alkaline environment. The conjugated protein is in a horizontal electrophoresis apparatus (mass: 1 = 65.0 cm, w = 76.0 cm, h = 1.2) containing 3.61 PVC powder (Geon X 427 from Serva, Heidelberg) cm) at pH 8.1, a field strength of 6 V per cm, at a current of 0.6 A for a period of 15 hours. The transferrin conjugate has clearly moved towards the anode. The yellow-brown color of the transferrin-containing zone clearly stands out from the free dye components, which are colored differently and have migrated further anode. The transferrin conjugate with an optimal F / P ratio, which can also be determined in strips immediately after separation, is cut out as a PVC zone and washed out of the carrier with 0.9% saline. The eluate is concentrated to about 1 g% protein by ultrafiltration.
Danach kann die Endeinstellung und Qualitätskontrolle erfolgen. The final setting and quality control can then be carried out.
Beim Einsatz von 3,6 g Human-Transferrin werden ca. 3,0 g des entsprechenden fluoresceinkonjugierten Proteins gewonnen. When using 3.6 g of human transferrin, approximately 3.0 g of the corresponding fluorescein-conjugated protein are obtained.
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