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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Abbildung, und
insbesondere zur Abbildung Licht emittierender Lumineszenzproben
der Art, bei der die Probe mit Erregerstrahlung wie ultraviolettem
Licht beleuchtet wird, oder bei der die Probe durch ein geeignetes
chemilumineszentes oder biolumineszentes Mittel aktiviert wird und
auf resultierendes Emissionslicht, beispielsweise aufgrund von Fluoreszenz
in der Probe, abgefragt wird. Die Erfindung betrifft insbesondere
Mehr-Wege- (oder Mehrkanal-)-Systeme, bei denen eine große Zahl
Proben Licht emittieren kann und gleichzeitig abgefragt werden muss.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
US-A-4295199 offenbart eine Vorrichtung zum Messen der Menge einer
fluoreszent markierten Verbindung in einer flüssigen Probe. Ein Cut-Off-Filter
zum Blockieren von gestreutem Erregerlicht und ein Interferenzfilter
sind in dieser Reihenfolge zwischen der Probe und einer Photomultiplier-Röhre vorgesehen.
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Die
PCT-Anmeldung WO 98/01744 beschreibt ein Abbildungssystem für Fluoreszenztests, bei
dem ein Interferenzfilter verwendet wird, um eine hochselektive Übertragung
der Strahlung zu ermöglichen,
die die Abbildungsvorrichtung, z.B. eine Kamera, erreichen soll.
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Die
GB 2315130 offenbart eine
Vorrichtung zum Abbilden einer Vielzahl fluoreszierender Proben, die
in Vertiefungen einer Multilochplatte angeordnet sind und die mit
einer Erregerstrahlung beleuchtet werden. Die Proben in den Vertiefungen
sind biochemische Proben, in denen eine markierte Phase der Probe
vorhanden ist oder in die Flüssigkeit
eingeführt wird,
und die Bindung der beiden Teile der Probe erfasst wird. Das fluoreszente
Licht von jeder Probe wird durch ein faseroptisches Bündel oder
einen faseroptischen Stab über
einen Interferenzfilter, der Erreger-Wellenlängen entfernt und vor der Kamera
angeordnet ist, an eine CCD-Kamera übertragen.
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Während ein
Interferenzfilter eine sehr scharfe Trennung hat und praktisch 100% Übertragung
erwünschter
Wellenlängen
und praktisch null Übertragung
unerwünschter
Wellenlängen
ermöglicht,
kann ein Durchbruch auftreten, wenn Licht einer nicht akzeptablen
Wellenlänge
in einem ausreichend großen
Winkel auf den Filter einfällt,
so dass das Fabry-Perot-Übertragungskriterium
für den
Interferenzfilter erfüllt
ist, d.h. das Verhältnis
zwischen Wellenlänge
und Einfallswinkel für
den Interferenzfilter. Die unerwünschten
Wellenlängen
können
dem Licht zuzuschreiben sein, das von der Probe emittiert wird, gleich,
wie sie stimuliert wird.
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Durch
Verwendung optischer Fasern zur Übertragung
von Licht von der Probe zu dem Interferenzfilter und weitestgehendes
Abschirmen der Faserenden gegenüber
Störlicht
werden freie Strahlen im Allgemeinen auf reflektiertes oder gebrochenes Licht
beschränkt,
das Erregerlicht oder Licht, das aufgrund der Aktivierung durch
chemilumineszente oder biolumineszente Mittel von der Probe emittiert
wird, sein kann, und dieses hat allgemein eine feste Wellenlänge. Strahlen
solchen Lichts, die durch die optischen Fasern übertragen werden können und
einen so großen
Winkel haben, dass sie den Interferenzfilter durchbrechen können, sind
wahrscheinlich Schrägstrahlen,
und es wurde bereits in der oben genannten PCT-Anmeldung vorgeschlagen,
einen Winkelkollimator zwischen dem Interferenzfilter und der Kamera
zu positionieren, um die Leitung von Schrägstrahlen, die von dem Interferenzfilter
ausgehen, an die Kamera zu reduzieren.
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist es, das Blockieren solcher Schrägstrahlen
weiter zu verbessern und dadurch den Einfall unerwünschter
Strahlung auf den Detektor weiter zu reduzieren.
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Bei
dem Fluoreszenztest-Abbildungssystem, das in der PCT-Anmeldung WO98/01744
beschrieben ist, wird Erregerstrahlung der Probe über eine ringförmige Hülse zugeführt, die
passend um das Ende eines faseroptischen Bündels angeordnet ist, dessen
Ende sich nah bei der Probe befindet. Die Fasern sammeln aufgrund
der Fluoreszenz, die von der Erregerstrahlung erzeugt wird, emittiertes
Licht. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung einer ringförmigen Strahlungsquelle
nicht die gleichmäßigste und
ausreichend intensive Beleuchtung der Testreaktionsstelle produziert,
und es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die
Gleichmäßigkeit
und Intensität
der Erregerbeleuchtung über
der präsentierten
Fläche
jeder Testreaktionsstelle zu verbessern, ohne eine Lichtsammeleffizienz
der Fasern zu beeinträchtigen.
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Das
Erzielen von Gleichmäßigkeit über der Reaktionsstelle
hat sich als noch schwieriger herausgestellt, wenn die Probe eine
sehr dünne
Zellschicht ist oder in oder auf einem dünnen Gel oder einer dünnen Membran
enthalten ist.
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Das
oben identifizierte Problem verstärkt sich noch, wenn die Fläche jeder
Reaktionsstelle kleiner wird. Dies tritt tendenziell dann auf, wenn
größere Zahlen
von Proben und daher Reaktionsstellen in einer Probenhalteeinrichtung
wie einer Multilochplatte, einer Multi-Site-Membran, einem Multi-Site-Gel
oder -wafer oder einem Chip aus Silikon oder ähnlichem Material untergebracht
sind.
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Es
ist daher eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Beleuchtungs-
und Sammelsystem zur Verfügung
zu stellen, das es ermöglicht, dass,
wenn dies von dem Test erfordert wird, in Reaktionsstellen wie z.B.
solchen in einer 96-Vertiefungs-Platte (für die das bekannte Abbildungssystem nach
WO 98/01744 insgesamt adäquat
ist), und auch in den wesentlich kleineren Reaktionsstellen, wie
sie jetzt in hochformatigen multiplen Probenplatten existieren,
die viele Hundert oder sogar einige Tausend Reaktionsstellen pro
Platte enthalten, ausreichende Erregerstrahlung eingeführt und
emittiertes Licht aus diesen gesammelt wird.
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Die
Erfindung ist für
jeden Lumineszenz erzeugenden Test anwendbar.
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Licht
emittierende Lumineszenzprozesse, einschließlich Fluoreszenz, Chemilumineszenz
und Biolumineszenz und/oder eine Kombination aus diesen Prozessen
können
bei der Messung biomedizinischer und chemischer Proben verwendet
werden. Die Wellenlängen
der Erregung und Emission für
diese Prozesse sind charakteristisch für die verwendeten fluoreszenten
und/oder lumineszenten Moleküle und
Anteile. Verwendete Wellenlängenbereiche
liegen im UV-Teil, im sichtbaren Teil, im roten Teil und im infraroten
Teil des Spektrums. Ein typischer Erregerbereich ist 260-800 nm,
ein typischer Emissionsbereich ist 320-1100 nm.
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In
dieser Anmeldung umfassen die gemessenen Lumineszenzprozesse Fluoreszenz,
Chemi- und Biolumineszenz.
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Bei
normaler Fluoreszenz wird ein fluoreszentes Molekül oder Fluorophor
durch externe Strahlung erregt, so dass es Lichtenergie absorbiert
und Licht mit einer größeren Wellenlänge re-emittiert.
Die Fluoreszenz kann fast sofort oder später auftreten, in diesem Fall
wird sie als zeitverzögerte
Fluoreszenz bezeichnet.
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Bei
einem alternativen Lumineszenzprozess, welcher das umfasst, was
allgemein als Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Energietransfer
bekannt ist, wird Energie über
einen nicht-strahlenden Mechanismus von einem Donormolekül oder -anteil
an ein Akzeptormolekül
oder einen Akzeptoranteil übertragen. Dieser
Mechanismus kann z.B. durch Resonanz oder durch Elektronentransfer
zwischen Atomen und Molekülen
stattfinden. Solche lumineszenten Donor- und Akzeptormoleküle können fluoreszent
oder chemi- oder biolumineszent sein. Die Donor- oder Akzeptormoleküle sind
insgesamt unterschiedlich, und es kann mehr als eine Molekülart sowohl
in der Donor- als auch in der Akzeptorphase des Prozesses verwendet
werden.
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Die
Aktivierung der Donormoleküle
kann durch Erregerlicht im Fall von Fluoreszenz oder durch chemische
Aktivierung im Fall von Chemi- oder Biolumineszenz erfolgen. Bei
der Fluoreszenzaktivierung kann eine kurze Verzögerung zwischen der Erregung
des Donors und der Emission des Akzeptors im Bereich von Mikrosekunden
bis zu Millisekunden auftreten.
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Energietransfer
findet nur über
sehr kurze Distanzen statt (typischerweise 100 nm), und daher müssen das
Donor- und das Akzeptormolekül
sehr nah beieinander sein. Dies kann durch direkte Bindung (z.B.
kovalent) des Donor- und des Akzeptormoleküls oder durch Verbinden der
beiden Moleküle durch
eine biochemische Brücke
(z.B. über
eine Peptidbindung) erreicht werden. Alternativ können die Moleküle beschichtet
oder an eine feste Phase gebunden werden, so dass sie nah beieinander
sind (z.B. eine Mikroplatte oder -kugel). In einem weiteren Beispiel
kann der Energietransfer von dem Donor über ein reaktives Zwischenprodukt
erfolgen, z.B. Singulettsauerstoff oder ein erregtes chemisches
Radikal, das z.B. in einem Fluid diffundiert, so dass es mit dem
Akzeptormolekül
interagiert.
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Wo
kein Energietransfer zwischen dem Donor- und dem Akzeptormolekül stattfindet,
setzt das Donormolekül
selbst, wenn es aktiviert wird, Energie direkt als Licht frei, mit
einer Emissionswellenlänge, die
charakteristisch für
das Molekül
selbst ist. Wenn ein Energietransfer stattfindet, ist die Emissionswellenlänge charakteristisch
für das
Akzeptormolekül. Wenn
das Donor- und das Akzeptormolekül
unterschiedlich sind, kann die Lichtemission von den Akzeptormolekülen eine
längere
oder kürzere
Wellenlänge
als die Emission haben, die für
das Donormolekül
charakteristisch ist.
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Wenn
sie bei biomedizinischen oder chemischen Tests verwendet werden,
um das Vorhandensein oder die Aktivität einer Verbindung oder eines
Agens zu messen, könne
diese Lumineszenzprozesse als Indikator für das Vorhandensein oder die
Aktivität
einer solchen Verbindung oder eines solchen Agens verwendet werden.
Der Anstieg oder das Absinken der Lichtemission von dem Donor- oder dem
Akzeptormolekül
kann als Indikator für
die getestete unbekannte Verbindung verwendet werden. Beispielsweise
kann die unbekannte Verbindung direkt oder indirekt mit dem Energietransfersprozess interagieren,
z.B. die Brücke
zwischen dem Donor- und dem Akzeptormolekül brechen oder den Transferprozess
auf andere Art hemmen. Dies würde
zu einer Änderung
der relativen Intensität
der Lichtemission des Donor- und des Akzeptormoleküls führen, die durch
Messung erfasst werden könnte,
z.B. auf den zwei oder mehr Wellenlängen, die charakteristisch für jedes
Molekül
sind. So kann eine radiometrische Messung geeignet sein, die verschiedene
Paare von Wellenlängen
umfasst, die charakteristisch für
die verwendeten Moleküle
sind.
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Die
EP 0580362 A1 beschreibt
eine Fluoreszenzerfassungsvorrichtung, bei der einige der Fasern,
die unterhalb eines abgedichteten Probenhalters 7 enden, Erregerstrahlung
an die Probe übertragen
und andere die Fluoreszenzstrahlung zu einem Detektor ableiten.
Auf S. 3 und 4 ist eine bevorzugte Anordnung für schwache Fluoreszenz beschrieben, bei
der die Erregerfasern in der Mitte des Bündels konzentriert sind, das
der Probe präsentiert
wird, und diejenigen für
die Aufnahme und das Ableiten von der Fluoreszenzstrahlung ringförmig um
den zentralen Erregerfaserkern angeordnet sind.
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Es
wurde zweifellos angenommen, dass durch die Konzentration der Erregerstrahlungsfasern in
einem zentralen Bereich der Probe und durch Zusammenbringen der
schwachen emittierten Fluoreszenz aus einem ringförmigen Bereich
des zentralen Kerns ein Großteil
der unerwünschten
Erregerstrahlung, die durch die Probe (oder die Reaktionsstelle) zu
den Fasern zurück
reflektiert oder gebrochen wurde, nicht von den Fasern gesammelt
werden würde, die
zu dem Detektor führen.
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Es
hat sich jedoch gezeigt, dass dies einen praktisch toten Bereich
im Zentrum der Reaktionsstelle erzeugt, wo das Produkt aus Erregung
und Lichtsammlung für
jeden beliebigen Punkt sehr niedrig oder null ist (aufgrund der
ringförmigen
Anordnung der Sammelfasern), und echte Signale können nicht vom Hintergrundrauschen
unterschieden werden, das von einer großen zentralen Fläche der
Reaktionsstelle ausgeht.
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Das
verbesserte Lichtsammelsystem, das in dieser Erfindung vorgeschlagen
ist, zielt auch darauf ab, dieses Problem zu beseitigen, da es für eine zuverlässige und
genaue Testauswertung nicht nur erforderlich ist, dass über die
gesamte Lochplatte eine gute Gleichmäßigkeit des Ansprechens von
einer Vertiefung zur anderen vorhanden ist, sondern es auch sehr
wichtig ist, dass ein hoher Grad der Einheitlichkeit des Ansprechens über die
Fläche
jeder Test-Reaktionsstelle vorhanden ist.
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Die
US-4113384 offenbart ein Proben-Fluoreszenzdetektorsystem, bei dem
die Fluoreszenzstrahlen, bevor sie auf einen Detektor einfallen,
einen Interferenzfilter und Fenster durchlaufen, die als Blockierfilter
für Durchlassbereiche
höherer
Ordnung des Interferenzfilters dienen. Im Gegensatz dazu betrifft
die vorliegende Erfindung keine Strahlen, die Bedingungen eines
Durchlassbereichs höherer
Ordnung des Interferenzfilters erfüllen und die in allen Winkeln,
einschließlich
0 Grad, durch den Interferenzfilter übertragen werden können, sondern Schrägstrahlen,
wie oben erläutert.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Abbildung
von induzierter Lumineszenz bei einer Vielzahl von Proben zur Messung
des Vorhandenseins oder der Aktivität einer Verbindung oder eines
Agens in den Proben, wobei die Vorrichtung eine CCD-Kamera, ein
Bündel
optischer Fasern zum Sammeln von Licht, das von den Proben emittiert
wird und Strahlen einer Wellenlänge λem umfasst,
wenn die Proben durch Erregerstrahlung einer Wellenlänge λex erregt
werden, für
eine Übertra gung an
die Kamera, und wenigstens einen Interferenzfilter zur Auswahl der
Wellenlänge λem, der zwischen dem
optischen Faserbündel
und der Kamera angeordnet ist, aufweist. Erfindungsgemäß ist ein
Absorptionsfilter zwischen dem Interferenzfilter und der Kamera
angeordnet, wobei der Absorptionsfilter eine solche Dämpfungskennlinie
hat, dass Strahlen einer Wellenlänge λex < λem blockiert
werden, die, wenn sie als Schrägstrahlen
auf den Interferenzfilter einfallen, die Fabry-Perot-Durchlassbedingung
für den
Interferenzfilter erfüllen
und dadurch den Interferenzfilter zu der Kamera durchbrechen können, und
wobei ein zweiter Blockierfilter vor dem Interferenzfilter zwischen
diesem und den Enden der optischen Fasern, die Licht von der Probe übertragen,
angeordnet ist, so dass Licht mit unerwünschten Wellenlängen stark gedämpft wird,
bevor es den Interferenzfilter erreicht, unabhängig von dem Einfallswinkel
der Strahlung auf den Blockierfilter, und wobei der Absorptionsfilter Licht
dämpft,
das eine Wellenlänge
hat, die sich von derjenigen unterscheidet, die von dem zweiten
Blockierfilter zwischen dem Bündel
und dem Interferenzfilter gedämpft
wird.
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Der
Absorptionsfilter, der nach dem Interferenzfilter zwischen diesem
und dem Detektor angeordnet ist, dämpft Schrägstrahlen, die den Interferenzfilter
durchbrochen haben, bevor sie den Detektor erreichen.
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Wo
zwei oder mehr verschiedene Interferenzfilter verwendet werden,
von denen jeder für
eine unterschiedliche Wellenlänge
selektiv ist, und optische Fasern, die von der Probe weg führen, gleich auf
die zwei oder mehr Interferenzfilter aufgeteilt sind, ist entweder
ein separater Absorptionsfilter zwischen den Enden der optischen
Fasern und jedem separaten Interferenzfilter vorgesehen, oder ein
großer
Absorptionsfilter ist vorgesehen, der alle Interferenzfilter einschließt, und
die aufgeteilten Bündel
optischer Fasern enden an der Fläche
des großen
Filters an Stellen, die jedem der Interferenzfilter gegenüberliegen,
oder separate Filter sind jenseits der Interferenzfilter deckungsgleich
mit den faseroptischen Bündeln
vorgesehen, die das emittierte Licht an die verschiedenen Interferenzfilter übertragen,
oder ein großer
Filter, der alle Interferenzfilter einschließt, ist jenseits der Letztgenannten
vor dem Detektor angeordnet.
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Das
Positionieren eines Absorptionsfilters vor dem Interferenzfilter
kann Lichtstrahlen, die von der Erregerstrahlung herrühren, oder
anderes unerwünschtes
Licht, das von einer Probe emittiert wird, entfernen und die Fasern
als Schrägstrahlen
emittieren, die den Interferenzfilter durchdringen und an dem Detektor
eine ausreichende Intensität
im Vergleich zu der Intensität
erwünschter
Strahlung aufgrund von Probenlumineszenz haben können, um Letztere an dem Detektor
zu verdecken oder damit verwechselt zu werden.
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Ein
Absorptionsfilter, der zwischen dem Interferenzfilter und dem Detektor
angeordnet ist, kann auch so gewählt
werden, dass er die Übertragung
unerwünschter
Fluoreszenz reduziert, die von dem Interferenzfilter emittiert wird.
Bevorzugt werden natürlich
die Materialien, die den oder die Interferenzfilter und den oder
die Blockierfilter bilden, aufgrund ihrer niedrigen Fluoreszenzeigenschaften
ausgewählt.
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Die
Kennlinie der Emissionsfilter, die für die Erfassung dieser Arten
von Lumineszenzprozessen erforderlich sind, besonders wenn die Emissionswellenlängen der
Akzeptormoleküle
kürzer
oder länger als
die Wellenlängen
der Donormoleküle
sein können,
muss berücksichtigt
werden.
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Im
Fall von Fluoreszein, das normale Fluoreszenz erzeugt, erzeugt Erregerlicht
von z.B. 485 nm ein fluoreszentes Licht, das mit einer größeren Wellenlänge emittiert
wird, z.B. mit 530 nm.
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Jedes
Erregerlicht, das an einem 530-nm-Bandpass-Interferenzfilter erscheint,
mit einem Winkel zum Filter, der der Fabry-Perot-Bedingung entspricht,
wird übertragen.
Dies ist z.B. der Fall für
485-nm-Licht, das bei –54° auftrifft.
Im Fall von faseroptischen Komponenten können Schrägstrahlen übertragen werden und in einem
solchen Winkel in den Filter eintreten. Ein Absorptionsfilter wird
gebraucht, um Licht zu eliminieren, das aufgrund der Fabry-Perot-Bedingung
oder eines Durchgriffeffekts übertragen
wird.
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Im
Fall von Fluoreszenzenergie-Transfertests, bei denen das Erregerlicht
genutzt wird, um die Donormoleküle
zu aktivieren, und beispielsweise eine Wellenlänge von 480 nm hat und eine
kürzere Wellenlänge hat
als das von dem Akzeptormolekül emittierte
Licht, z.B. 540 nm, liegt die gleiche Situation vor. Das bedeutet,
dass ein Absorptionsfilter erforderlich ist, um das 480-nm-Erregerlicht
zu absorbieren, das andernfalls durch die Fabry-Perot-Bedingung
für den
Interferenzfilter übertragen
würde,
der so gewählt
wird, dass er das 540-nm-Emissionslicht überträgt. Der Absorptionsfilter hilft
auch, einen Durchgriffeffekt des 480-nm-Lichts zu eliminieren.
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Im
Fall von Energietransfertests, bei denen chemi- oder biolumineszente
Aktivierung der Donormoleküle
auftritt und daher kein Erregerlicht verwendet wird, besteht trotzdem
noch das Problem, das daher kommt, dass die Donor- oder Akzeptormoleküle unterschiedliche
Emissionswellenlängen
haben und daher die Notwendigkeit besteht, die längere Wellenlänge in Gegenwart
der kürzeren
Wellenlänge
zu erfassen, wobei die Intensität
der kürzeren
Wellenlänge
deutlich größer als
die Intensität
der längeren
Wellenlänge
ist.
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Dies
ist besonders dann der Fall, wenn die Emissionswellenlänge des
Akzeptors kürzer
als die Emissionswellenlänge
des Donors ist, und wenn der Energietransfersprozess zu einer deutlichen
Verstärkung
des von den Akzeptormolekülen
erzeugten Signals führt.
Wiederum ist ein Blockierfilter wünschenswert, um zu verhindern,
dass aufgrund dessen, dass das Licht mit kürzerer Wellenlänge durch
den Filter übertragen
wird, indem die Fabry-Perot-Bedingung erfüllt wird, oder durch einen
Dwchgriffeffekt, Licht einer kürzeren
Wellenlänge
von dem Interferenzfilter durchgelassen wird, der normalerweise
nur Licht mit längerer
Wellenlänge überträgt.
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Bei
einem typischen Beispiel wird blaues Erregerlicht, das eine Wellenlänge von
485 nm hat, verwendet, um grüne
Fluoreszenz zu erregen, die eine Wellenlänge in der Größenordnung
von 530 nm hat. Blaues Licht, das seinen Weg durch Fasern findet, die
nur emittierte grüne
Fluoreszenz übertragen
sollten, z.B. durch Reflexion von dem Boden einer Probenplatte,
die den Test enthält,
kann die Fasern in einem Kegel von Schrägstrahlen verlassen, deren Winkel
groß genug
ist, um die Fabry-Perot-Übertragungsbedingung
des Interferenzfilters zu erfüllen, und
ein intensiver Ring blauen Lichts wird dem Detektor präsentiert.
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Ohne
das Vorhandensein des Blockierfilters wird dieses unerwünschte Licht über die übrige Faseroptik
an den Detektor (die Kamera) übertragen. Wenn
dieser Ring aus blauem Licht nicht durch eine Winkelkollimationseinrichtung
vor der Kamera eliminiert wird, wie bereits vorgeschlagen, verdeckt
der Ring aus Licht den Detektor genau in dem Bereich des Detektors,
an den aufgrund von Probenfluoreszenz grünes Licht auf niedriger Ebene
geleitet wird, falls vorhanden.
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Obgleich
ein Winkelkollimator die Intensität eines solchen Rings senkt,
ist dies keine vollständige Lösung des
Problems, und bei Vorhandensein starker Schrägstrahlen kann immer noch ein
ausreichendes Verdecken auftreten, um grünes Licht an dem Detektor praktisch
ununterscheidbar von Rauschen usw. zu machen. Wenn die Probe Licht
z.B. durch Fluoreszenz emittiert, kann der kleine Fleck aus grünem Licht,
der der Fluoreszenz zuzuschreiben ist, sogar bei Vorhandensein eines
Winkelkollimators von dem Ring aus intensivem blauem Licht, das
von dem unerwünschten
Durchbruch von Erregerstrahlung erzeugt wird, umgeben und im Wesentlichen
verdeckt werden. Ein dem Interferenzfilter nachgelagerter Absorptionsfilter
verringert dies signifikant.
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Um
wirksam zu sein, sollte der Absorptionsfilter eine scharfe Trennung
zwischen Übertragung und
Abschwächung
und eine starke Abschwächung der
Wellenlängen
jenseits des Cut-Off-Punkts haben. Bei dem oben stehenden Beispiel,
bei dem die Wellenlänge
des blauen Lichts 485 nm beträgt
und die emittierte Strahlung z.B. aufgrund von Fluoreszenz eine
Wellenlänge
von 530 nm hat, wurde ein Filter mit einem Cut-Off bei 515 nm passend
ausgebildet, wodurch Wellenlängen
in der Größenordnung
von 530 nm (wenn auch abgeschwächt) übertragen
werden, Wellenlängen
in der Größenordnung
von 485 nm jedoch sehr signifikant gehemmt werden.
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Ein
Filter mit einer solchen Kennlinie ist ein Schott-Filter vom Typ
OG515. Dieser überträgt Wellenlängen von
515 nm mit einem 50%-igen Übertragungsfaktor
und oberhalb von 515 nm mit einem immer größeren Übertragungsfaktor, schwächt Wellenlängen unterhalb
von 515 nm jedoch sehr stark ab und ist stark abschwächend bei
485 nm.
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Die
Verwendung eines Absorptionsfilters umgeht nicht die Notwendigkeit
eines Winkelkollimators, wie bereits vorgeschlagen, wird aber bevorzugt in
Kombination mit diesem verwendet.
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Die
Winkelkollimationseinrichtung reduziert die Schrägstrahlen weiter und besteht
in der Praxis aus einer Fiberoptikplatte der Größenordnung einer Dicke von
5-10 mm, die vor dem Detektor-/Kamera-Eingang angebracht ist. Bevorzugt
ist sie aus Glasfasern einer relativ niedrigen numerischen Apertur
(NA) hergestellt, typischerweise in der Größenordnung von 0,30. Eine solche
Einrichtung überträgt erwünschte Strahlen
innerhalb der numerischen Apertur von 0,22 des Faserbündels, reduziert
jedoch die Schrägstrahlen
stark, die sonst von dem Bündel übertragen
würden.
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Durch
Einsetzen der Platte unmittelbar vor der Detektor-/Kamera-Eingangsflächenplatte
wird die Neigung zu Streuung oder Kreuzkopplung zwischen den Fasern
und dem Detektor-/Kamera-Eingang reduziert.
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Wenn
die Winkelkollimationseinrichtung nach dem Interferenzfilter angeordnet
wird, ist es weniger wichtig, ob das Material, aus dem die Kollimationseinrichtung
aufgebaut ist, selbst Fluoreszenz erzeugt. Es ist beispielsweise
schwierig, eine Fiberoptikplatte aus nicht fluoreszentem Material
wie Siliciumdioxid zu erzielen.
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Es
ist auf die Schrägstrahlen
Bezug genommen worden. In diesem Zusammenhang ist die numerische
Apertur einer Faser der Kegelwinkel für Strahlen, die mit hoher Effizienz
von der Faser übertragen
werden. Im idealen Sinn trifft die Bedingung nur auf meridionale
Strahlen zu, d.h. diejenigen, die entlang einer Ebene verlaufen,
die die Achse der Faser einschließt. Es wird normalerweise davon
ausgegangen, dass die Faser ein langer Zylinder ist.
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In
der Praxis gibt es nur verschwindend wenige solcher Strahlen, und
das Licht, das von einer Faser übertragen
wird, wird normalerweise als alle Strahlen innerhalb desselben Kegelwinkels
betrachtet, die jedoch an einem beliebigen Punkt der Eintrittsfläche der
Faser in die Faser eintreten, da alle diese Strahlen auch mit relativ
hoher Effizienz übertragen
werden.
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Schrägstrahlen
sind daher diejenigen, die an einem beliebigen Punkt an der Endfläche der
Faser eintreten, aber in einem Winkel, der größer als sin–1 NA
ist. Die Bedingungen dafür,
dass solche Strahlen übertragen
werden, sind kompliziert und schwer zu erfüllen, aber in einigen Situationen
können
bis zur Hälfte
der von einer Faser übertragenen
Strahlen Schrägstrahlen
sein.
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Bei
Einkanal-Testsystemen sind Schrägstrahlen
weniger problematisch, da der Strahlengang in einem Einkanalsystem
hoch kollimiert sein kann, um sie effektiver zu entfernen. Das Problem
macht sich in Mehrkanalsystemen stärker bemerktbar, wo nicht ausreichend
Platz zwischen den Kanälen
vorhanden ist, um optische Kollimationsmechanismen zum individuellen
Kollimieren jedes Kanals unterzubringen.
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Der
lichtempfindliche Detektor ist bevorzugt ein CCD, ein ICCD, ein
gekühlter
CCD, eine Fotodiodenanordnung oder eine Anordnung von PMTs. Gleichgültig, welche
Einrichtung gewählt
wird, sie sollte eine gute räumliche
Auflösung
nach der Zentrierung haben, so dass sie einzelne Faserbündel in dem
Endbild auflösen
kann, so dass minimale Kreuzkopplung zwischen den Kanälen entsteht.
Eine bevorzugte räumliche
Auflösung
ist 10-20 μm.
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Der
Detektor sollte eine gute Quantenausbeute (quantum efficiency, QE)
haben.
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Typischerweise
hat ein ICCD eine QE von 15% im Blau, die auf wenige Prozent im
Rot fällt.
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Ein
gekühlter
CCD hat eine bessere QE, die auf ungefähr 30% im Rot steigt.
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Wenn
das optische System, das dem Detektor/der Kamera Licht präsentiert,
Licht von der Probe über
Fasern mit 100 μm
Durchmesser sammelt (typischerweise in der Größenordnung eines Durchmessers
von 100 μm
oder weniger) und diese Auflösung durchgehend
bis zu dem Eingang des Fotodetektors, z.B. einer CCD-Kamera, beibehält, wobei
Letztere eine räumliche
Auflösung
in der Größenordnung
vor. 10-20 μm
hat, ermöglicht
es eine Untersuchung der Fläche
der CCD-Anordnung, auf die Licht von einer Probe trifft, Licht von
einzelnen Fasern in den Bündeln,
die Licht von der Probe an die Kamera leiten, zu identifizieren.
Dies ermöglicht
es beispielsweise, Licht von einem Zellklumpen in einer Probe zu
beobachten, das getrennt und anders als Licht von getrennten einzelnen
Zellen ist, was nützlich
sein kann.
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Wo
dies ein Fokussieren des Lichts erfordert, das den Interferenzfilterbereich
durchdringt, kann eine Grin-Linse oder eine andere Einrichtung verwendet
werden, wie sie in unserer zuvor erwähnten PCT-Anmeldung WO 98/01744
beschrieben ist.
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Es
ist hervorzuheben, dass in allen solchen Systemen ein oder mehrere
Blockierfilter vorgesehen sein können,
einschließlich
solcher, die verschiedene Detektoren umfassen, und solcher, die
eine Abbildung unterhalb der Vertiefung unter Verwendung von Grin-Linsen
umfassen.
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Der
oder die Blockierfilter können
aus einem Material ausgebildet sein, das unerwünschte Wellenlängen absorbiert,
aber auf Wellenlängen
nahe an denen des Lichts, das von der Probe emittiert wird, und
die von Interesse sind, durchlässig
sind.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur gleichzeitigen Abbildung
induzierter Lumineszenz bei einer Vielzahl von Proben zur Messung
des Vorhandenseins oder der Aktivität einer Verbindung oder eines
Agens in den Proben, umfassend die Schritte:
- – Erregen
der Proben mit Erregerstrahlung der Wellenlänge λex;
- – Sammeln
von Licht von den Proben, das Strahlen der Wellenlänge λem aufweist,
unter Verwendung eines faseroptischen Bündels, und Übertragung an eine CCD-Kamera;
und
- – Filtern
des gesamten Lichts, das das Bündel
zu der Kamera verlässt,
durch einen Interferenzfilter, um die Wellenlänge λem auszuwählen.
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Erfindungsgemäß umfasst
das Verfahren die Schritte:
- – Vorsehen
eines Absorptionsfilters zwischen dem Interferenzfilter und der
Kamera, wobei der Absorptionsfilter so gewählt wird, dass das Licht mit
einer Wellenlänge
von λex < λem, das,
wenn es als Schrägstrahlen
auf den Interferenzfilter einfällt,
das Fabry-Perot-Kriterium für
den Interferenzfilter erfüllen
und dadurch den Interferenzfilter zu der Kamera durchbrechen kann,
wesentlich gedämpft
wird; und
- – Vorsehen
eines zweiten Blockierfilters vor dem Interferenzfilter zwischen
diesem und den Enden der optischen Fasern, die Licht von der Probe übertragen,
so dass Licht mit unerwünschten
Wellenlängen
stark gedämpft
wird, bevor es den Interferenzfilter erreicht, unabhängig von
dem Einfallswinkel der Strahlung auf den Blockierfilter, wobei der
Absorptionsfilter Licht dämpft,
das eine Wellenlänge
hat, die sich von derjenigen unterscheidet, die von dem zweiten
Blockierfilter zwischen dem Bündel
und dem Interferenzfilter gedämpft wird.
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Gemäß einem
weiteren Merkmal der Erfindung werden bei einer Vorrichtung zur
Erfassung von Lumineszenz in einer Probe, bei der von der Probe emittiertes
Licht für
eine Übertragung
an ein fotosensitives Detektormittel von einem optischen Faserbündel gesammelt
wird, dessen Querschnittsfläche
der Fläche
der Probe entspricht und dessen eines Ende nahe an der Probe angeordnet
ist, um Licht zu erfassen, das von dieser emittiert wird, ausgewählte Fasern,
die das Bündel
bilden, von dem Rest getrennt und erstrecken sich zu einer Quelle
von Erregerstrahlung und dienen dazu, Erregerstrahlung (falls für die Erzeugung
von Fluoreszenz erforderlich) direkt an die Probe zu leiten, und
der Rest des Faserbündels dient
dazu, Licht zu sammeln, das entweder aufgrund von Fluoreszenz, die
durch die Erregerstrahlung erzeugt wird, oder auf andere Art emittiert
wird, und einen Strahlengang zu dem fotosensitiven Detektor zu bilden,
wobei die Enden der Erregerfasern und die Enden der Lichtsammelfasern
gleichmäßig über die Fläche des
Faserbündels
verteilt sind, das der Probe präsentiert
wird.
-
Die
Lichtsammelfasern, die den Rest bilden, können in zwei gleiche Gruppen
eingeteilt werden und können
Licht an zwei verschiedene Bereiche an dem Detektor leiten, wodurch
sie zwei parallele Strahlengänge
von der Probe zu dem Detektor bilden, und wellenlängenselektive
Filter, zweckmäßigerweise
Interferenzfilter, die Schrägstrahlen-Blockiermittel aufweisen,
sind in den beiden Strahlengängen
angeordnet, die nur ausgewählte
Wellenlängen
des emittierten Lichts die verschiedenen Bereiche des Detektors
erreichen lassen, wenn diese in dem Licht, das von der Probe emittiert
wird, vorhanden sind.
-
Bevorzugt
sind die Fasern, die jede der beiden gleichen Gruppen bilden, gleichmäßig über die Fläche des
Endes des Bündels,
das der Probe präsentiert
wird, verteilt.
-
Bevorzugt
sind auch die Enden der ausgewählten
Fasern, die Erregerstrahlung an den Probenhalter leiten, gleichmäßig über die
gesamte Fläche des
Endes des Bündels,
das dem Probenhalter präsentiert
wird, verteilt.
-
Bei
der bevorzugten Anordnung leitet ein Drittel der Fasern in dem Bündel Erregerstrahlung
an den Probenhalter, ein weiteres Drittel der Fasern leitet emittierte
Strahlung über
einen ersten wellenlängenselektiven
Filter zu einem bestimmten Bereich des fotosensitiven Detektors,
und das restliche Drittel der Fasern leitet emittierte Strahlung über einen zweiten
wellenlängenselektiven
Filter zu einer anderen bestimmten Region des Detektors.
-
Wenn
die Querschnittsform der Probe insgesamt kreisförmig ist und das Faserbündel ebenfalls einen
insgesamt kreisförmigen
Querschnitt hat, sind die Fasern bevorzugt in einem symmetrischen
Muster so angeordnet, dass in der Endfläche des Bündels, die dem Probenhalter
präsentiert
wird, jedes Erregerfaserende von einem Ring aus sechs emissionsempfangenden
Faserenden umgeben ist, die um den Ring alternierend zu den beiden
verschiedenen wellenlängenselektiven
Filtern führen.
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Außer den
peripheren Bereichen der Faserbündelfläche gehört jede
emissionsempfangende Faser zu jedem von drei getrennten, aber sich schneidenden
Ringen von emissionsempfangenden Fasern, deren Mittelpunkte auf
drei Erregerfaserenden liegen, die unmittelbar benachbart zueinander sind.
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Indem
die Erregerfasern gleichmäßig über die
Fläche
verteilt sind, die der Probe präsentiert wird,
und indem die emissionserfassenden Fasern ebenfalls auf ähnliche
gleichmäßige Art
verteilt sind, besteht eine größere Wahrscheinlichkeit,
dass Erregerstrahlung zu Stellen durchdringt, die lumineszieren
können,
etwa durch Fluoreszieren, und es besteht auch eine große Wahrscheinlichkeit,
dass die sehr kleinen Lichtmengen, die als Reaktion auf eine solche
Erregung emittiert werden, von einer der emissionserfassenden Fasern
gesammelt und zu dem fotosensitiven Detektor geleitet werden.
-
Typischerweise
werden die Proben in kleinen Vertiefungen gehalten, die in einer
Matrix in einer Platte angeordnet sind, die als Lochplatte bekannt
ist, wobei wenigstens ein Ende jeder der Vertiefungen geschlossen
ist, so dass eine flüssige
Probe darin gehalten wird, aber der Verschluss hinreichend dünn und transparent
ist, um zu ermöglichen,
dass Erregerstrahlung in die Probe eindringt und dass Licht, das
z.B. aufgrund von Fluoreszenz emittiert wird, von der Probe zurück durch
die Basis nicht behindert wird.
-
Probenanalysen
umfassen oft das Studium von Reaktionen, die in Hunderttausenden
von Proben aufgetreten sind, und Lochplatten sind häufig so konstruiert,
dass sie eine Matrix aus vielen Hunderten oder Tausenden von Vertiefungen
haben. Eine typische Lochplatte enthält 3456 Vertiefungen, die zweckmäßigerweise
abgefragt werden, indem die Lumineszenz von je 96 Vertiefungen gleichzeitig
untersucht wird, wobei eine Präsentationsplatte
verwendet wird, die 96 Faserbündel
mit 96 der 3456 Vertiefungen in der Lochplatte in Flucht bringt,
und wobei die Präsentationsplatte
36 Mal bezüglich
der Lochplatte weitergerückt
wird, um alle 3456 Vertiefungen abzufragen.
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Im
Fall einer 3456-Loch-Platte mit kreisförmigen Vertiefungen hat typischerweise
jede Vertiefung einen Durchmesser von 1 mm, während im Fall einer Lochplatte
mit einer kleineren Zahl von Vertiefungen jede Vertiefung größer sein
kann. Die Vertiefungen können
eine beliebige Querschnittsform haben, sind im Normalfall jedoch
kreisförmig
oder quadratisch.
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Gemäß einem
bevorzugten Merkmal der Erfindung werden die beiden Gruppen von
emissionssammelnden Fasern aus jedem der 96 Bündel in zwei Gruppen von 96
Bündeln
zusammengestellt, und jede der beiden Gruppen wird einer Interferenzfilteranordnung
präsentiert,
von denen jede eine andere Filterkennlinie hat als die andere, und
weitere Bündel
von optischen Fasern übertragen
Licht, das durch jeden der Interferenzfilter gehen kann, an zwei getrennte
Bereiche an der Eingangsflächenplatte
des Detektors.
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Wenn
die Filter kreisförmig
sind, werden die Gruppen von Fasern von der Präsentationsplatte bevorzugt
so umgeordnet, dass sie die Fläche
des Filters optimal nutzen, und wenn die Eingangsflächenplatte
zu dem Detektor ein nicht kreisförmiges
Seitenverhältnis
hat, werden die Fasern, die von den Filtern zu der Eingangsflächenplatte
führen,
bevorzugt so umgeordnet, dass sie die aktive Fläche des Detektors optimal besetzen.
So werden im Fall eines Detektors, der ein quadratisches Eingangsflächenplattenfenster
hat, die Fasern, die von dem Interferenzfilter weg führen, bevorzugt
in zwei rechtwinkligen Anordnungen angeordnet, die ein Quadrat bilden,
dessen Größe dem quadratischen
Eingangsfenster der Flächenplatte
entspricht.
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Obgleich
eine Umordnung der Faserbündel auftritt,
kann durch Aufrechterhalten einer festen Deckung zwischen den 192
Faserbündelenden,
die dem Detektor präsentiert
werden, und den 192 Faserbündeln,
die von den 96 Vertiefungsuntersuchungsbündeln stammen, das Vorhandensein
von emittiertem Licht von einer beliebigen Vertiefung bestimmt werden,
indem die X,Y-Koordinatenpositionen in der Detektoranordnung abgefragt
werden, die den Abbildungen von zwei Faserbündeln in den beiden Gruppen
von 96 Bündeln
entsprechen, die dem Detektor präsentiert
werden und die mit den beiden Gruppen von Fasern von dem Faserbündel korrelieren,
das diese bestimmte Vertiefung untersucht.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung besteht jedes der faseroptischen
Bündel,
das jeder Vertiefungsstelle präsentiert
wird, aus Siliziumdioxidfasern, die von 45 Ge-legiertem Siliziumdioxid umhüllt sind
und die jeweils typischerweise einen Durchmesser von 100-200 μm haben,
von denen 15 als Unterbündel
abgesondert und mit ähnlichen
Unterbündeln
aus jedem der anderen 96 Bündel
kombiniert werden, und die sich zu einer Erregerstrahlungsquelle
wie UV-Licht erstrecken. Ein oder mehrere Filter können zwischen
der UV-Quelle und den Unterbündeln
angeordnet sein. Die übrigen
30 Fasern aus jedem der 96 Bündel
werden in zwei weitere Unterbündel
von je 15 Fasern aufgeteilt. Dies erzeugt insgesamt 192 emissionssammelnde
Unterbündel, von
denen 96 zu getrennten Positionen am Eingang eines ersten Interferenzfilters
führen
und die anderen 96 zu getrennten Positionen am Eingang eines zweiten
Interferenzfilters führen,
der unterschiedliche Wellenlängen überträgt als die
von dem ersten Filter übertragenen.
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Licht,
das an die Interferenzfilter übertragen wird,
tritt in eine oder die andere der beiden nachgelagert angeordneten
Gruppen von 96 Unterbündeln ein,
die auf Eins-zu-Eins-Basis
mit jeder der beiden Anordnungen von 96 den Filtern vorgelagerten
Unterbündeln
angeordnet sind, und die nachgelagerten Unterbündel werden gemischt, so dass
sie eine Anordnung aus 192 Unterbündeln bilden, die das gleiche
Seitenverhältnis
wie der Detektor haben.
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Wenn
das Seitenverhältnis
des Detektors ungefähr
quadratisch ist, werden die ersten 192 Unterbündel zweckmäßigerweise in 14 Reihen angeordnet,
von denen die erste und die letzte 12 Unterbündel umfassen und jede der
12 Reihen dazwischen 14 Unterbündel
umfasst. Die Anordnung der Reihen und Spalten bildet somit eine
im Wesentlichen quadratische Fläche,
bei der alle Ecken fehlen, um einem Detektor mit insgesamt quadratischem Seitenverhältnis präsentiert
zu werden.
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Typischerweise
sind die Interferenzfilter kreisförmig und haben einen Durchmesser
von ungefähr
80 mm.
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Es
ist ebenfalls hervorzuheben, dass, während die verschiedenen Aspekte
der Erfindung bisher in Bezug auf Lochplatten beschrieben wurden,
jeder der Aspekte der Erfindung ebenso auf Testsysteme anwendbar
ist, bei denen die Proben auf getrennten Flächen einer Membran oder eines
Gels angeordnet sind oder in der Matrix eines Probenträgers wie
eines Wafers oder Chips aus Silikon oder einem dünnen Glasobjektträger oder
einer dünnen
Glasplatte verteilt sind.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden beispielartig unter Bezugnahme auf die
beigefügten
Zeichnungen näher
beschrieben, in denen:
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In 1 und 1A ist
eine Lochplatte 10 gezeigt, die oberhalb einer Präsentationsplatte 12 angeordnet
ist. Die Zeichnung ist eine perspektivische Explosionsansicht, und
die in der Zeichnung dargestellte Beabstandung ist eine Übertreibung
gegenüber
der tatsächlichen
Beabstandung. In der Praxis ist die Präsentationsplatte 12 sehr
nah an der Unterseite der Lochplatte 10.
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Lochplatten
wurden tendenziell entweder mit 96 Vertiefungen hergestellt, die
typischerweise in 8 Reihen zu 12 Spalten angeordnet waren, in den
letzten Jahren jedoch wurden Platten mit höherer Dichte konstruiert, und
eine typische Platte mit hoher Dichte kann beispielsweise 36 Mal
so viele Vertiefungen aufweisen wie die Platte mit 96 Vertiefungen.
Die Fläche der
Platte ist jedoch gleich, ebenso die Basismatrix. Der einzige Unterschied
ist in diesem Fall, dass die Vertiefungsgröße verringert wurde, was es
ermöglicht,
dass sechs Vertiefungen in jeder Reihe und sechs Vertiefungen in
jeder Spalte angeordnet sind, an Stelle einer einzigen Vertiefung
in der ursprünglichen
Anordnung. Das bedeutet, dass an Stelle von zwölf Vertiefungen in jeder Reihe
nun 72 vorhanden sind und an Stelle von acht Reihen nun 48 Reihen vorhanden
sind.
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Um
daraus einen Vorteil zu ziehen und um das Weiterrücken einer
Präsentationsplatte
mit 96 Öffnungen
zu erleichtern, wird diese mit Öffnungen hergestellt,
die bezüglich
ihrer Position jeder der ursprünglichen
96 Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen entsprechen, bezüglich der
Größe aber gleich
der Größe der Vertiefungen
in der Platte mit 3456 Vertiefungen sind. Das bedeutet, dass 96
der 3456 Vertiefungen gleichzeitig untersucht werden können, indem
die Präsentationsplatte 12 so
in Flucht gebracht wird, dass die erste der 96 Öffnungen (14) an der
Position 60 in der Lochplatte mit der ersten der 3456 Vertiefungen übereinstimmt.
Das bedeutet, dass die zweite Öffnung 18 in
der Präsentationsplatte
mit der siebten Vertiefung 20 in der ersten Reihe fluchtet,
und so weiter.
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Ein
Verschieben der Präsentationsplatte 12 um
eine Distanz, die gleich der Distanz zwischen den Öffnungen 16 und 22 ist
(die nächste
Vertiefung in der ersten Reihe neben 16), bedeutet, dass
alle 96 Öffnungen
in der Präsentationsplatte 12 nun
mit einem neuen Satz von 96 der Vertiefungen in der Lochplatte 10 fluchten.
Durch Bewegen der Präsentationsplatte
sukzessive um sechs Schritte parallel zu den Reihen, die die Vertiefungen 16, 22 und 20 enthalten,
und für
jeden Schritt um sechs Positionen senkrecht zu dieser Reihe, wobei
in jedem Fall jede Bewegung der Distanz zwischen angrenzenden Vertiefungen
in der Lochplatte senkrecht zu der ersten Reihe gemessen entspricht
(d.h. der Distanz zwischen Vertiefung 16 und Vertiefung 24),
kann jede der 3456 Vertiefungen durch 36 relative Bewegungen zwischen
der Präsentationsplatte
und der Lochplatte abgefragt werden.
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In
der Praxis wird die Lochplatte bezüglich der Präsentationsplatte
bewegt.
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Jede
der Öffnungen
wie z.B. 14 in der Präsentationsplatte 12 dient
als ein Ende für
ein Faserbündel,
das aus 45 Einzelfasern besteht. Die Fasern sind nur illustrationshalber
so dargestellt, dass sie in zwei der Öffnungen enden, von denen eine
mit 26 und die andere mit 28 bezeichnet ist.
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Jedes
Bündel
von 45 Fasern besteht aus drei Gruppen von 15, wobei eine Gruppe
wie z.B. 30 sich zu einer Erregerlichtquelle erstreckt,
eine Gruppe wie z.B. 32 Fluoreszenzlicht von einer Vertiefung,
die mit der Öffnung 26 fluchtet,
zu einer Öffnung 34 in
einer Präsentationsscheibe 36 leitet.
Die dritte Gruppe von 15 Fasern 38 erstreckt sich zu einer
anderen Öffnung 40 in
einer zweiten Präsentationsscheibe 42 zum
Leiten von Fluoreszenzlicht zu dieser anderen Öffnung 40.
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Die
drei Gruppen von 15 Fasern, die das andere dargestellte Bündel bilden,
das zu der Öffnung 28 hin
und von ihr weg führt,
sind durch die Bezugszeichen 44, 46 bzw. 48 bezeichnet,
und diese erstrecken sich von der Erregerlichtquelle im Fall der
Gruppe 44 und zu zwei anderen Öffnungen 50 bzw. 52 in den
beiden Präsentationsscheiben 36 und 42.
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Jede
der Letztgenannten umfasst 96 Öffnungen,
die gleichmäßig über die
kreisförmige
Fläche
jeder Scheibe verteilt sind, und ähnliche Scheiben 36' und 42' fluchten mit
den Scheiben 36 und 42. Geeignete optische Filterscheiben 54 und 56 sind
sandwichartig zwischen den Scheiben 36 und 36' und den Scheiben 42 und 42' angeordnet.
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Öffnungen
in den beiden Scheiben 36, 36' (42, 42') fluchten auf
einer Eins-zu-Eins-Basis,
und Fasern führen
von jeder der fluchtenden Öffnungen wie 34' in der Scheibe 36' zu eindeutigen Öffnungen in
zwei Gruppen von 96 Öffnungen,
die in einer geradlinigen Matrix in einer Ausgangsplatte angeordnet sind,
die insgesamt mit 58 bezeichnet ist. Die erste dieser Matrices
ist mit 60 bezeichnet und die zweite mit 62, und
die Fasern wie z.B. 64 von Öffnung 34' und 50' führen zu
den Öffnungen 34'' und 50'' in
dem Matrixbereich 60, und die Fasern 68 und 70 von
den Öffnungen 40' und 52' in der Scheibe 42' führen zu Öffnungen
wie z.B. 40'' und 52'' in der Matrix 62.
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Die
beiden Matrices 60 und 62 bilden zusammen einen
insgesamt quadratischen Umriss, der ungefähr dem quadratischen Seitenverhältnis eines Eingangsfensters
entspricht, das in einer Kamera 74 mit 72 bezeichnet
dargestellt ist.
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Die
Erregerlichtquelle ist mit dem Bezugszeichen 76 bezeichnet,
und zwischen ihr und den 96 Gruppen von 15 Fasern wie 30 und 44 ist
ein Filter 78 angeordnet. Die Anordnung der Öffnungen
wie 34 und 50 und 40 und 52 auf
jeder der Platten 36 und 42 ist so wie in 2 gezeigt.
Zwei der Öffnungen
sind willkürlich
mit 34 und 36 bezeichnet.
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Die
Anordnung der beiden Gruppen von 96 Faserenden in den beiden Matrices 60 und 62 ist
in 3 gezeigt. Die Kamera hat typischerweise ein insgesamt
quadratisches Seitenverhältnis,
und die Anordnung der 192 Öffnungen,
die die beiden Matrices 60 und 62 bilden, stellt
die bestmögliche
Nutzung des verfügbaren,
insgesamt quadratischen Umrisses dar.
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Gemäß einem
besonders bevorzugten Merkmal der Erfindung sind die drei Gruppen
von 15 Fasern, die das Faserbündel
an jeder Präsentationsplattenöffnung wie
z.B. 16 bilden, wie in 4 gezeigt.
Hier entsprechen die ausgefüllten
schwarzen Faserenden denen in dem Erregerbündel 30, die unausgefüllten Kreise
entsprechen denen in dem Faserbündel 32,
die zu dem ersten Filterweg führen,
der den Filter 54 enthält,
und die schraffierten Kreise entsprechen den Fasern in dem Bündel 38,
die zu dem anderen wellenlängenselektiven
Weg führen,
der den zweiten Filter 56 enthält.
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Jede
der in 4 dargestellten Fasern hat typischerweise einen
Durchmesser in der Größenordnung
von 100-200 μm
und ist eine germaniumlegierte, silikonumhüllte Siliziumdioxidfaser mit
einer numerischen Apertur von ungefähr 0,22. Die Faser umfasst
bevorzugt eine Polyimidbeschichtung.
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Die
Verwendung von Fasern dieser Größe bedeutet,
dass bei einer Bündelung
zu einer Anordnung mit insgesamt kreisförmigem Querschnitt der Außendurchmesser
des Bündels
ungefähr
1,7 mm beträgt.
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Es
hat sich gezeigt, dass die besondere Anordnung von Fasern, die in 4 gezeigt
ist, wesentlich dafür
ist, eine hohe Intensität
der Beleuchtung durch Erregerlicht zu gewährleisten, indem gewährleistet
wird, dass Erregerfaserenden gleichmäßig über die gesamte kreisförmige Fläche des
Faserbündels
verteilt sind, und indem Fasern, die zu den beiden verschiedenen
wellenlängenselektiven
Wegen führen,
ebenso gleichmäßig in dem übrigen Raum verteilt
sind, so dass eine optimale Erreger-/Sammelkennlinie für jede Vertiefung
erreicht wird.
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Obgleich
Bündel
aus sehr kleinen Fasern zwischen der Präsentationsplatte 12 und
jeder der Präsentationsscheiben 36 und 42 erforderlich
sind, brauchen die Fasern, die von den Scheiben 36' und 52' zu der Ausgangsplatte 58 führen, nicht
aus Faserbündeln
zu bestehen, sondern können
Einzelfasern sein. So kann beispielsweise 64 ein Bündel aus
kleinen Fasern oder eine Einzelfaser sein und in jedem Fall einen
typischen Außendurchmesser
von 2 mm haben.
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Eine
Winkelkollimationseinrichtung 76 in Form einer dünnen Platte
kann zwischen der Matrixanordnung der Faserenden 34'', 50'' usw.
und dem Eingangsfenster 72 der Kamera 74 angeordnet
sein.
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Die
Filter 54 und 56 sind typischerweise Interferenzfilter
und sind bevorzugt austauschbar, um eine Auswahl verschiedener Wellenlängen zu
ermöglichen.
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Obwohl
die in den Zeichnungen gezeigten Beispiele eine Lochplatte sind,
ist hervorzuheben, dass die Proben sich in einer beliebigen anderen
Trägereinrichtung
befinden können,
wie z.B. einer Multilochplatte, Multi-Site-Membran oder einem Multi-Site-Gel oder -wafer oder
-silikonchip oder ähnlichem Material.
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Wie
in 1 dargestellt, kann die Fläche der Präsentationsplatte deutlich kleiner
sein als die Fläche
der Lochplatte, wenn das Verhältnis
der Proben zu den Untersuchungsöffnungen
in der Präsentationsplatte
groß ist.
Vorausgesetzt, dass die Anordnung und Beabstandung und Zahl der
Untersuchungsöffnungen
für ein
Fluchten mit Gruppen von Proben geeignet ist, und das eine bezüglich des
anderen schrittweise geändert
werden kann, um unterschiedliche Deckungen zu erreichen, können außerdem das
Seitenverhältnis
und die Größe des Probenträgers und
der Präsentationsplatte
sehr unterschiedlich sein.
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Die
Filter 78, 80 zum Blockieren von Schrägstrahlen
sind, wie durch die gestrichelte Linie in 1 gezeigt,
für den
oben beschriebenen Zweck vorgesehen.
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Es
wird angenommen, dass der Interferenzfilter aus Material aufgebaut
ist, das nicht fluoresziert, oder dass Fluoreszenz, die von dem
Filter erzeugt wird, in dem Filter abgeschwächt wird.
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Wenn
der Interferenzfilter so viel unerwünschte Fluoreszenz erzeugt,
dass ein Problem an dem Detektor auftritt, kann ein zweiter Blockierfilter zwischen
dem Interferenzfilter und dem Detektor erforderlich sein.
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Interferenzfilter
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Wie
hier erwähnt
können
Interferenzfilter eine große
Zahl dünner
Schichten von dielektrischen Materialien umfassen, die unterschiedliche
Brechungsindices haben, um eine konstruktive und destruktive Interferenz
in übertragenem
Licht zu erzeugen. Solche Filter können dafür vorgesehen sein, nur ein
bestimmtes Wellenband zu übertragen
(ein Bandpassfilter), und können
auch so hergestellt sein, dass sie einen sehr steil geneigten Cut-On
oder Cut-Off auf einer bestimmten Wellenlänge liefern und einen Spaltfilter
bilden.
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Metallische
Schichten können
ebenfalls in solchen Einrichtungen und in Hilfs-Blockierstrukturen vorgesehen sein.
Breitband-Interferenzfilter enthalten üblicherweise eine metallische
Schicht.
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Schmalband-Bandpass-Interferenzfilter
können
als Fabry-Perot-Interferometer betrachtet werden, das in der ersten
Ordnung operiert.
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Beispiele für Blockier-
und Interferenzfilterkombinationen
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Beispiel 1 Fluoreszein – ein Grünfluoreszenztest
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Die
Spitzen-Erregerwellenlänge
für Fluoreszein
beträgt
485 nm und die Spitze der Emission liegt im Bereich von 518-523
nm.
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Ein
Interferenzfilter mit einem Spitzen-Übertragungswellenband von 525-530
nm wird gewählt, und
ein Blockierfilter wird gewählt,
der Wellenlängen unter
515 nm abschwächt – wie z.B.
ein Schott OG 515-Filter.
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Beispiel 2 Cumarin – ein Blaufluoreszenztest
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Die
Spitzen-Erregerwellenlänge
für Cumarin beträgt 400 nm
und die Spitze der Emissionswellenlänge liegt im Bereich von 455-460
nm.
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Ein
Interferenzfilter mit einer Spitzen-Übertragungswellenlänge von
460 nm wird gewählt,
und ein Blockierfilter wird gewählt,
der Wellenlängen
unter 455 nm abschwächt – wie z.B.
ein Schott BG 455.
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Beispiel 3 Cy5 – ein Rotfluoreszenztest
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Die
Spitzen-Erregerwellenlänge
für Cy5
beträgt
649 nm und die Spitzenemission tritt bei 670 nm auf.
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Ein
Interferenzfilter mit einer Spitzen-Übertragungswellenlänge von
680 nm wird gewählt,
und ein Blockierfilter wird gewählt,
der Wellenlängen
unter 665 nm abschwächt – wie z.B.
ein Schott RG 665.
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Beispiel eines Energietransfertests
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Hier
ist keine Erregerstrahlung erforderlich, um Emission zu stimulieren.
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Ein
Beispiel eines Donoranteils ist Luciferase, die ein biolumineszentes
Enzym ist. Ein Akzeptoranteil könnte
ein grünfluoreszentes
Protein sein, wie es aus Renilla gewonnen wird.
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In
diesem Fall beträgt
die Donor-Emissionswellenlänge
480 nm und die Akzeptor-Emissionswellenlänge 520
nm.
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Wenn
ein Interferenzfilter verwendet wird, der eine Spitzen-Übertragungswellenlänge von
530 nm hat, dann hat der Blockierfilter bevorzugt eine Cut-Off-Wellenlänge von
515 nm – wie
z.B. ein Schott OG 515.
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Wenn
Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor auftritt, ist das zu
messende Emissionslicht die Akzeptoremission bei 520 nm.
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Wenn
kein Energietransfer stattfindet, tritt wenig oder gar keine Emission
von dem Akzeptor auf, sondern der Donor verliert Energie als Licht
auf seiner charakteristischen Emissionswellenlänge, in dem obigen Beispiel
480 nm.
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In
der Praxis werden sowohl 520 nm und 480 nm getrennt beobachtet,
und die relativen Proportionen der Wellenlängen werden gemessen.
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Da
der Energietransferprozess nicht zu 100% effizient ist, emittiert
der Donorkonstituent weiterhin Licht auf seiner charakteristischen
Wellenlänge
von 480 nm, und die Akzeptoremissionen müssen vor einem Donoremissionshintergund
gemessen werden. So müssen
in dem obigen Beispiel 520-nm-Wellenlängen-Emissionen vor einem Hintergrund
von Donoremissionen auf 480 nm gemessen werden.
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Erfolgreiches
Filtern wird üblicherweise
erreicht, indem ein Blockierfilter ausgewählt wird, der eine scharfe
Trennung zwischen Übertragung
und Abschwächung
sowie eine starke Abschwächung von
Wellenlängen
jenseits des Cut-Off-Punkts aufweist, und dieser (bei dem eine 50%-ige
Abschwächung
stattfindet) ist näher
bezüglich
der Lumineszenz als zu der Spitzen-Wellenlänge der nächstgelegenen Komponente von
unerwünschter
Strahlung.
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Beispiele
für Energietransfertests
wie Biolumineszenz- und Chemilumineszenztests finden sich in „Chemiluminescence:
Principles and Applications in Biology and Medicine" von A. K. Campbell.
1988. Herausgegeben von Ellis Harwood Ltd, Chichester, England.