Herstellung des antibiotischen Wirkstoffes Actinochrysin Es wurde
gefunden, daß ein neuer antibiotisch wirksamer Stoff dadurch hergestellt werden
kann, daß man Vertreter einer Gruppe von Actinomyceten, welche einen Farbstoff bilden,
der die Nährlösung in der natürlichen Konzentration gelb färbt und der als ziegelrotes
Produkt vom Schmelzpunkt 254° isoliert werden kann, auf geeignetenNährlösungen wachsenläßt.Production of the antibiotic active ingredient actinochrysin It was
found that a new antibiotic substance can be produced thereby
can that one representative of a group of actinomycetes, which form a dye,
that colors the nutrient solution yellow in its natural concentration and that as brick-red
Product with a melting point of 254 ° can be isolated, growing on suitable nutrient solutions.
Der aus den Nährlösungen isolierte Farbstoff zeigt starke antibiotische
Wirksamkeit und stellt ein wirksames Chemotherapeuticum gegen eine Reihe von Mikroorganismen,
z. B. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis und Bacterium coli, dar. Außerdem
hat er sich überraschenderweise als tumorhemmend erwiesen. Diese Hemmung tritt auch
bei den reinen Produkten in Erscheinung. Der antibiotisch wirksame Farbstoff ist
im folgenden als Actinochrysin bezeichnet.The dye isolated from the nutrient solutions shows strong antibiotic properties
Effectiveness and represents an effective chemotherapeutic agent against a number of microorganisms,
z. B. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Bacterium coli. In addition
it has surprisingly proven to be anti-tumor. This inhibition also occurs
in the pure products. The antibiotic dye is
hereinafter referred to as actinochrysin.
Es ist in den letzten Jahren eine Anzahl von Antibiotica aus Actinomycesstämmen
isoliert worden. Unter anderem haben Waksman und Mitarbeiter (USA.-Patentschrift
Nr. 2 378 449 Waksman und Tishler, J. Biol. Chem. 142, S. 519 [z942] und Science
98 r=943] SuPPI. S. 8 und io) bei der Züchtung des Actinomyces antibioticus aus
den Nährlösungen einen Stoff isoliert, den sie als Actinomycin bezeichneten und
der ebenfalls bacteriostatische Eigenschaften hat. Dieser bekannte, antibiotisch
wirksame Stoff hat mit Actinochrysin zahlreiche Berührungspunkte, das Actinochrysin
unterscheidet sich jedoch von ihm in charakteristischer Weise. Insbesondere unterscheidet
es sich hinsichtlich des Stickstoffgehaltes (i2,27 °/o N beim Actinochrysin, 13,35
°/o N beim Actinomycin), seiner Löslichkeit in Aceton, in dem es erheblich löslicher
ist als Actinomycin, und durch die Tatsache, daß es im Gegensatz zum Actinomycin
kein Diacetylderivat bildet. Auch hat das Leukoacetylderivat des Actinochrysins
einen niedrigeren Stickstoffgehalt als
das Leukoacetylderivat des
Actinomycins. Besonders charakteristisch und zur leichten Unterscheidung der beiden
Antibiotica geeignet ist ihr verschiedenes Verhalten gegenüber Claisenlauge. Während
beim Actinomycin in alkoholischer Natronlauge eine Rotfärbung auftritt, die rasch
wieder verschwindet, ist die Rotfärbung beim Actinochrysin beständiger.A number of antibiotics from strains of Actinomyces have been used in recent years
been isolated. Among other things, Waksman et al. (USA. Patent
No. 2,378,449 Waksman and Tishler, J. Biol. Chem. 142, p. 519 [z942] and Science
98 r = 943] SuPPI. S. 8 and io) in the breeding of Actinomyces antibioticus
isolated a substance from the nutrient solutions that they called actinomycin and
which also has bacteriostatic properties. This well-known, antibiotic
Active substance has numerous points of contact with actinochrysin, actinochrysin
however, differs from him in characteristic ways. In particular, differs
it is with regard to the nitrogen content (12.27% N in actinochrysin, 13.35
° / o N in actinomycin), its solubility in acetone, in which it is considerably more soluble
is called actinomycin, and by the fact that it is in contrast to actinomycin
does not form a diacetyl derivative. Also has the leucoacetyl derivative of actinochrysin
a lower nitrogen content than
the leucoacetyl derivative des
Actinomycins. Particularly characteristic and for easy differentiation between the two
Their different behavior towards Claisenlauge is suitable for antibiotics. While
Actinomycin in alcoholic sodium hydroxide solution turns red, which quickly occurs
disappears again, the red color is more constant in actinochrysin.
Der das Actinochrysin erzeugende Stamm hat mit dem Streptomyces fulvissimus
(Jensen) gewisse Merkmale gemeinsam, unterscheidet sich von diesen jedoch grundlegend
durch die Bildung eines löslichen Pigmentes. Durch diese Pigmentbildung ist er Streptomyces
flaveolus ähnlich. Er unterscheidet sich von diesem jedoch hinsichtlich Farbe und
Bildung des Luftmycels, Farbe des Pigmentes, Wachstum auf Kartoffel und ganz besonders
dadurch, daß ihm die Fähigkeit fehlt, Nitrat zu reduzieren. Diese Unterschiede berechtigen,
den Stamm unter dem Speciesnamen Streptomyces (Actinomyces) chrysomallus neben Streptomyces
flaveolus zu stellen.The actinochrysin producing strain has Streptomyces fulvissimus
(Jensen) have certain features in common, but differ fundamentally from them
through the formation of a soluble pigment. This pigment formation makes it Streptomyces
similar to flaveolus. However, it differs from this in terms of color and
Formation of the aerial mycelium, color of the pigment, growth on potatoes and especially
in that it lacks the ability to reduce nitrate. These differences justify
the strain under the species name Streptomyces (Actinomyces) chrysomallus in addition to Streptomyces
flaveolus.
Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften sind stark verschieden
von denen des Streptomyces antibioticus, der ein ähnliches Antibioticum bildet wie
der Streptomyces (Actinomyces) chrysomallus.The morphological and physiological properties are very different
of those of Streptomyces antibioticus, which forms an antibiotic similar to that of
the Streptomyces (Actinomyces) chrysomallus.
Zur weiteren Charakterisierung des Actinochrysin bildenden Mikroorganismus
sei noch auf die folgenden Merkmale verwiesen: Hyphen verzweigt, reich an färbbaren
Körnchen. Konidien oval bis elliptisch; Glykollagar: Wachstum stark, Mycel goldgelb,
weich, locker, leicht abkratzbar, stark runzlig, Luftmycel weiß bis schwachgelblich,
fleckenweise gebildet; Probacit-Glukoseagar: Wachstum etwas geringer, kaum Luftmycelbildung;
Gelatine: wird verflüssigt; Stärke (Kartoffelstärke) : wird hydrolysiert; Wachstum
auf Kartoffel: goldgelb, schließlich bronzefarben, stark runzlig, mit cremefarbigen
Stellen (Luftmycel) ; Wachstum auf Karotten: cremefarbig bis schwachgoldgelb; Celluloseagar:
nur sehr gehemmtes Wachstum; Pepton-Bouillonagar: Wachstum schwach, Mycel weißlich
bis schwachgelblich; Nitratreduktion: keine; Sehwefelwasserstoffproduktion: keine.;
_ Lackmusmilch : geringes Wachstum unter Blaufärbung, keine Ausflockung des Caseins,
das Medium klärt sich etwas auf (Caseinabbau) ; Wachstum auf Kirschsaft: gut; Milchagar:
um die Kolonien klare Zonen (Caseinabbau).
C-Quellen Wachstum und Farbstoff
bei NaH03 als N-Quelle
Glycerin . . . . . . . . . . . . . . . . -+- -+- -+-
Glukose . . . . . . . . . . . . . . . . + -+-- -+-
Milchzucker . . . . . . . . . . . . . -[- -f- -+-
Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . + -+- -+-
Rohrzucker .............
Stärke ................. ,
N- Quellen !
bei Glycerin als C-Quelle I Wachstum Farbstoff
NaN0.................. -+- -+- + -+- + -+-
KN 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . -+- -f- -+- = -F-
Glykokoll . . . . . . . . . . . . . . -+-- + + -*- -+-- -+--
Harnstoff . . . . . . . . . . . . . . + + -+-
(NH4)2S04 . . . . . . . . . . . . . -+- -+-
Actinochrysin kristallisiert aus Essigester in alizarinroten hexagonalen Bipyramiden.
Es ist eine sehr schwache, zweisäurige Base mit einer wahrscheinlichen Summenformel
C4aH57 OiiN7 und einem errechneten Molekulargewicht von 811,5.For further characterization of the actinochrysin-producing microorganism, reference is made to the following characteristics: Hyphae branched, rich in colorable granules. Conidia oval to elliptical; Glycollagar: strong growth, mycelium golden yellow, soft, loose, easily scratchable, very wrinkled, aerial mycelium white to pale yellowish, formed in spots; Probacit glucose agar: growth somewhat less, hardly any aerial mycelia formation; Gelatin: is liquefied; Starch (potato starch): is hydrolyzed; Growth on potatoes: golden yellow, finally bronze colored, very wrinkled, with cream colored spots (aerial mycelium); Growth on carrots: cream-colored to pale golden yellow; Cellulose agar: only very inhibited growth; Peptone broth agar: growth weak, mycelium whitish to pale yellowish; Nitrate reduction: none; Hydrogen sulphide production: none .; _ Litmus milk: little growth with blue coloration, no flocculation of the casein, the medium clears up somewhat (casein degradation); Growth on cherry juice: good; Milk agar: clear zones around the colonies (casein degradation). C-sources growth and dye
with NaH03 as N source
Glycerin. . . . . . . . . . . . . . . . - + - - + - - + -
Glucose. . . . . . . . . . . . . . . . + - + - - + -
Lactose. . . . . . . . . . . . . - [- -f- - + -
Dextrin. . . . . . . . . . . . . . . . + - + - - + -
Cane sugar .............
Strength ................. ,
N-sources!
in the case of glycerine as C source I growth dye
NaN0 .................. - + - - + - + - + - + - + -
KN 03. . . . . . . . . . . . . . . . . - + - -f- - + - = -F-
Glycocolla. . . . . . . . . . . . . . - + - + + - * - - + - - + -
Urea. . . . . . . . . . . . . . + + - + -
(NH4) 2S04. . . . . . . . . . . . . - + - - + -
Actinochrysin crystallizes from ethyl acetate in alizarin red hexagonal bipyramids. It is a very weak, two-acid base with a likely molecular formula C4aH57 OiiN7 and a calculated molecular weight of 811.5.
Die Züchtung der Actinochrysin bildenden Actinomyceten kann in an
sich bekannter Weise im Oberflächenverfahren oder submers erfolgen. Das submerse
Verfahren gibt bessere Ausbeuten an Antibioticum, und die Zeiten bis zur optimalen
Konzentration des Actinochrysins in der Nährlösung werden erheblich abgekürzt. Infolgedessen
wird das submerse Verfahren bevorzugt. Die Isolierung des Actinochrysins aus der
Kulturflüssigkeit geschieht durch Extraktions- und bzw. oder Adsorptionsverfahren.
Als Extraktionsmittel eignen sich organische Lösungsmittel, insbesondere Butylacetat,
als Adsorptionsmittel kommt in erster Linie Aluminiumoxyd in Frage. Bei der Abtrennung
des Actinochrysins von seinen Verunreinigungen durch Adsorptionsverfahren wird das
Rohprodukt in einem organischen Lösungsmittel gelöst und chromatographisch mit Hilfe
von Aluminiumoxyd getrennt. Das Produkt läßt sich aus einem Gemisch aus gleichen
Teilen Essigester und Benzol umkristallisieren. Der Schmelzpunkt liegt dann bei
25q.°. Ausführungsbeispiel i. Stammkultur Der Stamm Actinomyces Bo 103 Streptomyces
(Actinomyces) chrysomallus wird auf einem Nährboden gezüchtet, der außer der unten
beschriebenen Nährlösung 16 30/, Agar enthält. a. Vorkultur Für die Vorkultur werden
3oo ccm Erlenmeyer mit j e 5o ccm Nährlösung 16 beschickt, sterilisiert und mit
Impfmaterial, das von der Stammkultur gewonnen wurde, beimpft. Die Kölbchen werden
etwa 5 Tage bei 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, wobei sich eine Submerskultur
des Mikroorganismus bildet und die Nährlösung eine rötlichgelbe Farbe annimmt. Das
Impfmaterial wird bakteriologisch auf seine Reinheit und Brauchbarkeit geprüft.
Gleichzeitig wird die antibiotische Wirksamkeit getestet. Hierbei werden gegenüber
Staphylococcus aureus Hemmungswerte von i : Zoo bis i : 6oo erreicht. 3. Hauptansatz
(Nährlösung 16) Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
500 kg Glycerin ....................... . .... io kg Kaliumnitrat...........
. . . . . . . . . . . . . . 5 kg Dikaliumphosphat .. . . . . . . . . . . . . . .
. . . o,5 kg
Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . i kg Magnesiumsulfat ..................... 259
Ferrosulfat ..........................
59
Calciumcarbonat gefällt . . . . . . . . . . . . . . . 59
Die Nährlösung
wird in einem iooo-l-Kessel, der mit einer Rührvorrichtung und einerBelüftungsvorrichtung
versehen ist, i Stunde bei 12o° sterilisiert. Dann wird der Kessel auf 30° heruntergekühlt
und unter sterilen Bedingungen mit etwa 11 der obigen Vorkultur beimpft.
Dann wird der Hauptansatz unter Rühren und Belüften 4 bis 6 Tage bei 29 bis 30°
bebrütet. Der Luftdurchsatz beträgt im Anfang 5oo 1 pro Minute, bei starkem Schäumen
wird die Belüftung schwächer eingestellt. Das pu der Nährlösung ist im Anfang 6,5
bis 6,9; es steigt während der Bebrütung auf 8,8 bis 9,1 an. Die Lösung färbt sich
rötlichgelb, und zum SchluB des Wachstumsvorganges scheidet sich das Actinochrysin
zum Teil in rötlichen Flocken ab, die sich beim Stehen der Flüssigkeit oben abscheiden,
während das Pilzmycel zu Boden sinkt. 4. Roh-Actinochrysin Die aus dem Submerskessel
abgezogene Kulturflüssigkeit wird bei Zimmertemperatur in einem iooo-l-Rührkessel
mit im Vakuum destilliertem Butylacetat, und zwar Zoo kg auf 5oo kg Kulturflüssigkeit,
ausgerührt. Man läßt über Nacht stehen und scheidet am nächsten Morgen die tiefgelb
gefärbte Butylacetatlösung in einer Mischzentrifuge vom Kulturfiltrat ab. Das Butylacetat
wird unter vermindertem Druck bei 6o° abdestilliert. Der Rückstand, eine rotbraune
harzige Masse, welche rohes Actinochrysin darstellt, wird im Vakuum getrocknet.
Ausbeute Zoo g. 5. Gereinigtes Actinochrysin Für die nun folgende chromatographische
Adsorption wird i Gewichtsteil Rohprodukt in 4 Gewichtsteilen Benzol gelöst, durch
Faltenfilter filtriert, und über io Gewichtsteile, vorher mit Benzol angeschlämmten
Aluminiumoxyd Merck (nach Brockmann) im Glasrohr filtriert. Es kommt im oberen Drittel
der Säule zu einigen gelb bis rotbraun gefärbten Zonen; nach Durchlauf der Farbstofflösung
wird noch etwas Benzol nachgegeben, dann Essigester. Hierdurch verschieben sich
die Zonen immer mehr nach unten bis an den Rand der Säule. Bei weiterem Zusatz von
Essigester tritt das Actinochrysin unten aus und wird aufgefangen. Man hört mit
dem Essigesterzusatz auf, wenn der Durchlauf nur noch schwachgelb gefärbt ist. Dann
erhält die Säule zwar noch einen mit warmem Alkohol ablösbaren Farbstoff, im wesentlichen
sind jedoch zwei Hauptfraktionen erhalten worden, nämlich der Benzolvorlauf und
die Essigesterfraktion, die die Hauptmenge Actinochrysin enthält.The actinochrysin-forming actinomycetes can be cultivated in a manner known per se by the surface process or submerged. The submerged process gives better antibiotic yields, and the times until the optimal concentration of actinochrysin in the nutrient solution is shortened considerably. As a result, the submerged process is preferred. The actinochrysin is isolated from the culture fluid by extraction and / or adsorption processes. Organic solvents, in particular butyl acetate, are suitable as extracting agents, and aluminum oxide is primarily suitable as adsorbent. When actinochrysin is separated from its impurities by adsorption processes, the crude product is dissolved in an organic solvent and separated chromatographically with the aid of aluminum oxide. The product can be recrystallized from a mixture of equal parts of ethyl acetate and benzene. The melting point is then 25q. °. Embodiment i. Stock culture The Actinomyces Bo 103 Streptomyces (Actinomyces) chrysomallus strain is cultivated on a nutrient medium which contains, in addition to the nutrient solution described below, 16 30/1 agar. a. Preculture For the preculture, 300 ccm Erlenmeyer are charged with 5o ccm nutrient solution 16 each, sterilized and inoculated with inoculum material obtained from the stock culture. The flasks are shaken on a shaking machine at 30 ° for about 5 days, a submerged culture of the microorganism forming and the nutrient solution taking on a reddish-yellow color. The inoculation material is bacteriologically tested for its purity and usability. At the same time, the antibiotic effectiveness is tested. Here, inhibition values of i: Zoo to i: 600 are achieved against Staphylococcus aureus. 3. Main approach (nutrient solution 16) tap water. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500 kg glycerine ........................ .... 10 kg of potassium nitrate ............ . . . . . . . . . . . . . 5 kg dipotassium phosphate ... . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 kg of sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i kg magnesium sulphate ..................... 259 ferrous sulphate ........................ .. 59 Calcium carbonate like. . . . . . . . . . . . . . . 59 The nutrient solution is sterilized for one hour at 120 ° in a 1,000 l kettle equipped with a stirrer and aeration device. Then, the vessel is cooled down to 30 ° and with about 1 1 of the above preculture under sterile conditions. The main batch is then incubated for 4 to 6 days at 29 to 30 ° with stirring and aeration. The air throughput is 500 liters per minute at the beginning, and the ventilation is set to be less when there is strong foaming. The pu of the nutrient solution is 6.5 to 6.9 at the beginning; it rises to 8.8 to 9.1 during incubation. The solution turns reddish-yellow in color, and at the end of the growth process the actinochrysin is partly deposited in reddish flakes, which are deposited on the top when the liquid stands, while the mycelium sinks to the bottom. 4. Crude actinochrysin The culture liquid withdrawn from the submerged kettle is stirred at room temperature in a 100 l stirred kettle with butyl acetate distilled in vacuo, namely zoo kg to 500 kg of culture liquid. It is left to stand overnight and the next morning the deep yellow colored butyl acetate solution is separated off from the culture filtrate in a mixing centrifuge. The butyl acetate is distilled off at 60 ° under reduced pressure. The residue, a red-brown resinous mass, which is crude actinochrysin, is dried in vacuo. Yield zoo g. 5. Purified actinochrysin For the chromatographic adsorption that now follows, 1 part by weight of crude product is dissolved in 4 parts by weight of benzene, filtered through a folded filter and filtered through a glass tube through 10 parts by weight of Merck aluminum oxide (according to Brockmann) previously slurried with benzene. There are some yellow to red-brown colored zones in the upper third of the column; after the dye solution has run through, a little more benzene is added, then ethyl acetate. As a result, the zones move more and more down to the edge of the column. With further addition of ethyl acetate, the actinochrysin emerges from the bottom and is collected. You stop adding ethyl acetate when the run-through is only pale yellow in color. The column then still receives a dye which can be removed with warm alcohol, but essentially two main fractions have been obtained, namely the benzene first run and the ethyl acetate fraction, which contains the main amount of actinochrysin.
Die Ausbeute an Actinochrysin nach dem Abdestillieren des Essigesters
beträgt 4o bis 6o °/o des eingesetzten Rohproduktes. 6. Actinochrysinkristallisat
Man löst i Gewichtsteil der Essigesterfraktion in einem Gemisch von 7 Teilen Essigester
und 7 Teilen Benzol, filtriert, dampft unter vermindertem Druck auf etwa ein viertel
Volumen ein und versetzt nach Abkühlung auf Zimmertemperatur mit demselben Volumen
über Quecksilber destillierten Schwefelkohlenstoff. Spontan oder nach Reiben mit
dem Glasstab fällt das kristallisierte Actinochrysin aus und wird nach 24stündigem
Stehen bei o° abgesaugt und nachgewaschen, wobei zuerst ein Essigester-Schwefelkohlenstoff-Gemisch,
dann Ligroin verwendet wird. Man trocknet auf dem Wasserbade; Ausbeute mindestens
70 % des eingesetzten gereinigten Actinochrysins, Fp. 254.°.The actinochrysin yield after the ethyl acetate has been distilled off is 40 to 60% of the crude product used. 6. Actinochrysine crystallizate One part by weight of the ethyl acetate fraction is dissolved in a mixture of 7 parts of ethyl acetate and 7 parts of benzene, filtered, evaporated to about a quarter volume under reduced pressure and, after cooling to room temperature, the same volume of carbon disulfide distilled over mercury is added. Spontaneously or after rubbing with a glass rod, the crystallized actinochrysin precipitates and is sucked off and washed after standing for 24 hours at 0 °, using first a mixture of ethyl acetate and carbon disulfide, then ligroin. One dries on the water bath; Yield at least 70 % of the purified actinochrysin used, melting point 254 °.