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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 18. Mai 1954 Bekanntgemacht am 3. Mai 1956Registration date: May 18, 1954. Advertised on May 3, 1956

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines adrenocortiicotropen Präparates, das sieb für intramuskuläre oder subkutane Injektionen eignet und eine gesteigerte Wirkung zeigt. Das adrenocorticotrope Hormon ist eine Substanz, die von dem Hypophysenvarderlappen abgesondert wird und wahrscheinlich durch die Blutbahn zur Nebenniere gebracht wird, wo sie einen Einfluß auf die Entwicklung, das Wachstum und die Wirksamkeit der Nebennierenrinde ausübt. In den letzten Jahren haben sich Extrakte aus adrenocorticotropen Hormon, die aus den Hypophysen von Tieren, wie Sahweinen, Schafen'und Rindern, gewonnen wurden, als äußerst wirksam für die Besserung bestimmter pathologischer Zustände beim Menschen bei pareniteraler Injektion erwiesen.The invention relates to the production of an adrenocortiicotropic preparation, the sieve for intramuscular or subcutaneous injections and shows an increased effect. The adrenocorticotrope Hormone is a substance produced by the pituitary vardal lobe is secreted and likely through the bloodstream to the adrenal gland is brought where it has an impact on the development, growth and effectiveness of the Adrenal cortex exercises. In recent years, extracts from adrenocorticotropic have become Hormones obtained from the pituitary glands of animals such as white wines, sheep and cattle, to be extremely effective for ameliorating certain pathological conditions in humans proven with pareniteral injection.

Da die tierischen Hypophysen, aus denen das adrenooortieotirope Hormon gewonnen wird, jedoch nur in begrenzter Anzahl für eine Verarbeitung zur Verfügung stehen und dabei nur verhältnismäßig geringe Mengen an' Wirkstoff besitzen, wurde erfindungsgemäß ein Verfahren entwickelt, das nicht nur die äußerste Ausbeute an aktiver Substanz aus den verfügbaren Drüsen gewährleistet, sondern auch die Wirksamkeit der aktiven Subetaaiz bis zum größtmöglichen Ausmaß steigert.As the animal pituitary glands from which the adrenooortieotirope hormone is obtained, however only in limited numbers for processing Are available and only have relatively small amounts of 'active ingredient, according to the invention a process developed that not only yields the utmost in active substance ensures the available glands, but also the effectiveness of the active subetaaiz up to to the greatest possible extent.

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Ernndungsgemäß wird das AdrenocoirticotrOpin mit einer besonderen Art von Gelatimeträger, nämlich mit Oxypolygelatine, unter Bildung einer Kotnplexverbiindung kombiniert.According to the AdrenocoirticotrOpin with a special type of gelatin carrier, namely with oxypolygelatine, forming a complex compound combined.

Das adirenoGortieotrope Hormon ist bei Anwendung in der Komplex verbindung mit Oxypolygelatine wirksamer als das gleiche Adrenocoirtico tropin-Hotrnon bei Anwendung in irgendeiner anderen bekannten Gelatineart und selbstverständlichThe adirenoGortieotropic hormone is in use In the complex compound with Oxypolygelatine more effective than the same Adrenocoirtico tropine hotron when used in any other known type of gelatin and of course

ίο wesentlich wirksamer als das gleiche Hormon in einer üblichen wäßrigen Lösung. Die gesteigerte Wirksamkeit zeigte¹ sich in einer Verdoppelung und Verdreifachung der A C T Η-Wirkung gegenüber der mit anderen Gelatinearten erzielten.ίο much more effective than the same hormone in a common aqueous solution. The increased effectiveness showed ¹ to Η effect achieved compared with the other types of gelatin in a doubling and tripling of ACT.

Die oben beschriebene Wirkungssteigerung ist eine tatsächliche' Potenzierung zum Unterschied von einer nur verzögernden Wirkung, die manchmal durch die Viskosität des Trägers hervorgerufen werden kann. Dies. wird vielleicht durch die Tat-The increase in effectiveness described above is an actual 'potentiation as opposed to a merely retarding effect, which sometimes can be caused by the viscosity of the carrier. This. may be due to the fact

2ύ · sache klär, daß das Oxypolygelatine-Adrenoooirtieotropin-Präparat unmittelbar nach der Injektion eine plötzliche starke Reaktion verursacht, die weit über die Reaktion, die durch eine gleiche Dosis derselben Substanz, in einer wäßrigen Lösung, der keine Oxypolygelatine zugegeben wurde, hinausgeht. Es zeigte sich, daß während der ersten 24 Stunden nach der Injektion die Reaktionseir scheinung bei einer bestimmten Dosis Oxypolygelatine-Adrenoaorticotropin ähnlich der des Adrenocortiootropin waren. Im weiteren Verlauf konnte jedoch beobachtet werden, daß die Reaktion des Oxypolygelatine-Adrenoooirticotropins stärker wird, so als sei eine viel größerei Dosis gegeben worden. Diese Erscheinung kann nicht einfach auf Grund von Re-Sorptionsverzögerung erklärt werden, sondern man darf annehmen, daß sie auf der Eigenschaft der Komplexverbindung mit der Oxypolygelatine beruht. 2ύ · thing clarifies that the oxypolygelatin-adrenoirtieotropin preparation caused a sudden strong reaction that went well beyond immediately after the injection the reaction caused by an equal dose of the same substance, in an aqueous solution of none Oxypolygelatin was added, goes beyond. It was found that during the first 24 hours After the injection, the symptoms of reaction with a certain dose of Oxypolygelatine-Adrenoaorticotropin similar to that of adrenocortiootropin was. In the further course, however, it could be observed that the reaction of the oxypolygelatine-adrenoirticotropin becomes stronger, as if a much larger dose had been given. This Appearance cannot be explained simply on the basis of re-sorption delay, but one may assume that it is based on the property of the complex compound with the oxypolygelatine.

Oxypolygelatine, der erfindungsgemäß angewandte Träger, ist bekannt, in der Literatur ausführlich beschrieben und leicht zu erhalten. (Campbell u.a., »The Preparation and Properties of a Modified Gelatin; [Oxypolygelatin] As an Oncotic Substitute for Serum Albumin« Texas Reports on Biology and Medicine, Bd. 9,. Nr. 2, S. 235 bis 280, Sommer 1951). Im allgemeinen wird Oxypolygelatine wie folgt hergestellt: D ie Gelatine wird mit einem Komdensiationsimittel, wie z. B. Glyoxal oder einem Kupp lungs agens zu größeren Komplexen gebunden und dieses Gelatine-Polymere mit hohem Molekül äirgewicht der Oxydation mit Wasserstoffsuperoxyd bis -zu einem bestimmten Grad unterworfen, wobei das Molekül bis zur ge-Oxypolygelatin, the carrier used according to the invention, is known in the literature described in detail and easy to obtain. (Campbell et al., The Preparation and Properties of a modified gelatin; [Oxypolygelatin] As an Oncotic Substitute for Serum Albumin, "Texas Reports on Biology and Medicine, Vol. 9 ,. No. 2, p. 235 to 280, summer 1951). In general, oxypolygelatin is used prepared as follows: T he gelatin is treated with a Komdensierungsimittel, such as. B. glyoxal or a coupling agent bound to form larger complexes and this gelatin polymer with high molecular weight of the oxidation Hydrogen peroxide up to a certain point Degree, with the molecule up to

- wünschten' Größe und Konfiguration abgebaut wird, Oxypolygelatine wurde bereits zur Vergröße^- rung des Plasmavolumens verwendet. Die Verwendung als Träger für adrenocortiootropes Hormon war bis jetzt noch nicht bekannt. Es ist bekannt, daß sie nicht toxisch wirkt und weder Antigene er-, 60 zeugt noch Fieber hervorruft. Es wird vorzugsweise eine 35- bis 40⁰/oige wäßrige Oxypolygelatine bei der Herstellung des ernndungsgernäßen Produktes angewandt. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, daß die Konzentration: an Oxypolygelatine in einem Bereich zwischen 5 und 50 Gewichtepro'zent der Injektioinslösung liegt, es können aber auch Oxypolygelatine-Koozentrationen angewendet werden, die ober- und unterhalb dieser Grenzen liegen. '
■ Das adrenocorticotrope Hormon ist zwar bis jetzt noch nicht isoliert worden, und seine Molekülstruktür ist noch nicht endgültig oharäkteriisiert. Man nimmt jedoch an, daß es ein Eiweißkörper ist und daß bestimmte Herstellungsverfahren zu einem Polypeptid-Molekül mit adrenocortiootroper Wirksamkeit führen. Bei der vorliegenden Arbeit wurde eine ziemlich reine Substanz verwendet, aber jede der bekannten adrenocortiootropen Substanzen ■— ganz gleich, ob sie in der sogenannten ■ »Ganzproteinform« oider der »Poilypeptidfbrm« vorliegt — kann unabhängig von ihrer Herkunft oder ihrem Herstellungsverlauf mit Oxypolygelatine zur Erzielung der erfindiungsgemäß beabsichtigten Wirkung kombiniert werden.- Desired 'size and configuration is degraded, Oxypolygelatine has already been used to enlarge the plasma volume. Its use as a carrier for adrenocortiootropic hormone was not heretofore known. It is known that it is non-toxic and does not produce antigens, nor does it induce fever. There is preferably used a 35 to 40 ⁰ / o aqueous oxypolygelatin in the preparation of ernndungsgernäßen product. In general, it is expedient that the concentration of oxypolygelatin is in a range between 5 and 50 percent by weight of the injection solution, but oxypolygelatin co-concentrations which are above and below these limits can also be used. '
The adrenocorticotropic hormone has not yet been isolated, and its molecular structure has not yet been definitively oharacerized. It is believed, however, that it is a protein body and that certain manufacturing processes lead to a polypeptide molecule with adrenocortiootropic activity. In the present work a fairly pure substance was used, but each of the known adrenocortiootropic substances ■ - regardless of whether they are in the so-called ■ »whole protein form« or the »polypeptide form« - can be achieved with oxypolygelatine regardless of their origin or their production process the effect intended according to the invention can be combined.

Die Art, in der die aktive Substanz mit der Oxypolygedatine reagiert, um die erhöhte Wirksamkeit zu schaffen, könnte man etwa wie folgt erklären:The way in which the active substance with the oxypolygedatine reacts to create the increased effectiveness, one could explain something like this:

Durch die Öxydationsireaktion, der die Oxypolygelatine unterzogen wird, wird das Molekül mit einer größeren Anzahl saurer Carboxylgruppen versehen, die verursachen, daß die Oxypoilygelatine sich mit dem basischen Adrenoooirticotropin unter Bildung eines chemischen Komplexes mit erhöhter adrenocorticotroper Wirksamkeit verbindet.As a result of the oxidation reaction to which the oxypolygelatine is subjected, the molecule becomes with provided a greater number of acidic carboxyl groups that cause the oxypoilygelatin with the basic Adrenoooirticotropin with the formation of a chemical complex with increased adrenocorticotropic effectiveness.

Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele näher beschrieben:The invention is described in more detail using the following examples:

Beispiel ιExample ι

Eine bestimmte Menge Adrenocorticotropin wird durch Extraktion mit Eisessig bei γο° C aus mit. Aceton entwässerten Hypophysenvordeirlappen von Schweinen erhalten. Durch Zusatz des halben Volumens Aceton und einer kleinen Menge NaCl zu der Lösung werden unerwünschte Bestandteile ausgefällt. Durch Versetzen der Lösung mit einer gleich großen Menge Äthyläther fällt man ein rohes Adrenocortico'tropiin aus. Der Niederschlag wird durch Adsorption an OxyzelMose gereinigt und wieder eluiert. Man versetzt das Eluat mit einem Ionenaustauschharz, insbesondere einem Anionenaustauschharz (ein Handelsprodukt der Fa. Röhm und, Haas mit dem Namen 1 R 400), um das Adrenocorticotrop in in das Acetat zu' überführen. Die so gebildete Lösung wird dann lyophilisiert, mit destilliertem pyrogenf reiem Wasser aufgenommen, steril filtriert, in Ampullen, abgefüllt, abgekühlt und wieder lyophilisiert.A certain amount of adrenocorticotropin is made from with extraction with glacial acetic acid at γο ° C. Acetone-dehydrated anterior pituitary lobes obtained from pigs. By adding half the volume of acetone and a small amount of NaCl to the solution, undesired constituents are precipitated. By adding an equal amount of ethyl ether to the solution, a crude Adrenocortico'tropiin is precipitated. The precipitate is purified by adsorption on OxyzelMose and eluted again. The eluate is mixed with an ion exchange resin, in particular an anion exchange resin (a commercial product from Röhm and Haas with the name 1 R 400) in order to convert the adrenocorticotrope into the acetate. The solution thus formed is then lyophilized, taken up in distilled, pyrogen-free water, sterile filtered, put into ampoules, filled, cooled and lyophilized again.

Das getrocknete Produkt, das manchmal als »Polypeptidfoirm« des Adrenocorticotrop ins bezeichnet wird, wird mit einer Lösung, die 37% Oxypolygelatine und 0,5 °/o Phenol enthält, umgesetzt. The dried product, sometimes referred to as the "polypeptide form" of the adrenocorticotrope, is made with a 37% solution Oxypolygelatine and 0.5% phenol contains, implemented.

Die Oxypolygelatmelosunig wurde durch Kondensation, von Gelatine mit Glyoxal und darauffolgender Oxydation mit Wasserstoffsuperoxyd hergestellt und lag als 5°/oige Oxypolygelatinelösung in Salzlösung vor. Diese wurde für die Ver-The Oxypolygelatmelosunig was made by condensation, made of gelatine with glyoxal and subsequent oxidation with hydrogen peroxide and lay as a 5% oxypolygelatine solution in saline before. This was for the

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wendung in dem vorliegendem Beispiel so behandelt, daß der normale Salzgehalt durch Dialyse entfernt, die Lösung durch Vakuumdestillation auf 37% Oxypolygelatine angereichert, mit Phenol bis zu einer Konzentration von 0,5% versetzt und steril filtriert wurde.application in the present example is treated in such a way that that the normal salt content is removed by dialysis, the solution is enriched by vacuum distillation to 37% oxypolygelatin, with phenol up to a concentration of 0.5% and sterile was filtered.

Example 2

Lyophiilisiertes Adrenooortiootropin, das nach Beispiel 1 hergestellt worden war, wird mit i6°/oiger Gelatine zu einer A C T H-Wirksamkeit von 16,5 Einheiten/o,S ml aufgebaut. Die obige Stammlösumg wird in zwei gleich große Teile geteilt und zur Herstellung der Lösungen A und B wie folgt verwendet: Lösung A wird durch Verdünnen der Stammlöisung auf 0,40 Einheiten/0,5 ml mit i6%iger Gelatine, die 0,5 % Phenol enthält, hergestellt. Lösung¹ B wird durch Verdünnen der Stammlösumg auf 0,40 Einheiten / 0,5 ml mit 37°/oiger Oxypolygelatine, die 0,5 °/o Phenol enthält, hergestellt.Lyophilized adrenoortiootropin, which had been prepared according to Example 1, is built up with 16% gelatin to an ACT H activity of 16.5 units / 0.5 ml. The above stock solution is divided into two equal parts and used to prepare solutions A and B as follows: Solution A is obtained by diluting the stock solution to 0.40 units / 0.5 ml with 16% gelatin containing 0.5% Contains phenol. Solution ¹ contains B is by diluting the Stammlösumg to 0.40 units / 0.5 ml with 37 ° / cent oxypolygelatin, 0.5 ° / o phenol produced.

Lösungen A und B werden darauf nach dem Adrenalin-AsiciOTbinsäu're-Ersahöpfunigstest an hypophysektoimierten Ratten untersucht. Den Ratten werden, die Hypophysendrüsen vor dem Test entfernt. Die Versuchstiere bekommen eine Injektion von ACTH und werden in Abständen getötet und der Gehalt an Ascorbinsäure in der Adrenalindrüse bestimmt. Das ACTH hat die Wirkung, den Gehalt an Ascorbinsäure in der Adrenalindrüse zu senken. Die gefundene Konzentration der Ascorbinsäure wird als Maßstab der Aktivität des ACTH-Produktes verwendet. Diese Methode ist eine Standardmethode zur Untersuchung der Aktivität von A C T Η-Produkten (Sayers u.a. »Indocrinology« 42, 379 [1948]).Solutions A and B are then after the adrenaline-AsiciOTbinsäu're-Ersahöpfunigstest on hypophysectoimized Rats examined. The rats have their pituitary glands removed prior to testing. The test animals are injected with ACTH and are sacrificed at intervals the content of ascorbic acid in the adrenaline gland definitely. The ACTH has the effect of increasing the level of ascorbic acid in the adrenaline gland reduce. The ascorbic acid concentration found is used as a measure of the activity of the ACTH product used. This method is a standard method for studying the activity of A C T Η products (Sayers et al. "Indocrinology" 42, 379 [1948]).

B e i s ρ i e 1 3B e i s ρ i e 1 3

Lyophilisiertas Adrenooortiootropin, das nach Beispiel 1 hergestellt worden war, wird mit i6°/oiger Gelatine zu einer A C T H-Wirksamkeit von 16,5 Einheiten/0,5 ml aufgebaut.Lyophilized as adrenooortiootropin, which after Example 1 had been prepared, with 16% gelatin to an A C T H activity of 16.5 units / 0.5 ml.

Die obige Stammlösung wird in zwei gleich große Teile geteilt und zur Herstellung der Lo-sung C und D wie folgt verwendet:The above stock solution is divided into two equal parts and used to make the solution C and D used as follows:

Lösung C wird durch Verdünnen der Stammlösung auf 0,120 Einheiten/0,5 ml mit i6°/<Mger Gelatine, die 0,5 % Phenol enthält, hergestellt.Solution C is obtained by diluting the stock solution to 0.120 units / 0.5 ml with 16 ° / <Mger Gelatin containing 0.5% phenol.

Lösung D wird durch Verdünnen der Stammlösung auf 0,120 Einheiten/0,5 ml mit 37⁰/odger Oxypolygelatine, die 0,5 °/o Phenol enthält, verdünnt. Solution D contains by diluting the stock solution to 0.120 units / ml with 0.5 37 ⁰ / Odger oxypolygelatin, 0.5 ° / o phenol diluted.

Lösungen C und D werden nach der genannten Standardmethode untersucht, und es zeigte sich, daß Lösung D (mit Oxypolygelatine umgesetzt) eine Wirksamkeit von etwa 150 bis 200% der Lösung C (mit nur gewöhnlicher Gelatine) besaß. Wenn der Ausdruck »Einheit« hier in Verbindung mit ACTH-Wirksaimkeit gebraucht wird, so bedeutet dies immer: »Internationale Einheit«, wie sie von der Welt-Gesundheits-Organisaitiom - angenommen wird.Solutions C and D are examined according to the standard method mentioned, and it was found that solution D (reacted with oxypolygelatin) has an effectiveness of about 150 to 200% of the solution C (with only ordinary gelatin) possessed. When the term "unity" is used here is used with ACTH effectiveness, then means this always: "International Unity" as adopted by the World Health Organization will.

Claims

Patent claims:

1. Method of stabilizing an adrenocorticotrope Preparation, characterized in that it is reacted with oxypolygelatine.

2. The method of claim 1, characterized ge * - kenmzeichnet that Adrenocorticotrop ", is preferably from 35 to 40% dissolved in in an aqueous solution of oxypolygelatin at a concentration of 5 to 50 ⁰ /.