DE69934689T2

DE69934689T2 - Verwendung der protein-kinase-c-epsilon-inhibitoren zur behandlung von schmerzen

Info

Publication number: DE69934689T2
Application number: DE69934689T
Authority: DE
Inventors: Robert O. Foster City Messing; Jon D. San Francisco Levine
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-06
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2019-07-07
Also published as: WO2000001415A3; EP1093379B1; IL140716A0; JP2002519391A; WO2000001415A2; CA2336709A1; NZ508767A; ES2283120T3; EP1093379A2; DE69934689D1; AU4863199A; AU764760B2; ATE350032T1

Description

Hintergrund
Für Betroffene wie auch für deren Familien, Gemeinschaften und Arbeitgeber ist Schmerz mehr als eine unbedeutende Unpässlichkeit – Schmerz ist eine schwere physische, emotionale, soziale und wirtschaftliche Belastung. Da alleine in den Vereinigten Staaten mehr als zwei Millionen Menschen aufgrund täglicher chronischer Schmerzen arbeitsunfähig sind, ist die Zahl jener Menschen und Rechtspersönlichkeiten, die diese Last tragen müssen, recht groß (T.M. Jessell & D.D. Kelly, Pain and Analgesia, in: Principles of Neural Science, 3. Auflage, E.R. Kandel, J.H. Schwartz, T.M. Jessell (Hrsg.) (1991)).
Leider sind gegenwärtige Schmerzbehandlungen nur zum Teil wirksam, und viele verursachen auch entkräftende oder gefährliche Nebenwirkungen. Zum Beispiel sind entzündungshemmende Nichtsteroid-Arzneimittel (NSAIDs), wie z.B. Aspirin, Ibuprofen und Indomethacin, nur mäßig wirksam gegen Entzündungsschmerzen, sie sind aber auch Nierentoxine, und hohe Dosen können gastrointestinale Irritation, Ulzeration, Blutung und Verwirrtheit verursachen. Patienten, die mit Opioiden behandelt werden, leiden häufig unter Verwirrtheit, und langfristige Opioidverwendung ist mit Toleranz und Abhängigkeit verbunden. Lokalanästhetika, wie z.B. Lidocain und Mixelitin, hemmen gleichzeitig Schmerzen und verursachen einen Verlust normaler Empfindungen. Daher besteht Bedarf für sichere und wirksame Schmerzbehandlungen.
Ein erhöhtes Verständnis der molekularen Grundlage von Schmerz trägt zur Entwicklung von Arzneimitteln gegen Schmerz bei. Schmerz ist insbesondere ein wichtiges Thema, weil Schmerz eine auf Signalen basierende Wahrnehmung ist, die aus der Umwelt erhalten werden und vom Nervensystem übertragen und interpretiert werden. Schädliche Reize, wie z.B. Hitze und Berührung, haben zur Folge, dass spezielle sensorische Rezeptoren in der Haut Signale an das Zentralnervensystem („ZNS") senden. Dieser Prozess wird Nozizeption genannt, und die peripheren sensorischen Neuronen, die diesen vermitteln, sind Nozizeptoren. Abhängig von der Stärke des Signals der Nozizeptoren und der Abstraktion und Entwicklung dieses Signals durch das ZNS kann eine Person einen schädlichen Reiz als schmerzhaft oder nicht schmerzhaft empfinden.
Während Schmerz nicht angenehm ist, ist er doch wichtig, da wir ohne ihn viele Umweltgefahren nicht wahrnehmen würden. Wenn unser Schmerzempfinden angemessen an die Intensität des Reizes angepasst wird, erfüllt Schmerz seine vorgesehene schützende Funktion. Jedoch verursachen bestimmte Formen von Gewebsschäden ein Phänomen, das als Hyperalgesie oder Pronozizeption bekannt ist, bei welchem relativ harmlose Reize als stark schmerzhaft empfunden werden, weil die Schmerzschwellen der Person herabgesetzt worden sind. Sowohl Entzündungen als auch Nervenschäden können Hyperalgesie auslösen. Daher leiden Personen, die unter Entzündungserkrankungen, wie Sonnenbrand, Osteoarthritis, Colitis, Carditis, Dermatitis, Myositis, Neuritis, Kollagenose (die rheumatoide Arthritis und Lupus umfassend) und dergleichen, leiden, oft unter verstärkten Schmerzempfindungen. Auf ähnliche Weise verursachen Trauma, Chirurgie, Amputation, Abszess, Kausalgie, Kollagenose, Entmarkungskrankheit, Trigeminusneuralgie, Krebs, chronischer Alkoholismus, Schlaganfall, Thalamussyndrom, Diabetes, Herpesinfektionen, erworbenes Imundefektsyndrom („AIDS"), Toxine und Chemotherapie Nervenschäden, die zu übermäßigen Schmerzen führen. Offensichtlich sind die herabgesetzten Schmerzschwellen, die für Hyperalgesie charakteristisch sind, auf die Art und Weise zurückzuführen, wie Nozizeptoren, die mit der Entzündung oder den geschädigten Nerven in Verbindung stehen, auf schädliche Reize reagieren. Würden die Mechanismen, durch welche Nozizeptoren externe Signale unter normalen Bedingungen und bei Hyperalgesie transduzieren, besser verstanden werden, könnten Prozesse identifiziert werden, die für Hyperalgesie einzigartig sind, die, wenn sie unterbrochen werden würden, die Herabsetzung der Schmerzschwelle hemmen könnten und dadurch das empfundene Schmerzausmaß verringern würden. Da eine solche Behandlung chronischen Schmerzes auf Ebene der sensorisch afferenten Neuronen wirkt, umgeht sie Probleme, die mit Arzneimitteln verbunden sind, die auf das ZNS wirken. Wenn die Behandlung einen Transduktionsweg beeinträchtigt, der für Nozizeptoren spezifisch ist und/oder in die Vermittlung anderer Signale nicht involviert ist, ist das Potenzial für Nebenwirkungen, die durch Behandlungen induziert werden, klein. Die vorliegende Beschreibung offenbart ein solches Verfahren zur Linderung von Schmerzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Beschreibung offenbart ein Verfahren zur Linderung von Schmerz, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Inhibitors des ε-Isozyms van Protein-Kinase C („PKCε") an ein Subjekt umfasst, das dies benötigt. Es ist auch die Verwendung eines PKCε-Inhibitors offenbart, um Hyperalgesie zu verringern, vorzugsweise ohne Nozizeption zu stören. Die Inhibitoren sind für PKGε selektiv, und es ist die lokale Verabreichung des Inhibitors bevorzugt. Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Messung der Fähigkeit von Verbindungen, Schmerz zu modulieren, wie in den Ansprüchen dargelegt, umfassend die Auswahl einer Testverbindung, welche die Aktivität von PKCε moduliert, und Verabreichung der Testverbindung an ein Subjekt in einem Tiermodell zur Bestimmung, ob Schmerz moduliert wird. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine wie in den Ansprüchen dargelegte pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Inhibitor von PKCε und ein Analgetikum umfasst, das kein Inhibitor von PKCε ist. Weitere Aspekte der Erfindung umfassen die Verwendung eines Modulators von PKCε zur Herstellung eines Medikaments, wie in den Ansprüchen dargelegt. Ein solches Medikament kann zur Behandlung von Schmerzen verwendet werden. Diese Erfindung dient in geeigneter Weise zur Behandlung von Subjekten, die akute oder chronische Schmerzen haben, die durch Neuropathien oder Entzündungserkrankungen verursacht sind.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Wirkung von α- und β-adrenergen Antagonisten, Sympathektomie und Prostaglandinsyntheseinhibitoren auf durch Epinephrin induzierte dosisabhängige Hyperalgesie als Reaktion auf mechanische Reize. Prozentuelles Sinken der nozizeyptiven Grenzwerte aufgrund der Injektion von 12, 10, 100 und 1000 ng Epinephrin nach (A) keiner Behandlung (Quadrate), Injektion von Prapranolol (Dreiecke), Injektion von Phentoiamin (gefüllte Kreise) und (B) Vortäuschen von Sympathektomie (Quadrate), Sympathektomie (Kreise) und Indomethacininjektion (auf den Kopf gestellte Dreiecke).
2. Latenz und Dauer von durch Epinephrin induzierter Hyperalgesie als Reaktion auf mechanische Reize. Prozentueller Rückgang nozizeptiver Grenzwerte bei angegebener Minutenzahl nach Injektion von 1 μg Epinephrin.
3. Wirkung von α- und β-adrenergen Antagonisten auf durch Isoproterenol induzierte Hyperalgesie als Reaktion auf mechanische Reize. Prozentuelles Sinken der nozizeptiven Grenzwerte aufgrund der Injektion von 1, 10, 100 und 1000 ng Isoproterenol nach keiner Behandlung (Quadrate), Injektion von Phentolamin (Rauten) und Injektion von Propranolol (Dreiecke).
4. (A) Spannungskurve aus einem kultivierten Ratten-DRG-Neuron mit kleinem Durchmesser vor und während Exposition gegenüber 1 μM Epinephrin. (B) Wirkung von 1 μM Epinephrin im Laufe der Zeit auf die Zahl von Wirkungspotenzialen (Quadrate) und Latenz gegenüber dem ersten Aktionspotenzial (Kreise) in einem anderen kultivierten Ratten-DRG-Neuron mit geringem Durchmesser.
5. Wirkung von (A) 1 μM Epinephrin oder (C) Isoproterenol auf den Tetrodotoxin-resistenten Peak-Natriumstrom („TTX-RI_Na-Strom"), (B) TTX-RI_Na- Strom-Spannungscharakteristiken für kein Epinephrin (nicht ausgefüllte Kreise) und 1 μM Epinephrin (ausgefüllte Kreise) im Zeitverlauf.
6. Wirkung von α- und β-adrenergen Antagonisten auf durch Epinephrin induzierte Potenzierung des TTX-RI_Na-Stroms. Normalisierter Einwärtsstrom im Zeitverlauf, mit alleiniger Perfusion von 1 μM Epinephrin (nicht ausgefüllte Kreise), 1 μM Epinephrin und Phentolamin (Dreiecke) und 1 μM Epinephrin und Propranolol (ausgefüllte Kreise).
7. Wirkung des PKA-Inhibitors auf durch Epinephrin induzierte Potenzierung des TTX-RI_Na-Stroms. Normalisierter Einwärtsstrom im Zeitverlauf mit alleiniger Perfusion von 1 μM Epinephrin (nicht ausgefüllte Kreise) oder Perfusion von 1 μM Epinephrin mit Rp-cAMPs, die in der aufzeichnenden Pipette gegenwärtig sind (ausgefüllte Kreise).
8. Wirkung des PKC-Inhibitors auf durch Epinephrin induzierte Potenzierung des TTXC-RI_Na-Stroms. Normalisierter Einwärtsstrom im Zeitverlauf mit alleiniger Perfusion von 1 μM Epinephrin (nicht ausgefüllte Kreise) oder Perfusion von 1 μM Epinephrin mit BIM-Vorbehandlung (ausgefüllte Kreise).
9. Mechanische, thermische und chemische Nozizeption und Hyperalgesie bei Wildtyp- und PKCε-Mutantenmäusen. (A) Die Reaktionen von Wildtyp- (diagonal gestreifte Balken) und PKCε-Mutantenmäusen (weiße Balken) auf mechanische Reize wurden durch Messung der Häufigkeit des Rückziehens der Pfote nach Freyhaar(VFH-) Stimulation mit einer Intensität von 4, 6,9 oder 14,8 g untersucht. Der VFH-Stimulation ging keine Behandlung („basal"), Epinephrininjektion oder PGE₂-Injektion voran. (B) Die Toleranz von Wildtyp- (diagonal gestreifte Balken) und PKCε-Mutantenmäusen (weiße Balken) auf thermische Reize wurde durch Messung der Länge der Exposition (in Sekunden) gegenüber einem 50-Watt-Strahlungswärmereiz vor dem Zurückziehen der Pfote bestimmt. Der Wärmestimulation ging keine Behandlung („basal"), Epinephrininjektion oder PGE₂-Injektion voran. (C) Die Fähigkeit intraperitonealer Essigsäureinjektion, abdominale Kontraktionen („Krümmungen") auszulösen, wurde Wildtyp- und PKCε-Mutantenmäuse („Knock-out"-Mäuse) untersucht wurden.
10. PKCε-Expression in Ratten-DRG-Neuronen und Haut; Inhibition in Ratten mit durch Epinephrin induzierter Hyperalgesie durch einen nicht-selektiven PKCε-Inhibitor und einen selektiven PKCε-Inhibitor. Ratten-DRG-Neuronen (A) und Haut (B und C) wurden mit PKCε-Antikörpern (A und B) und mit Antigen präabsorbiertem Antikörper (C) gefärbt. Balken = 50 μm (A, B und C); Ep = Epidermis, De = Dermis. Rat ten erhielten intradermale Injektionen von 100 ng Epinephrin („epi") oder 100 ng PGE₂ als Folge von Injektionen in den dorsalen Teil der Hinterpfote von (D) 1 μg Bisindolylmaleinimid-I („BIM") oder (E) sterilem Wasser gefolgt von entweder 1 μg εV1-2-Peptid („VIε1-2") oder 1 μg eines ungeordneten Konkurrenz-Peptids („S-VIε1-2"). Die Veränderung des nozizeptiven Grenzwerts wurde durch Messung der Reaktion auf Ugo-Basile-Stimulation getestet.
11. PKCε-Expression in den Neuronen der dorsalen Maus-Rückenmarkswurzelganglionen („DRG") (A und B) und dem Rückenmark (D und E). Wildtyp- (A und D) und PKCε-Mutanten- (B und E) Mausgewebe wurden mit Anti-PKCε-Antikörper inkubiert. Balken = 50 μm (A und B) oder 100 μm (D und E). (C) Größenhäufigkeitshistogramm von PKCε-exprimierenden und allen DRG-Neuronen.
12. Wirkung von PKCε-Inhibitoren auf Vincristin-induzierte Hyperalgesie (A) oder diabetesinduzierte Hyperalgesie (B) als Reaktion auf mechanische Reize. Prozentuelles Sinken der nozizeptiven Grenzwerte nach keiner Behandlung (weiße Balken), Injektion von PKCε-Hemmpeptid (diagonal gestreifte Balken), Injektion einer ungeordneten Version des Hemmpeptids (punktierte Balken) oder Injektion von Bisindolylmaleinimid-1 (umgekehrt diagonal gestreifte Balken).
13. Wirkung des PKCε-Inhibitors auf durch Carrageenan induzierte Hyperalgesie als Reaktion auf mechanische Reize. Die prozentuelle Abnahme der nozizeptiven Grenzwerte nach alleiniger Exposition gegenüber Carrageenan (weiße und diagonal gestreifte Balken – Hyperalgesie wurde 3 bzw. 4 Stunden nach Carrageenanverabreichung getestet), Exposition gegenüber Carrageenan und Injektion von PKCε-Hemmpeptid (umgekehrt diagonal gestreifter Balken) oder Exposition gegenüber Carrageenan und Injektion einer ungeordneten Version des Hemmpeptids (punktierter Balken). * zeigt signifikante Unterschiede an, p < 0,0001.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Proteinkinase („PKC") ist eine Multigenfamilie von phospholipidabhängigen Serin-Threoninkinasen, die für viele Signaltransduktionswege zentral sind. Molekulare Klonierungsstudien haben zehn Mitglieder der PKC-Familie identifiziert. Für diese Familienmitglieder, die Isozyme genannt werden, kodieren neun verschiedene Gene. Die zehn Isozyme werden α-, βI-, βII-, γ-, δ-, ε-, ζ-, η-, ι/λ- und θ-Isozyme genannt (Y. Nishizuka, Science 258, 607–614 (1992); L.A. Selbie, C. Schmitz-Pfeiffer, Y. Sheng, T.J. Biden, J. Biol. Chem. 268, 24296–24302 (1993)). Basierend auf der Sequenzhomologie und biochemischen Eigenschaften ist die PKC-Genfamilie in drei Gruppen unterteilt worden: (i) die „herkömmlichen" PKCs, die α-, βI-, βII- und γ-Isozyme, werden durch Kalzium, Diacylglycerin und Phorbolester reguliert; (ii) die „neuen" PKCs, die δ-, ε-, θ-, η-Isozyme, sind kalziumunabhängig, aber diacylglycerin- und phorbolesterempfindlich, und (iii) die „atypischen" PKCs, die ζ- und ι/λ-Isozyme, sind unempfindlich auf Kalzium, Diacylglycerin und Phorbol-12-myristat-13-acetat. Zusätzlich dazu teilen zwei verwandte phospholipidabhänge Kinasen, PKCμ und Proteinkinase-D, in ihren regulierenden Domänen Sequenzhomologie mit neuen PKCs und können eine neue Untergruppe bilden (F.-J. Johannes, J. Prestle, S. Eis, P. Oberhagemann, K. Pfizenmaier, Biol. Chem. 269, 6140–6148 (1994), A.M. Valverde, J. Sinett-Smith, J. Van Lint, E. Rozengurt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8572–8576 (1994)).
Es ist gängig, dass PKC-Familienproteine zentrale Rollen beim Zellwachstum und bei der Zelldifferenzierung spielen. PKCs vermitteln die Wirkung von Peptidhormonen, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern und Tumorpromotoren, indem sie als sekundäre Messenger (stromab, intrazellulär) für diese Signalmoleküle wirken (Y. Nishizuka, Science 233, 305–312 (1986), Y. Takai, K. Kaibuchi, T. Tsuda, M. Hoshijima, J. Cell. Biochem. 29, 143–155 (1985)). Es werden immer noch die Identitäten der PKC-Isozyme, die besondere Signale in spezifischen Zelltypen transduzieren, bestimmt. Die α-, βI- βII-, γ-, δ-, ε- und ζ-Isozyme sind in der Differenzierung nichtneutraler Zellen impliziert gewesen (E. Berra et al., Cell 74, 555–563 (1993), J. Goodnight, H. Mischak, J.F. Mushinski, Adv. Cancer Res. 64, 159–209 (1994); J.R.
Gruber. S. Ohno, R.M. Niles, J. Biol. Chem. 267, 13356–13360 (1992), D.E. Macfarlane, L. Manzel, J. Biol. Chem. 269, 4327–4331 (1994), C.T. Powell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 147–151 (1992)). Jüngste Studien, die zeigen, dass das ε-Isozym von PKC („PKCε") durch Nervenwachstumsfaktor („NGF") aktiviert wird und NGF-induzierten Neuritenauswuchs vermittelt, wurden so interpretiert, als dass sie eine Rolle für PKCε in der Neuronendifferenzierung angeben (B. Hundle et al., J. Biol. Chem. 272, 15028–15035 (1997)).
Eine der Hauptentdeckungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist der Beweis, dass ein spezifisches Isozym von PKC, pKCε, in primären afferenten Nozizeptoren wirkt, um bestimmte Formen von Hyperalgesie zu vermitteln. Insbesondere zeigen Mäuse, denen das funktionale PKCε-Protein fehlt („PKCε-Mutantenmäuse"), reduzierte Reaktionen auf Essigsäureinjektionen und verringerte epinephrininduzierte Hyperalgesie als Reaktion auf mechanische und thermische Reize. Die Verabreichung eines Peptids, das selektiv PKCε hemmt, verringert auch epinephrininduzierte Hyperalgesie, carrageenaninduzierte Hyperalgesie und Hyperalgesie, die mit Chemotherapie und Diabetes verbunden ist, als Reaktion auf mechanische Reize. Da das Ausmaß epinephrininduzierter Hyperalgesie bei Ratten, die mit einem nichtselektiven PKCε-Inhibitor behandelt wurden, und bei Ratten, die mit einem selektiven Inhibitor von PKCε behandelt wurden, ähnlich war, scheint PKCε das einzige PKC-Isozym zu sein, das epinephrininduzierte Hyperalgesie vermittelt. Auf ähnliche Weise scheint PKCε das grundlegende, aber nicht einzige PKC-Isozym zu sein, das diabetesassoziierte Hyperalgesie vermittelt, da das Ausmaß der diabetesassoziierten Hyperalgesie geringfügig niedriger war als bei Ratten, die mit einem nicht-selektiven PKCε-Inhibitor behandelt wurden.
Die Entdeckung, dass PKCε bestimmte Formen von Hyperalgesie vermittelt, war unerwartet. Obwohl es Beweise gab, dass die PKC-Familie von Proteinen zur diabetischen neuropathischen Hyperalgesie (S.C. Ahlgren, J.D. Levine, J. Neurophys. 72, 684–692 (1994)) und zur Bradykinin-induzierten Aktivierung und Sensibilisierung von Nozizeptoren beiträgt (S.M. McGuirk, A.C. Dolphin, Neuroscience 49, 117–28 (1992), L.M. Boland, A.C. Allen, R. Dingledine, J. Neurosci. 11, 1140–9 (1991)), waren die Rollen individueller PKC-Isozyme in diesen Prozessen unerforscht und unvorhersehbar.
Ein besonders nützlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass Inhibitoren von PKCε Hyperalgesie reduzieren können, ohne Nozizeption zu beeinflussen oder sensorische Wahrnehmung zu beeinträchtigen. Daher sollte eine Person, die einen PKCε-Inhibitor erhält, Erleichterung von übermäßigen Schmerzen erfahren, die durch schädliche Reize ausgelöst werden, während sie trotzdem in der Lage sein sollte, als Reaktion auf intensive Reize Schmerzen zu empfinden. Dieser Aspekt der Erfindung basiert auf Versuchen, die mechanische und thermische Reize verwenden, um zu zeigen, dass PKCε epinephrininduzierte Hyperalgesie und carrageenaninduzierte Hyperalgesie vermittelt, aber nicht in Nozizeption involviert ist (d.h. die Basisreaktion). Die reduzierte Krümmung, die bei PKCε-Mutantenmäusen zu beobachten ist, denen Essigsäure injiziert wird, im Vergleich zu Wildtypmäusen stimmt mit PKCε überein, die eine Rolle in entzündlicher Hyperalgesie, aber nicht in Nozizeption spielen. Die Theorie, dass Essigsäureinjektionen Entzündungen verursachen, die zu Hyperalgesie führen, wird durch Daten unterstützt, die zeigen, dass entzündungshemmende Arzneimittel (in diesen Fällen NSAIDs) das Ausmaß der Krümmung, die durch Essigsäureexposition induziert wird, hemmen (C.J. Niemegger, J.A. Van Bruggen und P.A. Janssen, Arzneimittelforschung 25, 1505–1509 (1975), R. Vinegar, J.F. Truax und J.L. Selph, Eur. J. Pharmacol. 37, 23–30 (1976); R. Bjorkman, Acta Anaesthesiol. Scand. Supp. 103, 1–44 (1995)). Die Tatsache, dass die Verabreichung eines selektiven Inhibitors von PKCε Hyperalgesie, die durch Carrageenan, ein gängiges Entzündungsmittel, verursacht ist, fast eliminiert, festigt weiters die Rolle von PKCε in der Vermittlung von entzündlicher Hyperalgesie.
Wie zuvor ausgeführt beschreibt die vorliegende Beschreibung die Verabreichung eines Inhibitors von PKCε, um Schmerzen zu reduzieren, zukünftige Schmerzen zu vermeiden und/oder erhöhte Empfindlichkeit auf schädliche Reize zu hemmen. Obwohl ein beliebiges Molekül, welches das PKCε-Isozym hemmt, ausreichend ist, um Schmerzen zu verringern, sind Moleküle, die das PKCε-Isozym selektiv hemmen, bevorzugt, da, wie durch PKCε-Mutantenmäuse gezeigt wird, eine Eliminierung von PKCε keine großen Entwicklungsanomalien oder ernsthafte Nebenwirkungen verursacht. Da Moleküle, die auch in der Lage sind, PKC-Isozyme zu hemmen, die keine PKCε sind, die verschiedene Funktionen, die von diesen Isozymen erfüllt werden, beeinflussen, haben solche nicht-selektiven Inhibitoren von PKCε, obwohl sie Schmerzen verringern, wahrscheinlich unerwünschte Nebenwirkungen.
Es gibt viele bekannte Inhibitoren von PKCε, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 5.783.405 eine große Zahl an Peptiden, die PKC-Isozyme hemmen. Davon sind die εV1-1, εV1-2, εV1-3, εV1-4, εV1-5 und εV1-6-Peptide für PKCε selektiv und bevorzugte Peptidinhibitoren. Peptid εV1-2 ist ein besonders bevorzugtes Hemmpeptid. Kleine Inhibitoren von PKC sind in US-Patent Nr. 5.141.957, 5.204.370, 5.216.014, 5.270.310, 5.292.737, 5.344.841, 5.360.818 und 5.432.198 beschrieben. Diese Moleküle gehören zu den folgenden Klassen: N,N'-Bis(sulfonamido)-2-amino-4-aminonaphthalin-1-one, N,N'-Bis(amido)-2-amino-4-aminonaphthalin-1-one; vicinal substituierte Carbocyclen, 1,3-Dioxanderivate, 1,4-Bis(aminohydroxyalkylamino)anthrachinone, Furocumarinsulfonamide, Bis(hydroxylalkylamino)anthrachinone, und N-Aminoalkylamide. Aufgrund ihrer relativen einfachen Verabreichung (zum Beispiel transdermale Verabreichung oder Verdau sind oft für kleine Moleküle durchführbar, jedoch nicht für Peptide), sind kleine Inhibitoren von PKCε gegenüber Peptidinhibitoren bevorzugt.
Zusätzliche Inhibitoren von PKCε können unter Einsatz von Tests identifiziert werden, welche die Aktivierung, die intrazelluläre Translokation, die Bindung an intrazelluläre Rezeptoren (z.B. RACKs) oder die katalytische Aktivität von PKCε messen. Traditionell ist die Kinaseaktivität von PKC-Familienmitgliedern unter Einsatz von zumindest teilweise gereinigten PKC in einer rekonstituierten Phospholipidumgebung mit radioaktivem ATP als Phosphatdonor und einem Histonprotein oder einem kurzen Peptid als Substrat getestet worden (T. Kitano, M. Go, U. Kikkawa, Y. Nishizuka, Meth. Enzymol. 124, 349–352 (1986); R.O. Messing, P.J. Peterson, C.J. Heinrich, J.
Biol. Chem. 266, 23428–23432 (1991)). Jüngste Verbesserungen umfassen einen raschen, höchst empfindlichen chemilumineszierenden Test, der Proteinkinaseaktivität in physiologischen Konzentrationen misst und automatisiert werden kann und/oder in Hochdurchsatz-Screeningverfahren verwendet werden kann (C. Lehel, S. Daniel-Issakani, M. Brasseur, B. Strulovici, Anal. Biochem. 244, 340–346 (1997)), und ein Test, der PKC in isolierten Membranen und ein selektives Peptidsubstrat verwendet, das vom MARCKS-Protein abstammt (B.R. Chakravarthy, A. Bussey, J.F. Whitfield, M. Sikorska, R.E. Williams, J.P. Durkin, Anal. Biochem. 196, 144–150 (1991)). Inhibitoren, welche die intrazelluläre Translokation von PKCε beeinflussen, können mithilfe von Tests identifiziert werden, in welchen die intrazelluläre Lokalisierung von PKCε durch Fraktionierung bestimmt wird (R.O. Messing, P.J. Peterson, C.J. Heinrich, J. Biol. Chem. 266, 23428–23432 (1991)), oder Immunhistochemie (US-Patent Nr. 5.783.405, US-Patentanmeldung Nummer 08/686.796). Zur Identifikation eines PKCε-Inhibitors sollte der Test mit PKCε durchgeführt werden. Die Selektivität solcher PKCε-Inhibitoren kann durch den Vergleich der Wirkung des Inhibitors auf PKCε mit seiner Wirkung auf andere PKC-Isozyme verglichen werden.
Da PKCε ein intrazelluläres Protein ist, umfassen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung pharmazeutisch annehmbare Inhibitorformulierungen, die in der Lage sind, die Plasmamembran zu durchdringen. Kleine, apolare Moleküle sind oft membrandurchlässig. Die Membrandurchlässigkeit anderer Moleküle kann durch eine Reihe von Verfahren verstärkt werden, die Fachleuten bekannt sind, umfassend deren Lösung in hypotonen Lösungen, die Bindung dieser an Transportproteine und die Verpackung in Mizellen.
PKCε-Inhibitoren können stündlich, mehrmals täglich, täglich oder so oft die Person Schmerz empfindet oder wie es der Arzt für richtig hält verabreicht werden. Vorzugsweise reicht der Verabreichungsintervall von 8 bis 24 Stunden. Es kann die Schwere der Schmerzen des Patienten berücksichtigt werden, wenn die geeigneten Intervalle für PKCε-Inhibitorbehandlungen bestimmt werden. PKCε-Inihibitorbehandlungen können über mehrere Tage, einen Monat, mehrere Monate, ein Jahr, mehrere Jahre oder über die Lebensdauer des Patienten fortgesetzt werden. Alternativ dazu können PKCε-Inhibitoren einmal täglich verabreicht werden, unter der Voraussetzung, dass davon ausgegangen wird, dass der Schmerz vorübergehend ist und nicht wieder erneut auftaucht. PKCε-Inhibitoren sollten in Mengen verabreicht werden, die ausreichend sind, um Schmerzen im Körper des Patienten zu reduzieren. Es versteht sich für den Fachmann, dass zunehmende Dosen von PKCε-Inhibitoren verabreicht werden sollten, bis der Patient eine Schmerzreduktion empfindet, und größere Dosen bringen keine größere Schmerzverbesserung. Die Verabreichung könnte so erfolgen, dass der Patient zukünftige Dosierungen von PKCε-Inhibitoren angepasst an das Ausmaß des Schmerzes, den er empfindet, kontrollieren kann.
Die Inhibitordosis variiert abhängig von vielen Parametern, einschließlich von der Natur des Inhibitors und vom Verabreichungsmodus. Für das εPKC-v1-Peptid hemmte eine intrazelluläre Konzentration von 150 μg/ml die PKCε-Translokation und Stromab-Wirkungen der PKCε-Aktivierung (US-Patent Nr. 5.783.405). Für PKC-Inhibitoren werden Tagesdosen im Bereich von 1 μg/kg–100 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 1 μg–1 mg/kg und am bevorzugtesten 10 μg/kg–1 mg/kg, in Erwägung gezogen, die N,N'-Bis(sulfonamido)-2-amina-4-aminonaphthalin-1-one oder N,N'-Bis(amido)-2-amino-4-aminonaphthalin-1-one sind. Tagesdosen im Bereich von 1 μg/kg–100 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 1 g/kg–40 mg/kg Körpergewicht und am bevorzugtesten 10 μg/kg–20 mg/kg, werden für PKC-Inhibitoren in Erwägung gezogen, die vicinal substituierte Carbocyclen sind. Tagesdosen im Bereich von 5–400 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10–200 mg/kg und noch bevorzugter 10–50 mg/kg, werden für PKC-Inhibitoren in Erwägung gezogen, die 1,4-Bis(aminohydroxylalkylamino)anthrachinone, Bis(hydroxylalkylamino)anthrachinone oder N-Aminoalkylamide sind. Tagesdosen im Bereich von 0,1–40 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 1–20 mg/kg, werden für PKC-Inhibitoren in Erwägung gezogen, die 1,3-Dioxanderivate sind. Tagesdosen im Bereich von 1–100 mg/kg Körpergewicht werden für PKC-Inhibitoren angestrebt, die Furocumarinsulfonamide sind.
PKC-Inhibitoren können lokal nahe der Entzündungsstelle oder des peripheren Nervenschadens verabreicht werden. Eine solche lokale Verabreichung kann eine topische, intradermale oder subkutane Injektion sein. Die systemische Verabreichung eines PKCε-Inhibitors stellt eine andere Ausführungsform der Erfindung dar. Orale und intravenöse Injektion sind bevorzugte Wege systemischer Verabreichung. Da PKCε Schmerzen auf Ebene peripherer Nozizeptoren zu modulieren scheint und andere Funktionen im Gehirn ausführen kann, ist die lokale Verabreichung von PKCε-Inhibitoren bevorzugter als die systemische Verabreichung, da die lokale Verabreichung Schmerzen in der Nachbarschaft mit minimalen schädlichen Wirkungen auf die PKCε-Aktivität an entfernten Stellen behandeln sollte. Die in der Beschreibung beschriebenen Verfahren sind für die Behandlung von Säugetieren im Allgemeinen und Menschen im Besonderen zweckdienlich.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verabreichung einer pharmazeutisch annehmbaren Formulierung eines Inhibitors von PKCε umfassen. Eine „pharmazeutisch annehmbare Formulierung" umfasst eine, die zur Verabreichung des PKCε-Inhibitors auf eine Art und Weise geeignet ist, welche die erwünschten Ergebnisse erbringt und nicht auch negative Nebenwirkungen produziert, die ausreichend sind, um einen Arzt davon zu überzeugen, dass der potenzielle Schaden für einen Patienten größer ist als der potenzielle Nutzen für diesen Patienten. Der Hauptinhaltsstoff für eine injizierbare Formulierung ist ein Wasserträger. Das verwendete Wasser wird von einer Reinheit sein, die USP-Standards für steriles Wasser zu Injektionszwecken erfüllt. Nützliche wässrige Träger umfassen Natriumchlorid-(NaCl-) Lösung; Ringer-Lösung, NaCl/Dextrose-Lösung und dergleichen. Wasser-mischbare Träger dienen auch dazu, eine vollständige Löslichkeit des PKCε-Inhibitors zu erreichen. Antimikrobielle Wirkstoffe, Puffer und Antioxidanzien sind zweckdienlich, abhängig vom Bedarf.
Bei der Herstellung von PKCε-Inhibitorzusammensetzungen für diese Erfindung können die Standard-Empfehlungen bekannter wissenschaftlicher Quellen befolgt werden, wie z.B. Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY; 19. Auf lage, Mack Publishing (1995). Im Allgemeinen ist die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung eine pulver- oder wasserbasierte mit zugegebenen Exzipienten, die zur Löslichkeit des PKCε-Inhibitors, der Isotonizität der Zusammensetzung, der chemischen Stabilität und der Abschreckung des Wachstums von Mikroorganismen beitragen. Zur oralen Verabreichung ist es bevorzugt, Substanzen aufzunehmen, die den PKCε-Inhibitor vor Abbau durch Verdaumittel schützen.
Die Erfindung kann zur Behandlung eines Patienten mit Entzündungsschmerzen verwendet werden. Solche Entzündungsschmerzen können akut oder chronisch und auf eine Reihe von Leiden zurückzuführen sein, die durch Entzündung charakterisiert sind, einschließlich von unter anderem Sonnenbrand, rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Colitis, Carditis, Dermatitis, Myositis, Neuritis und Kollagenose. Diese Anwendung der Erfindung basiert auf Versuchen, die zeigen, dass die Verabreichung eines PKCε-Inhibitors sowohl akute als auch chronische Hyperalgesie signifikant verringert, die aus der Exposition gegenüber dem Entzündungsmittel Carrageenan resultiert. Die Tatsache, dass PKCε-Inhibitoren chronische Hyperalgesie wirksam reduzieren, wenn sie lange Zeit nach dem Entzündungsmittel verabreicht werden (in diesen Versuchen Carrageenan), zeigt, dass bei Personen, die lange Zeit unter Schmerzen gelitten haben, die mit Entzündungserkrankungen verbunden sind, wie z.B. den oben angeführten, sich nach Verabreichung eines Inhibitors von PKCε zumindest zum Teil eine Linderung der Schmerzen einstellen soll. Zusätzlich dazu kann die Verabreichung eines PKCε-Inhibitors an ein Subjekt kurz vor, während oder nach einem Entzündungsereignis sowohl akute Schmerzen als auch chronische Hyperalgesie verbessern, unter welchen das Subjekt andererseits leiden würde.
Die Erfindung kann auch bei Patienten mit neuropathischen Schmerzen verwendet werden. Solche Patienten können eine Neuropathie haben, die als Radikulopathie, Mononeuropathie, Mononeuropathiemultiplex, Polyneuropathie oder Plexopathie klassifiziert werden. Erkrankungen in diesen Klassen können durch eine Vielzahl von nervenschädigenden Leiden oder Verfahren verursacht sein, einschließlich von unter anderem Trauma, Schlaganfall, Entmarkungskrankheit, Abszess, Chirurgie, Amputa tion, Entzündungserkrankungen der Nerven, Kausalgie, Diabetes, Kollagenose, Trigeminusneuralgie, rheumatoider Arthritis, Toxinen, Krebs (die direkten oder entfernten (z.B. paraneoplastischen) Nervenschaden verursachen können), chronischem Alkoholismus, Herpesinfektion, AIDS und Chemotherapie. Nervenschaden, der Hyperalgesie verursacht, kann in peripheren oder ZNS-Nerven auftreten. Diese Anwendung der Erfindung basiert auf Versuchen, die zeigen, dass die Verabreichung eines PKCε-Inhibitors Hyperalgesie aufgrund von Diabetes, Chemotherapie oder traumatischen Nervenschäden signifikant verringert.
Es wird angenommen, dass Inhibitoren von PKCε durch die Beeinflussung der PKCε-Funktion in sensorisch afferenten Neuronen (auch als Nozizeptoren oder primäre afferente Neuronen bekannt) Schmerzen verringern. Diese Neuronen, eine Teilmenge von Dorsalwurzelganglionneuronen („DRG-Neuronen") mit kleinem oder mittlerem Durchmesser, erstrecken sich von der Dermis, wo sich ihre peripheren Enden befinden, zu den oberflächlichen Schichten des Dorsalhorns, wo sie mit ZNS-Neuronen Synapsen bilden. Bei sensorischen afferenten Neuronen wird davon ausgegangen, dass PKCε ein sekundärer Messenger ist, der eine Reaktion transduziert, die von einem schädlichen Reiz oder einem hyperalgesie-induzierenden Mittel ausgelöst wird.
Einige dieser Beobachtungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, wurden in Versuchen angestellt, in welchen Hyperalgesie durch intradermale Injektion von Epinephrin in die Hinterpfote einer Maus oder Ratte induziert wurde. Epinephnninduzierte Hyperalgesie ist ein Modellsystem für das Studium natürlich auftretender Hyperalgesie, und die klinische Relevanz dieses Systems wird durch die Tatsache unterstützt, dass die lokale Verabreichung von Epinephrin bei Patienten mit neuropathischen Schmerzen die Symptome verschlimmert (B. Choi, M.C. Rowbotham, Pain 69, 55–63 (1997)) und dass Epinephrin in Abwesenheit von apparenter Ischämie Anginaschmerzen verursacht (B. Eriksson et al., Am. J. Cardiol. 75, 241–245 (1995)). Epinephrin verursacht dosisabhängige mechanische und thermische Hyperalgesie in sensorischen Nervenenden in der Haut durch Bindung an β-adrenerge Rezeptoren auf diesen Nervenenden. Die β-adrenergen Rezeptoren, die durch Epinephrin ge bunden sind, aktivieren hingegen zwei unabhängige zweite Messenger-Wege, den PKC-Weg und den Weg via zyklischer AMP („cAMP")-Proteinkinase-A („PKA"). Obwohl epinephrininduzierte Hyperalgesie nicht durch Prostaglandin verursacht ist, verstärken sowohl Epinephrin als auch Prostaglandin E₂ („PGE₂") den tetrodotoxinresistenten Natriumstrom (TTX-RI_Na), der für eine durch einen Entzündungsmediator induzierte Hyperalgesie und Nozizeptorensensibilisierung wichtig ist. Da PKC-Inhibitoren die Wirkung von Epinephrin auf diesen Strom reduzieren, kann TTX-RI_Na ein Ziel von PKC sowie PKA sein.
Die direkte Wirkung von Epinephrin auf primäre sensorische afferente Neuronen steht im Gegensatz zu anderen Hyperalgesie-induzierenden Mitteln, die diese Neuronen indirekt sensibilisieren. Zum Beispiel beeinflussen Bradykinin und Norepinephrin Nozizeptoren, indem verursacht wird, dass intermediäre Zellen Prostaglandine freisetzen, die auf Nozizeptoren wirken, und indem bewirkt wird, dass sympathische Neuronen Signale an Nozizeptoren senden (N.Y. Andreev, N. Dimitrieva, M. Koltzenburg, S.B. McMahon, Pain 63, 109–115 (1995), S.H: Ferreira et al., Brit. J. Pharmacol. 121, 883–888 (1997); Y.O. Taiwo, P.H. Heller, J.D. Levine, Neuroscience 39, 523–531 (1990)). Die Tatsache, dass weder die Hemmung von Prostaglandinsynthese noch die Sympathektomie der Hinterpfote (Eliminierung der sympathischen Innervation der Hinterpfote) jegliche Wirkung auf die Fähigkeit von Epinephrin zeigt, Hyperalgesie zu induzieren, zeigt, dass der einzige Wirkmodus von Epinephrin direkt ist. Die direkten Wirkungen von Epinephrin auf den primären afferenten Nozizeptor stellen weitere Beweise bereit, dass dies ein gutes Modell ist, um den Beitrag des PKC-Isozyms/der PKC-Isozyme zu untersuchen, die in der nozizeptiven Signalgebung involviert sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Messung der Fähigkeit einer Verbindung, Schmerzen zu modulieren, indem als Testverbindung eine Verbindung ausgewählt wird, welche die Aktivität von PKCε moduliert, und diese Testverbindung an ein Subjekt verabreicht wird, um zu bestimmen, ob Schmerzen moduliert werden können, wie in den Ansprüchen dargelegt. Vorzugsweise hemmt die Verbindung die Aktivität von PKCε. Das Subjekt ist ein Tier, das häufig in der Schmerzforschung und/oder -entwicklung eingesetzt wird. Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Aktivität von PKCε zu hemmen, kann mit geeigneten Tests bestimmt werden, welche die Funktion von PKCε messen. Zum Beispiel können Reaktionen, wie z.B. ihre Aktivität, z.B. Enzymaktivität, oder die Fähigkeit von PKCε, sein(e) Liganden, Adaptermolekül oder Substrat zu binden, in In-vitro-Tests bestimmt werden. Es können Zelltests entwickelt werden, um eine Modulierung einer Produktion eines zweiten Messengers, Veränderungen im Zellmetabolismus oder Wirkungen auf die Enzymaktivität zu überwachen. Diese Tests können unter Einsatz herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, die für diese Zwecke entwickelt werden. Letztendlich kann die Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung der Funktion von PKCε in geeigneten Tiermodellen in vivo gemessen werden.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wie in den Ansprüchen dargelegte Zusammensetzung, die einen Inhibitor von PKCε mit einem oder mehreren zusätzlichen schmerzreduzierenden Mitteln kombiniert. Eine individuelle Schmerzmedikation stellt oft nur teilweise wirksame Schmerzlinderung bereit, weil sie nur einen schmerztransduzierenden Weg von vielen beeinflusst. Zum Beispiel zeigen hierin präsentierte Versuche, dass PKCε und PKA beide sekundäre Messenger von epinephrininduzierter Hyperalgesie sind. Es kann wirksamer auf den mit dieser Form von Hyperalgesie verbundenen Schmerz abgezielt werden, indem sowohl PKCε als auch PKA gehemmt werden, als dadurch, PKCε alleine zu hemmen. Alternativ dazu können PKCε-Inhibitoren in Kombination mit einem schmerzreduzierenden Mittel (Analgetikum) verabreicht werden, das an einem anderen Punkt im Schmerzwahrnehmungsprozess wirkt. Ein PKCε-Inhibitor kann Schmerz durch Änderung der Reaktionen von Nozizeptoren auf schädliche Reize minimieren. Eine Klasse von Analgetika, wie z.B. NSAIDs, reguliert die chemischen Messenger der Reize herab, die durch die Nozizeptoren detektiert werden, und eine andere Klasse von Arzneimitteln, wie z.B. Opioide, verändert die Verarbeitung von nozizeptiver Information im ZNS. Andere Analgetika sind Lokalanästhetika, Antikonvulsiva und Antidepressiva. Die Verabreichung von einer oder mehreren Klassen von Arzneimitteln zusätzlich zu PKCε-Inhibitoren kann eine wirksamere Linderung von Schmerzen be reitstellen. NSAIDs sind bevorzugte Komponenten der Zusammensetzung der Erfindung. Bevorzugte NSAIDs sind Aspirin, Acetaminophen, Ibuprofen und Indomethacin.
Der Begriff „Schmerzlinderung" umfasst wie hierin verwendet ein Verfahren, durch welches das Ausmaß des Schmerzes, das ein Subjekt wahrnimmt, im Verhältnis zum Ausmaß des Schmerzes, welches das Subjekt ohne Intervention wahrgenommen hätte, reduziert wird. Wo das Subjekt eine Person ist, kann das Ausmaß des Schmerzes, welches die Person wahrnimmt, beurteilt werden, indem sie befragt wird oder gebeten wird, den Schmerz zu beschreiben oder ihn mit anderen schmerzhaften Erlebnissen zu vergleichen. Alternativ dazu können die Ausmaße von Schmerzen kalibriert werden, indem die physischen Reaktionen von Subjekten auf Schmerz gemessen werden, wie z.B. die Freisetzung von mit Stress verbundenen Faktoren oder die Aktivität von schmerztransduzierenden Nerven im peripheren Nervensystem oder im ZNS. Es können auch Schmerzspiegel kalibriert werden, indem die Menge eines gut charakterisierten Analgetikums gemessen wird, das erforderlich ist, sodass eine Person berichten kann, dass kein Schmerz vorliegt, oder dass ein Subjekt keine Schmerzsymptome mehr zeigt. Schmerzlinderung kann aus dem Anstieg des Grenzwerts resultieren, bei welchem ein Subjekt einen bestimmten Reiz als schmerzhaft empfindet. Diese kann aus der Inhibition von Hyperalgesie, der erhöhten Sensibilität auf einen schädlichen Stimulus, resultieren, und eine solche Inhibition kann auftreten, ohne die Nozizeption, die normale Sensibilität eines Subjekts auf einen gefährlichen Reiz, zu beeinträchtigen.
„Ein Subjekt, das dies benötigt", umfasst ein Tier oder eine Person, vorzugsweise eine Person, von der erwartet wird, dass sie in der nahen Zukunft Schmerz empfindet. Ein solches Tier oder eine solche Person kann ein andauerndes Leiden haben, das derzeit Schmerz verursacht und wahrscheinlich weiterhin Schmerz verursachen wird, oder das Tier oder die Person ist andauernd von einem Verfahren oder einem Ereignis betroffen gewesen, ist derzeit oder wird andauernd darunter leiden, das üblicherweise schmerzhafte Folgen hat. Chronische schmerzhafte Leiden wie z.B. diabetische neuropathische Hyperalgesie und Kollagenose sind Beispiele für die erste Form; dentale Arbeit, insbesondere im Bereich einer Entzündung oder eines Nervenschaden, und Toxinexposition (einschließlich Exposition gegenüber Chemotherapeutika) sind Beispiele für Letzteres.
„Eine wirksame Menge" umfasst eine Menge, die zu einer Schmerzlinderung führt. Eine solche wirksame Menge variiert von Subjekt zu Subjekt, abhängig von der normalen Empfindlichkeit des Subjekts auf Schmerz, von der Größe, vom Gewicht, Alter, von der Gesundheit und Schmerzquelle, vom Verabreichungsmodus des Inhibitors von PKCε, von dem speziellen verabreichten Inhibitor und anderen Faktoren. Als Folge ist es ratsam, unter einer bestimmten Reihe von Umständen empirisch eine wirksame Menge für ein bestimmtes Subjekt zu bestimmen.
„Ein Inhibitor des ε-Isozyms von Proteinkinase-C (PKCε)" umfasst ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen, die Folgendes beeinflussen: (1) die Expression, Modifikation, Regulierung oder Aktivierung von PKCε, (2) eine oder mehrere normale Funktionen von PKCε oder (3) die Expression, Modifikation, Regulierung oder Aktivierung eines Moleküls, das stromab von PCKε in einem PKCε-abhängigen Weg wirkt. Die normalen Funktionen von PKCε, wovon viele aktivierungsabhängig sind, umfassen die Phosphorylierung von Substraten (d.h. die katalytische Aktivität von PKCε), Autophosphorylierung, Bewegung von einem intrazellulären Ort zu einem anderen nach Aktivierung (d.h. intrazelluläre Translokation) und Bindung an ein oder mehrere Protein oder Freisetzung aus einem oder mehreren Proteinen, die PKCε an einem bestimmten Ort verankern. Ein Inhibitor von PKCε kann auch andere Isozyme von PKC hemmen. Jedoch hemmt ein selektiver Inhibitor von PKCε signifikant eine oder mehrere Funktionen von PKCε in einer Konzentration, bei welcher die anderen Isozyme von PKC nicht signifikant gehemmt werden. Ein Inhibitor „wirkt direkt auf PKCε", wenn der Inhibitor sich über elektrostatische oder chemische Wechselwirkungen an PKCε bindet. Solche Wechselwirkungen können durch andere Moleküle vermittelt werden, müssen aber nicht. Ein Inhibitor wirkt „indirekt auf PKCε", wenn die unmittelbarste Wirkung auf ein Molekül erfolgt, ein anderes als PKCε, das die Expression, Aktivierung oder Funktionsweise von PKCε oder die Stromab-Wirkungen von PKCε beeinflusst.
Eine Verbindung oder ein Molekül „moduliert die Aktivität von PKCε", wenn es (1) eine oder mehrere normalen Funktionen von PKCε beeinflusst oder (2) die Expression, Modifikation, Regulierung, Aktivierung oder den Abbau von PKCε oder einem Molekül beeinflusst, das stromauf von PKCε in einem regulierenden oder enzymatischen Weg wirkt. Die normalen Funktionen von PKCε, wovon viele aktivierungsabhängig sind, umfassen die Phosphorylierung von Substraten (d.h. die katalytische Aktivität von PKCε), Autophosphorylierung, die Bewegung von einem intrazellulären Ort zu einem anderen nach Aktivierung (d.h. intrazelluläre Translokation) und Bindung an ein oder mehrere Protein oder Freisetzung aus einem oder mehreren Proteinen, die PKCε an einem bestimmten Ort verankern.
Der Unterschied zwischen „akutem" und chronischem" Schmerz liegt im Timing: akuter Schmerz wird bald (bevorzugt innerhalb von 48 Stunden, noch bevorzugter innerhalb von 24 Stunden und am bevorzugtesten innerhalb von 12 Stunden) nach Auftreten des Ereignisses (wie z.B. Entzündung oder Nervenschaden), das zu einem solchen Schmerz führt, wahrgenommen. Hingegen gibt es eine signifikante Verzögerung zwischen dem Empfinden des chronischen Schmerzes und dem Auftreten des Ereignisses, das zu einem solchen Schmerz führt. Eine solche Verzögerung erfolgt zumindest etwa 48 Stunden nach einem solchen Ereignis, vorzugsweise zumindest etwa 96 Stunden nach einem solchen Ereignis, noch bevorzugter zumindest etwa eine Woche nach einem solchen Ereignis.
„Neuropathischer Schmerz" umfasst Schmerz, der aus Leiden oder Ereignissen entsteht, die zu Nervenschäden führen. „Neuropathie" umfasst einen Krankheitsprozess, der zu einem Nervenschaden führt. „Kausalgie" bezeichnet einen Zustand chronischen Schmerzes nach Nervenschaden oder ein Leiden oder ein Ereignis, wie z.B. Herzinfarkt, das den damit verbundenen Schmerz auslöst. „Allodynie" umfasst ein Leiden, bei welchem eine Person Schmerz als Reaktion auf einen normalen nicht schmerzhaften Reiz empfindet, wie z.B. eine sanfte Berührung. Ein „Analgetikum" umfasst ein Molekül oder eine Kombination von Molekülen, das/die eine Schmerzreduktion verursachen. Ein Analgetikum verwendet einen anderen Wirkmechanismus als die Hemmung von PKCε, wenn sein Wirkmechanismus keine direkte (über elektrostatische oder chemische Wechselwirkungen) Bindung an und Reduktion der Funktion von PKCε oder jedes beliebigen intrazellulären Moleküls im PKCε-Weg umfasst.
Die spezifischen in den vorangegangenen Definitionen erwähnten Punkte repräsentieren bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Epinephrininduzierte Hyperalgesie ist prostaglandinunabhängig und wird durch β-adrenerge Rezeptoren, PKC, Proteinkinasa-A und μ-Opioidrezeptoren vermittelt
Wie in 1A dargestellt produzierten intradermale Injektionen von 1 ng bis 1 μg Epinephrin in die dorsale Oberfläche der Hinterpfote einer Ratte ein dosisabhängiges Sinken (F = 90,7, p < 0,01) des Grenzwerts, bei welchem die Ratte die Pfote als Reaktion auf die Anwendung einer linear ansteigenden mechanischen Kraft durch den Ugo-Basile-Analgesiemeter (Stoelting, Chicago, Illinois) zurückzog. Die Anfangslatenz dieser epinephrininduzierten Hyperalgesie war kurz – sie war nach 2 Minuten nach einer Injektion von 1 μg Epinephrin signifikant, erreichte eine Peakwirkung nach 5 Minuten (2A) und hielt etwa 2 Stunden an (2B).
Da Epinephrin eine Affinität für sowohl α- als auch β-adrenegre Rezeptoren („α-AR" bzw. „β-AR") aufweist, wurde der Beitrag von α-AR zu epinephrininduzierter Hyperalegsie unter Einsatz von Phentolamin, einem α-AR-Antagonisten, getestet. Frühere Studien zeigten, dass eine ähnliche Dosis von Phentolamin keine Wirkung auf den basalen Pfotengrenzwert bei einer normalen Ratte hatte, aber formalininduzierte Hy peralgesie signifikant umkehrte und die Fähigkeit von Rolipram, einem Inhibitor von Typ-IV-Phosphodiesterae, hemmte, um PGE₂-induzierte Hyperalgesie zu verlängern (J.D. Levine et al., Nature 323, 158–160 (1986); A.K. Ouseph et al., Neurosci. 64, 769–776 (1995)). Jedoch beeinflusste Phentolmain epinephrininduzierte Hyperalgesie nicht signifikant (1A), was zeigt, dass α-AR die Hyperalgesiewirkungen von Epinephrin nicht vermittlete.
Zur Untersuchung der Rolle von β-AR in epinephrininduzierter Hyperalgesie wurden Propranolol, ein β-AR-Antagonist, und Isoproterenol, ein selektiver β-AR-Agonist, mittels intradermaler Injektion verabreicht. Isoproterenol produzierte dosisabhängige Hyperalgesie bei Abwesenheit von Epinephrin (3). Propranolol schwächte signifikant sowohl Hyperalgesie, die durch Isoproterenol verursacht ist, als auch jene ab, die durch Epinephrin verursacht ist (3 bzw. 1A). Daher produziert Epinephrin durch Aktivierung von β-AR Hyperalgesie.
Es ist bekannt, dass Bradykinin und Norepinephrin indirekt Hyperalgesie verursachen, indem ausgelöst wird, dass andere Zellen Prostaglandine produzieren, die eine sensibilisierende Wirkung auf primäre afferente Neuronen haben, und durch Stimulierung sympathischer Neuronen, welche Nozizeptoren beeinflussen (J.D. Levine et al., Nature 323, 158–160 (1986); Y.O. Taiwo, P.H. Heller, J.D. Levine, Neurosci. 39, 523–531 (1990)). Zum Testen, ob Epinephrin auch indirekt Hyperalgesie verursacht, wurde die Prostaglandinsynthese durch kontinuierliche Behandlung mit 4 mg/kg Indomethacin (n = 8) gehemmt, und der Beitrag sympathischer Neuronen wurde durch Sympathektomie (n = 8) eliminiert. Weder Indomethacinbehandlung noch Sympathektomie zeigten irgendeine Wirkung auf die Fähigkeit von Epinephrin, Hyperalgesie zu induzieren (1B). Dies lässt vermuten, dass Epinephrin direkt auf nozizeptive DRG-Neuronen wirkt.
Die Rollen von PKC, Proteinkinase-A („PKA") und dem μ-Opioidrezpetor in der Vermittlung von epinephrininduzierter Hyperalgesie wurden durch Messung der Wirkungen von Folgendem beurteilt: Rp-Adenosin-3', zyklisches 5'-Monophosphat („Rp- cAMPs") und WIPTIDE, beides Inhibitoren von PKA; SQ22536, ein Inhibitor von Adenylylcyclase, einem Enzym, das durch PKA aktiviert wird; Bisindolylmaleinimid („BIM"), ein nicht-selektiver Inhibitor von PKC-Isozymen; und [D-Ala²,N-Me-Phe⁴,Gly⁵-ol]enkephalin („DAMGO"), μ-Opioidrezeptoragonist. Die Dosis für jeden Inhibitor betrug 1 μg, mit der Ausnahme von WIPTIDE, das in einer 100-ng-Dosis verabreicht wurde. DAMGO wurde gemeinsam mit Epinephrin co-injiziert, während die anderen Inhibitoren 15 Minuten vor Epinephrininjektion angewendet wurden. Wie in Tabelle 1 dargestellt linderten alle diese Inhibitoren epinephrininduzierte Hyperalgesie signifikant, was zeigte, dass epinephrinvermittelte Hyperalgesie durch PKC- und PKA-Wege und durch μ-Opioidrezeptoren vermittelt wird. Dieselbe Dosis von BIM zeigte keine Wirkung auf PGE₂-induzierte Hyperalgesie, aber linderte isoproterenolinduzierte Hyperalgesie. Hingegen linderte dieselbe Dosis WIPTIDE auch PGE₂-induzierte Hyperalgesie und vernichtete isoproterenolinduzierte Hyperalgesie fast vallständig. Dies zeigt eine Rolle für PKA sowohl bei prostaglandin- als auch β-AR-vermitteiter Hyperalgesie und eine Rolle für PKC, allerdings nur bei Letzterer.
TABELLE 1: Prozentuelles Sinken des nozizeptiven Grenzwerts als Reaktion auf Epinephrin, PGE₂ oder Isoproterenol (jeweils 100 ng) und Wirkungen von DAMGO, SQ22536, BIM, Rp-cAMPs (alle 1 μg) oder WIPTIDE (0,1 μg). Ein großer Zahlenwert bedeutet mehr Hyperalgesie.

* Signifikanter Unterschied zu Epinephrin alleine (P < 0,01).
*† Signifikanter Unterschied zu Isoproterenol alleine (P < 0,01).
** Signifikanter Unterschied zu PGE₂ alleine (P < 0,01).
§ PGE₂-Daten aus S.G. Khasar et al., Neurosci. 64, 1161–1165 (1995), oder Y.O. Taiwo und J.D. Levine, Neurosci. 44, 131–135 (1991), mit der Ausnahme von BIM und WIPTIDE.

Beispiel 2. Epinephrin verursacht epinephrininduzierte Hyperalgesie durch direkte Wirkung auf primäre afferente Nozizeptoren
Zum Testen, ob epinephrininduzierte Hyperalgesie, die unter Einsatz von Verhaltensmodellen gemessen wird, auf die direkte Wirkung von Epinephrin auf primäre afferente Nozizeptoren zurückzuführen ist, wurden Patch-Clamp-Versuche mit ganzen Zellen auf dissoziierten DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser innerhalb von 12–24 Stunden Plattierung durchgeführt. Es wurde zuvor gezeigt, dass diese Neuronen als Modell für periphere Nozizeptorterminals dienen (P.I. Baccaglini und P.G. Hogan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 594–598 (1983); S. Pitchford und J.D. Levine, Neurosci. Let. 132, 105–108 (1991), S. England et al., J. Physiol. London 495, 429–440 (1996), M.S. Gold et al., Neurosci. 71, 265–275 (1996)).
„Current-Clamp"-Aufzeichnungen wurden unter Einsatz des „Perforated-Patch-Whole-Cell"-Verfahrens durchgeführt. Die Zahl der Wirkpotenziale, die während einer depolarisierenden Strominjektion von 750 ms mit einem Anstieg und Plateau („ramp and plateau") erzeugt wurden, sowie die Latenz bis zum ersten Spike wurden als Maß für die Reizbarkeit verwendet. Nach 5–10 Minuten der Basislinienaufzeichnung wird dem Bad Epinephrin (1 μM) zugegeben. 4A zeigt Spannungskurven aus einem typischen Neuran vor und während Exposition gegenüber 1 μM Epinephrin, während 4B den Zeitverlauf von Veränderungen der Zahl von Wirkpotenzialen zeigt und die Latenz bis zum ersten Wirkpotenzial für eine andere Zelle. Für 11 Neuronen, die mit 1 μM Epinephrin behandelt wurden, betrug die durchschnittliche Zahl von Wirkpotenzialen, die als Reaktion auf „Current-Ramp-and-Plateau" erzeugt wurden, 1,7 ± 0,2 vor Zugabe von Epinephrin und 5,3 ± 0,9 fünf Minuten oder mehr nach dem Beginn der Arzneimittelperfusion (p < 0,005). Wenn kein Epinephrin vorhande war, betrug die mittlere Latenz vom Start der Strom-Injektion bis zum Peak des ersten Spikes 278 ± 42 ms, nach Epinephrinperfusion betrug die mittlere Latenz 189 ± 21 ms (n = 11, p < 0,05). Neun (81 %) der 11 getesteten Neuronen zeigten einen Anstieg der Spike-Zahl und 5 (45 %) dieser Neuronen zeigten auch einen Rückgang der Spike-Latenz von zumindest 50 ms. Das mittlere Ruhepotenzial blieb von Epinephrin unbeeinflusst.
Die Tatsache, dass die Zugabe von 10 μM Propranolal 30 Sekunden vor und mit 1 μM Epinephrin den Anstieg der Spikezahl (1,2 ± 0,1 vor und 1,3 ± 0,2 nach Epinephrinzugabe, n = 7, p < 0,05) und den Rückgang der Latenz des ersten Spikes (235 ± 9 ms vor und 233 ± 10 ms nach Epinephrinzugabe, n = 7, p < 0,05) aufhob, die üblicherweise durch Epinephrin verursacht ist, zeigte, wie in den Verhaltensstudien, dass Epinephrin auf primäre afferente Neuronen einwirkt, indem β-AR aktiviert wird.
Da gezeigt worden ist, dass Hyperalgesiemittel, die Nozizeptoren in vitro sensibilisieren, TTX-RNI_Na erhöhen (S. England et al., J. Physiol. London 495, 429–440 (1996); M.S. Gold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1108–1112 (1996)), wurde die Wirkung von Ephinephrin auf TTX-RI_N _a untersucht. Wie in 5 dargestellt verursachte 1 μM Epinephrin eine deutliche Potenzierung van TTX-RI_Na, wobei die Strom-Spannungs-Charakteristik zur Aktivierung durch etwa 10 mV in der hyperpolarisierten Richtung (5B) verschoben wurde. Diese Epinephrin-Dosis verursachte einen Anstieg von TTX-RI_Na bei 14 von 21 (67 %) Neuronen. Da die Isoproterenolanwendung ähnliche Ergebnisse wie Epinephrin produzierte (5C) und 2 μM Propranolol diese Potenzierung eliminierten, aber 5 μM Phentolamin dies nicht taten, wurden die Wirkungen von Epinephrin auf TTX-RI_Na durch β-AR und nicht α-AR vermittelt.
Die Rollen von PKC und PKA in der Vermittlung von epinephrininduzierter Potenzierung von TTX-RI_Na wurden durch die Zugabe von 100 μM Rp-cAMPs oder 100 μM BIM getestet. Rp-cAMPs vernichteten und BIM reduzierte signifikant (n = 11, p < 0,01) epinephrininduzierte Potenzierung von TTX-RI_N _a (7 und 8), wodurch die Involvierung von PKA- und PKC-Wegen gezeigt wurde. Die PKC-Hemmung durch BIM verringerte die Zahl der Neuronen (5 von 11 gegenüber 8 von 11), die auf Epinephrin reagierten, und das Ausmaß ihrer Reaktionen (mittlerer Peak-Strom-Anstieg von 32 % gegenüber 49 %).
Daher ist die bei Tieren auftretende epinephrininduzierte Hyperalgesie auf Epinephrinstimulierung von β-adrenergen Rezeptoren und PKC- und PKA-Wege in primären afferenten Nozizeptoren zurückzuführen.
Beispiel 3. Hyperalgetische Reaktionen auf mechanische und thermische Reize wie auch auf Essigsäureinjektion werden durch das Fehlen von PKCε signifikant verringert.
Eines der wirksamsten Verfahren zum Testen der Rolle eines Proteins in einem Verfahren ist es, mutierte Tiere zu erzeugen, denen das Protein fehlt, und das Verfahren bei mutierten Tieren mit jenem bei ihren Wildtypgegenstücken zu vergleichen. Zur Untersuchung, ob PKCε eine Rolle in der Schmerzsignalisierung spielt, wurden durch homologe Rekombination, die Produktion von chimären Mäusen und nachfolgender Züchtung homozygote PKCε-Mutantenmäuse erzeugt. Die Herstellung dieser Mäuse ist in der vorläufigen US-Patentanmeldung mit dem Titel „PKCε as Modulator of Anxiety", die am 6. Juli 1998 eingereicht wurde, im Detail beschrieben. PKCε-Mutantenmäuse sind lebensfähig und können in der normalen Umgebung des Käfigs nicht von Wildtyp-Wurfgeschwistern unterschieden werden. Darüber hinaus zeigte Hämatoxylin- und Eosin-Färbung des Gehirns, Rückenmarks und der DRG-Neuronen keine anatomischen Abnormalitäten.
Die mechanische, thermische und chemische Nozizeption wurden bei Wildtyp- und PKCε-Mutantenmäusen beurteilt. Sowohl für Wildtyp (n = 8) als auch PKCε-Mutantenmäuse (n = 8) wurde der basale mechanische nozizeptive Grenzwert als Häufigkeit gemessen, mit welcher Mäuse ihre Pfoten zurückzogen, nachdem sie mit einem von Frey-Hair („VFH"; Stoelting Co.) in die Hinterpfote gestochen wurden, wobei eine Kraft von 4, 6, 9 oder 14,8 Gramm angewendet wurde. Wie in 9A dargestellt, war die prozentuelle Reaktion der Mäuse mittels Rückziehen der Pfote nach VFH-Stimulierung bei Wildtyp- und Mutanten-Mäusen ähnlich. Wenn 100 ng von Epinephrin oder Prostaglandin E₂ („PGE-₂") durch intraplantare Injektion vor VFH-Stimulierung verabreicht wurden, nahm die prozentuelle Reaktion mittels Zurückzie hen der Pfote auf eine bestimmte Intensität des VFH-Stimulus bei Wildtypmäusen stark zu, was anzeigte, dass die injizierten Verbindungen nozizeptive Grenzwerte senken (E. Kinnman, J.D. Levine, Neuroscience 64, 751–767 (1995)). Während Mutantenmäuse und Wildtypmäuse ähnliche prozentuelle Reaktionen mittels Rückziehen der Pfote auf VFH-Stimulierung nach Exposition gegenüber PGE₂ zeigten, war die prozentuelle Reaktion mittels Rückziehen der Pfote nach Epinephrininjektion bei PKCε-Mutantenmäusen signifikant geringer als bei Wildtypmäusen (p = 0,0013 für 4 Gramm VFH, p = 0,0692 für 6,9 Gramm VFH, und p = 0,0023 für 14,8 Gramm VFH) (9A).
Wenn thermische nozizeptive Grenzwerte mithilfe des thermisch nozizeptiven Tests nach Hargreave bestimmt wurden (K.O. Aley, D.B. Reichling, J.D. Levine, Neuroscience 73, 259–265 (1996)), zeigten Wildtyp (n = 8) und Mutantenmäuse (n = 8) ähnliche basale Grenzwerte und ähnliche Reaktionen auf PGE₂, aber PKCε-Mutantentiere zeigten signifikant reduzierte (p = 0,0006) epinephrininduzierte thermische Hyperalgesie im Vergleich zu ihren Wildtypwurfgeschwistern (9B).
Chemisch induzierte Hyperalgesie bei Wildtyp- (n = 4) und Mutantenmäusen (n = 4) wurde mithilfe des Essigsäurekrümmungstests (S.J. Ward, A.E. Takemori, J. Pharmacol. Exp. Ther. 224, 525–530 (1983)) bestimmt. Wie in 9C dargestellt, haben PKCε-Mutantenmäuse signifikant höhere (p = 0,0124) nozizeptive Grenzwerte als Wildtyptiere.
Die Gegenwart normaler PGE₂-vermittelter Reaktionen bei PKCε-Mutantenmäusen stimmt mit Daten überein, die angeben, dass PGE₂-Hyperalgesie und -Sensibilisierung nicht von PKC, aber stattdessen von PKA abhängen (G.R. Lewin, A.M. Ritter, L.M. Mendell, J. Neurosci. 13, 2136–2148 (1993)). Diese Studien lassen vermuten, dass ein Defekt bei PKCε-vermittelter Signaltransduktion für reduzierte epinephrinvermittelte Hyperalgesie bei PKCε-Mutantenmäusen verantwortlich ist. Das geringere Ergebnis in Essigsäurekrümmungstests bei PKCε-Mutantenmäusen lässt auch vermuten, dass PKCε zu Entzündungsschmerzen beiträgt. Die Ergebnisse, dass PKCε nicht zu nozizeptiven Basisliniengrenzwerten beiträgt und dass Mutantenmäuse normal wirken und erscheinen, zeigen, dass Inhibitoren von PKCε Schmerzen lindern können, ohne ernsthafte systemische Nebenwirkungen zu verursachen oder normale nozizeptive Reaktionen zu beeinflussen.
Beispiel 4. Verabreichung eines selektiven Inhibitors von PKCε verringert Hyperalgesie als Reaktion auf einen mechanischen Reiz.
Zur Bestätigung, dass die hyperalgetischen Reaktionen von PKCε-Mutantenmäusen, von denen in Beispiel 3 berichtet worden ist, auf die Rolle von PKCε in diesen Prozessen zurückzuführen sind, anstatt auf ein mögliche Erfordernis von PKCε während der Entwicklung des Nervensystems, wurden die nozizeptiven und hyperalgetischen Reaktionen von erwachsenen Wildtyp-Sprague-Dawley-Ratten (200–250 g) von Bantin-Kingman (Fremont, Kalifornien) sofort nach Behandlung mit einem selektiven Inhibitor von PKCε, dem εV1-2-Peptid, untersucht. Dieses Peptid hemmt das ε-Isozym von PKC selektiv, indem es in die aktivierungsinduzierte Translokation eingreift; in Gegenwart von εV1-2 wird die Bindung von PKCε an β'COP, sein Ankerprotein, gestört (J.A. Johnson, M.O. Gray, C.-H. Chen, D. Mochly-Rosen, J. Biol. Chem. 271, 24962–24966 (1996); M. Csukai, C.-H. Chen, M.A. De Matteis, D. Mochly-Rosen, J. Biol. Chem. 272, 29200–29206 (1997); B. Hundle et al., J. Biol. Chem. 272, 15028–15035 (1997)).
Für mechanisches nozizeptives Testen wurde mithilfe eines Ugo-Basile-Analgesiemeters, der eine konstant ansteigende Kraft, die in Gramm gemessen wird, anwendet, der nozizeptive Flexionsreflex bestimmt (Stoelting, Chicago, Illinois, K.O. Aley, J.D. Levine, J. Neurosci. 17, 8018–23 (1997)). Der mittlere basale mechanische Grenzwert für Ratten, die in diesen Versuchen verwendet wurde, betrug 105,3 ± 2,8 Gramm. Die Wirkungen der hyperalgesieinduzierenden Mittel Epinephrin (100 ng) und PGE₂ (100 ng) auf mechanische nozizeptive Grenzwerte wurden durch Messung der Häufigkeiten des Zurückziehens der Pfote 15, 20 und 25 Minuten nach Verabreichung des hyperalgetischen Mittels und durch darauf folgende Kalkulation des Mit telwerts dieser drei Messungen bestimmt. Wie in 10E dargestellt, waren die mechanischen nozizeptiven Grenzwerte von Ratten (n = 8), die Injektionen von sterilem Wasser (um eine hypotone Umwelt zu schaffen) und 1 μg einer ungeordneten Version des εV1-2-Peptids vor Epinephrinbehandlung in die Pfote erhielten, jenen von Ratten sehr ähnlich (n = 8), die nur mit Epinephrin behandelt wurden, beide Gruppen zeigten ein Sinken des Grenzwerts von etwa 25–30 %. Hingegen zeigten Ratten, die εV1-2 und PGE₂ (n = 10) erhielten, Reduktionen der Grenzwerte, die von jenen von Ratten nicht zu unterscheiden waren, die nur PGE₂ erhielten (n = 10). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibition von PKCε in erwachsenen Neuronen epinephrinvermittelte Hyperalgesie reduziert.
Beispiel 5. PKC ist das einzige PKC-Isozym, das in epinephrininduzierte Hyperalgesie involviert ist.
Zur Beurteilung des Beitrags von PKC-Isozymen, die nicht PKCε sind, zu epinephrininduzierter Hyperalgesie co-injizierten die Erfinder Epinephrin mit einem PKC-Inhibitor, der nicht isozymselektiv ist, Bisindolylmaleinimid-1 („BIM", D. Toullec et al., J. Biol. Chem. 266, 15771–15781 (1991)), und verglichen die resultierenden nozizeptiven Grenzwerte mit den Grenzwerten, die nach darauf folgenden Injektionen des εV1-2-Peptids und Epinephrin aufgezeichnet wurden. Da BIM epinephrininduzierte Hyperalgesie in einem ähnlichen Ausmaß hemmt wie εV1-2 (10D), scheint PKC das einzige PKC-Isozym zu sein, das in epinephrininduzierte Hyperalgesie involviert ist.
Beispiel 6. PKCε wirkt in primären afferenten Neuronen
Zur Bestimmung des Orts/der Orte der hyperalgesie-transduzierenden Aktivität von PKCε wurde die Zellverteilung von PKCε untersucht. Anästhetisierte Mäuse und Ratten wurden transkardial mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 0,5 mM MgCl₂, 0,9 mM CaCl₂, pH 7,2) und dann mit 4 % Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Das Rückenmark und DRGs wurden entfernt und 3 Stun den lang in 4 % Paraformaldehyd, dann 24 h lang in PBS-enthaltende 20 % Saccharose und für 24 h in 40 % Saccharose platziert. Sektionen (5–10 μm) wurden mithilfe eines tiefgekühlten Mikrotoms (Leica SM2000R) herausgeschnitten und dann mit Methanol:Aceton (1:1) 10 Minuten lang bei –20 °C behandelt. DRG-Neuronen wurden bei 25 °C in PBS/1 % eines normalen Ziegenserums/0,05 % Tween-20 1 Stunde lang und dann im selben Puffer 1–2 Stunden lang inkubiert, der polyklonales Anti-PKCε enthielt (1:300-Verdünnung, Santa Cruz Biotechnology). Die Sektionen wurden mithilfe eines FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:50-Verdünnung, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien) sichtbar gemacht. Für PKCε-Immunozytochemie wurden die Sektionen des Rückenmarks mit 3 % H₂O₂ vor Inkubation mit 4 normalem Ziegenserum und 0,05 % Tween-20 in Superblock (Pierce) vorbehandelt. Die Proben wurden dann mit polyklonalem Anti-PKCε-Antikörper (1:300-Verdünnung) über Nacht in PBS/1 % Tween-20 inkubiert, und die Immunreaktivität wurde unter Einsatz des ABC-Sets (Vector) mit Diaminobenzamin nach Verbesserung mit 0,02 % Osmiumtetroxid detektiert.
PKCε war in 70 ± 2 % der DRG-Neuronen bei erwachsenen Wildtypmäusen (n = 6) gegenwärtig, einschließlich der meisten DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser und vieler DRG mit mittlerem Durchmesser (11A und C). Bei Ratten exprimieren DRG-Neuronen ähnlicher Größe PKCε (10A).
Da nozizeptive DRG-Neuronen im Dorsalhorn des Rückenmarks enden, wurde auch die PKCε-Verteilung im Rückenmark von Wildtyp- und PKCε-Mutantenmäusen untersucht. Bei normalem Mausrückenmark (n = 4) wurde PKCε im oberflächlichem Dorsalhorn detektiert (3D). Daher ist PKCε in primären afferenten Nervenfasern von DRG-Neuronen gegenwärtig. Bei PKCε-Mutantenmäusen wurde keine PKCε im Rückenmark detektiert (11B).
Zur Befassung mit der Möglichkeit, dass intradermale Injektion des εV1-2-Peptids oder BIM durch Hemmung von PKCε in nicht-neuronalen Zellen, die in der Dermis zu finden sind, Hyperalgesie blockierte, wurde die Haut normaler Ratten mit einem PKCε-Antikörper gefärbt. PKCε wurde in einem dünnen Band in der Grundschicht der Epidermis detektiert, es war aber keine PKCε in der Dermis detektierbar. Präabsorption des Anti-PKCε-Antikörpers mit dem immunisierenden Peptid eliminierte die Färbung, was zeigte, dass sie spezifisch ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass aufgrund der Tatsache, dass keine PKCε in der Dermis gegenwärtig ist, intradermal injizierte PKCε-Inhibitoren nicht wirken, indem sie PKCε im Hautbindegewebe hemmen. Eher führen diese Daten kombiniert mit jenen, die zuvor präsentiert wurden, zur Schlussfolgerung, dass PKCε-Inhibitoren, die in die Dermis injiziert wurden, in primäre afferente Neuronen eintreten (DRG-Neuronen mit kleinem und mittlerem Durchmesser) und auf PKCε wirken, die in diesen Zellen gegenwärtig ist.
PKCε-Immunreaktivität war in kleinen und mittelgroßen DRG-Neuronen und in der oberflächlichen Schicht des Dorsalhorns des Rückenmarks gegenwärtig, wo nozizeptive Afferente enden. Außerdem reduzierte die intradermale Injektion eines PKCε-Inhibitors epinephrininduzierte Hyperalgesie; dieses Peptid wurde nach Injektion einer hypotonen Lösung injiziert, ein wirksames Verfahren zur Einführung von Peptiden in periphere Nervenenden (L.K. West, L. Huang, Biochemistry 19, 4418–4423 (1980)). Da andere Zellypen in der Dermis PKCε nicht exprimierten, zeigten diese Ergebnisse, dass PKCε, die in den DRG-Neuronen liegt, für die hyperalgetische Wirkung von Epinephrin notwendig ist.
Beispiel 7. PKCε moduliert akuten und chronischen chemotherapie-induzierten neuropathischen Schmerz
Menschen, die sich einer Chemotherapie unterziehen, leiden häufig unter Hyperalgesie. Vincristin ist ein Chemotherapeutikum, von dem bekannt ist, dass es Hyperalgesie verursacht, und ein Ratten Modell von vincristininduzierter Hyperalgesie wurde wie folgt etabliert. Vincristin (100 μg/kg in Kochsalzlösung, Sigma Chemical Catalog) wurde jeder von 32 Ratten täglich über einen Zeitraum von zwei Wochen intravenös verabreicht. Nach dem zweiten Tag der Vincristinverabreichung zeigten die Ratten ein akutes dosisabhängiges Sinken mechanischer nozizeptiver Grenzwerte und eine erhöhte Reaktion („Hyperalgesie") auf nicht-schädliche mechanische Reize, verabreicht mittels Ugo-Basile-Analgesiemeter, im Vergleich zu Kontrollratten, zeigten aber keine signifikanten motorischen Defizite (wie durch die Rotorod-Analyse bestimmt). Während der zweiten Woche der Vincristin-Verabreichung zeigten Ratten, die mit Vincristin behandelt worden waren, niedrigere chronische mechanische nozizeptive Grenzwerte und eine erhöhte Reaktion auf nicht-schädliche mechanische Reize 24 Stunden nach der letzten Vincristin-Behandlung. Die Reaktionen auf mechanische Reize wurden in den zwei Wochen nach Beendigung der Vincristin-Behandlung allmählich auf den Normalzustand reduziert.
Zur Bestimmung, ob die Verabreichung eines Inhibitors von PKCε vincristininduzierte Hyperalgesie im zuvor beschriebenen Rattenmodell verringern würde, erhielten die Ratten am 13. Tag nach der Vincristin-Behandlung keine Behandlung (n = 16) oder intradermale Injektionen von sterilem Wasser gefolgt von intradermalen Injektionen von entweder 1 μg εV1-2, einem PKCε-Hemmpeptid (n = 8, in 12A als „PKCεI" markiert), oder 1 μg S-VεV1-2, einer ungeordneten Version des εV1-2-Peptids (n = 8, in 12A als „PKCεI-SCR" markiert), 20–30 Minuten vor Verabreichung eines mechanischen Reizes. Wie in 12A dargestellt, wurde vincristininduzierte chronische Hyperalgesie durch Verabreichung des PKCε-Inhibitors signifikant verringert (p < 0,05), blieb aber vom ungeordneten Inhibitorpeptid unbeeinflusst. Diese Daten zeigen, dass die Inhibition von PKCε Schmerz aufgrund von toxischem Nervenschaden verringert, wie z.B. jenen, der durch ein chemotherapeutisches Arzneimittel verursacht ist.
Beispiel 8. PKCε moduliert Schmerz in Zusammenhang mit diabetischer Neuropathie
Personen mit nicht behandeltem oder schlecht behandeltem Diabetes leiden häufig unter Hyperalgesie. Die Rolle von PKCε in diabetischer Neuropathie wurde in einem Diabetes-Modell untersucht, in welchem männliche Sprague-Dawley-Ratten eine subkutane Injektion von Streptozotocin (70 mg/kg), eines Pankreas-β-Zell-Toxins, er halten. Diese Ratten zeigen Hyperglykämie und Glycosurie innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion und zeigen nach einer Woche niedrigere nozizeptive Grenzwerte als Reaktion auf mechanische Reize, die mittels Ugo-Basile-Analgesiemeter in die Hinterpfote verabreicht werden (S.C. Ahlgren et al., Neurophysiology 68, 2077–2085 (1992), S.C. Ahlgren und J.D. Levine, Neuroscience 52, 1049–1055 (1993)). Vier Wochen nach der Streptozotocininjektion erhielt jede Ratte keine Behandlung (n = 8) oder jede Ratte eine intradermale Injektion von sterilem Wasser gefolgt von intradermalen Injektionen von (1) 1 g Bisindolylmaleinimid, einem Proteinkinase-C-Inhibitor (n = 4, in 12B als „BIM" markiert), (2) 1 μg εV1-2, einem PKCε-Hemmpeptid (n = 8, in 12B als „PKCεI" markiert), oder (3) 1 μg S-VεV1-2, einer ungeordneten Version des εV1-2-Peptids (n = 4, in 12B als „PCKεI SCR" markiert), und wurden in der Folge einem mechanischen Reiz ausgesetzt. Wie in 12B dargestellt reduzierte die Verabreichung von entweder Bisindolylmaleinimid oder εV1-2 das diabetesinduzierte Sinken der nozizeptiven Grenzwerte deutlich (beides p < 0,05), die Behandlung mit dem ungeordneten Peptid zeigte wenig Wirkung auf das Sinken des nozizeptiven Grenzwerts. Diese Daten zeigen, dass PKCε das Hauptisozym von PKC ist, das bei Diabetikern Hyperalgesie vermittelt, und dass die Verabreichung von Inhibitoren von PKCε Schmerz in Zusammenhang mit diabetischer Neuropathie verringert.

¹ Da Bisindolylmaleinimid eine größere Reduktion des prozentuellen Sinkens des nozizeptiven Grenzwerts verursacht als PKCεI, ist es möglich, dass ein oder mehrere Isozyme von PKC, die nicht PKCε sind, Rollen in der Modulierung von diabetes-induzierter Hyperalgesie übernehmen.

Beispiel 9. PKCε moduliert durch traumatischen Nervenschaden induzierte Hyperalgesie
Das Seltzermodell des traumatischen Nervenschadens (Z. Seltzer et al., Pain 43, 205–218 (1990)) wird dazu verwendet, die Rolle von PKCε in der Modulation von Hyperalgesie, die durch traumatischen Nervenschaden induziert wird, zu erforschen. Nach der Bestimmung von Stellen im dorsalen Teil der Hinterpfote, in welchem traumatischer Nervenschaden Hyperalgesie ausgelöst hat, erhalten Ratten an einer solchen Stelle keine Behandlung oder intradermale Injektionen von sterilem Wasser ge folgt von intradermalen Injektionen von (1) 1 μg Bisindolylmaleinimid, (2) 1 μg εV1-2 oder (3) 1 μg S-VεV1-2. Reaktionen auf mechanische Reize werden in der Folge getestet, und Inhibitoren von PKCε kehren zumindest Hyperalgesie in Zusammenhang mit traumatischem Nervenschaden zum Teil um.
Beispiel 10. PKCε moduliert akuten Entzündungsschmerz
Die Essigsäurekrümmungsversuche, die in Beispiel 3 angeführt sind, geben an, dass PKCε zu Entzündungsschmerz beiträgt. Zur Erforschung, ob PKCε Hyperalgesie vermittelt, die durch andere Entzündungsmittel ausgelöst wird, erhielten Ratten intradermal 10-μl-Injektionen einer 1% Lösung von Carrageenan, einem starken Reizmittel (S.H. Ferreira et al., Nature 334, 698–700 (1988)), und dreieinhalb Stunden später erhielten die Ratten keine Behandlung (n = 12, in 13 als „Car-4" markiert) oder intradermale Injektionen von sterilem Wasser gefolgt von intradermalen Injektionen von entweder 1 g εV1-2, einem PKCε-Hemmpeptid (n = 6, in 13 als „εV" markiert), oder 1 μg S-VεV1-2, einer ungeordneten Version des εV1-2-Peptids (n = 6, in 13 als „S-εV" markiert). Als mechanische Reize 30 Minuten später angewendet wurden, wie in 13 dargestellt ist, zeigten die Ratten, die nur Carrageenan oder sowohl Carrageenan als auch das ungeordnete Peptid erhielten, wesentliche Hyperalgesie. Durch den Vergleich zeigten die Ratten, die Carrageenan und das PKCε-Hemmpeptid erhielten, fast nur mechanische Hyperalgesie. Diese Daten zeigen, dass die Verabreichung eines Inhibitors von PKCε carrageenan-induzierte Hyperalgesie signifikant verringerte.
Beispiel 11. PKCε moduliert chronischen Entzündungsschmerz
A. Modell für chronischen Entzündungsschmerz
Zur Erforschung der etwaigen Rolle von PKCε bei chronischem Entzündungsschmerz wurde das folgende Modellsystem für chronischen Entzündungsschmerz entwickelt. Ratten erhielten intradermale Injektionen Carrageenan, einem Entzün dungsmittel, in die Hinterpfote. Bis zu 3–4 Tage nach der Carrageenanverabreichung zeigten die Ratten mechanische Hyperalgesie, wie durch den Randall-Selitto-Test des Zurückziehens der Pfote beurteilt wurde. Dies wurde als akute Reaktion auf die carrageenan-induzierte Entzündung angesehen. Obwohl die Verabreichung von Prostaglandin-E₂ („PGE₂"), 5-Hydroxytryptamin („5-HT", Serotonin) oder CGS-21680 (ein Adenosin-A₂-selektiver Rezeptoragonist) normalerweise zur Folge hat, dass unbehandelte Ratten (d.h. Ratten, die keine Carrageenaninjektionen erhalten haben) unter Hyperalgesie leiden, die bis zu 6 Stunden dauert, dauerte die Hyperalgesie, unter welcher carrageenan-sensibilisierte Ratten nach Verabreichung einer dieser Substanzen litten, bis zu 24 Stunden. Diese anhaltende Hyperalgesie war bei solchen Ratten bis zu drei Wochen nach der Carrageenaninjektion zu bebachten. Diese Daten erstellen ein Modell eines chronischen andauernden Entzündungschmerzes und lassen vermuten, dass Veränderungen, die durch akute Entzündungen induziert werden, für einen längeren Zeitraum andauern.
B. PKCε moduliert chronischen Entzündungsschmerz und Prozesse, die diesen entstehen lassen
Die Rolle von Protein-Kinase-C-Enzymen im Allgemeinen und dem PKCε-Isozym im Besonderen in der Modulierung von chronischem Entzündungsschmerz wurde durch Verabreichung von 1 μ Bisindolylmaleinimid („BIM", einem nichtselektivem PKCε-Inhibitor) oder 1 μg εV1-2 (einem Peptid, das PKCε selektiv hemmt) mehrere Tage nach der Carrageenaninjektion und in der Folge durch Behandlung der Ratten mit PGE₂ und Messung der resultierenden Hyperalgesie getestet. Die andauernde PGE₂-induzierte Hyperalgesie, die normalerweise bei carrageenan-sensibilisierten Ratten zu sehen ist, wurde durch die Verabreichung von BIM oder εV1-2 gehemmt. Diese Daten zeigen, dass andauernde PGE₂-induzierte Hyperalgesie von der PKCε-Aktivität abhängt und dass die Verabreichung eines Inhibitors von PKCε chronisch erhöhten Schmerz aufgrund von vorheriger Entzündung verringert.
Zur Untersuchung, ob Protein-Kinase C die Prozesse moduliert, durch welche ein kurzes Entzündungsereignis viele Tage später andauernde Hyperalgesie auslöst, erhielten Ratten zur selben Zeit Injektionen von Carrageenan und 1 μg BIM. Hyperalgesie wurde 72 Stunden später gemessen als die Ratten mit PGE₂ behandelt wurden. Die Verabreichung von BIM zur selben Zeit wie Carrageenan linderte sowohl die akute Hyperalgesie, die normalerweise durch Carrageenanexposition induziert wurde, als auch die andauernde Hyperalgesie, die normalerweise zu beobachten ist, wenn die Ratten mit PGE₂ 72 Stunden nach Carrageenanexposition behandelt werden. Diese Daten zeigen, dass PKC sowohl akute als auch chronische Hyperalgesie moduliert. Daher kann die Verabreichung eines Inhibitors von PKC entweder zu etwa demselben Zeitpunkt wie das Entzündungsmittel, das chronische andauernde Hyperalgesie auslöst, oder zu etwa demselben Zeitpunkt wie der hyperalgesieinduzierende Stimulus eine solche chronische Hyperalgesie verringern. Die Verabreichung von εV1-2 anstelle von BIM bestätigte, dass diese Wirkungen auf das PKCε-Isozym zurückzuführen sind, und zeigten, dass die Verabreichung eines selektiven Inhibitors von PKCε kurz vor, während oder nach dem Entzündungsereignis sowohl akuten Schmerz aufgrund eines solchen Ereignisses verringert als auch die Mechanismen beeinflusst, die zu chronischem Schmerz infolge eines solchen Ereignisses führen.

Claims

Inhibitor des ε-Isozyms von Protein-Kinase C (PKCε) zur Verwendung in einem Verfahren zur Linderung von Schmerz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Inhibitors des ε-Isozyms von Protein-Kinase C (PKCε), worin die wirksame Menge eine Menge ist, die keine anderen Isozyme von PKC signifikant hemmt, und worin der Inhibitor Schmerz lindert, indem er die Aktivität von PKCε beeinflusst, und worin der Inhibitor ein Peptid ist, das aus der aus εV1-1, εV1-2, εV1-3, εV1-4, εV1-5 und εV1-6 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Inhibitor nach Anspruch 1, worin die Verabreichung zu verringerter Hyperalgesie ohne verringerte Nozizeption führt.
Inhibitor nach Anspruch 1, worin das Verfahren auch die Verabreichung einer Verbindung umfasst, die aus der aus einem Inhibitor von Protein-Kinase A (PKA), einem Inhibitor von cAMP, einem entzündungshemmenden Nichtsteroid-Arzneimittel, einem Lokalanästhetikum, einem Antikonvulsivum, einem Antidepressivum und einem Opioid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Inhibitor nach Anspruch 1, worin der Schmerz akut oder chronisch ist.
Inhibitor nach Anspruch 1, worin der Schmerz entzündlich oder neuropathisch ist.
Inhibitor nach Anspruch 5, worin der entzündliche Schmerz durch einen Sonnenbrand, Osteoarthritis, Colitis, Carditis, Dermatitis, Myositis, Neuritis oder Kollagenose ausgelöst ist, der neuropatische Schmerz durch Kausalgie, Diabetes, Kollagenose, Trigeminusneuralgie, eine Rückenmarksschädigung, eine Hirnstammschädigung, das Thala müssyndrom, Krebs, chronischen Alkoholismus, einen Schlaganfall, einen Abszess, eine Entmarkungskrankheit, eine Herpesinfektion, AIDS, ein Trauma, eine Operation, eine Amputation, ein Toxin oder Chemotherapie ausgelöst ist.
Verfahren zur Messung der Fähigkeit einer Testverbindung, Schmerz zu lindern, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Auswählen eines Inhibitors des ε-Isozyms von Protein-Kinase C (PKCε) als Testverbindung, worin der Inhibitor PKCε in einer Konzentration signifikant hemmt, bei der die anderen Isozyme von PKC nicht signifikant gehemmt werden, und das Messen der Fähigkeit des Inhibitors, Schmerz in einem Schmerz-Tiermodell zu lindern, worin die Testverbindung Schmerz in einem Individuum lindert, indem die Aktivität von PKCε moduliert wird.
Zusammensetzung, die einen Inhibitor des ε-Isozyms von Protein-Kinase C (PKCε), worin der Inhibitor PKCε in einer Konzentration signifikant hemmt, bei der die anderen Isozyme von PKC nicht signifikant gehemmt werden, und ein Analgetikum umfasst, wobei das Analgetikum einen anderen Wirkmechanismus aufweist als die Hemmung von PKCε, worin der Inhibitor ein aus der aus εV1-1, εV1-2, εV1-3, εV1-4, εV1-5 und εV1-6 bestehenden Gruppe ausgewähltes Peptid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das Analgetikum aus der aus einem entzündungshemmenden Nichtsteroid-Arzneimittel, einem Opioid, einem Lokalanästhetikum, einem Antikonvulsivum und einem Antidepressivum ausgewählt ist.
Verwendung eines Inhibitors des ε-Isozyms von Protein-Kinase C (PKCε), worin der Inhibitor PKCε in einer Konzentration signifikant hemmt, bei der die anderen Isozyme von PKC nicht signifikant gehemmt werden, bei der Herstellung eines Medikaments zur Schmerzbehandlung, worin der Inhibitor den Schmerz behandelt, indem er die Aktivität von PKCε beeinflusst.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Inhibitor ein selektiver Inhibitor von PKCε ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin der selektive Inhibitor ein aus der aus εV1-1, εV1-2, εV1-3, εV1-4, εV1-5 und εV1-6 bestehenden Gruppe ausgewähltes Peptid ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Inhibitor zu verringerter Hyperalgesie ohne verringerte Nozizeption führt.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Medikament auch eine Verbindung umfasst, die aus der aus einem Inhibitor von Protein-Kinase A (PKA), einem Inhibitor von cAMP, einem entzündungshemmenden Nichtsteroid-Arzneimittel, einem Lokalanästhetikum, einem Antikonvulsivum, einem Antidepressivum und einem Opioid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Schmerz akut oder chronisch ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Schmerz entzündlich oder neuropathisch ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin der entzündliche Schmerz durch einen Sonnenbrand, Osteoarthritis, Colitis, Carditis, Dermatitis, Myositis, Neuritis oder Kollagenose ausgelöst ist, der neuropatische Schmerz durch Kausalgie, Diabetes, Kollagenose, Trigeminusneuralgie, eine Rückenmarksschädigung, eine Hirnstammschädigung, das Thalamussyndrom, Krebs, chronischen Alkoholismus, einen Schlaganfall, einen Abszess, eine Entmarkungskrankheit, eine Herpesinfektion, AIDS, ein Trauma, eine Operation, eine Amputation, ein Toxin oder Chemotherapie ausgelöst ist.