DE945470C

DE945470C - Production of streptogramin

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Publication number: DE945470C
Application number: DEM26609A
Authority: DE
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1954-05-12
Filing date: 1955-03-29
Publication date: 1956-07-12
Also published as: CH331992A; FR1179212A; GB776035A

Description

Herstellung von Streptogramin Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibioticum, das als »Streptogramin#c bezeichnet werden soll, sowie auf dessen Herstellung.Preparation of streptogramin The invention relates to a new one Antibiotic to be referred to as »streptogramin # c, as well as on its Manufacturing.

Bakterielles Spektrum Es wurde festgestellt, daß die neue antibiotische Substanz gegenüber einer großen Anzahl verschiedener Bakterientypen wirksam ist. Unter den Bakterien, deren Wachstum in Gegenwart des neuen Antibioticums aufhört, wären zu erwähnen der Haemophilus pertussis, Baeillus subtilis, Streptococcus pyogenes und insbesondere der Staphylococcus aureus, der gegenüber Penicillin und sonstigen verfügbaren Drogen resistent geworden ist. Dieser letztgenannte Mikroorganismus hat in letzter Zeit beim Menschen eine große Anzahl ernster und oft tödlicher Infektionen verursacht. Es ist bemerkenswert, daß ein Stamm von Staphylococcus aureus, der durch laufende Übertragung gegenüber mehr als dem Hundertfachen der ursprünglichen hemmenden Dosis von Penicillin resistent gemacht worden war, dennoch gegenüber dem neuen Antibioticum Streptogramin volle Empfindlichkeit zeigt.Bacterial spectrum It was found that the new antibiotic Substance is effective against a large number of different types of bacteria. Among the bacteria that stop growing in the presence of the new antibiotic, the Haemophilus pertussis, Baeillus subtilis, and Streptococcus pyogenes should be mentioned and in particular the Staphylococcus aureus, the opposite of penicillin and others available drugs has become resistant. This latter microorganism has recently had a large number of serious and often fatal infections in humans caused. It is noteworthy that a strain of Staphylococcus aureus passed through ongoing transmission versus more than a hundred times the original inhibitory Penicillin dose had been made resistant to the new antibiotic nonetheless Streptogramin shows full sensitivity.

Eine ausführliche Liste der Mikroorganismen, die auf das neue Antibioticum ansprechen, findet sich in der nachstehenden Tabelle I. Tabelle I Bakteriostatische Wirkung in vitro in Mikrogranim je cm# Kultunnedium Staph. aureus ............. o,o3 bis o,o8 Strep. pyogenes ........... o,o2 bis 0,03 Strep. agalactiae .......... 0,04 Strep. faecalis ............ 0,94 bis 1,12 D. Pneumoniae ........... o,16 bis 0,31 C. diphtheriae ............ 0,005 bis o,o2 S. typhosa ............... 1,25 bis über io S. paratyphi ............. mehr als io S. SchottmueHeri .......... mehr als io Shig. sonnei .............. 7,5 bis io E. coli .................... 30 P. multocida ............. iß bis 3,8 K. pneumoniae ........... mehr als io Ps. aeruginosa ............ mehr als 30 Br. abortus ............... 15 H. pertussis .............. o,o6 P. vulgaris ............... mehr als 30. Physikalische und chemische Eigenschaften Die neue Substanz ist eine neutrale Verbindung. Gereinigte Konzentrate des Antibioticums sind in Wasser schwer löslich (ungefähr o,i mg je cm3). Die Substanz ist leicht in Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylacetat löslich, in Ligrgin unlöslich. Versuche, ein Präparat des Streptogramins in KristaUforin zu erhalten, sind bisher fehlgeschlagen. Verschiedene mit dem Antibioticum gesättigte Lösungsmittel setzten beirn Abkühlen winzige feste Kügelchen ab. Hier und da ballten sich derartige Kügelchen, zusammen, um Pseudo-Kristalle (Nadeln) zu bilden, welche indessen zwischen den gekreuzten Nikols kein Erlöschen des polaxisierten Lichtstrahls zeigten. Das stärkste Präparat, welches erhalten werden konnte, enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Schwefel (-letzterer als Spuren einer Verunreinigung). Die chemische Analyse dieses Präparats ergab im Mittel 62,25 0/0 Kohlenstoff, 6,62 0/,Wasserstoff , 8,42 % Stickstoff und Spuren von Schwefel. Hieraus errechnet sich eine Bruttoformel etwa gleich C.,11..N.07.A detailed list of the microorganisms that respond to the new antibiotic can be found in Table I. Table I. Bacteriostatic effect in vitro in microgranim per cm # culture medium Staph. aureus ............. o, o3 to o, o8 Strep. pyogenes ........... o, o2 to 0.03 Strep. agalactiae .......... 0.04 Strep. faecalis ............ 0.94 to 1.12 D. Pneumoniae ........... o, 16 to 0.31 C. diphtheriae ............ 0.005 to 0.02 S. typhosa ............... 1.25 to over io S. paratyphi ............. more than io S. SchottmueHeri .......... more than io Shig. sunny .............. 7.5 to io E. coli .................... 30 P. multocida ............. eat up to 3.8 K. pneumoniae ........... more than io Ps. Aeruginosa ............ more than 30 Br. Abortus ............... 15 H. pertussis .............. o, o6 P. vulgaris ............... more than 30. Physical and chemical properties The new substance is a neutral compound. Purified concentrates of the antibiotic are sparingly soluble in water (approx . 0.1 mg per cm3). The substance is easily soluble in methanol, ethanol, acetone and ethyl acetate, and insoluble in ligrgin. Attempts to obtain a preparation of the streptogramin in KristaUforin have so far failed. Various solvents saturated with the antibiotic deposited tiny solid globules when they cooled. Here and there such spheres clumped together to form pseudo-crystals (needles) which, however, showed no extinction of the polaxized light beam between the crossed Nikols. The strongest preparation that could be obtained contains the elements carbon, hydrogen, oxygen and sulfur (- the latter as traces of an impurity). The chemical analysis of this preparation showed an average of 62.25% carbon, 6.62 % hydrogen , 8.42% nitrogen and traces of sulfur. From this a gross formula is calculated roughly equal to C., 11..N.07.

Das Streptogramin besitzt ein deutliches Infrarot-Absorptionsspektrum, wie aus der Zeichnung hervorgeht. Es wurde erhalten -mit einem Perkin-Ehner selbsttätig registrierenden Infrarot-Spektrophotometer mit NaCI-Prisma. Das Spektrum wurde selbsttätig, von 2 bis zu 15 Y aufgezeichnet. Das Muster wurde mit Schweröl (Mineralöl) getränkt und ohne die Verwendung eines Distanzstückes gleichmäßig zwischen zwei Salzplatten ausgebreitet. Als Bezugsmuster wurde - Mineralöl allein verwendet. Die Spitzenwerte in den Musterspektren bei 3,4 bis 6,8 und 7,2 y sind teilweise auf das Mineralöl zurückzuführen. Es wurden die folgenden unterscheidbaren Banden festgestellt: 3,05, 3,43, 3,54, 5,8o, 6,o2, 6,17, 6,23, 6,316,46, 6x58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, -7,64, 7,72, 7,96, 8,og, -8,2o, 8M, 8,61, 8,94, 9,45, 9,65, 9,78, IOJ5, io,26, io,6o, io,8o, io,98, 11,29, 11,50, 11,78, 12,23, 12,68, 13,00, 13,23-? 13,40 und 14,35.The streptogramin has a clear infrared absorption spectrum, as can be seen from the drawing. It was obtained with a Perkin-Ehner automatically registering infrared spectrophotometer with NaCl prism. The spectrum was recorded automatically, from 2 to 15 Y. The sample was soaked in heavy oil (mineral oil) and spread evenly between two salt plates without the use of a spacer. - Mineral oil alone was used as a reference sample. The peak values in the sample spectra at 3.4 to 6.8 and 7.2 y are partly due to the mineral oil. The following distinguishable bands were found: 3.05, 3.43, 3.54, 5.8o, 6, 02, 6.17, 6.23, 6.31 6.46, 6x58, 6.94, 7 , 03, 7.32, 7.46, -7.64, 7.72, 7.96, 8, og, -8.2o, 8M, 8.61, 8.94, 9.45, 9.65 , 9.78, IOJ5, io, 26, io, 6o, io, 8o, io, 98, 11.29, 11.50, 11.78, 12.23, 12.68, 13.00, 13.23 -? 13.40 and 14.35.

Bemerkenswert ist, daß das stärkste bisher erhaltene Präparat ein Absorptionsspektrum zeigt, %Deiches identisch ist mit demjenigen eines Konzentrats, welches um io 0/, in der Potenz differiert, woraus hervorgeht, daß die unwirksamen Verunreinigungen eine nahe verwandte Struktur besitzen. Damit bekommt man eine mögliche Erklärung für die Schwierigkeit, das Antibioticum. in Kristallforin zu erhalten. Ein anderer Grund, eine nahe strukturelle Verwandtschaft zwischen dem Antibioticum und der darin enthaltenen unwirksamen Verunreinigung zu vermuten, ist die Schwierigkeit,. die beiden Stoffe durch Verteilung eines Lösungsmittels im Gegenstrom voneinander zu trennen. Auch zeigt die Phasenregel-Löshchkeitsanalyse solcher Gemische die Gegenwart nur einer Komponenten, was also zeigt, daß die beiden Stoffe isomorph sind. Der Schmelzpunkt der Streptograniin-Präparate (ungefähr 155' C) ist innerhalb gewisser Grenzen unabhängig von der Potenz, -ebenso auch die spezifische Drehung (la] 2D5 # - (1340) - Eine negative Ninhydrin-Reaktion (a-Amii#ostickstoff) erhält man sowohl vor als auch nach der Hydrolyse. Die Gegenwart von Ringstickstoff wird'nachgewiesen durch einen positiven Farbtest mit Dimethylaminobenzaldehyd in Phosphorsäure.It is worth noting that the preparation strongest previously obtained shows an absorption spectrum,% dike is identical to that of a concentrate which, differs by io 0 / to the power, from which it follows that the inactive impurities possess a closely related structure. This gives a possible explanation for the difficulty, the antibiotic. available in crystal form. Another reason to suspect a close structural relationship between the antibiotic and the ineffective contaminant it contains is the difficulty. to separate the two substances from one another by distributing a solvent in countercurrent. The phase-rule solubility analysis of such mixtures also shows the presence of only one component, which shows that the two substances are isomorphic. The melting point of the streptograniin preparations (approx. 155 ° C) is independent of the potency within certain limits, -just as does the specific rotation (Ia) 2D5 # - (1340) - a negative ninhydrin reaction (a-Amii # nitrogen) both before and after the hydrolysis.The presence of ring nitrogen is demonstrated by a positive color test with dimethylaminobenzaldehyde in phosphoric acid.

Eine positive Farbreaktion, erhalten beim Kuppeln mit Diazosulfanüsäure, und ein positiver Farbtest mit Eisen-(III)-Chlorid zeigen die Gegenwart einer oder mehrerer Phenol-Gruppen an. Kennzeichen des Mik:roorganismus Der Organismus, welcher die erfindungsgemäße neue chemische Substanz erzeugt, w urde aus einem Bodenmuster des Staat es Texas isoliert. Dieser im Boden natürlich vorkommende Organismus und spontane Mutationen desselben gehören zu der allgemein als Treptomyces bezeichneien Art. Er ist typisch aerob, bei begrenztem Wachstum im untergetauchten Zustande. Es bildet sich ein echtes Mycel. Bei Verwendung von mit dem Organismus geimpften Natriumcaseinatagar trat nach einer angemessenen Inkubationszeit an der Oberfläche Wachstum und reichliche Sporenbildung auf. Die mikroskopische Untersuchung enthüllte verzweigte vegetative Mycelien von etwa. i Mikron Durchmesser. Es bildeten sich Lufthyphen bzw. ZeHfäden von r bis 1,3 Mikron Durchmesser, welche kugelförmige Konidien in Ketten, die in dicht aneinanderliegende Windungen ausliefen, trugen. Diese Konidien maßen etwa 1,2 Mikron im Durchmesser.A positive color reaction obtained when coupling with diazosulfanuic acid, and a positive color test with ferric chloride indicate the presence of an or several phenol groups. Characteristics of the microorganism The organism which the novel chemical substance of the present invention was generated from a soil pattern the state of it Texas isolated. This organism naturally occurring in the soil and spontaneous mutations thereof belong to what is commonly referred to as Treptomyces Art. Typically aerobic, with limited growth when submerged. A real mycelium forms. When using vaccinated with the organism Sodium caseinate agar appeared on the surface after a reasonable incubation period Growth and abundant sporulation. Microscopic examination revealed branched vegetative mycelia of about. i micron diameter. It formed Aerial hyphae or toe threads from r to 1.3 microns in diameter, which have spherical conidia in chains that ended in tight turns. These conidia measured about 1.2 microns in diameter.

'-Lakusmolke trug ein ausgezeichnetes Wachstum in der Form eines dunkelbraunen bis schwarzen Ringes an der Oberfläche des, Mediums. Es erfolgte Peptonisierung bei einer bestimmten alkalischen Reaktion (p]a = 6,4, wechselnd auf 8,2). Lacus whey carried excellent growth in the form of a dark brown to black ring on the surface of the medium. There was peptonization with a certain alkaline reaction (p] a = 6.4, changing to 8.2).

In. Nitratbouillon erfolgte ein mäßiges bis ausgezeichnetes Wachstum bei Oberflächenkolonien mit weißen Sporen und etwas weißem Niederschlag am Boden des Röhrchens. Das Nitrat wurde in 14 Tagen bei 37' C langsam zu Nitrit reduziert. In Tryptonbouillon erfolgte mäßiges Wachstum in der Form eines weißen bis grauen Teilhäutchens. Es bildete sich ein gelbes lösliches Pigment. Der Indol-Test war negativ.In . Nitrate broth showed moderate to excellent growth on surface colonies with white spores and some white precipitate at the bottom of the tube. The nitrate was slowly reduced to nitrite in 14 days at 37 ° C. In tryptone broth there was moderate growth in the form of a white to gray partial membrane. A yellow soluble pigment formed. The indole test was negative.

In künstlicher Nährbouillon (Szapek) bildete sich ein vollständiges Häutchen winziger Kolonien, die reichlich mit weißen bis grauen Lufthyphen bedeckt waren. Die Flüssigkeit wurde rötlichbraun gefärbt.In an artificial nutrient broth (Szapek) a complete one formed Membranes of tiny colonies that are profusely covered with white to gray aerial hyphae was. The liquid became reddish brown in color.

Gelatineschnitzel wurden in 7 Tagen bei 37" C verflüssigt, obwohl das Wachstum in der Form einiger weniger brauner Oberflächenkolonien und spärlichen Bodensatzes gering war.Gelatin chips were liquefied in 7 days at 37 " C , although growth in the form of a few brown surface colonies and sparse sediments was little.

Das Wachstum auf Kartoffelpfröpfchen war ausgezeichnet. Die Oberfläche des Pfröpfchens bedeckte sich mit winzigen aufrecht stehenden Kolonien, die ihrerseits mit pulverförmigen, weißen Lufthyphen, die später grau wurden, überzogen waren. Die Kartoffelpfröpfchen wurden schwarz.The growth on potato droplets was excellent. The surface the plug covered itself with tiny upright colonies, which in turn were covered with powdery, white aerial hyphae, which later turned gray. The potatoes turned black.

Das Wachstum auf Stärke-Agar war reichlich in der Form leicht aufrecht stehender, lederfarbener bzw. lohfarbener Kolonien mit unregelmäßigen Kanten und rauher Oberfläche sowie mit Riefen von der Kante zur Mitte. Die Oberflächen waren mit grauen Lufthyphen mit weißem Rande bedeckt. Die Rückseite der Kolonie war braun bis zu schwarz. Die Stärke wurde hydrolysiert.The growth on starch agar was plentiful and slightly erect in shape standing, buff or tan colonies with irregular edges and rough surface and with grooves from the edge to the center. The surfaces were covered with gray aerial hyphae with a white border. The back of the colony was brown up to black. The starch has been hydrolyzed.

Das Wachstum auf Bennetts Agar war ausgezeichnet. Die Kolonien waren den auf Stärke-Agar gezüchteten ähnlich. Ein lösliches Pigment war nicht vorhanden.Growth on Bennett's agar was excellent. The colonies were similar to those grown on starch agar. Soluble pigment was not present.

Das Wachstum auf Nähragar (Fleischpepton) war mäßig. Die Kolonien waren den auf Stärke-Agar gezüchteten ähnlich.The growth on nutrient agar (meat peptone) was moderate. The colonies were similar to those grown on starch agar.

Das Wachstum auf Glukose-Pepton-Agar war mäßig und gab Anlaß zu lohfarbenen Kolonien mit unregelmäßigen Kanten, die sich in den Agar hineingruben; sie waren mit weißen Lufthyphen bedeckt. Die Rückseite der Kolonien war braun bis zu schwarz. Es wurde ein gewisses Aufspalten der bei 37' gewachsenen Kolonien beobachtet. Ein lösliches Pigment war nicht vorhanden.The growth on glucose-peptone agar was moderate, giving rise to tan colonies with irregular edges that dug into the agar; they were covered with white aerial hyphae. The back of the colonies was brown to black. Some splitting of the colonies grown at 37 'was observed. Soluble pigment was not present.

Das Wachstum in Glukose-Asparagin-Agar war gering unter Auftreten spinnwebenähnlicher isabellfarbener Kolonien mit unregelmäßigen Kanten und spärlichen weißen Lufthyphen bei 30'C. The growth in glucose-asparagine agar was low with the appearance of cobweb-like isabel-colored colonies with irregular edges and sparse white aerial hyphae at 30 ° C.

Bei künstlichem Agar (Szapek) erhielt man ein mäßiges Wachstum isabellfarbener spinnwebenähnlicher Kolonien, ähnlich denjenigen auf Glukose-Asparagin. Es konnte weder eine Bildung von Sporen noch eine solche von löslichem Pigment beobachtet werden.In the case of artificial agar (Szapek), moderate growth of isabel-colored was obtained cobweb-like colonies, similar to those on glucose-asparagine. It could neither the formation of spores nor that of soluble pigment was observed will.

Natriumeaseinat-Agar trug ein ausgezeichnetes Wachstum mit geruchlosen Kolonien von unregelmäßigen Kanten bzw. Rändern, die sich bei 30' mit grauen Luftmycelien bedeckten. Bei 37' bildeten sich gefiederte Kolonien mit flacher Oberfläche, mit Sporen in der Mitte und sporenlosem Rande. Die Rückseite der Kolonie zeigte ein braunes Zentrum mit farblosem Rande. Ein lösliches Pigment wurde nicht gebildet.Sodium aseinate agar had excellent growth with odorless colonies of irregular edges which were covered with gray aerial mycelia at 30 '. At 37 ' , pinnate colonies formed with a flat surface, with spores in the middle and a sporeless edge. The back of the colony showed a brown center with a colorless border. Soluble pigment was not formed.

Auf Tyrosin-Agar war das Wachstum gering in der Form winziger, hütchenförrniger, brauner Kolonien mit nicht wahrzunehmenden Lufthyphen. Die Rückseite der Kolonien war hellbraun. Ein lösliches Pigment wurde nicht gebildet.Growth on tyrosine agar was small in the form of tiny, cone-shaped, brown colonies with imperceptible aerial hyphae. The back of the colonies was light brown. Soluble pigment was not formed.

Das Wachstum auf Calciummalat-Agar war mäßig unter Bildung gefiederter Kolonien unter der Oberfläche mit einem hütchenförmigen Mittelpunkt über dem Agar, bedeckt mit gelblichweißen Lufthyphen. Ein lösliches Pigment wurde nicht gebildet. Im allgemeinen waren Wachstum und Sporenbildung bei 37' besser als bei 3o', aber einige wenige Grade mehr oder weniger ergaben auch noch zufriedenstellende Resultate.The growth on calcium malate agar was moderate with formation of pinnate colonies below the surface with a cone-shaped center over the agar covered with yellowish white aerial hyphae. Soluble pigment was not formed. In general 37 ' growth and sporulation were better than 3o', but a few degrees more or less gave satisfactory results.

Von obigen Kennzeichen darf man annehmen, daß sie den Organismus und seine Formen von irgendwelchen Arten wie sie in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 6. Auflage, S. 929 bis 967, beschrieben sind, unterscheiden.The above characteristics can be assumed to distinguish the organism and its forms from any species as described in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6th edition, pp. 929 to 967 .

Demzufolge wurde der Name Streptomyces graminofaciens gewählt, um dem neuen, vorstehend beschriebenen Organismus zu bezeichnen. Wachstum bzw. Züchtung des Mikroorganismus Das Antibiotir-um wird erzeugt durch die üblichen Fermentierungsverfahren einschließlich Rühren und Belüftung zwecks Durchführung einer aeroben Kultur. Es kann dazu eines der üblichen Fermentierungsmedien verwendet werden; dieses muß die üblichen Bestandteile-, wie z. B. ein Kohlehydrät, eine Quelle für Stickstoff, Mineralsalze, wie z. B. Phosphate, sowie Spurenelemente einschließen. Beispielsweise wird Streptogramin in dem folgenden Kulturmedium erzeugt: Gerelose (geringe Verunreinigungen enthaltende Glukose, erzeugt von der Fa. Corn Products, USA.): oß l)/,; N-Z-Amin B (Trypton) (enzymatischer Auszug von Kasein, erzeugt von der Fa. Bordon Co., USA.): o,280/,; Sojapepton (Papainauszug von Sojabohnenmehl, erzeugt von der Fa. Sheffield Co. USA.): 0,05 %; Basaminbact (llefeextrakt, erzeugt von der Brauerei Anheuser Busch Company, USA.): o, i Of,; Glutaminsäure: o,i0/,; NaC1: 0,0831)/,; K2HP04: 0,2404; KH2P04: 0,20/0; MnCI,: o,oooz0/,. Die Cerelose kann durch andere Kohlehydrate, wie z. B. Dextrin oder Stärke, ersetzt werden.Accordingly, the name Streptomyces graminofaciens was chosen to designate the new organism described above. Growth or cultivation of the microorganism The antibiotic is produced by the usual fermentation processes including stirring and aeration for the purpose of carrying out an aerobic culture. One of the usual fermentation media can be used for this purpose; this must include the usual components, such as. B. a carbohydrate, a source of nitrogen, mineral salts, such as. B. Include phosphates, as well as trace elements. For example, streptogramin is produced in the following culture medium: Gerelose (glucose containing low levels of impurities, produced by Corn Products, USA.): Oß l) / ,; NZ-Amin B (tryptone) (enzymatic extract of casein, produced by Bordon Co., USA.): O, 280 / ,; Soy peptone (papain extract of soybean meal, manufactured by Sheffield Co. USA.): 0.05%; Basaminbact (oil extract, produced by the Anheuser Busch Company Brewery, USA.): O, i Of ,; Glutamic acid: o, i0 / ,; NaCl: 0.0831) / ,; K2HP04: 0.2404; KH2P04: 0.20 / 0; MnCI ,: o, oooz0 / ,. The cerelose can be replaced by other carbohydrates, such as B. dextrin or starch, can be replaced.

Zu Beginn des Fermentierungswachstums des S. graminofaciens soll das Kulturmedium auf einen pn-Wert von 6,7 bis 7 eingestellt werden.At the beginning of the fermentation growth of S. graminofaciens, the culture medium should be adjusted to a pn value of 6.7 to 7 .

Die Erzeugung sowie die Gewinnung von Streptogramin gehen weiterhin aus den nachfolgenden Beispielen typischer Verfahren hervor. Beispiel i Es wird ein sieriles Kulturmedium der folgenden Gewichtszusammensetzung hergestellt: Cerelose (geringe Verunreinigungen enthaltende Glukose, erzeugt von der Fa. Com Products, USA.) .................... o,80/0 N-Z-Amin B (Trypton) (enzymatischer Auszug von Kasein, erzeugt von der Fa. Bordon Co., USA.) .............. 0,280/0 K2 I-1 P 04 ............................ 0,24% KH2P04 ............................ 0,20/0 Basaminbact (HefeeXtrakt, erzeugt von der Brauerei Anheuser Busch ComPany, USA.) ............................. 0,204 Mononatriumglutamat ................. 0,1% NaC1 ................................ O,d83 04 Sojapepton (Papainauszug von Sojabohnenmehl, erzeugt von der Fa. Sheffield Co., USA.) ............................. o,o5"/, MnC12 ................................. 0,00020/0 p_H # 6,7 bis 6,8 Eine Öse voll sterilen Bodens, der vorher mit S. graminofaciens geimpft worden war, wird einem das Kulturmedium enthaltenden Kolben von 25o cm3 hinzugesetzt. Unter Schütteln des Kolbens läßt man das Wachstum 4 Tage lang bei 25' C vor sich gehen. Aus dem Kolben werden io cm3 entnommen und einem 2-1-Kolben des Mediums hinzugesetzt. Das Schütteln wird 3 Tage lang bei 25' C fortgesetzt.The production and recovery of streptogramin are also evident from the following examples of typical processes. Example i A sterile culture medium with the following weight composition is prepared: Cerelose (glucose containing low levels of impurities, produced by Com Products, USA.) .................... o, 80/0 NZ-Amin B (tryptone) (enzymatic extract of casein, produced by Bordon Co., USA.) .............. 0.280 / 0 K2 I- 1 P 04 ............................ 0.24% KH2P04 .............. .............. 0.20 / 0 Basaminbact (yeast extract, produced by the Anheuser Busch Company, USA.) ................ ............. 0.204 monosodium glutamate ................. 0.1% NaC1 ............. ................... O, d83 04 Soy peptone (papain extract from soybean meal, produced by Sheffield Co., USA.) ......... .................... o, o5 "/, MnC12 ....................... .......... 0.00020 / 0 p_H # 6.7 to 6.8 A loop of sterile soil previously inoculated with S. graminofaciens is added to a 250 cm3 flask containing the culture medium . While shaking de The flask is allowed to grow for 4 days at 25 ° C. 10 cm3 are removed from the flask and added to a 2-1 flask of the medium. Shaking is continued at 25 ° C for 3 days.

Das Wachstum wird dann unter Rühren in einer Flasche, die iz 1 des auf einen pR-Wert von 6,7 eingestellten Kulturmediums enthält, ausgeführt. Merzu fügt man 36o cm3 des Inokulats aus dem 2-1-Kolben. Ferner wird ein Schaumverhütungsmittel hinzugesetzt. Das Rühren geschieht durch ein Rührwerk bei 1750 Umdr./Min. Zur Belüftung wird % Volumen sterfler Luft je Minute eingeführt. Die Temperatur wurde auf 25'C gehalten, und der Betrieb wurde 24 Stunden lang fortgesetzt.The growth is then carried out with stirring in a bottle containing iz 1 of the culture medium adjusted to a pR value of 6.7. Then add 36o cm3 of the inoculate from the 2-1 flask. An anti-foaming agent is also added. The stirring is done by a stirrer at 1750 rev / min. For ventilation, % volume of sterile air is introduced per minute. The temperature was maintained at 25 ° C and operation continued for 24 hours.

:12 1 dieses Fermentierungsproduktes setzte man 6oo 1 des Kulturmediums mit einem p11-Wert von 6,7 und ein Schaumverhinderungsmittel hinzu'. Das Rühren erfolgte durch- ein Rührwerk mit i2o Umdr./. Min. Die Belüftung erfolgte durch Einführend 'von etwa "/, Volumen steriler Luft je Minute. Die Temperatur wurde auf 25' C gehalten, und der Betrieb wurde 48 Stunden lang fortgesetzt.: 12 1 of this Fermentierungsproduktes continued to 6oo 1 of the culture medium with a p11 value of 6.7 and an anti-foaming agent added '. The stirring was carried out by a stirrer with 10 revolutions /. Aeration was carried out by introducing about "/, volume of sterile air per minute. The temperature was maintained at 25 ° C and operation continued for 48 hours.

Das Wachstum wurde dann in größeren Behältern fortgesetzt, indem man 48 1 des Fermentierungsproduktes zu 24oo 1 des Kulturmediums hinzusetzte. Die Wachstumsbedingungen wurden wie bei der 6oo 1-Charge aufrechterhalten. Nach 24 Stunden hatte das Fermentierungsmedium gi,2 Einheiten je cm3, nach 48 Stunden einen Gehalt von 177 Einheiten.je CM3. Das sind also 17,7 jug je cm3, auf die Potenz des reinsten Präparats von Streptogramin, das isoliert werden konnte, bezogen. Isolierung des Streptogramins Beispiel 2 Das Mycel wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtra.t mit % Volumen Äthylacetat in einem Gegenstrom-Extraktionsgefäß extrahiert. - Das das Antibioticum enthaltende Lösungsmittel wurde zuerst mit li, Volumen einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 9, dann mit einer Acetatpufferlösung - % Volumen - mit einem pn-Wert von 3,5 und schließlich mit li, Volumen Wasser gewaschen. Diese Waschungen, wenn sie auch nicht wesentlich sind, beseitigen doch die Verunreinigungen, welche sonst das Endprodukt verschlechtern würden. Das gewaschene Lösungsmittel wurde durch Destillation im Vakuum auf ein Volumen von etwa 41 herabgesetzt und dann mit dem dreifachen Volumen Ligroin behandelt, wobei-der wirksame Stoff ausgefällt wurde, der nach Filtrieren und Trocknen im Vakuum eine Reinheit von etwa 50 % besaß und 200 g wog. Growth was then continued in larger containers by 48 one should put the Fermentierungsproduktes to 24oo 1 of the culture medium. The growth conditions were maintained as for the 600 1 batch. After 24 hours the fermentation medium had gi, 2 units per cm3, after 48 hours a content of 177 units per CM3. That is 17.7 jug per cm3, based on the potency of the purest preparation of streptogramin that could be isolated. Isolation of the Streptogramin Example 2 The mycelium was removed by filtration and the Filtra.t extracted with % volume of ethyl acetate in a countercurrent extraction vessel. - The solvent containing the antibiotic was washed first with one liter volume of a phosphate buffer solution with a pH value of 9, then with an acetate buffer solution -% volume - with a pn value of 3.5 and finally with one liter volume of water. These washes, while not essential, remove the impurities which would otherwise degrade the end product. The washed solvent was reduced to a volume of about 41 % by distillation in vacuo and then treated with three times the volume of ligroin, the active substance being precipitated, which, after filtering and drying in vacuo, had a purity of about 50% and weighed 200 g .

Zur weiteren Reinigung wurde eine io0/#ge Lösung in Methanol des oben beschriebenen Rohprodukts mit dem neunfachen Volumen einer i0/jgen Phosphatpufferlösung mit einem pu-Wert von 7 behandelt. Die Lösung wurde bei 5' C 18 bis 24 Stunden lang aufbewahrt und dann filtriert. Das Antibioticum verblieb im Filtrat und wurde auf - diese Weise von einer erheblichen Menge der gefärbten unwirksamen Ver-1111 einigungen abgetrennt. Das Filtrat wurde durch Destillation fin Vakuum auf ein. Volumen von ein Zehntel des vorherigen eingedampft. In diesem Stadium schied sich das Antibioticum aus der Lösung in reiner Form aus, wurde durch Filtrieren aufgesammelt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man go g reinen Streptogramins erhielt. Physiologische Eigenschaften Streptogramin zeigt bei Mäusen eine intraperitoneale Giftigkeit von etwa 45o mg/kg (LD"). Mäuse, die intraperitoneal mit xooo letaler Mindestdosen pathogener Organismen infiziert worden waren, wurden geschützt durch die Verabfolgung eines geringen Bruchteils der giftigen Dosis von Streptogramin. Das Streptogramin wurde im Verlauf von 4 Tagen verabfolgt, und zwar auf verschiedenen Wegen, wobei die Mindestmenge in Mikrogranun je Dosis bestimmt wurde, die 50% Überlebende ergab. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Tabelle II PD,0-Dosis Infektiöser Verabfolgung in Mikroorganismus Mikrogramm/ Dosis Staph. aureus intraperitoneal 1,9 desgl. intramuskulär 3525,0 desgl. peroral 1509,0 --des91- intravenös 492,0 desgl. subkutan 543,0 Strep. pyogenes intraperitoneal 1,2 desgl. intramuskulär iii,0 desgl. peroral 664,0 desgl. intravenös 142,0 Es ist bezeichnend, daß eine einzige Dosis Streptogramin ungefähr ebenso wirksam ist wie sieben Dosen der gleichen Größe und daß die Dosis bzw. -die Droge sowohl bei intraperitonealer als auch bei intravenöser, intramuskulärer oder peroraler Verabfolgung wirksam wird. Bei Versuchen mit Hautwunden an Kaninchen, die mit dem Staphylococcus aureus infiziert worden waren, ergab die Behandlung mit Streptogramin eine Verkürzung der Heilungsdauer im Vergleich zu ähnlichen unbehandelten Kontrolltieren. Die Verabfolgung gereinigten Streptogramins auf allen möglichen Wegen (intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, und peronal) wurde in allen Fällen gut vertragen; es zeigten sich weder Nekrosen noch Verfärbung noch sonstige Schäden.For further purification, a 10% solution in methanol of the crude product described above was treated with nine times the volume of a 10% phosphate buffer solution with a pu value of 7. The solution was stored for 18 to 24 hours at 5 'C and then filtered. The antibiotic remaining in the filtrate and was on - separated this way from a significant amount of colored ineffective Ver-1111 'associations. The filtrate was reduced to a vacuum by distillation. Evaporated volume of a tenth of the previous one. At this stage the antibiotic separated out of the solution in pure form, was collected by filtration, washed with water and dried in vacuo to give g of pure streptogramins. Physiological properties Streptogramin shows an intraperitoneal toxicity of about 450 mg / kg (LD ") in mice. Mice infected intraperitoneally with xooo lethal minimum doses of pathogenic organisms were protected by the administration of a small fraction of the toxic dose of streptogramin. The streptogramin was administered over 4 days by various routes, determining the minimum amount in microgranuns per dose that yielded 50% survivors, and the results are shown in the table below. Table II PD, 0 dose Infectious administration in Microorganism micrograms / dose Staph. aureus intraperitoneally 1.9 likewise intramuscular 3525.0 the same perorally 1509.0 --des91- intravenous 492.0 also subcutaneous 543.0 Strep. pyogenes intraperitoneally 1,2 also intramuscular iii, 0 the same perorally 664.0 same intravenous 142.0 It is significant that a single dose streptogramin is about as effective as seven cans of the same size and that the dose or - the drug is effective in both intraperitoneal as well as intravenous, intramuscular or peroral administration. In experiments with skin wounds on rabbits infected with Staphylococcus aureus, treatment with streptogramin resulted in a reduction in the healing time compared to similar untreated control animals. Administration of purified streptogramins by all possible routes (intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, and peronally) was well tolerated in all cases; there was no necrosis, discoloration or other damage.

Das kräftigste bisher isolierte Präparat zeigte einen Schmelzpunkt von etwa 155' sowie eine spezifische Drehung von [a]"' D 134'.The strongest preparation so far isolated showed a melting point of about 155 'as well as a specific rotation of [a] "' D 134 '.

Claims

PATENT CLAIM: The use of Streptomyces graminofaciens for the production and extraction of the antibiotic streptogramin by submerged cultivation in conventional nutrient liquids and extraction of the culture medium with ethyl acetate and precipitation with ligroin.