DE69930988T2

DE69930988T2 - Immunologische Reaktion und Fluoreszenzmarker verwendender optischer Filter

Info

Publication number: DE69930988T2
Application number: DE69930988T
Authority: DE
Inventors: Guy Voirin; Rino Kunz
Original assignee: Centre Suisse dElectronique et Microtechnique SA CSEM
Current assignee: Centre Suisse dElectronique et Microtechnique SA CSEM
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: US6312961B1; DE69930988D1; FR2778986B1; EP0959343A1; FR2778986A1; EP0959343B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches Messsystem, das das allgemeine Konzept aufweist, das im Oberbegriff von Anspruch 1 definiert ist.
Die immunologische Reaktion, die in einem Biosensor eines solchen Messsystems zur Anwendung kommt, kann im Wesentlichen auf zwei verschiedene Arten ablaufen.
Gemäß einem ersten Verfahren werden Antikörper an der Oberfläche des Wellenleiters befestigt, die spezifisch für ein nachzuweisendes Antigen sind. Die zu analysierende Probe, deren Gehalt an Antigenen erfasst werden soll, wird mit Antigenen gemischt, die genau mit denjenigen übereinstimmen, die nachgewiesen werden sollen, jedoch chemisch an einen Fluoreszenzstoff gebunden sind (auch als „Marker" oder „Label" bezeichnet).
Diese gemischte Probe wird anschließend inkubiert und es wird die Fluoreszenz gemessen, die durch die evaneszente Welle angeregt wird. Wenn die Probe unter diesen Bedingungen eine große Menge an Antigenen enthält (sie wird als „positiv" bezeichnet), binden sich wenig Antigene, die mit dem Fluoreszenzstoff verbunden sind, an die Antikörper, die an der Oberfläche des Wellenleiters immobilisiert sind, sodass eine schwache Fluoreszenz gemessen wird. Wenn die Probe im Gegensatz dazu zu Beginn wenig Antigene oder überhaupt keine Antigene enthielt (sie wird als „negativ" bezeichnet), binden sich diejenigen, die mit dem Fluoreszenzstoff zugegeben wurden, an die immobilisierten Antikörper und es wird eine starke Fluoreszenz gemessen.
Gemäß einem zweiten Anwendungsverfahren wird gewissermaßen umgekehrt vorgegangen. In diesem Fall werden Antigene der Art, die nachgewiesen werden soll, vorher an ein Einweiß gebunden und an der Oberfläche des Wellenleiters immobilisiert. Die Probe wird mit Antikörpern gemischt, die spezifisch für dieses Antigen sind, jedoch an einen Fluoreszenzstoff gebunden sind. Diese Probe wird mit den Antigenen in Berührung gebracht, die vorher an der Oberfläche des Wellenleiters immobilisiert wurden, wird inkubiert und anschließend wird die Fluoreszenz gemessen.
Wenn dann die Probe positiv ist, binden sich die Antikörper, die mit dem Fluoreszenzstoff versehen sind, an die Antigene der Probe, anstatt sich an die Antigene zu binden, die an der Oberfläche des Wellenleiters immobilisiert sind. Die Komplexe aus Antigen-Antikörper-Fluoreszenzstoff bleiben dann beabstandet von der Oberfläche des Wellenleiters und es wird eine geringe Fluoreszenz gemessen.
Wenn im Gegensatz dazu die Probe negativ ist, lagern sich die Antikörper, die mit dem Fluoreszenzstoff versehen sind, an den Antigenen an, die an der Oberfläche des Wellenleiters immobilisiert sind. Der Fluoreszenzstoff kann so durch die evaneszente Welle angeregt werden und es wird eine starke Fluoreszenz gemessen.
Die Messung kann qualitativ, jedoch auch quantitativ sein, wenn die Intensität der beobachteten Fluoreszenz gemessen wird.
Der Wellenleiter kann auf bekannte Art und Weise aus einem massiven, Licht leitenden Stoff aufgebaut sein, auf dessen Oberfläche Beugungsgitter vorgesehen sein können, durch die dort ein Anregungsstrahl gekoppelt werden kann, der aus einer Lichtquelle stammt, und die Ausgangsstrahlung daraus ausgekoppelt werden kann, die auf Fluoreszenz zurückzuführen ist, und die ursprüngliche Strahlung, die nicht durch Fluoreszenz umgewandelt wurde. Da die Strahlung, die auf Fluoreszenz zurückzuführen ist, eine andere Wellenlänge aufweist als die einfallende Strahlung, werden die beiden Strahlungen vom Gitter in einem Winkel getrennt und im Strahl der Fluoreszenzstrahlung kann ein Photomessfühler angeordnet werden, wobei dann das Ausgangssignal dieses Photomessfühlers kennzeichnend für die Menge an Antigenen ist, die in der Probe vorliegt.
Die Messung mit einem solchen System wird durch Störeffekte beeinflusst, die mit seinem Aufbau oder mit Umgebungsbedingungen verbunden sind, beispielsweise die Qualität des Koppelns/Auskoppelns der Lichtstrahlen, Verluste an Lichtenergie im Wellenleiter und Temperatureinflüsse.
Zur Durchführung einer Absolutmessung müssen folglich auf dem Wellenleiter Bezugsbereiche vorgesehen werden, bei denen die Fluoreszenz bekannt ist und die im Sensor ebenso wie die Messbereiche vorgesehen sind, wie beispielsweise in der US-Patentschrift 5,631,170 beschrieben ist. Ein weiterer Umstand, der das Vorhandensein eines Bezugsbereichs erforderlich macht, ist, dass der Biosensor vorzugsweise ein Gegenstand zum Einmalgebrauch ist, sodass die Messbedingungen von einem Biosensor zum nächsten aufgrund von unvermeidbaren Fertigungstoleranzen abweichen können, insbesondere bei den Abmessungen und der Oberflächenbeschaffenheit des Wellenleiters des Biosensors.
Jedoch ergeben sich durch das Vorhandensein dieser Bezugsbereiche mehrere Nachteile. Erstens nehmen sie Platz auf der Oberfläche des Wellenleiters ein, wodurch für die Messbereiche entsprechend weniger Platz verfügbar ist.
Darüber hinaus sind die Bezugsbereiche zwangsläufig an anderen Stellen vorgesehen als an denjenigen, wo sich die Messbereiche befinden, sodass die Messbedingungen hier nicht übereinstimmen (unterschiedliche Oberflächenbeschaffenheiten, unterschiedliche Stärken des Wellenleiters usw.). Daraus ergibt sich trotz der vorhandenen Bezugsbereiche und der zusätzlichen Messung, die sie beinhalten, eine dem Biosensor eigene Ungenauigkeit.
Die Dokumente WO 96/35940 und WO 95/33198 beschreiben Messsysteme der definierten allgemeinen Ausführung, die zuvor dargelegt wurde. Bei diesen Messsystemen werden Biosensoren verwendet, deren Wellenleiter aus einem Material wie TiO₂ hergestellt ist. Dadurch weisen diese Wellenleiter von sich aus die Eigenschaft auf, dass ihre spontane Fluoreszenz durch einen Anregungslichtstrahl angeregt werden könnte. Diese Eigenschaft der Anregung der spontanen Fluoreszenz wird jedoch in keinem der beiden Dokumente zur Verbesserung der Messergebnisse genutzt.
In dem Dokument WO 95/33198 wird zwar die Möglichkeit erwähnt, außer der Strahlung +k'_out, die auf die Fluoreszenz des zu messenden Gegenstands zurückzuführen ist, eine Strahlung k_out aufzufangen, jedoch ist letztere Strahlung keine andere als die, die auf die Reststrahlung der Strahlungsquelle zurückzuführen ist, die vom Wellenleiter nicht absorbiert wurde.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein optisches Messsystem bereitzustellen, bei dem Biosensoren mit immunologischer Reaktion verwendet werden, wobei die Strahlung, die auf die spontane Fluoreszenz des Materials des Wellenleiters des Biosensors zurückzuführen ist, zur Verbesserung des Messergebnisses genutzt wird. Genauer gesagt, zielt die Erfindung darauf ab, auf einfache und zuverlässige Weise eine Bezugsmessung zu erhalten, ohne die verfügbare Fläche für die eigentliche Messung zu verkleinern, wobei diese außerdem unabhängig von der Maßungenauigkeit ist, die ein in großer Stückzahl gefertigter Biosensor aufweist.
Aufgabe der Erfindung ist somit ein optisches Messsystem, wie es im kennzeichnenden Teil von Anspruch 1 definiert ist.
Aufgrund dieser Eigenschaften ist es möglich, auf einfache und zuverlässige Weise eine Bezugsmessung zu erhalten, die auf spontaner Fluoreszenz beruht, die im Biosensor selbst stattfindet, bei der die Fluoreszenz durch denselben Anregungsstrahl angeregt wird, wobei die Bezugsmessung so an der spontanen Strahlung des Materials des Biosensors erfolgt, dass sie die gleichen Störeffekten unterliegt wie die Strahlung, die die Messdaten der immunologischen Reaktion liefert.
Weitere vorteilhafte Eigenschaften der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.
Es ist festzuhalten, dass der Begriff „Wellenleiter" im vorliegenden Zusammenhang so verstanden werden soll, dass er entweder einen Wellenleiter bezeichnet, der im Wesentlichen aus einem Material hergestellt ist, das spontane Fluoreszenz aufweist, wenn es angeregt wird, oder einen Wellenleiter, der mit einem solchen Material beschichtet ist, wobei dieses in diesem Fall zum Wellenleiter gehört.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offensichtlich, die lediglich als Beispiel dient und in Bezug auf die angehängten Zeichnungen erfolgt, von denen:
1 eine grafische Darstellung ist, in der das Konzept veranschaulicht ist, auf dem die vorliegende Erfindung beruht;
2 perspektivisch und sehr vereinfacht ein Messsystem und einen Biosensor zeigt, die erfindungsgemäß ausgestaltet sind;
3 und 4 in ähnlichen Ansichten zwei Abwandlungen eines Biosensors zeigen, der beim erfindungsgemäßen Messsystem verwendet wird;
5 ebenfalls eine vereinfachte Darstellung eines Biosensors ist, der beim erfindungsgemäßen Messsystem verwendet wird, wobei dieser Biosensor mit einem Kapillarkanal für das Ansaugen einer zu analysierenden Probe ausgestattet ist;
6 bis 9 weitere Abwandlungen des Biosensors veranschaulichen;
10 eine vereinfachte Schnittdarstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines Biosensors zeigt, der beim erfindungsgemäßen Messsystem verwendet werden kann;
11 eine vereinfachte Übersicht über ein vollständiges erfindungsgemäßes Messsystem ist, in dem ein Biosensor enthalten ist.
Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass bei Verwendung bestimmter Materialien zur Herstellung des Wellenleiters, in dem die evaneszente Welle erzeugt wird, die Anregung einer spontanen Fluoreszenz möglich ist, vorausgesetzt, dass die Dichte der Lichtenergie ausreichend ist, die in den Wellenleiter gekoppelt wird.
Wenn das Material des Wellenleiters erfindungsgemäß so ausgewählt wird, dass seine Eigenfluoreszenz eine Intensitätskurve in Abhängigkeit von der Wellenlänge aufweist, die gegenüber der Intensitätskurve des Fluoreszenzstoffs verschoben ist, der während der immunologischen Reaktion verwendet wird, wird es möglich, eine Bezugsmessung im Wellenleiter durchzuführen, das heißt dort, wo die eigentliche(n) immunologische(n) Reaktion(en) stattfindet bzw. stattfinden. Unter diesen Bedingungen wird eine Strahlung, die mit einer vorher festgelegten Wellenlänge in den Wellenleiter gekoppelt wird, teilweise in fluoreszierende Strahlung umgewandelt, die auf die immunologische Reaktion zurückzuführen ist, und teilweise in eine Strahlung, die auf die spontane Fluoreszenz des Materials des Wellenleiters zurückzuführen ist. Da diese beiden Strahlungen unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, können sie derart in unterschiedlichen Winkeln aus dem Wellenleiter ausgekoppelt werden, dass sie durch unterschiedliche Photomessfühler leicht einzeln erfasst werden können.
Die grafische Darstellung von 1 veranschaulicht das Konzept der Erfindung. Darin sind die drei Graphen A, B und C der relativen Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge in nm dargestellt.
Die Kurven A und B sind kennzeichnend für zwei Beispiele von bestimmten Materialien, die im Rahmen der Erfindung für den Wellenleiter verwendet werden können, nämlich einerseits Siliziumnitrid Si₃N₄ und andererseits Titanoxid TiO₂. Diese Materialien haben Spitzenwerte der Fluoreszenzintensität bei etwa 575 nm beziehungsweise 610 nm. Kurve C ist kennzeichnend für die Fluoreszenz eines Stoffs oder Markers, der bei der immunologischen Reaktion verwendet werden kann. Es handelt sich hierbei um Fluorescein, dessen Fluoreszenzspitzenwert bei etwa 520 nm liegt. Anhand dieses Graphs ist ersichtlich, dass die Spitzenwerte der Fluoreszenzkurven ausreichend verschoben sind, um einerseits für den Marker und andererseits für das Material des Wellenleiters Wellenlängen zu erhalten, die gut voneinander zu unterscheiden sind.
2 ist eine vereinfachte Darstellung eines Beispiels für einen Biosensor mit immunologischer Reaktion, der beim erfindungsgemäßen Messsystem verwendet werden kann und allgemein mit dem Bezugszeichen BC gekennzeichnet ist. Er umfasst einen Wellenleiter 1, der aus einer Folie oder einer Schicht aus einem lichtdurchlässigen Werkstoff mit einer hohen Brechzahl besteht. Im Folgenden wird ersichtlich, dass die Schicht mit hoher Brechzahl vorteilhaft eine Schicht aus einem Material sein kann, die mit Herstellungsverfahren auf einem Substrat aufgebracht wird, die im Fachgebiet der Halbleitertechnik bekannt sind.
Als Beispiel und erfindungsgemäß besteht die Schicht 1 zumindest teilweise aus einem Material, in dem spontan eine Fluoreszenz angeregt werden kann. Beispiele für Materialien, die sich besonders gut dafür eignen, sind Siliziumnitrid, Titanoxid und Tantaloxid. Der Wellenleiter kann aus der gesamten Schicht bestehen oder darin durch photolithografische Verfahren abgegrenzt sein, damit er sich nur auf einen Teil davon beschränkt. Dies gilt im Übrigen für alle Ausführungsformen und Abwandlungen, die im Folgenden beschrieben sind.
Um die Anregung der spontanen Fluoreszenz des Wellenleiters des Biosensors zu gewährleisten, kann dafür ein Material verwendet werden, das im Wesentlichen diese Eigenschaft aufweist. Es ist jedoch auch möglich, die spontane Fluoreszenz durch Dotierung des Wellenleiters mit einer geeigneten Dotiersubstanz oder auch dank einer Schicht zu erzielen, die aus einem intrinsischen oder dotierten Material besteht und unter dem oder auf den Wellenleiter aufgebracht wird.
In der Fläche 2 der Schicht 1 mit hoher Brechzahl sind Beugungsgitter 3 und 4 angeordnet, die aus Mikrorillen bestehen und ein Eingangsgitter beziehungsweise ein Ausgangsgitter bilden. Bei dieser ersten Ausführungsform der Erfindung ist festzuhalten, dass die Mikrorillen im Verhältnis zur Gesamtausdehnung (Länge) des Wellenleiters quer ausgerichtet sind.
Es sollte auch festgehalten werden, dass die Beugungsgitter in der Unterseite oder Oberseite der Schicht 1 hergestellt werden können oder sogar sowohl auf der Unterseite als auch auf der Oberseite.
Zwischen den Beugungsgittern 3 und 4 liegt ein Messbereich 5, in dem sich Reaktionsbereiche befinden können, die jeweils durch Aufbringen eines Bestandteils der immunologischen Reaktion oder Analyseelementen wie Antikörpern oder Antigenen gebildet sind, wie sie zuvor worden beschrieben sind. In 2 ist ein einzelner Reaktionsbereich durch den Kreis 6 gekennzeichnet.
Der Biosensor BC ist in ein erfindungsgemäßes Messsystem eingebunden, das eine Lichtquelle 7 umfasst, beispielsweise einen Laser, die über das Eingangs-Beugungsgitter Lichtenergie in den Wellenleiter koppeln kann, wobei diese Energie darin spontane Fluoreszenz anregen kann. Die Wellenlänge der Quelle 7 wird vorzugsweise bei der Wellenlänge ausgewählt, die dem Absorptionsmaximum des Fluoreszenzmarkers entspricht (bei Fluorescein 492 mm). Die so erzeugte Fluoreszenzenergie tritt in einem festgelegten Winkel α aus dem Wellenleiter 1 aus, der von der Wellenlänge der spontanen Fluoreszenz des Materials abhängt, aus dem der Wellenleiter besteht. Auf dem Weg dieser Fluoreszenzstrahlung ist ein Photomessfühler 8 angeordnet, damit sie als Bezugsmessung erfasst werden kann.
Wurde der Reaktionsbereich 6 (beispielsweise durch Pipettieren) mit einem zu untersuchenden Stoff in Berührung gebracht, regt die Anregungsstrahlung, die aus der Quelle 7 stammt, gegebenenfalls auch Fluoreszenz bei einer Wellenlänge an, die kennzeichnend für den verwendeten Marker ist. Als Beispiel für einen Stoff, der mithilfe eines erfindungsgemäßen Messsystems untersucht werden kann, kann Milch genannt werden, deren Gehalt an Antibiotikarückständen in Erfahrung gebracht werden soll. Da die Wellenlänge des Markers so gewählt wird, dass sie von der der spontanen Fluoreszenz abweicht, tritt die Strahlung, die auf die Fluoreszenz der immunologischen Reaktion zurückzuführen ist, über das Ausgangs-Beugungsgitter 4 aus dem Wellenleiter 1 aus, jedoch in einem Winkel β, der sich vom vorgenannten Winkel α unterscheidet. Auf dem Weg dieser Messstrahlung ist ein zweiter Photomessfühler 9 angeordnet, um ihre Erfassung zu gewährleisten.
Schließlich tritt die verbleibende Lichtenergie, die nicht in den Winkeln α und β ausgekoppelt wird, in einem eigenen Austrittswinkel γ aus dem Wellenleiter aus. Wenn der Träger des Wellenleiters durchsichtig ist, können die Lichtstrahlen über Beugungsgitter an der Grenzfläche zwischen dem Wellenleiter und dem durchsichtigen Träger einfallen und auf der Seite des Trägers austreten.
Es ist festzustellen, dass die Bezugsmessung bei dem erfindungsgemäßen Messsystem unter Bedingungen erfolgt, die genau mit denen der Messung durch die immunologische Reaktion übereinstimmen, sodass alle Störeffekte problemlos berücksichtigt werden können.
3 zeigt eine zweite Ausführungsform der Erfindung, wobei ein Biosensor BCA einen Wellenleiter 1A umfasst, in dem ein Eingangs-Beugungsgitter 3A für den Anregungsstrahl sowie eine Vielzahl von Ausgangs-Beugungsgittern 4A-1 bis 4A-6 vorgesehen ist, die Strahlung, die auf Fluoreszenz zurückzuführen ist, von so vielen immunologischen Reaktionen auskoppeln können, wie in den Messbereichen 6A-1 bis 6A-6 stattfinden, die in einem Messbereich 5A angeordnet sind. Die Fluoreszenz, die auf immunologische Reaktionen in diesen Bereichen zurückzuführen ist, wird hier als durch denselben Fluoreszenzmarker angeregt angenommen, sodass die Messstrahlung aus der Folie 1A in einem Winkel α ausgekoppelt wird, der bei allen Messbereichen 6A-1 bis 6A-6 übereinstimmt. Obwohl dies in 3 nicht dargestellt ist, ist der Biosensor BCA in diesem Fall in ein Messsystem eingebunden, das mit Photomessfühlern ausgestattet ist, die den Photomessfühlern 8 und 9 von 2 ähneln. Die Messstrahlung, die von den verschiedenen Auskopplungs-Beugungsgittern 4A-1 bis 4A-6 stammt, wird vorzugsweise von einer Reihe Photomessfühlern gemessen, die so viele Pixel aufweisen, wie Bereiche vorhanden sind. Eine Anordnung aus CCD-Zellen kann dafür geeignet sein. Selbstverständlich ist es auch zweckmäßig, einen oder mehrere Photomessfühler vorzusehen, die dem Photomessfühler 8 von 2 ähneln, um von mindestens einem Ausgangs-Beugungsgitter die ausgekoppelte Strahlung zu erfassen, die auf spontane Fluoreszenz zurückzuführen ist, die im Material des Wellenleiters 1A angeregt wurde. Hier kann ein einzelner Photomessfühler vorgesehen werden, der diese Strahlung nur von einem einzelnen Ausgangsgitter erfasst, aber auch genauso viele Photomessfühler, wie Ausgangsgitter vorhanden sind, um für alle Reaktionsbereiche 6A-1 bis 6A-6 eine Bezugsmessung zu erhalten.
Es ist festzuhalten, dass bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Biosensors die Rillen der Auskopplungs-Beugungsgitter parallel zur Längsausdehnung der Folie 1A ausgerichtet sind.
4 stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar, wobei ein Wellenleiter 1B des Biosensors BCB die Reaktionsbereiche 6B-1 bis 6B-6 umfasst, die zwischen zwei Reihen von Ausgangs-Beugungsgittern angeordnet sind, 4B-1a bis 4B-6a einerseits und 4B-1b bis 4B-6b andererseits, wobei diese Reihen längs entlang des Messbereichs 5B angeordnet sind. Dieser wird außerdem durch ein Eingangs- Beugungsgitter 3B bestrahlt. Die Ausgangs-Beugungsgitter sind so ausgerichtet, dass ihre Rillen parallel zur Längsrichtung der Folie 1B verlaufen. Zudem sind die Reihen 4B-1a bis 4B-6a beziehungsweise 4B-1b bis 4B-6b so entgegengesetzt ausgerichtet, dass sich die ausgekoppelten Strahlen in den Photomessfühlern 9 verstärken können (hier der Deutlichkeit halber ebenfalls nicht dargestellt, wie der oder die Photomessfühler 8). Die Photomessfühler können genauso vorgesehen sein, wie bereits in Bezug auf 3 beschrieben wurde.
5 stellt eine Abwandlung des Biosensors BCC dar, der dem von 4 ähnelt, jedoch wird hier der Messbereich 5C von einem Abdeckelement 10 bedeckt, das einen Querschnitt in Form eines umgekehrten „U" aufweist. Dieses Abdeckelement kann mit der Oberseite des Wellenleiters 1C dieses Biosensors eine Kapillare 11 zum Ansaugen der zu messenden Stoffe bilden.
6 stellt eine weitere Abwandlung des Biosensors BCD dar, der dem von 4 ähnelt. In diesem Fall weist die Folie 1D parallel zur Längsausdehnung die zwei Messbereiche 5D-1 beziehungsweise 5D-2 auf, die jeweils eine eigene Gruppe von Reaktionsbereichen aufweisen. Die Ausgangs-Beugungsgitter 4D-1a bis 4D-6a beziehungsweise 4D-1b bis 4D-6b sind genauso angeordnet wie die Gitter der Abwandlung von 4, jedoch wirken sie je Reihe auf zwei Gruppen der Photomessfühler 9 (nicht dargestellt) ein, die nebeneinander über der Folie 1D angeordnet sind.
7 zeigt eine weitere Ausführungsform des Biosensors BCE, der beim erfindungsgemäßen Messsystem verwendet werden kann. In diesem Fall umfasst eine Folie 1E ein Eingangs-Beugungsgitter 3E, dessen Rillen im Verhältnis zur Längsausdehnung der Folie 1E quer ausgerichtet sind. In der Folie 1E entsteht durch Feinstbearbeitung ein Wellenleiter 12, der sich in die drei Wege 12a, 12b, 12c verzweigt, die jeweils zu einem Messbereich 5E-1, 5E-2 beziehungsweise 5E-3 führen. Diese Messbereiche sind zwischen den Beugungsgittern 13 bis 16 angeordnet, die die fluoreszierende Mess- und Bezugsstrahlung des Bereichs 5E-1 auffangen (Gitter 13 und 14), des Bereichs 5E-2 (Gitter 14 und 15) beziehungsweise des Bereichs 5E-3 (Gitter 15 und 16). In diesem Fall werden für die Messung Photomessfühler in drei Reihen verwendet, wobei Photomessfühler für die Bezugsmessung beispielsweise für jeden Messbereich vorgesehen werden können.
In 8 ist eine weitere Ausführungsform eines Biosensors BCF für ein erfindungsgemäßes Messsystem dargestellt, der einen Träger 1F umfasst, auf dem ein Wellenleiter 17 abgegrenzt ist und der nur ein einziges Beugungsgitter 18 umfasst, das sowohl dem Koppeln von Lichtenergie (Strahl 19) in den Wellenleiter 17 und dem Auskoppeln von Lichtenergie dient, die darin durch Fluoreszenz angeregt wird. Als Beispiel umfasst der Wellenleiter 17 hier nur einen einzigen Messbereich 5F, der mit einem einzigen Reaktionsbereich 6F versehen ist. Bei der Analyse einer Probe werden so ein Messstrahl 20 und ein Bezugsstrahl 21 über das Beugungsgitter 18 aus dem Wellenleiter ausgekoppelt. Wieder können mit Photomessfühlern der Mess- und der Bezugsstrahl 20 und 21 erfasst werden (sie sind nicht dargestellt).
Der Biosensor BCG von 9 ist eine Abwandlung von demjenigen, der in der vorhergehenden Figur dargestellt ist. Auch hier ist ein Träger 1G nur mit einem einzigen Beugungsgitter 22 versehen, das von einem Eingangsstrahl 23 bestrahlt wird. Dieses Gitter wirkt mit einem Wellenleiter 24 zusammen, dessen Breite so ausgewählt ist, dass der Messbereich 5G eine derartige Breite aufweist, dass mehrere Reaktionsbereiche 6G1, 6G2 und 6G3 nebeneinander angeordnet werden können, wobei diese Breite auch der des Beugungsgitters entspricht. Bei der Analyse erzeugt dieser Biosensor BCG abgesehen vom Bezugsstrahl (hier nicht dargestellt) die drei aneinander grenzenden Strahlen 25-1, 25-2 und 25-3, die auf die Fluoreszenz zurückzuführen sind, die in den Proben angeregt wurde.
10 zeigt eine Querschnittsdarstellung eines Biosensors für ein erfindungsgemäßes Messsystem, der beispielsweise durch Feinstbearbeitung mithilfe von herkömmlichen photolithographischen Verfahren hergestellt wurde.
Auf ein Substrat aus Silizium 26 wird eine Schicht aus thermischem Siliziumoxid 27 aufgebracht. Auf diese Schicht 27 wird gezielt eine Schicht 28 aus einem Material aufgebracht, das dazu geeignet ist, eine Strahlung zu erzeugen, die auf spontane Fluoreszenz zurückzuführen ist. Diese Schicht bildet den Wellenleiter im Sinne der vorliegenden Erfindung. Im dargestellten Fall besteht die Schicht aus Siliziumnitrid und wurde durch die chemische Gasphasenabscheidung bei Niederdruck gewonnen. In 10 ist dargestellt, dass in dieser Schicht 28 die Messbereiche 29 und 30 abgegrenzt sind, die ein Zwischenraum 31 trennt. Eingangs- und Ausgangs- oder kombinierte Eingangs-/Ausgangs-Beugungsgitter (in 10 nicht dargestellt) werden durch lithographische Übertragung und Ätzen mit gepufferter Flusssäure oder reaktivem Plasmaätzen in die Schicht 28 eingebracht. Das Material, das für den Träger des Wellenleiters verwendet wird, kann auch ein Kunststoff sein, die Gitter können dann auch durch Prägen mithilfe eines Stempels oder durch Spritzgießen darin eingebracht werden. In diesem Fall wird die Schicht, die den Wellenleiter bildet, beispielsweise durch Gasphasenabscheidung bei niedriger Temperatur auf einen Träger des Biosensors aufgebracht.
Die Reaktionsbereiche 32 sind mit einem Reaktionsstoff oder Analyseelement bedeckt, der bzw. das bei diesem Beispiel Antikörper umfasst.
Über der Schicht, die den Wellenleiter bildet, ist ein Mikrofluidkreislauf angeordnet. Es handelt sich dabei um eine selektive Schicht 33 aus Siliziumoxid, die bei niedriger Temperatur aufgebracht wird, über der ein Abdeckmittel 34 angeordnet ist, das mit dieser selektiven Schicht 33 einen Kapillarkanal 35 begrenzt, über den die Probe zu den Reaktionsbereichen 31 und 32 gesaugt werden kann.
Bei allen Ausführungsformen und allen Abwandlungen, die gerade beschrieben wurden, kann gemäß weiteren vorteilhaften Merkmalen der Erfindung das Verhalten der Materialschicht, aus der der Wellenleiter besteht, so abgeändert werden, dass sie die Eigenschaft der spezifischen Fluoreszenz aufweist, die bei Anregung durch die Mode des Wellenleiters erzeugt wird. Es ist beispielsweise möglich, diese Materialschicht in einer mehr oder weniger großen Tiefe zu dotieren, wodurch diese spezifische Fluoreszenz bestimmt werden kann. So kann die Schicht erfindungsgemäß mit seltenen Erden wie Erbium und Europium dotiert werden, die die Eigenschaft aufweisen, Fluoreszenzstrahlungen mit ausgeprägten und ähnlichen Wellenlängen hervorzurufen, die sich von den Wellenlängen unterscheiden, die die immunologischen Reaktionen und das Material kennzeichnen, das für den Wellenleiter verwendet wird. Das Verhältnis der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die auf diese Dotierungsstoffe zurückzuführen ist, ist ein Hinweis auf die Temperatur des Biosensors. Diese Strahlung, die über ein Beugungsgitter aus dem Wellenleiter ausgekoppelt wird, kann dann mit Photomessfühlern gemessen werden, die mit den Mess- und Bezugsphotomessfühlern 8 und 9 von 2 verbunden sind. Dadurch kann durch Auswertung der Signale, die diese zusätzlichen Photomessfühler liefern, mittelbar nicht nur die Leistung ermittelt werden, die sich im Wellenleiter ausbreitet, sondern auch die Temperatur des Biosensors.
Das Temperatursignal kann auch genutzt werden, um die Temperatur des Biosensors zu regulieren, indem dafür eine vorher festgelegte Umgebungstemperatur geschaffen wird, die vorteilhaft für die immunologischen Reaktionen ist, die darin stattfinden.
11 zeigt stark vereinfacht eine Vorderansicht eines Messsystems, bei dem ein erfindungsgemäßer Biosensor verwendet werden kann.
Ein derartiges System umfasst ein Gestell (in 11 einfach durch das Viereck 36 angedeutet), auf dem ein Tisch 37 aufgebracht ist, der um eine waagerechte Achse schwenkbar ist. Dieser Tisch trägt eine Montagevorrichtung 38, in die die Einmalträger 39 eingesetzt werden können. Jeder Träger umfasst einen Biosensor 40, der ebenfalls zum einmaligen Gebrauch gedacht ist. In der Messstellung wird der Träger 39, der mit den V-förmigen Anordnungsnuten 41 versehen ist, von einer Feder 43, die von der Montagevorrichtung 38 getragen wird, gegen Stifte 42 gedrückt, die fest mit dem Gestell 36 verbunden sind.
Die Lichtquelle 7 ist ein Laser, der über einen Laserspiegel 45 eine Stelle im Bereich der Montagevorrichtung 38 bestrahlt, an der sich jeweils ein Kopplungsgitter 44 (11) des Biosensors 40 befindet. Der Photomessfühler 8 fängt über eine Fokussierlinse 46 die Strahlung auf, die auf spontane Fluoreszenz (Winkel α) zurückzuführen ist.
Die Messstrahlung wird aus dem Wellenleiter des Biosensors 40 in einem Winkel β ausgekoppelt, um über eine Fokussierlinse 47 vom Photomessfühler 9 erfasst zu werden.
Es ist somit ersichtlich, dass der Biosensor 40, der bei diesem Messsystem verwendet wird, die Ausführung aufweist, die zuvor hinsichtlich der Ausführungsform von 8 beschrieben wurde. Es ist jedoch zu bemerken, dass sich der Biosensor 40 von dieser konkreten Ausführungsform durch das Vorhandensein eines zweiten Kopplungsgitters 48 unterscheidet, mit dem Fluoreszenzstrahlungen aus dem Wellenleiter des Biosensors 40 ausgekoppelt werden können, die auf eine bestimmte Dotierung zurückzuführen sind, beispielsweise mit Erbium und Europium, wie zuvor beschrieben worden ist. Diese Strahlung wird an einen Sensor 49 geleitet, dessen Ausgangssignal zur Überwachung und über einen Regelkreis (nicht dargestellt) möglicherweise zur Steuerung der Energie, die die Quelle 7 in den Biosensor 40 sendet, oder auch dessen Temperatur verwendet werden kann.
Es ist abschließend festzuhalten, dass die Lage des schwenkbaren Tischs 37 mit einer Vorrichtung mit Mikrometerschraube 50 fein eingestellt werden kann, wodurch der Strahlengang der Lichtstrahlen genau eingestellt werden kann.

Claims

Messsystem, das optische Biosensoren (BC bis BCG) verwendet, die eine immunologische Reaktion und einen Fluoreszenzmarker verwenden, das dafür geeignet ist, durch eine evaneszente Welle angeregt zu werden, wobei jeder Biosensor umfasst: – einen Träger (26), – einen Lichtwellenleiter (1), der auf diesem Träger angeordnet ist, – mindestens ein Beugungsgitter (3, 4; 18), das in mindestens einer der Flächen (2) des Wellenleiters angeordnet ist, um jeweils einen Anregungsstrahl in den Wellenleiter zu koppeln und einen Messstrahl, der auf Fluoreszenz zurückzuführen ist, aus dem Wellenleiter auszukoppeln, – mindestens ein Analyseelement, das in mindestens einem Reaktionsbereich (6) befestigt ist, der auf der Fläche abgegrenzt ist, sodass es dazu beitragen kann, die Fluoreszenz des Markers in Zusammenwirkung mit einer zu analysierenden Probe anzuregen, wobei der Marker eine Fluoreszenzkurve besitzt, die einen Energiespitzenwert bei einer ersten vorgegebenen Fluoreszenzwellenlänge aufweist, – wobei der Wellenleiter (1) aus einem Material hergestellt ist, dessen Fluoreszenz spontan bei Vorhandensein eines Anregungsstrahls angeregt werden kann, – wobei das System auch eine Lichtquelle (7) umfasst, um das mindestens eine Beugungsgitter (3, 4) zu bestrahlen, einen ersten Photomessfühler (9), um die Fluoreszenzstrahlung zu erfassen, die aus dem Wellenleiter ausgekoppelt wird, dank dem mindestens einen Beugungsgitter (3, 4), wobei die Fluoreszenz auf den Marker zurückzuführen ist, – wobei dieses System dadurch gekennzeichnet ist, dass die Lichtquelle eine Wellenlänge aufweist, die es erlaubt, die Fluoreszenz des Materials des Wellenleiters anzuregen, wobei diese Fluoreszenz bei einer zweiten Wellenlänge liegt, die sich von der ersten Wellenlänge unterscheidet, und dadurch, dass dieses System auch einen zweiten Photomessfühler (8) umfasst, um die Fluoreszenzstrahlung zu erfassen, die aus dem Wellenleiter (1) ausgekoppelt wird, dank dem mindestens einen Beugungsgitter (3, 4), und die spontan in dem Wellenleiter (1) durch die Strahlung angeregt wird, die aus der Quelle (7) stammt, wobei der zweite Photomessfühler eine Bezugsmessung liefert.
Messsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiter (1) mit mindestens einer Dotiersubstanz dotiert ist, die dazu geeignet ist, die Wellenlänge der spontanen Fluoreszenz zu bestimmen, und dadurch, dass das System auch mindestens einen zusätzlichen Sensor (49) aufweist, um die fluoreszierende Strahlung zu erfassen, die bei der Wellenlänge dieser spontanen Fluoreszenz angeregt wird.
Messsystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dotiersubstanz unter den seltenen Erden wie Erbium und Europium ausgewählt ist.
Messsystem nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zusätzliche Sensor (49) mit einem Regelkreis verbunden ist, um mithilfe des Signals, das von diesem Sensor bereitgestellt wird, die Energie zu regeln, die dem Biosensor (40) zugeführt wird, oder die Temperatur des Biosensors.
Messsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material, aus dem der Wellenleiter hergestellt ist, Siliciumnitrid, Titanoxid oder Tantaloxid ist.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiter (1) aus einem Material hergestellt ist, das im Wesentlichen spontane Fluoreszenz aufweist.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiter (1) mit einer Substanz dotiert ist, die spontane Fluoreszenz hervorruft, wenn sie angeregt wird.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiter (1) mit einer Schicht eines Materials beschichtet ist, das spontane Fluoreszenz aufweist, wenn es angeregt wird, oder mit einer Schicht, die mit einem solchen Material dotiert ist.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor ein Beugungsgitter (18) umfasst, das mit dem Wellenleiter (1F) kommuniziert, sowohl für das Koppeln als auch für das Auskoppeln der Lichtstrahlen.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor mindestens ein Eingangs-Beugungsgitter (3) und mindestens ein Ausgangs-Beugungsgitter (4) aufweist, das mit dem oder den Wellenleiter(n) (1) kommuniziert.
Messsystem nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Beugungsgitter (3, 4; 18) aus Rillen gebildet ist, die in der Fläche (2) durch Feinstbearbeitung, durch Prägen oder Spritzgießen eingebracht sind.
Messsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche (2) des Wellenleiters, in dem mindestens ein Beugungsgitter angeordnet ist, eine im Allgemeinen rechteckige Form aufweist, und dadurch, dass die Rillen des Beugungsgitters (3, 4; 18) parallel oder senkrecht im Verhältnis zur großen Abmessung der Fläche ausgerichtet sind.
Messsystem nach Anspruch 11 und 12, wenn diese von Anspruch 10 abhängen, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor mindestens ein Kopplungs-Beugungsgitter (3A) aufweist, dessen Rillen senkrecht zur großen Abmessung der Fläche sind, und mindestens ein Auskopplungs-Beugungsgitter (4A-1 bis 4A-6), dessen Rillen parallel zu dieser Ausdehnung sind.
Messsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor mindestens eine Reihe Auskopplungs-Beugungsgitter (4A-1 bis 4A-6) umfasst, die an mindestens eine Reihe Reaktionsbereiche (6A-1 bis 6A-6) grenzt, und dadurch, dass die Reihe der Bereiche ebenso viele Bereiche umfasst wie Gitter in der Reihe Gitter vorhanden sind.
Messsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Reihen Ausgangs-Beugungsgitter (4A-1a bis 4A-6a; 4A-1b bis 4A-6b) zu beiden Seiten einer Reihe Reaktionsbereiche (6A-1 bis 6A-6) angeordnet sind.
Messsystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangs-Beugungsgitter (4A-1a bis 4A-6a; 4A-1b bis 4A-6b) der zwei Reihen so ausgerichtet sind, dass die Strahlungen, die sie aus dem Wellenleiter (1B) auskoppeln, sich verstärken.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsbereiche in einem Kapillarkanal (10, 11) für das Ansaugen der Probe angeordnet sind.
Messsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor darauf abnehmbar montiert ist.