DE977124C

DE977124C - Process for the production of citric acid by submerged fermentation

Info

Publication number: DE977124C
Application number: DEM23106A
Authority: DE
Inventors: Leonard Brudy Schweiger
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1953-06-01
Filing date: 1954-05-18
Publication date: 1965-03-11
Also published as: FR1090297A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von Zitronensäure aus kohlehydrathaltigem Material durch submerse Gärung und betrifft insbesondere ein Verfahren zum Hemmen gewisser verunreinigender Einflüsse auf die Gärung, welche sich auf die Zitronensäureerzeugung störend auswirken können.The invention relates to the production of citric acid from material containing carbohydrates by submerged fermentation and relates in particular to a method of inhibiting certain contaminants Influences on fermentation, which can have a disruptive effect on citric acid production.

Wenn auch bekanntlich die zuckerhaltigen Nährmedien, die üblicherweise zur Herstellung von Zitronensäure durch submerse Gärung verwendet werden, eine hohe Resistenz gegenüber Verunreinigungen durch die meisten Mikroorganismen aufweisen, haben sich die gleichen Kulturlösungen jedoch gegenüber Verunreinigungen durch Penicilliumstämme und gewisse Hefearten als recht empfindlich gezeigt. Die Widerstandsfähigkeit gegenüber der ersten Form von Verunreinigungen und die Empfindlichkeit gegenüber der letzteren ist in erster Linie auf den niederen pH-Wert des Nährmediums zurückzuführen, der meistens bei etwa pH 2,2 bis 2,8 liegt.Even if it is well known that the nutrient media containing sugar, which are usually used for the production of Citric acid used by submerged fermentation, high resistance to impurities exhibited by most microorganisms, the same culture solutions have however to be quite sensitive to contamination by Penicillium strains and certain types of yeast shown. Resistance to the first form of contamination and the sensitivity to the latter is primarily due to the lower pH of the nutrient medium due, which is mostly around pH 2.2 to 2.8.

Die Hauptwirkung einer Hefeverunreinigung liegt in einer verringerten Gärungsausbeute, die sich als Folge der konkurrierenden Verwertung des Zuckers in der Nährlösung durch die Hefe und den säureproduzierenden Pilz, wie z. B. Aspergillus niger, ergibt. Die Gegenwart von Penicillien hat dagegen sowohl anfangs als auch in den späteren Stadien der Gärung einen viel stärkeren Einfluß, da sie eine völlige Aufhebung der Säureproduktion bewirkt. Wenn dies auch meistens auf einen Ver-The main effect of yeast contamination is a reduced fermentation yield, the as a result of the competing utilization of the sugar in the nutrient solution by the yeast and the acid-producing fungus, such as B. Aspergillus niger results. Has the presence of penicillia on the other hand, both at the beginning and in the later stages of fermentation, have a much stronger influence because it brings about a complete abolition of acid production. Even if this is mostly due to a

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brauch der Kulturlösung zurückgeführt wird, ist diese Unfähigkeit, die erwartete Menge an Zitronensäure zu ergeben, nicht auf eine Änderung in dem Medium zurückzuführen, sondern scheint eine Wirkung zu sein, die durch eine parasitäre Beziehung zwischen dem verunreinigenden Mikroorganismus, nämlich dem Penicillium, und dem Fermentationsorganisrnus besteht.When the culture solution is returned, this is inability to obtain the expected amount of citric acid appears not to be due to a change in the medium, but appears to be a Effect caused by a parasitic relationship between the contaminating microorganism, namely the Penicillium, and the fermentation organism.

Demgemäß besteht eine Aufgabe dieser Erfindung ίο darin, diese Gärungsverluste auf Grund der Penicillienverunreinigung auszuschalten.Accordingly, it is an object of this invention to remedy these fermentation losses due to penicillin contamination turn off.

Ein weiterer Zweck der Erfindung liegt darin, einAnother purpose of the invention is to provide a

Verfahren zu schaffen, die Entwicklung von anfangs vorhandenen Penicilliunistämmen in der Gärungsflüssigkeit zu vermeiden, die der mikrobiologischen Umwandlung zu Zitronensäure unterworfen, wird.Process to create the development from the beginning existing penicilliunis strains in the fermentation liquid to avoid those of the microbiological Conversion to citric acid is subjected.

Eine weitere Aufgabe des Verfahrens gemäß derAnother task of the method according to

Erfindung ist die Ausschaltung des hemmenden Einflusses der Penicillien, ohne daß aber dadurch das Wachstum und die physiologische Wirksamkeit des Gärungsorganismus verändert wird.The invention is the elimination of the inhibitory influence of the penicillia, but without this the growth and physiological effectiveness of the fermentation organism is changed.

Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch submerse Züchtung von AspergiUus niger in einem kohlehydrathaltigen Nährmedium unter Zusatz von. Kupferionen., wobei dieses Nährmedium Penicillien als verunreinigende Organismen enthält, darin, daß man dem Nährmedium nach praktisch vollendeter Entwicklung des Aspergillus-niger-Myzels Kupferionen in einer Menge von 5 bis 75 mg/1 zusetzt.According to the invention, there is a method for producing citric acid by submerged cultivation of AspergiUus niger in a nutrient medium containing carbohydrates with the addition of. Copper ions., this nutrient medium containing penicillia as contaminating organisms in that after practically complete development of the Aspergillus niger mycelium, copper ions are added to the nutrient medium added in an amount of 5 to 75 mg / l.

Die Zugabe von Kupferionen in Spurenkonzentrationen von 0,048 bzw. 0,075 mg%> zu Nährlösungen, die durch AspergiUus niger auf Zitronensäure vergoren werden sollen, ist bereits bekannt. Diese Konzentration fördert die Entwicklung des Gärungsorganismus. Es ist nun überraschend, daß eine 10- bis ioofache Erhöhung dieser Konzentration an Kupferionen auf den AspergiUus niger keine schädigende Wirkung hat, während das unerwünschte Wachstum von Penicillien in dem Gärmedium wirksam unterdrückt wird.The addition of copper ions in trace concentrations of 0.048 or 0.075 mg%> about nutrient solutions that are to be fermented on citric acid by AspergiUus niger is already known. This concentration promotes the development of the fermentation organism. It is now surprising that a 10 to 100 fold increase in this concentration of copper ions on the AspergiUus niger none has a damaging effect, while the undesirable growth of penicillia in the fermentation medium is effectively suppressed.

Um das durch die Erfindung zu lösende Problem in großen Zügen näher zu erläutern, wird im folgenden auf Versuche und Untersuchungen mit Nährlösungen Bezug genommen, die mit Aspergillusniger-Sporen geimpft wurden. Diese Nährlösungen waren so zusammengesetzt, daß sie mit den optimalen Verhältnissen im Einklang standen, wie sie in den US A.-Patents ehr if ten 2 492 667 und 2 492 673 offenbart wurde, worauf die Nährlösungen dem Gärungsverfahren, wie es dort beschrieben ist, unterworfen wurden.In order to explain the problem to be solved by the invention in greater detail, in the following referred to experiments and studies with nutrient solutions containing Aspergillus niger spores have been vaccinated. These nutrient solutions were composed in such a way that they could be combined with the optimal Ratios were consistent as set out in U.S. Patents 2,492,667 and 2,492,673 was disclosed, whereupon the nutrient solutions subjected to the fermentation process as described therein became.

Um vorerst die hemmenden Einflüsse der Verunreinigung durch Penicillien festzustellen und um die Zeitdauer zu bestimmen, die nötig ist, um bei einer bestimmten Anzahl von Organismen ein Altern oder Mattwerden der Gärungslösung hervorzurufen, wurde eine von Kationen befreite Maisstärkenährlösung mit verschiedenen Konzentrationen von Penicilliensporen beimpft, und zwar zur gleichen Zeit, als die Impfung mit AspergiUus niger durchgeführt wurde. Folgende Alterungswirkungen wurden festgestellt:In order to first determine the inhibitory effects of the contamination by penicillia and in order to to determine the length of time it takes to enter a certain number of organisms Cause the fermentation solution to age or dull, became a de-cationized corn starch broth at various concentrations inoculated from penicillia spores at the same time as the inoculation with AspergiUus niger was carried out. The following aging effects were found:

Table 1

Penicillien-Sporen/LiterPenicillia spores / liter Ver
unreinigungVer
impurity TageDays IO⁶ IO ⁶ ++ 22 IO⁵ IO ⁵ 4-4- 33 IO*IO * ++ 44th IO³ IO ³ 4-4- 55 IO² IO ² 4-4- 55 IOIO ++ 66th

+ bedeutet ein für die Änderung der Säurebildung ausreichendes Wachstum an Penicillien.+ means sufficient growth in penicillia to change acid formation.

Da sich eine übliche Fermentation der Kulturlösung normalerweise über eine Zeitspanne von etwa 8 bis 10 Tagen erstreckt, kann aus der Tabelle ι entnommen werden, daß sämtliche Konzen- trationen der Penicilliensporen, bis zu der geringen Anzahl von 10 Sporen je Liter Nährlösung, eine Alterungswirkung besitzen, die sich im Laufe der Gärungsdauer auswirkt. Die Penicilliumverunreinigung wurde bei allen Versuchen durch mikrosko- ⁸S pische Untersuchung, durch den Fermentationsgeruch und durch die Verringerung der Säureproduktion festgestellt. Man kann erkennen, daß die Zeitspanne, die nötig ist, um ein Mattwerden oder Verringern der Säureproduktion durch das Penicil-Hum zu bewirken, von der ursprünglichen Konzentration der Verunreinigungssporen abhängt.Since a conventional fermentation of the culture solution normally extends over a period of about 8 to 10 days, it can be seen from Table ι that all concentrations of penicilli spores, up to the small number of 10 spores per liter of nutrient solution, have an aging effect which affects the fermentation period. The Penicilliumverunreinigung was found in all experiments by microscopically ⁸ S european investigation by the fermentation odor, and by reducing the acid production. It can be seen that the length of time it takes for the Penicil-Hum to tarnish or decrease acid production depends on the initial concentration of the contaminant pores.

Zu kationenfreier Maisstärkegärlösung, die diese hemmenden Mengen von Penicilliumsporen enthält, wurde nun Kupfersulfat in verschiedenen Konzentrationen zugegeben, damit bei den verunreinigten Kulturlösungen die verminderte Säureproduktion verstärkt wird, wie es in der Tabelle 2 deutlich gezeigt ist. Die darin gezeigten Kupferkonzentrationen können, durch Zugabe irgendeines löslichen Kupfersalzes zu der Nährlösung erreicht werden, wobei das Salz jedoch keine schädlichen oder unerwünschten Anionen besitzen darf. Geeignet sind z. B. Kupfersulfat, Kupferchlorid u. dgl.To cation-free corn starch fermentation solution, which contains these inhibitory amounts of Penicillium spores, copper sulphate was now added in various concentrations, thus with the contaminated Culture solutions the reduced acid production is increased, as clearly shown in Table 2 is. The copper concentrations shown therein can, by adding any soluble copper salt to the nutrient solution can be achieved, but the salt is not harmful or undesirable May have anions. Suitable are e.g. B. copper sulfate, copper chloride and the like.

In der Tabelle 2 ist klar zu erkennen, daß den Ansätzen verschiedene Konzentrationen sowohl von Penicilliensporen als auch von Kupferionen, jeweils zu verschiedenen Zeiten der Zellentwicklung und Säureproduktion hinzugegeben wurden, um die vergleichbaren Ergebnisse zu erhalten. noIn Table 2 it can be clearly seen that the batches have different concentrations of both Penicilli spores as well as copper ions, each at different times of cell development and Acid production were added to get comparable results. no

Der in der Tabelle 2 aufgeführte erste Gärungsansatz wurde als Standard-Gärungsversuch zum Vergleich durchgeführt und ergab mit der Standard-Nährlösung, die keine Penicilliensporen und kein zugefügtes Kupfer enthielt, 356 g Säure. Zu einer entsprechenden Menge der gleichen Nährlösung, die bereits eine Gärung von 2 -h Tagen durchlaufen hatte, wurden verschiedene Mengen von Penicilliensporen hinzugefügt, wie dies bei den Ansätzen 2, 3, 4 und 5 angegeben ist, worauf der Einfluß auf die Säureproduktion und die Alterungszeit festgestellt wurde. Man kann sehen, daß diese vier Versuche eine etwas längere Zeitspanne brauchten, um zu altern, als die in der Tabelle 1 angeführten Versuche, da hier die Ansätze nicht während der Anfangszeit von 2 ²/a Tagen der Gärung verunreinigtThe first fermentation batch listed in Table 2 was carried out as a standard fermentation test for comparison and resulted in 356 g of acid with the standard nutrient solution which contained no penicilli spores and no added copper. To a corresponding amount of the same nutrient solution, which had already undergone fermentation for 2 hours , different amounts of penicilli spores were added, as indicated in batches 2, 3, 4 and 5, whereupon the influence on the acid production and the Aging time was determined. It can be seen that these four experiments took a somewhat longer period of time to age than the experiments listed in Table 1, since here the batches are not ^{contaminated during the initial period of 2 2} / a days of fermentation

wurden. Unter sonst gleichen Bedingungen wurden Kupfermengen, die zwischen 5 und 75 Teilen je Million schwankten, gleichzeitig mit der künstlichen Verunreinigung der Nährlösung durch Penicilliensporen hinzugefügt. Hierbei wurde die Säureproduktion in den Versuchen 6 bis 9 stark vergrößert, und es wurde keine Verunreinigung der Nährlösung deutlich sichtbar. Die gleiche verbesserte Säureproduktion und das Fehlen einer sichtbaren Verunreinigung in der Endlösung wurde in den Versuchen 10 bis 14 beobachtet, bei denen die künstliche Verunreinigung zu Beginn der Gärung erfolgt war und die Kupferzugabe nach 2²/s bzw. 3 ²Ia Tagen erfolgte.became. All other things being equal, amounts of copper, which fluctuated between 5 and 75 parts per million, were added at the same time as the artificial contamination of the nutrient solution by penicilli spores. The acid production was greatly increased in experiments 6 to 9, and no contamination of the nutrient solution was clearly visible. The same improved acid production and the absence of any visible contamination in the final solution was observed in tests 10 to 14, in which the artificial contamination occurred at the beginning of fermentation and the copper addition occurred after 2 ² / s and 3 ² Ia days, respectively.

Tabel

Ansatzapproach Zugabe
der PenicilliensporenEncore
of the penicillic spores GärungstagFermentation day Cu++-ZugabeCu ++ addition GärungstagFermentation day SäurebildungAcid formation Veränderungen
der Kulturlösung*)Changes
of the culture solution *) GärungstagFermentation day JNr.JNr. Anzahl/LiterNumber / liter —- Teile
je MillionParts
per million —- inging Ver
unreinigungVer
impurity 1212th II. 00 2²/s2 ² / s OO —- 356356 —- 4V24V2 22 IO³ IO ³ 2²/s2 ² / s OO —- 169169 ++ 6V26V2 33 IO⁴ IO ⁴ 2²/₃ 2 ^_2/3 OO —- 256256 ++ 77th 44th IO³ IO ³ 2;²/₃ 2; ^_2/3 OO —- 254254 ++ 88th 55 IOIO 2⁵Vs2 ⁵ Vs OO 2²/s2 ² / s 293293 ++ 1212th 66th 10*10 * 2²/32 ^2/3 55 2^a/s2 ^a / s 39¹ 39 ¹ —- 1212th 77th IO⁴ IO ⁴ 2²/32 ^2/3 2525th 2²/s2 ² / s 363363 —- 1212th 88th IO⁴ IO ⁴ 2²/s2 ² / s 5050 2²/s2 ² / s 362362 —- 1212th 99 IO⁴ IO ⁴ OO 7575 2²/s2 ² / s 353353 —- 1212th IOIO IO³ IO ³ OO 5050 22/322/3 3SO3SO —- 1212th IIII IO³ IO ³ OO 7575 2²/s2 ² / s 347347 —- 1212th 1212th IO⁴ IO ⁴ OO 7575 3²/s3 ² / s 338338 —- 1212th 1313th IO⁴ IO ⁴ OO 5050 3V33V3 319319 —- 1212th 1414th IO*IO * 7575 345345 —-

+ = ein für die Änderung der Säurebildung ausreichendes Wachstum an Penicillien. — = kein Penicillienwachstum.+ = a growth of penicillia that is sufficient for the change in acid formation. - = no growth of penicillia.

Den Tabellen ist zu entnehmen, daß Gärungsprozesse, bei denen Kupferionen zugesetzt wurden, niemals zu einer so starken Penicillienentwicklung führten, daß die Säureproduktion beeinträchtigt wurde. Ließ man jedoch die Penicillienentwicklung weiterlaufen, ohne sie durch Kupferionen zu hemmen, so führte dies zum Schluß zu einem vollständigen Aufhören der Säureproduktion.The tables show that fermentation processes in which copper ions were added never led to such a strong development of penicilli that acid production was impaired became. If, however, the development of penicillia was allowed to continue without inhibiting it by copper ions, so this ultimately led to a complete cessation of acid production.

Da sich gezeigt hatte, daß Kupfer in Ionenform mit Erfolg Verluste auf Grund einer Penicillienverunreinigung vermeiden hilft, wurden nun Kupferionen zu zwei fertig vergorenen Ansätzen hinzugefügt, die durch Penicillien verunreinigt waren und dadurch ihre säureproduzierende Fähigkeit völlig verloren hatten.Since it was shown that copper in ionic form was successful in losing losses due to penicillin contamination helps avoid, copper ions have now been added to two ready-fermented batches that have been contaminated by penicillia and thereby had completely lost their ability to produce acid.

TabelleTabel 33 Ansatz
Nr.approach
No. Säureprozent
beim Aufhören
der GärungAcid percentage
when stopping
the fermentation Endwert des Säuregehaltes
in Prozent nach Zugabe
von 25 Teilen Cu+ +
je Million Teile
KulturlösungFinal value of the acidity
in percent after addition
of 25 parts Cu ++
per million parts
Culture solution 9
79
7th 8,4
8,28.4
8.2 9,88
10,099.88
10.09

Aus dem Vergleich der endgültigen Säuremenge, wie sie nach der Zugabe des ionischen Kupfers erhalten wurde, mit der prozentualen Säuremenge in der verunreinigten Nährlösung, die nicht mehr in der Lage war, weiter zu gären, kann man entnehmen, daß beide Gärmedien wieder in einen Zustand der Säureproduktion zurückgeführt wurden. Da die normale Säurekonzentration in einer völlig vergorenen Nährlösung ungefähr 10% beträgt, kann jetzt die vollständige Verwertung gehemmter Kulturmedien gemäß dem Verfahren nach der Erfindung erreicht werden.From the comparison of the final amount of acid obtained after adding the ionic copper with the percentage of acid in the contaminated nutrient solution that is no longer in was able to continue fermenting, it can be seen that both fermentation media are back in one state were returned to acid production. Because the normal acid concentration in a completely fermented Nutrient solution is approximately 10%, the inhibited culture media can now be fully utilized can be achieved according to the method of the invention.

Claims

PATENT CLAIM:

Process for the production of citric acid by submerged cultivation of Aspergillus niger in a carbohydrate-containing nutrient medium with the addition of copper ions, this nutrient medium containing penicillia as contaminating organisms, characterized in that copper ions are added to the nutrient medium after practically complete development of the Aspergillus niger mycelium from 5 to 75 mg / 1 added.

Documents considered: Industrial and Engineering Chemistry 40 ', P. 1203, panel 1;

I. agr. Res. 64 (1942), p. 615.