DE69930723T2

DE69930723T2 - Verwendung des antikörpers 271.14d9.f8 (dsm acc2331) um die bindung zwischen alphavbeta6-integrin und fibronectin in vitro zu hemmen

Info

Publication number: DE69930723T2
Application number: DE69930723T
Authority: DE
Inventors: Simon Goodman; Beate Diefenbach; Francesc Mitjans; Ana Carceller; Elisabet Rosell-Vives
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-11
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2019-01-12
Also published as: AR014464A1; CN1168741C; SK10772000A3; WO1999037683A1; CA2319160A1; PL341569A1; JP2002501086A; BR9907218A; AU2716399A; CN1288469A; DE69930723D1; EP1049718B1; HUP0101151A3; EP1049718A1; KR20010034327A; ID27810A; ATE322508T1; NO20003767L; HUP0101151A2; ZA99453B

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung des monoklonalen Antikörpers, abgeleitet von der Hybridomzelllinie mit der Bezeichnung 271.14D9.F8, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2331, zur selektiven In-vitro-Inhibierung der Bindung einer αvβ6-Integrin-tragenden Zelle an das Integrin-Substrat Fibronectin.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Integrine sind eine Superfamilie der Zelloberflächen-Adhäsionsrezeptoren, die die Bindung von Zellen mit der festen extrazellulären Umgebung sowohl an die extrazelluläre Matrix (ECM) als auch an andere Zellen steuern. Die Adhäsion ist für eine Zelle von fundamentaler Bedeutung; sie schafft Verankerung, Signale zur Wanderung und Signale für Wachstum und Differenzierung. Integrine sind direkt an zahlreichen normalen und pathologischen Zuständen beteiligt, und sind als solche primäre Ziele für eine therapeutische Intervention. Integrine sind integrale Transmembranproteine, Heterodimere, deren Bindungsspezifität davon abhängt, welche von ungefähr 15 α-Ketten mit welchen von ungefähr 8 β-Ketten kombiniert ist. Die Integrine sind in vier überlappende Subfamilien unterteilt, die die β1-, β2-, β3- oder αv-Ketten enthalten, und eine bestimmte Zelle kann mehrere verschiedene Integrine aus jeder Subfamilie exprimieren. Das letzte Jahrzehnt hat gezeigt, dass Integrine die Hauptrezeptoren sind, die an der Zelladhäsion beteiligt sind. Über Integrine wird beispielsweise von E. Ruoslahti (J. Clin. Invest, 1991, 87) und R. O. Hynes (Cell, 1992, 69) berichtet, und sie können so ein geeignetes Ziel für die therapeutische Intervention sein.
Außer Erythrozyten exprimieren alle Humanzellen ein oder mehrere Integrine. Ihre Funktionen sind in vielen Stufen reguliert, jedoch hängt ihre Ligandenspezifität in erster Linie davon ab, welche α-Kette mit welcher β-Kette in dem Heterodimer zusammenkommt sowie von dem Aktivierungszustand der Integrine (Hynes, 1992; Diamond und Springer, 1994). Der zelluläre Hintergrund, in dem die Integrine arbeiten (Chan und Hemler, 1993), und die Spleißvariantenform des verwendeten Integrins (Delwel et al., 1993) können die Spezifität ebenfalls beeinträchtigen. Angesichts dieser Komplexitäten, einer der
Die Geschichte der Integrinforschung hat gezeigt, dass Reagenzien, die die Integrinfunktion spezifisch blockieren können, entscheidende Faktoren bei der funktionellen Analyse sind, und zwar von der Funktion Blockieren des CSAT-Antikörpers, der zuerst eine Integrin-β1-Kette definierte (Neff et al., 1982), bis hin zu zahlreichen entscheidenden späteren Beispielen (beispielsweise P1D6, P1B5 (Wayner und Carter, 1987), P4C10 (Carter et al., 1990) und LM609 (Cheresh und Spiro, 1987)); das Gebiet hängt absolut von solchen Reagenzien ab.
Die Integrine der αv-Reihe werden mittlerweile als Haupt-Unterfamilie angesehen, die sowohl klassische als auch neue Funktionen aufweisen. Die αv-Integrine sind sowohl bei der klassischen Vermittlung von Zellbindung und Verbreitung (Pytela et al., 1985; Cheresh, 1991) als auch an der Zellbewegung (Seftor et al., 1992), bei der Rezeptor-Internalisierung (Panetti und McKeown Longo, 1993a; Panetti und McKeown Longo, 1993b), als Virus-Corezeptoren (Wickham et al., 1993), beim Abwickeln der extrazellulären Protease-Kaskaden (de Boer et al., 1993) und als Regulatoren der Tumorprogression (Felding-Habermann et al., 1992) beteiligt. Die Spezifitäten der fünf bekannten Integrine der αv-Reihe, αvβ1 (Zhang et al., 1993), -β3 (Pytela et al., 1985; Cheresh et al., 1987), -β5 (Cheresh et al., 1989), -β6 (Busk et al., 1992) und -β8 (Moyle et al., 1991) wurden partiell definiert und sie scheinen ausschließlich Liganden zu erkennen, die die RGD- (NH₂-Arginin-Glycin-Asparaginsäure-COOH)-Tripeptid-Sequenzen tragen, einschließlich derjenigen in Vitronectin (αvβ1, αvβ3, αvβ5), Fibronectin (αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6) und von Willebrand-Faktor, Fibrinogen und Osteopontin (αvβ3) (beispielsweise 1991; Busk et al., 1992; Zhang et al., 1993; Denhardt und Guo, 1993; Smith und Cheresh, 1990;).
Bekanntlich sind αvβ3 und αvβ5 an der Tumorangiogenese beteiligt, wohingegen αvβ6 ein Costimulator der Kolon-Karzinomzellproliferation ist, und sie werden während der entzündlichen Epithelproliferation und Epithelkarzinogenese hochreguliert (Breuss et al., J. Cell. Sci. 108: 2241–2251, 1995). Seine Expression scheint das neohyperproliferative Epithel zu kennzeichnen (Zambruno et al., J. Cell. Biol. 129, 853–865 (1995)). Die Integrin-Überexpression kann einen psoriasisartigen Modellzustand hervorbringen. Spezifische Antagonisten und Agonisten von αvβ6-Integrinen können somit ein breites therapeutisches Potential aufweisen.
RGD-Peptide blockieren die αvβ6-Bindung, aber sie blockieren auch andere Zelloberflächen-Fibronectin-Rezeptoren, einschließlich α5β1 (Pytela, R. et al., Cell (1985) 40, 191–198) und αvβ3 (Pytela, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5766–70 (1985)). Es wurden inhibitorische Antikörper beschrieben, die auf sämtliche αv-Integrine (Lehmann et al., Cancer Res. 54, 2102–2107 (1994)) und die αvβ3- oder αvβ5-Komplexe (Weinacker et al., J. Biol. Chem. 269, 6940–6948) (1994)) zielen, aber man kennt kein Reagenz, das selektiv αvβ6 hemmt.
Es wurde zuvor eine Reihe von Antikörpern beschrieben, die humane Integrin-αv-Ketten binden, einschließlich der "nicht inhibitorischen" MAk 14D9.F8 (Mitjans er al., 1. Cell. Sci. 108, 2825–2838 (1995)).
Einer der von Mitjans et al. offenbarten Antikörper ist 17E6, der an Humanintegrin αv bindet und der sämtliche Integrine hemmt, die diese Kette enthalten. Als solcher ist er "nichtselektiv". Zudem offenbaren Mitjans et al. die Bindungseigenschaften von 14D9.F8, von dem gezeigt wird, dass er die Wechselwirkung zwischen UCLA-P3 (das αvβ3 exprimiert) und Vitronectin schwach hemmt. Mitjans et al. offenbaren jedoch nicht die überraschend hohe Selektivität von 14D9.F8, indem er die Wechselwirkungen einer definierten Subklasse von αv-Integrinen (αvβ6, αvβ3) mit ihren entsprechenden Substraten hemmt, und gleichzeitig keine Reaktivität auf αvβ5 zeigt.
Lehman et al. (Cancer Res. 54, 2102–2107 (1994)) beschrieben den monoklonalen Antikörper (69-6-5), der ähnlich wie 17E6 von Mitjans et al., die Integrinkette αv bindet und sämtliche Integrine hemmt, die diese Kette enthalten. Als solcher ist er "nichtselektiv" für die Integrine der αv-Reihe.
Kemperman et al. (Exp. Cell. Res. 234, 154–164 (1997)) offenbaren den Antikörper L230, der wie 17E6 und 69-6-5 die αv-Kette bindet und sämtliche Integrine der αv-Serie hemmt, und den Antikörper 33B6, der die β6-Kette bindet, aber nicht inhibitorisch ist. L230 ähnelt 17E6 von Mitjans et al., 33B6 ist nicht inhibitorisch und es wurde nicht beschrieben, dass dieser die Wechselwirkung zwischen αvβ6 und Ligand beeinträchtigt.
In EP 0 719 859 A1 wird der Antikörper von Mitjans et al., 17E6, verwendet, der sämtliche αv-Integrine bindet und hemmt.
Breuss et al., (J. Cell Sci., 108, 2241–2251 (1995)) offenbaren die monoklonalen Antikörper 9G6 und R6G9, die die Integrin-β6-Kette binden, aber nicht hemmen. Diese Antikörper sind nicht inhibitorisch und es wurde bisher nicht beschrieben, dass sie die Wechselwirkung zwischen Integrin αvβ6 und Ligand beeinträchtigen.
Aus der vorstehend erörterten Literatur sind einige Integrin-bindende Antikörper im Stand der Technik bekannt. Diese Antikörper, einschließlich 14D9.F8, der von Mitjans et al., erwähnt wird, unterscheiden jedoch kein αv-Integrin vom andern, oder es ist zumindest nicht bekannt oder wird gar erwartet, dass sie diese wichtige Eigenschaft aufweisen.
Folglich besteht der Bedarf, einen Antikörper zu besitzen, der die Wechselwirkungen einer definierten Subklasse von αv-Integrinen (αvβ6, αvβ3) mit ihren entsprechenden Substraten blockiert und gleichzeitig keine Reaktivität mit αvβ5 aufweist.
Es wurde überraschend von den Erfindern der vorliegenden Patentanmeldung gefunden, dass der Antikörper 14D9.F8 zur selektiven In-vitro-Inhibierung der Bindung einer αvβ-Integrin tragenden Zelle an das Integrinsubstrat Fibronectin verwendet werden kann.
ÜBERSICHT, MATERIALIEN, FIGUREN, TABELLEN
Die Reinigung und Quellen für Proteine, Zelllinien und ihre Anzucht, ELISA, Adhäsionsassays, FACS-Analyse und die Produktion und Charakterisierung der verwendeten Antikörper wurden an anderer Stelle eingehend beschrieben (Mitjans, F. et al., J. Cell Sci. 108, 2825–2838 (1995)). Die Maks 14D9.F8, 11D1 und 17E6 wurden aus serumfreien Hybridom-Überständen durch Protein-A-Affinitäts-Chromatographie, gefolgt von der Entfernung der Endotoxine, gereinigt, und sie waren durch SDS-PAGE >99% rein (Mitjans, F. et al., J. Cell Sci. 108, 2825–2838 (1995)). Der monoklonale Maus-Antikörper 11D1 ist ein IgG₁, das gegen Integrin β5 gerichtet ist. Die Molekülmasse von 155 kDa wird für Maus-IgG angenommen. Die Präparation der verkürzten Transmembranrekombinante αvβ6 war im Wesentlichen wie in Weinacker, A. et al., J Biol. Chem. 269., 6940–48 (1994) beschrieben. P3D10 (Agrez, M. et al., J. Cell Biol. 127, 547–556 (1994)), E. Wayner (Universität Minnesota, Minneapolis) und 4B7, J. Marshall (IRCF, London), wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Antikörperselektivität der verwendeten Antikörper ist in der Tab. 1 zusammengefasst, und das Integrinprofil der verwendeten Zelllinien ist in der Tab. 2 zusammengefasst. Die Zelllinie wurde an der Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2331 hinterlegt.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen enthalten auch leicht variierte oder veränderte Sequenzen, wie Mutanten und Varianten, die absichtlich oder zufällig durch chemische oder physikalische Verfahren erhalten werden. Gewöhnlich sind all diese Mutanten und Varianten, die die beschriebenen Eigenschaften und Funktionen aufweisen, aufgenommen.
Der Begriff Antikörper umfasst in der Regel auch Antikörperfragmente, wie Fab', F(ab')₂ oder einzelkettige Fvs. Diese Fragmente können durch übliche Standard-Techniken hergestellt werden.
Tabelle 1
Die Ableitung und Charakterisierung dieser Antikörper ist in der aufgeführten Literatur und in dieser Beschreibung definiert.
Tabelle 2
Die Integrin-Expressionsprofile dieser Linien wurden durch Oberflächenmarkierung und FACS-Analyse oder Immunfällung definiert. (FACS = Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer).
1 Mak 14D9. F8 bindet αv-Integrin-Ketten in mehreren Zusammenhängen:
Rekombinantes lösliches αvβ3 (A), Plazenta αvβ5 (B), rekombinantes lösliches αvβ6 (C) und Blutplättchen αIIbβ3 (D) (alle bei 1 μg ml^–1) wurden auf ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen absorbiert und mit den angegebenen Konzentrationen der Maks 14D9.F8 (ausgefüllte Quadrate), 17E6 (ausgefüllte Kreise), 4B7 (ausgefüllte Dreiecke mit der Spitze nach oben), 11D1 (ausgefüllte Dreiecke mit der Spitze nach unten), AP3 (ausgefüllte Rhombus), E7P6 (offene Kreise) getestet und wurden als Hybridom-Überstand verwendet, wobei der 5 μg/ml-Punkt eine Überstand-Verdünnung von 1:5 darstellt. Gebundener Antikörper wurde mit Peroxidase-konjugierter anti-Maus IgG nachgewiesen. Fehlerbalken = SD (n = 3).
2 Mak 14D9.F8 hemmt die Zelladhäsion an Fibronectin, aber nicht an Vitronectin:
Das HT-29 Kolon-Karzinom (A, B), UCLA-P3-Lungenkarzinom (C, D), WM-164 Melanom (E,F) konnten an Platten binden, die mit 5 μg ml^– ¹-Lösungen Fibronectin (A, C ,E) oder Vitronectin (B, D, F) in Anwesenheit der angegebenen Kon zentrationen der Maks 14D9.F8 (ausgefüllte Quadrate), 17E6 (ausgefüllte Kreise), P1F6 (ausgefüllte Dreiecke mit der Spitze nach unten), P4C10 (ausgefüllte Dreiecke mit der Spitze nach oben), LM609 (ausgefüllter Rhombus) beschichtet waren. Nach 1 Std. wurden die ungebundenen Zellen weg gewaschen, und die gebundenen Zellen durch Bewerten der lysosomalen Hexosaminidase erfasst. Die Bindung wurde normalisiert, wobei die maximal gebundenen Zellen als 100% verwendet wurden. Die tatsächlichen Zellbindungen an Fibronectin bzw. Vironectin waren HT-29 (27%, 53%), UCLA-P3 (42%, 64%), WM 164 (84%, 50%). Fehlerbalken = SD (n = 3).
3 Mak 14D9.F8 wirkt selektiv auf das αvβ6-Integrin.
SW480 Zellen, die scheintransfiziert (mock) waren oder mit Volllängen-Human-β6-Integrin (Beta-6) transfiziert waren, konnten an Platten, die mit Fibronectin (FN) oder Vitronectin (VN) beschichtet waren, für 1 Std. in der Anwesenheit von 10 μg ml^–1 Antikörpern wie in 2 beschrieben binden. Fehlerbalken = SD (n = 3).
Literaturstellen

1. Weinacker, A., Chen, A., Agrez, M., Cone, R. I. Nishimura, S., Wayner, E., Pytela, R., und Sheppard, D. (1994) J. Biol. Chem. 269, 6940–6948
2. Agrez, M., Chen, A., Cone, R. I., Pytela, R., und Sheppard, D. (1994) J. Cell Biol. 127, 547–556
3. Mitjans, F., Sander, D., Adan, J., Sutter, A., Marinez, J. M., Jäggle, C., Moyano, J., Kreysch, H.-G., Piulats, J., und Goodman, S. L. (1995) J. Cell Sci. 108, 2825–2838
4. Cheresh, D. A. und Spiro, R. C. (1987) J. Biol. Chem. 262, 17703–17711
5. Houghton, A. N., Eisinger, M. Albino, A. P., Cairncross, J. G., und Old, L. J. (1982) J. Exp. Med. 156, 1755–1766
6. Carter, W., Wayner, E., Bouchard, T., und Kaur, P. (1990) J. Cell Sci. 110, 1387–1404
7. Furihata, K., Nugent, D. J., Bissonette, A., Aster, R. H., und Kunicki, T. J. (1987) J. Clin. Invest. 80, 1624–1630
8. Ebert, E. C. (1996) Dig. Dis. Sci. 41, 1551–1556
9. Koretz, K. Bruderlein, S. Henne, C., Fietz, T., Laque, M., und Moller, P. (1994) Virchows Arch. 425, 229–236

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Der monoklonale Antikörper 14D9.F8 bindet fest an αvβ1-, αvβ3-, αvβ5- und αvβ6-Integrine. Im ELISA an gereinigten Human-Integrinen zeigten 14D9.F8 und 17E6 identische Reaktionsprofile, und es waren ähnliche Konzentrationen von Antikörpern vonnöten, um 50% maximale Bindung zu erhalten (1). 14D9.F8 reagierte nicht mit αIIbβ3, was zeigt, dass er die αv-Kette anzielt, wie es zuvor aus einer FACS-Analyse geschlossen wurde (Mitjans, F. et al., J. Cell Sci. 108, 2825–2838 (1995)). 14D9.F8 hatte wenig Einfluss auf die Zellbindung, die durch αvβ5 vermittelt wird, und schwache bis mäßige Wirkungen auf die Bindung, die durch αvβ3 und αvβ1 vermittelt wird (Mitjans, F. et al., J. Cell Sci. 108, 2825–2838 (1995)). Wurde jedoch 14D9.F8 auf seine Fähigkeit zur Beeinträchtigung der Zellbindung von HT-29- und UCLA-P3-Karzinom-Zellen an Fibronectin und UCLA-P3-Karzinom-Zellen an Fibronectin getestet, stellte sich heraus, dass er äußerst aktiv war (2). 14D9.F8 beseitigte die NT-29-Zelladhäsion an Fibronectin mit einer IC₅₀ von ungefähr 0,3 nM, während er auf Vitronectin bis zu 600 nM ziemlich stimulatorisch war. Der Grund dafür ist nicht klar. Die Bindung von HT-29 an Vitronectin wurde vollkommen durch P1F6 gehemmt, und die Bindung an Fibronectin war unempfindlich gegen P1F6, wurde aber durch 17E6 beseitigt. LM609 reagierte nicht mit HT-29- oder UCLA.P3-Zellen (Mitjans, F. et al., J. Cell. Sci. 108, 2825–2838 (1995)) und hatte keine Wirkung auf ihre Bindung an Vitronectin oder Fibronectin (2A, 2B). Somit moduliert ein αv-Intgrin, aber nicht αvβ3 oder αvβ5 die NT-29-Adhäsion an Fibronectin, und dieses Integrin wird selektiv durch Mak 14D9.F8 blockiert, wohingegen die Integrine, die die Adhäsion an Vitronectin vermitteln, durch Mak P1F6 inaktiviert werden, und dieses Integrin wird schwach durch 14D9.F8 gehemmt.
Für den Nachweis, dass es keine Besonderheit von HT-29-Zellen war, wurden die Hemmungsexperimente mit UCLA-P3, einer Karzinomzelle aus einer anderen Quelle, nämlich Lunge, die hohe Spiegel αvβ5 und αvβ6 exprimiert, wiederholt und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten (2C, 2D).
Mak 14D9.F8 beseitigte die Zelladhäsion an Fibronectin, wobei die Adhäsion vorwiegend durch 17E6-empfindliche Moleküle mit einem gewissen Beitrag von P4C10-empfindlichen Molekülen (mutmaßlich αvß5 oder αvβ1) vermittelt wird. Auf Vitronectin hemmte 14D9.F8 bis zu 30% der Zellbindung, aber P1F6 beseitigte diese. Wenn, wie man annimmt, P1F6 selektiv für αvβ5 ist (Weinacker et al., J. Biol. Chem. 269, 6940–6948 (1994)), legen diese Daten nahe, dass das Integrin bei UCLA-P3, das die Bindung an Fibronectin vermittelt, αvβ5 ist, und dieses Molekül wird durch 17E6 um etwa 4 Größenordnungen stärker als durch 14D9.F8 gehemmt. Wie in ELISA und FACS binden 17E6 und 14D9.F8 αvβ3, αvβ5 und αvβ6 mit sehr ähnlicher Konzentrationsabhängigkeit. Dies ist ein unerwarteter Befund.
Melanomzelllinien exprimieren einheitlich αvβ5, αvβ3 oder αvβ1, aber kein αvβ6 oder αvβ8 (Marshall, J.F. et al., Semin. Cancer Biol, 129–138 (1996). Wie in der 2E, 2F gezeigt, war auf WM164-Melanom-Zellen die Bindung an Fibronectin gegenüber αv-Inhibitoren unempfindlich, wohingegen die Bindung an Vitronectin durch 17E6 und zu ungefähr 50% durch 14D9.F8 und bis zu 80% durch LM609 blockiert wurde. Die Zugabe von P1F6 an LM609 oder 14D9.F8 hemmt vollständig die WM164-Bindung an Vitronectin. Dies zeigte, dass die Bindung durch LM609 und P1F6-empfindliche Moleküle vermittelt wurde, und dass das LM609-, aber nicht das P1F6-empfindliche Ziel auch durch 14D9.F8 gehemmt wurde.
Viele Karzinom-Zellen exprimieren αvβ6 (Sheppard, D. (1996) Bioassays 18, 655–660). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Karzinom-Zelladhäsion an Fibronectin zum Großteil durch αvβ6 vermittelt wurde, und dass 14D9.F8 dieses Molekül selektiv hemmte, wohingegen es αvβ3 und αvβ5 nicht hemmt. Dies wurde bestätigt, indem die Bindung der SW480-Zelllinie, transfiziert mit Volllängen-Human-β6, in Anwesenheit von 14D9.F8 transfiziert wurde. Auf Fibronectin wurden die SW480-β6-Transfektanten wenig durch P3D10 beeinträchtigt, wohingegen 14D9.F8, 17E6 und L230 allesamt leistungsfähige Inhibitoren der Bindung waren (3A). Die Bindung von scheintransfiziertem SW480 an Fibronectin, wo sie ausschließlich α5β1 als Adhäsionsrezeptor verwenden, konnte stark mit Mak P3D10 blockiert wurde (3B) (Weinacker, A. et al., J. Biol. Chem. 269, 6940–6948 (1994)) und 17E6, L230 und 14D9.F8 hatten nur eine leichte zusätzliche Aktivität, möglicherweise aufgrund der Hemmung von αvβ1 (Marshall, J.F. et al., J. Cell Sci. 108, 1227–1238 (1995)).
Wiederum wurde die Zelladhäsion auf Vitronectin stark durch P1F6 und 17E6 gehemmt, wurde aber durch 14D9.F8 (3C) nicht beeinflusst. Zusammen zeigen diese Daten, dass 14D9.F8 selektiv αvβ6 und αvβ3 stärker als αvβ1 hemmt, und αvβ5 nicht beeinträchtigt, obwohl es all diese Integrine stark bindet.
Die molekularen Einzelheiten dieses Verfahrens sind unbekannt, jedoch ist eine allgemeine Interpretation der Daten, dass wesentliche Änderungen der Integrinkonformation nach der Ligandenbindung auftreten (Schwanrtz, M.A. et al., Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 549–599 (1995)). Es wird daher die Möglichkeit bevorzugt, dass bei Bindung von 14D9.F8 an die αv-Kette von αvβ6 und αvβ3 eine Bewegung der β-Ketten gegen die αv-Kette verhindert wird, welche notwendig ist, damit eine Ligandenbindung möglich ist. Ein Sequenzvergleich zeigt potentielle Sequenzen, die die notwendige Konservierung zwischen β3 und β6 aufweisen, und die bei dem möglicherweise beteiligten β5 variieren. (unveröffentlichte Beobachtungen).
BEISPIELE
Beispiel 1: Materialien
Tiere: Die Mäuse für die Antikörper-Produktion (BALB/c-Weibchen; 8 Wochen alt) und für Tumor-Modelle ("Nacktmäuse": weibliche homozygote athymische BALB/c nu/nu; 4 bis 5 Wochen alt) stammten von Criffa (Barcelona, Spanien). Die Nacktmäuse wurden in einem Sterilraum in Mikroisolatorkäfigen gehalten, und wurden mit sterilem Futter und Wasser ad libitum gefüttert. Sämtliche Arbeitsschritte erfolgten in einer Sterilbank.
Proteine: Fibronectin (Ruoslahti et al., 1982), Vitronectin (Yatohgo et al., 1988) wurden aus frischem gefrorenem Humanplasma gereinigt. Wenn nicht anders angegeben, erfolgten sämtliche Arbeitsschritte bei 20°C, und alle Waschschritte erfolgten mit calcium- und magnesiumfreiem PBS ("PBS": 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄; pH-Wert 7,4). PBS++ ist PBS mit zugefügtem 1 mM MgCl₂ und 1 mM CaCl₂. Wenn nicht speziell angegeben, waren die Chemikalien von der höchsten verfügbaren Reinheit. Cyclische Peptide wie RGDfV wurden nach bekannten Standard-Techniken synthetisiert (beispielsweise FEBS Let. 291, S. 50–54, 1991)
Tumor-Zellinien und Kulturen – Die American Type Culture Collection (ATCC) lieferte HT29-Human-Karzinome, das UCLA-P3-Human-Lungen-Adenokarzinom (Cheresh et al., 1989) (Dr. D.A. Cheresh; Scripps) und das WM164-Melanom (Dr. M. Herlyn; Wistar) (Herlyn et al., 1990). Sämtliche Zellen wurden bei 37°C in 7,5% CO₂ 92,5% Luft in 90% RPMI 1640, 10% fötalem Kälberserum (FCS) plus 2 mM L-Glutamin gezüchtet und waren im Wesentlichen frei von Mycoplasma, wie es durch einen handelsüblichen Test bestimmt wurde (Mycotect Kit; Gibco).
Antikörper – Monoklonale Antikörper (Mak)-Fusionen, ELISA-Screening, Subklonierung und Erhaltung der Kulturen wurden wenn nicht anders angegeben jeweils mittels Standard-Technologien durchgeführt (Harlow und Lane, 1988).
Beispiel 2:
Immunisierung Maks gegen αvβ3 wurden hergestellt durch intraperitoneale (ip) Injektion von gereinigtem plazentalem αvβ3, immobilisiert auf Sepharose (80 μg αvβ3 auf 80 μl Sepharose in 200 μl PBS) oder von lebenden M21 Zellen (1 × 10⁶ Zellen in 0,5 ml PBS) alle zwei Wochen über zwölf Wochen. Vier Tage nach der letzten Injektion wurde eine PEG-induzierte Fusion mit Friendly Myeloma (Ventrex) als Partner durchgeführt. Antikörper gegen das 200 kDa Melanom-assoziierte Oberflächenprotein wurden durch Immunisierung von intakten M21-Zellen (1 × 10⁶ Zellen in 0,5 ml PBS) hergestellt.
Screening ELISA auf Rezeptoren und auf fixierten M21-Zellen wurden verwendet. Für Rezeptor-ELISA wurden ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech) mit gereinigtem αvβ3 (1 μg/ml in PBS, 16Std., 4°C) beschichtet, blockiert (1,5% Magermilch in PBS; 1 Std; 4°C) und mit Hybridom-Überständen inkubiert. Gebundene Immunglobuline wurden mit alkalischem Phosphatase-Konjugat-Anti-Maus Ig (Dako) mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat erfasst. Für zellulären ELISA wurden die UCLAP-3-Zellen vor der Inkubation mit Hybridom-Überständen und Erfassung wie in Rezeptor-ELISA auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen fixiert (4% Paraformaldehyd in PBS, 15 min 20°C) und blockiert (3% BSA, PBS, 1 Std. 4°C). Positive Hybride wurden dreimal durch einschränkende Verdünnung subkloniert und an RPMI-Medium angepasst. Der Immunglobulin-Isotyp wurde bestimmt mit subklassenspezifischen Schwereketten-Antikörpern (Zymed) oder Leichte-Ketten-Antikörpern (Promega).
Andere Maus-Antikörper, die in den Untersuchungen verwendet wurden, wurden freundlicherweise von unseren Kollegen zur Verfügung gestellt: M609 gegen αvβ₃, P4C10 gegen β1-Integrin (Carter et al., 1990) (Telios) und AP3 gegen die β3-Kette (Furihata et al., 1987) (ATCC).
Beispiel 3:
Antikörper-Reinigung und Scale-up – Für die Reinigung im großen Maßstab wurden die Antikörper-Überstände aus Kulturen in der exponentiellen Phasen geerntet, die in Rollflaschen gezüchtet wurden. Die Antikörper, die auf Protein-Sepharose CL-4B (Pharmacia) gereinigt wurden, wurden gegen PBS vor der Sterilfiltration (0,45 μm) und Aufbewahrung bei –70°C (Harlow und Lane, 1988) dialysiert. Gereinigte Antikörper wurden von Endotoxinen befreit, indem sie auf Kurimover-II-Säulen (Kurita-Vater; Tokyo) aufgetragen wurden. Dies reduzierte die Endotoxin-Spiegel von >250 IU Endotoxin mg^–1 Antikörper auf < 0,2 IU mg^–1 im Limulus-Assay (Melvaer und Fystro, 1982). F(ab')₂- und F(ab)'-Fragmente von 17E6 (Maus-IgG₁) wurden durch Standard-Techniken der Pepsin-Spaltung und Trennung auf Protein-A-Säulen (Pharmacia), gefolgt von Papin-Spaltung und Trennung durch Gelfiltration (Harlow und Lane, 1988) hergestellt.
Integrin-Reinigungen
αvβ5 wurden aus Human-Plazenta (Smith und Cheresh, 1988) gereinigt. Reife Plazenta wurde zerkleinert und in ~2 Volumen eiskalter Lösung A (0,05% w/v Digitonin, 2 mM CaCl₂, 2 mM PMSF, pH-Wert 7,4) gewaschen, dann filtriert. Das zurückbleibende Material wurde in ~4 Volumen eiskaltem Puffer B (100 mM Octyl-β-D-Glucopyranosid [OG], 1 mM CaCl₂, 2 mM PMSF in PBS) extrahiert und zentrifugiert (12000gmax, 45min; 4°C). Der Überstand wurde über einer P3D10-Säule (16 Std.; 4°C) rezirkuliert (16 Std.; 4°C). Nach dem Waschen mit Puffer C (0,1% NP-40 in PBS; ~10 cv) und Puffer D (0,1% NP-40, 2 mM CaCl₂, 10 mM NaAcetat; pH-Wert 4,5: ~10cv) wurde gebundenes Material mit Puffer E eluiert (Puffer D, eingestellt auf pH-Wert 3,1). Das Elutionsmittel wurde mit 3M Tris (pN-Wert 8,8) neutralisiert, gegen Puffer C dialysiert, und ~10x mit Aquazid II (Calbiochem) konzentriert. Die gereinigten Rezeptoren wurden bei –70°C aufbewahrt.
Rekombinante α_vβ₃ und α_vβ₆ wurden aus mit Baculovirus infizierten High-Five-Zellen durch Affinitätschromatographie auf LM609 (α_vβ₃) und 17E6 (α_vβ₆) unter Elution, Konzentration und Aufbewahrung wie für α_vβ₅ gereinigt. α_IIbβ₃ wurde aus Human-Blutplättchen (Pytela et al., 1986) hergestellt. Alte Blutplättchen-Konzentrate wurden mit einem Volumen Tyrodes-Puffer gemischt, pelletiert (1200 gmax), und das Pellet mit Lysepuffer (50 mM OG, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 1 μM MnCl₂, 2 mM PMSF, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl; pH-Wert 7,4) extrahiert (1 Std.; 20°C). Nach der Zentrifugation (32000 gmax, 30 min; 4°C) wurde der Überstand (16 Std.; 4°C) über eine GRGDSPK-konjugierte CL-4B-Sepharose-Säule rezirkuliert. Die Säule wurde mit Lysepuffer (~10 cv) gewaschen und mit dem GRGDSPK (3 mg ml^–1 in 90% Lysepuffer, 10% DMSO) eluiert. Der Peak wurde ~5fach konzentriert, gegen modifizierten Lysepuffer, (0,1% NP-40, ausgetauscht gegen OG) dialysiert und bei –70°C aufbewahrt. Die Integrin-Präparate waren ~95% rein, wie es durch Anti-Integrin-ELISA mit α- und β-kettenspezifischen monoklonalen Antikörpern und durch SDS-PAGE beurteilt wurde.
Tabelle 1
Tabelle 2

Claims

Verwendung des monoklonalen Antikörpers, abgeleitet von der Hybridomzelllinie mit der Bezeichnung 271.14D9.F8, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2331, zur selektiven In-vitro-Inhibierung der Bindung einer αvβ6-Integrin-tragenden Zelle an das Integrin-Substrat Fibronectin.