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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Retrovirenvektorpartikeln
mit Empfängerzellenspezifität bei der
Herstellung eines Medikamentes. Die Retrovirenvektorpartikel umfassen
einen Retrovirenvektor mit einem Chimärenhüllprotein, das aus einer Antigenbindungsstelle
eines Antikörpers
oder einem anderen mit dem Hüllprotein
des Retrovirenvektors fusionierten Peptid besteht. Die Antigenbindungsstelle
bzw. das andere Peptid ersetzt oder unterbricht die natürliche Virenrezeptorbindungsstelle.
Die entstehende Chimärenhülle wird
als „Empfängerhülle" bezeichnet. Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Retrovirenvektoren,
die nicht nur das Empfängerhüll-, sondern
auch ein Wildarthüllprotein
enthalten. Die zusätzlich
zu der Empfängerhülle vorliegende
Wildarthülle
fungiert als Helfermolekül,
indem sie eine voll funktionsfähige
Membranfusionsdomäne
bereitstellt, die bei den Empfängerhüllen beschädigt sein
kann. Diese Helferfunktion ermöglicht
und/oder verstärkt
die Infektion von Zellen, die keinen Rezeptor für die Wildarthülle enthalten,
sondern einen Rezeptor zur Bindung des Empfängermoleküls. Wir stellen darüber hinaus
ein Verfahren zur Herstellung der Retrovirenpartikel sowie zur Verwendung
der Retrovirenvektoren zur Einschleusung von Genen in Wirbeltierzellen
bereit.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Die
Offenbarungen, auf die hierin Bezug genommen wird, veranschaulichen
den Hintergrund der Erfindung und stellen weitere Einzelheiten bezüglich ihrer
Anwendung bereit. Zweckmäßigerweise
wird in dem nachfolgenden Text auf die Offenbarungen Bezug genommen;
diese sind in der beigefügten
Bibliographie entsprechend aufgeführt.
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Retrovirenvektoren
sind die effizientesten Instrumente zur Einschleusung von Genen
in Wirbeltierzellen. Es wurden klinische Experimente zur Verwendung
von Retrovirenvektoren zur Behandlung einer genetischen Erkrankung
beim Menschen (Adenosindeaminasemangel, ADA-Mangel) durchgeführt. Neben
der Korrektur angeborener Stoffwechselfehler wird die Gentherapie
derzeit auch in klinischen Studien zur Behandlung von Krebs und
verschiedenen anderen Krankheiten getestet (Science 1992, Band 258,
S. 744-746).
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Retrovirenvektoren
sind im Wesentlichen Retrovirenpartikel, die ein Genom enthalten,
in dem alle Virenproteincodierungssequenzen durch das/die Gene)
von Interesse ersetzt sind. Als Ergebnis können sich solche Viren nach
einer Infektion nicht mehr replizieren. Retrovirenvektorpartikel
werden durch Helferzellen erzeugt (1).
Solche Helferzellen sind Zelllinien, die Plasmidkonstrukte enthalten,
die sämtliche
für die
Replikation notwendigen Retrovirenproteine exprimieren. Nach der
Transfektion des Vektorgenoms in solche Helferzellen wird das Vektorgenom
in den Virenpartikeln eingekapselt (aufgrund der Gegenwart spezifischer
Einkapselungssequenzen). Die Viruspartikel werden von der Helferzelle,
die ein nur das/die Gene) von Interesse enthaltendes Genom trägt, freigesetzt
(1). In den letzten 10 Jahren wurden
verschiedene Retrovirenvektorsysteme aus Hühner- oder Mäuseretroviren
für die
Expression verschiedener Gene entwickelt (Reviews siehe Temin 1987,
Gilboa 1990).
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Retrovirenvektoren
haben unterschiedliche Beschränkungen.
Neben der begrenzten Genomgröße, die
in Virenpartikeln eingekapselt werden kann, ist der am stärksten einschränkende Faktor
für die
Anwendung von Retrovirenvektoren der eingeschränkte Wirtsbereich des Vektorpartikels.
Einige Retroviren können
nur Zellen einer Spezies infizieren (ökotrope Retroviren) oder sogar
nur eine Zellart einer Spezies (z.B. HIV). Andere Retroviren verfügen über einen
breiten Wirtsbereich und können
viele unterschiedliche Gewebearten zahlreicher unterschiedlicher
Spezies infizieren (amphotrope Retroviren).
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Der
erste Schritt bei der Retrovireninfektion ist die Bindung des Virenhüllglycoproteins
(Hülle
= env) an spezifische Zellmembranrezeptoren, deren Natur bei den
meisten Retroviren unbekannt ist. Die Wechselwirkung des Viren-env-Proteins
mit dem Zelloberflächenrezeptor
ist sehr spezifisch und bestimmt die zelltypische Spezifität des jeweiligen
Virus (Weiss et al., 1985). Das Hüllprotein aller bekannten Retroviren
besteht aus zwei assoziierten Peptiden (z.B. pg70 und p20(E) bei
SNV). Diese Peptide werden durch proteolytische Spaltung aus derselben
durch das Retroviren-env-Gen codierten Vorstufe (gPR90env) abgeleitet.
Ein Peptid p20(E), auch als TM bezeichnet, verankert das Protein
in der Membran des Virus und vermittelt, wie bei HIV dargestellt, die
Fusion von Virus- und Zellmembran. Das zweite Peptid gp70, auch
als SU bezeichnet, vermittelt die Bindung des Virus an seinen Rezeptor
und bestimmt damit den Wirtsbereich (Weiss et al. 1985; Varmus und Brown
1989).
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Daten
verschiedener Retroviren deuten darauf hin, dass das Retrovirenhüllprotein
Trimere oder Tetramere bildet. Die Bildung der Trimere scheint durch
das TM-Peptid vermittelt zu werden (Review siehe Hunter E. et al.
1990). Empfängerhüllen speichern
TM zur Aufrechterhaltung der (i) Membranfusionsfunktion und der (ii)
Oligomerisation. Da jedoch keine Röntgenaufnahmen verfügbar sind,
ist unklar, ob und in welchem Ausmaß die Konstruktion von Empfängermolekülen die
Struktur der Membranfusionsdomäne
beschädigt.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 ist ein Diagramm, das Retrovirenproteine
exprimierende Helferzellen darstellt: (A) Helferzellen werden durch
Transfektion von Plasmiden, die sämtliche zur Bildung infektiöser Viruspartikel
notwendigen Retrovirenproteine exprimieren, hergestellt. (B) Nach
der Transfektion des Retrovirenvektors wird das Vektor-RNA-Genom
in den Kernstrukturen eingekapselt. (C) Helferzellen, die ein Plasmid
enthalten, exprimieren ein modifiziertes Hüllgen.
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2 ist ein Diagramm, das Plasmide darstellt,
die mutierte Hüllgene
des Milznekrosevirus (SNV) exprimieren.
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3 stellt
die Sequenz des einkettigen Antikörpergens (scFv) gegen Hapten-DNP
dar.
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4 ist ein Diagramm, das Helferzellen darstellt,
die Empfängerhüllen plus
Wildarthüllen
exprimieren. Solche Helferzellen werden durch Transfektion von Plasmiden
hergestellt, die die entsprechenden Proteine exprimieren: (A) Helferzelle,
die sämtliche
zur Bildung der (1) Retrovirenkernproteine und (2) der Empfängerhülle notwendigen
Retrovirenproteine exprimiert. (B) Helferzellen, die die Empfängerhülle plus
die Wildarthülle
enthalten, werden durch Transfektion von Plasmiden hergestellt,
die solche Proteine codierende Gene exprimieren. Nach der Transfektion
des Retrovirenvektors mit dem Gen von Interesse wird das Retrovirenvektor-RNA-Genom
in den die Hülle
aufweisenden Retrovirenvektorpartikeln eingekapselt.
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5 ist
ein Diagramm eines eukaryontischen Genexpressionsvektorkonstrukts.
Der Genexpressionsvektor wurde von einem ähnlichen, von Sheay, W. et
al. 1993 beschriebenen Vektor abgeleitet.
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6 ist
ein Diagramm, das Plasmide darstellt, die den Milznekrosevirus (SNV),
Kernstrukturproteine, Wildarthüllproteine
und verschiedene Empfängerhüllproteine
exprimieren.
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7 ist
eine Restriktionskarte von pRSV-scFvN29-gamma, das das einkettige
Antikörpergen
anti-Her2neu inklusive der authentischen hydrophoben Leadersequenz
exprimiert.
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8 stellt die Sequenz des einkettigen Antikörpers anti-Her2neu
dar.
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9 ist
eine Restriktionskarte von pTC53. PCR-Produkte einkettiger Antikörpergene
können
in die NaeI-Stelle kloniert werden; das entstandene Konstrukt exprimiert
eine Chimärenhülle, die
durch das ER transportiert und auf der Oberfläche der von SNV abgeleiteten
Retrovirenvektorpartikel dargestellt wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Retrovirenvektorpartikels
mit definierter Empfängerzellenspezifität, die durch
die Natur der Empfängerhülle vermittelt
wird, die ein Chimärenprotein
aus einer Antigenbindungsstelle eines Antikörpers sein kann oder ein anderes
Peptid, das sich an eine spezifische Zelloberflächenstruktur (z.B. die Rezeptorbindungsdomäne eines
anderen Virus) bindet, die mit den Carboxyenden des Retrovirenhüllproteins
fusioniert ist, bei der Herstellung eines Medikamentes. Die Empfängerhülle vermittelt
den ersten Schritt der Retrovireninfektion, d.h. die Bindung des
Virus an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor. Die vorliegende
Erfindung bezieht sich außerdem
auf die Verwendung von Retrovirenpartikeln bei der Herstellung eines
Medikamentes, die zusätzlich
zu der Empfängerhülle eine
Wildarthülle
enthalten. Die Wildarthülle
fungiert als Helfermolekül
zur Verbesserung bzw. Bereitstellung einer funktionsfähigen Membranfusionsdomäne. Bei
Verwendung von Empfängerzellen,
die keinen Rezeptor für
die Wildarthülle
enthalten (SNV z.B. ist für
menschliche Zellen nicht infektiös),
ist die Wildarthülle
nur in den zweiten Schritt der Retrovireninfektion, d.h. die wirksame
Fusion von Virus- und Zellmembran involviert. Wir diskutieren darüber hinaus
die Konstruktion von Retrovirenvektorpartikeln, die zusätzlich zu
einer Empfängerhülle eine
Wildarthülle
enthalten, die den Infektiositätsverlust,
der bei ausschließlich
Empfängerhüllen enthaltenden Retrovirenpartikeln
beobachtet wurde, kompensiert.
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In
einer Ausführungsform
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines
Retrovirenvektors mit einem Hüllprotein,
bei dem ein Virenrezeptorabschnitt zumindest teilweise durch einen
einkettigen Antikörper
definiert ist und sich der Virenrezeptorabschnitt an ein ausgewähltes Antigen
bindet, bei der Herstellung eines Medikamentes, der dazu verwendet
wird, eine Zelle mit dem ausgewählten
Antigen in vivo zu infizieren, wobei das Medikament den Retrovirenvektor
in vivo so mit der Zelle in Kontakt bringen soll, dass der Viruspartikel
oder ein Teil davon in die Zelle aufgenommen und die Zelle mit dem
ausgewählten
Antigen durch den Retrovirenvektor infiziert wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Retrovirenvektors
mit einem Empfängerpeptid,
das zur Bildung einer Empfängerhülle mit
dem Hüllprotein
des Retrovirenvektors fusioniert ist, bei der Herstellung eines
Medikamentes, der dazu verwendet wird, eine Zelle mit einem ausgewählten Antigen
in vivo zu infizieren, wobei das Medikament den Retrovirenvektor
in vivo so mit der Zelle in Kontakt bringen soll, dass der Viruspartikel
oder ein Teil davon in die Zelle aufgenommen und die Zelle mit dem
ausgewählten
Antigen durch den Retrovirenvektor infiziert wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Retrovirenvektorpartikels
mit einer Empfängerzellenspezifität, der einen
Retrovirenvektor mit einer Antigenbindungsstelle für einen
mit dem Hüllprotein
des Retrovirusvektors fusionierten Antikörper umfasst, wobei die Antigenbindungsstelle
des Antikörpers
die natürliche
Virusrezeptorbindungsstelle ersetzt, bei der Herstellung eines Medikamentes,
für ein
zelltypspezifisches Verfahren, um Gene unter Verwendung von Retrovirenvektoren in
vivo in Wirbeltierzellen einzuschleusen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Empfängerhülle
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich gemäß den Ansprüchen auf die Verwendung von
Retrovirenvektorpartikeln mit einer Empfängerzellenspezifität bei der
Herstellung eines Medikamentes. Die Retrovirenvektorpartikelumfassen
einen Retrovirenvektor mit einem Chimärenhüllprotein aus einer Antigenbindungsstelle
eines Antikörpers
bzw. einem anderen Peptid, das mit dem Hüllprotein des Retrovirenvektors
fusioniert ist. Die Antigenbindungsstelle bzw. das andere Peptid
ersetzt oder unterbricht die natürliche
Virenrezeptorbindungsstelle. Die entstehende Chimärenhülle wird
als „Empfängerhülle" bezeichnet. Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Retrovirenvektoren,
die nicht nur das Empfängerhüll-, sondern
auch das Wildarthüllprotein
enthalten. Die zusätzlich
zu der Empfängerhülle vorliegende
Wildarthülle
fungiert als Helfermolekül,
indem sie eine voll funktionsfähige
Membranfusionsdomäne
bereitstellt, die bei den Empfängerhüllen beschädigt sein
kann. Diese Helferfunktion ermöglicht
und/oder verstärkt
die Infektion von Zellen, die keinen Rezeptor für die Wildarthülle enthalten,
sondern einen Rezeptor zur Bindung des Empfängermoleküls. Wir stellen darüber hinaus
ein Verfahren zur Herstellung der Retrovirenpartikel sowie zur Verwendung
der Retrovirenvektoren zur Einschleusung von Genen in Wirbeltierzellen
bereit.
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Zur
Veränderung
des Wirtsbereiches eines Vektorpartikels können Retrovirenvektorpartikel
so konstruiert sein, dass sie modifizierte Hüllproteine enthalten, die nur
eine für
die Empfängerzelle
von Interesse spezifische Zelloberflächenstuktur (Rezeptor) erkennen.
Proteine, die bekannterweise spezifische Strukturen von Proteinen
erkennen, sind Antikörpermoleküle. Daher
kann das sich an den Virenrezeptor bindende Peptid zur Erzeugung
eines für
einen Zelltyp von Interesse spezifischen Retrovirenvektorpartikels
durch eine Antigenbindungsstelle eines Antikörpermoleküls ersetzt werden. Um zu testen,
ob sich solche Antigenbindungsstellen enthaltenden Vektorpartikel
für eine
Infektion eignen, wurden unter Verwendung eines Antigenbindungspeptids
eines Antikörpers
gegen mit dem Hüllgen
des Milznekrosevirus (SNV) fusioniertes Hapten-Dinitrophenol (DNP)
Modellsysteme entwickelt.
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Die
Verwendung des Antihapten (Anti-DNP)-Antikörpers hat viele Vorteile. (1)
Die Wechselwirkung dieses Antigens mit dem Antikörper ist gut charakterisiert
(Davies und Metzger 1983). (2) Das Hapten ist leicht erhältlich.
(3) Eine große
Vielzahl von Zellen (die mit den Wildartvektorpartikeln nicht infiziert
werden können) kann
mit diesem Hapten konjugiert werden. DNP-konjugierte Zellen binden
sich an Antikörper,
die gegen dieses Hapten gerichtet sind. Daher kann das Hapten die
(weitverbreitete) Gegenwart eines Rezeptors für den Chimärenvektorpartikel imitieren.
(4) Antihapten-Antikörper
werden häufig
von der Zelle aufgenommen. Daher zerstört die Konstruktion der Chimärenhüllproteine
die Membranfusionsdomäne
von TM. Diese Eigenschaft kann den Funktionsverlust kompensieren.
(5) Um die Viruspartikelbildung und die Bindung solcher Viren an DNP
zu testen, lässt
sich leicht ein in vitro-Bindungstest entwickeln.
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Wildarthülle
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Retrovirenvektorpartikeln
mit einer Empfängerzellenspezifität. Die Retrovirenvektorpartikel
umfassen einen Retrovirenvektor mit einem Hüllprotein, das die Bindung
des Retrovirenvektorpartikels an einen Zelloberflächenrezeptor
der Empfängerzelle
vermittelt. Diese Bindung ist sehr spezifisch und bestimmt den Wirtsbereich
und die zelltypische Spezifität.
Die Partikel verfügen
darüber
hinaus über
eine Wildarthülle.
Bei Verwendung von Empfängerzellen,
die keinen brauchbaren Rezeptor für die Wildarthülle enthalten,
dient die Wildarthülle
nur dazu, eine voll funktionsfähige Membranfusionsdomäne bereitzustellen.
Wir stellen darüber
hinaus das Verfahren zur Herstellung der Retrovirenvektorpartikel
sowie ein Verfahren zur Verwendung der Retrovirenvektoren zur Einschleusung
von Genen in Wirbeltierzellen bereit.
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Vom
Milznekrosevirus abgeleitete Retrovirenvektoren, die nur eine Wildarthülle enthalten,
können
Zellen von Mensch und Hamster nicht infizieren. Bei diesen Infektiositätsstudien
wurden menschliche HeLa- und Col-1- sowie Hamster-CHTG (ret. 1)-Zellen
mit Retrovirenpartikeln aus DSN-Zellen infiziert (Dougherty, J.P. und
Temin, H.M. 1989) (Tabellen 1 und 2). DSN-Zellen sind Standard-Retrovirenverpackungszellen,
die ein Plasmid, das die Retrovirenkernproteine exprimiert, und
ein anderes Plasmid, das die Wildarthülle exprimiert, enthalten (Dougherty,
J.P. und Temin, H.M. 1989).
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Zur
Einschleusung von Genen in solche Zellen mittels SNV-Retrovirenvektorpartikeln
existieren zwei unterschiedliche Ansätze, bei denen verschiedene
Empfängerhüllen in
Kombination mit und ohne eine zusätzliche Wildarthülle eingesetzt
wurden.
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- 1. SNV-Retrovirenvektoren zielen auf menschliche
Krebszellen (HeLa und Col-1). Es wurde die Antigenbindungsstelle
eines gegen Hapten-DNP gerichteten Antikörpers verwendet. In den nachfolgend
beschriebenen Experimenten wurde die Antigenbindungsstelle in der
Empfängerhülle von
einem Antikörper
(B6.2, Bird, R.E. et al. 1988 und Colcher, D. et al. 1990) abgeleitet,
der gegen ein Zelloberflächenprotein
gerichtet ist, das auf verschiedenen Humankrebsarten exprimiert
wird (z.B. HeLa- und Col-1-Zellen, Bird, R.E. et al. 1988 und Colcher,
D. et al. 1990). Die Genkonstrukte (6) für die Expression
der Empfängerhülle ähneln den
zuvor beschriebenen. Insbesondere in zwei Konstrukten (6,
pTC24 und pTC25) war die Antikörpereinheit
an derselben Position des SNV-Hüllgens
fusioniert wie der nachfolgend beschriebene Anti-DNP-Antikörper (nähere Einzelheiten
siehe weiter unten unter „Material
und Verfahren").
Um zu testen, ob die Zugabe einer vollständig funktionsfähigen Membranfusionsdomäne (bereitgestellt
durch die Wildarthülle)
die Wirksamkeit der Infektion erhöhen würde, wurden Helferzellen, die
die Retrovirenkernproteine, die Wildarthülle und die Empfängerhülle exprimieren,
entwickelt (4). Der Virus, den man
von solchen Helferzellen erhielt, wurde Infektiositätsstudien
unterzogen.
- 2. Ziel sind CHTG-Zellen, die einen Rezeptor für den ökotropen
Mäuseleukämievirus
exprimieren. Um zu testen, ob von SNV abgeleitete Retrovirenpartikel,
die andere Empfängermoleküle als die
Antigenbindungsstellen eines Antikörpers aufweisen, infektiös sind,
wurden Empfängerhüllen konstruiert,
die das Rezeptorbindungspeptid eines anderen, mit der SNV-Hülle fusionierten
Virus (Mäuseleukämievirus)
enthielten. Die Infektiosität
von Viruspartikeln mit solchen Empfängerhüllen mit und ohne Wildarthülle wurde
getestet.
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Beispiele
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Empfängerhülle
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Material und Verfahren
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Konstruktion von Antikörperhüllenfusionsgenen
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Das
das Hüllprotein
des Milznekrosevirus (SNV) codierende Gen enthält keine geeigneten Restriktionsenzymstellen
für die
Konstruktion von Antikörperhüllfusionsgenen.
Daher wurden (durch ortsspezifische Mutagenese) an verschiedenen
Stellen Punktmutationen in das SNV-env-Gen eingeschleust, um Restriktionsenzymerkennungsstellen
zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurde das SNV-env-Gen (HindIII-Sacl-Fragment)
in pSelect (einen speziell für
die ortsspezifische Mutagenese entwickelten Vektor) subkloniert.
Restriktionsstellen für
Enzyme, die stumpfe Ende erzeugen, wurden in einer Weise eingeschleust,
dass die Restriktionsenzyme zwischen 2 Kodone schnitten. Folgt man
dieser Strategie kontinuierlich, können sämtliche Mutanten dazu verwendet
werden Deletionen, Insertionen und Fusionen in jeglicher Kombination
zu erzeugen, ohne dass der Leserahmen verändert wird. Weiterhin wurden
die Restriktionsenzymstellen zwischen Abschnitten eingebettet, die
hydrophobe und hydrophile Domänen
codieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Deletion
einer oder mehrerer bestimmter Domänen die korrekte Faltung der
nachfolgenden Domäne
nicht stören
würde. Diese
Hypothese basiert auf der Erkenntnis, dass viele Proteine in der
Evolution durch Exonverschiebung funktioneller Domänen entstanden
sind.
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Einige
der hergestellten Mutantenhüllen
sind in 2 dargestellt. pSNV-env-mC
( 2a) enthält
eine neue Restriktionsenzymstelle zwischen einer hydrophoben und
einer hydrophilen Peptiddomäne.
In dieser Mutante verändert
die Veränderung
der Nukleotidsequenz die Aminosäuresequenz
nicht. Daher kann pSNV-env-mC nicht als positive Kontrolle gelten.
pSNV-env-mD enthält
eine neue Restriktionsenzymstelle an der Spaltungsstelle der Hüllenvorstufe.
Das Einschleusen der Mutation veränderte auch die Aminosäuresequenz und
zerstörte
so das sämtlichen
Spaltungsstellen aller untersuchten Retroviren gemeinsame Motiv.
Daher wurde erwartet, dass die entstehende Hüllenvorstufe nicht gespalten
ist und daher keine infektiösen
Viruspartikel erzeugt. Mutierte env-Gene wurden in pHB3, einen eukaryontischen
Genexpressionsvektor eingefügt
(2).
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Die
die schwere und die leichte Kette eines Antikörpers gegen DNP codierenden
Gene wurden freundlicherweise von Dr. Ogawa (Scripps Clinic, La
Jolla, CA) bereitgestellt. Die Gene wurden sequenziert und veröffentlicht
(Riley et al. 1986). Mit Hilfe der beschriebenen PCR-Technologie
(Whitlow und Filpula 1990) wurde ein einkettiges Antikörpergen
konstruiert, das das Signalpeptid gegen DNP enthält. Das PCR-Produkt wurde in
die Smal-Stelle von pBluescript kloniert. Die DNA-Sequenzierung
bestätigte
die erfolgreiche Kombination der beiden die variablen Abschnitte
des Antigenbindungspeptids codierenden Gensegmente. Die vollständige Sequenz
des Anti-DNP-scFv-Gens
ist in 3 dargestellt. Ein SacII- (im Polylinker von pBluescript)
bis SmaI-(im 3'-PCR-Primer)
Fragment wurde in eukaryontische Expressionsvektoren eingefügt und ersetzte
die Aminoenden des Hüllgens
wie folgt: In pTC4 wurde das SacII- (oberhalb des ATG-Kodons des env-Gens)
bis SmaI-Fragment von env durch das scFv-Gen ersetzt, in pTC5 wurde das SacII-
bis MscI-Fragment von env durch das scFv-Gen ersetzt (2C bzw. 2D).
Nach dem Klonieren wurden die Berührungsstellen der Antikörperhülle sequenziert,
um die Aufrechterhaltung des korrekten Leserahmens des Chimärengens
zu verifizieren.
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Bindungstests
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Die
in vitro-Bindungstests wurden wie folgt durchgeführt. DNP wurde mit BSA konjugiert
(DNP-BSA wurde zur Erhöhung
der Zahl der anfänglichen
Antikörper,
von denen die scFv-Gene abgeleitet wurden, verwendet). DNP-BSA wurde
nach dem vom Hersteller (Sigma) empfohlenen Protokoll mit aktivierter
Sepharose gekoppelt. Ein ELISA-Test mit einem Anti-DNP-Antikörper (freundlicherweise
bereitgestellt von Dr. S. Pestka) bestätigte die erfolgreiche Kopplungsreaktion.
100 ml des Gewebekulturüberstandmediums
wurden mit 50 ml DNP-BSA-Sepharose 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Sepharosepartikel durch 30-sekündiges Zentrifugieren
in einer Qualitron-Minizentrifuge pelletiert. Die Pellets wurden
einmal mit PBS gespült.
Das PBS wurde entfernt und es erfolgten Reverstranskriptionstests
durch Zugabe der Reaktion zu dem Sepharosepellet. Der Reverstranskriptionstest
erfolgte unter Anwendung von Standardverfahren: der Einbau von 32PdTTP
in cDNA wurde durch TCA-Ausfällung
gemäß Beschreibung
(Schleif und Wensink 1981) bestimmt.
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Test
von Antikörperhüllfunktionsproteine
enthaltenden Partikeln bezüglich
Infektiosität
Die Hüllexpressionsplasmide
von 2 wurden zusammen mit pBRi und
pJD214HY, Plasmiden, die die Retrovirenkernproteine exprimieren
bzw. einen Retrovirenvektor für
die Expression des Hygromycinphosphotransferase-Gens enthalten (siehe
auch 1), in D17-Zellen (eine Hunde-Osteosarkomzelllinie)
transfiziert (2). Die Zellen wurden
nach Hygromycinresistenz ausgewählt.
Nach der Selektion nach Hygromycinresistenz wurde der Virus aus
konfluenten Zellkulturen gewonnen und Infektiositätstests
durchgeführt
(siehe unten). Infizierte Empfängerzellen
wurden nach Hygromycinresistenz ausgewählt (D 17-Zellen wurden mit
60 mg/ml Hygromycin enthaltendem Medium inkubiert, CHO-Zellen mit
250 mg/ml Hygromycin enthaltendem Medium). Hygromycinresistente
Zellkolonien deuten auf infektiöse
Viruspartikel.
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Die
Infektiositätstests
wurden mit D17- und CHO-Zellen mit und ohne konjugiertem DNP durchgeführt. DNP
wurde wie folgt mit den Zellen konjugiert: Die Zellen wurden mit
500 ml einer 1,4 mg/ml DNBS (2,4-Dinitrobenzolsulfonsäure-2-hydrat,
erworben von Kodak) in Natriumcocodylat-Puffer (0,25M) enthaltender
Lösung 3
bis 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Konjugationsreaktion
wurde durch Zugabe von 50 ml Medium zu den Zellen beendet.
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Die
Infektion nicht-konjugierter Zellen erfolgte in Gegenwart von 50
mM Polybren unter Standardprotokollbedingungen. Im Falle DNP-konjugierter
Zellen erfolgte die Infektion ohne Polybren.
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Wildarthülle
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Material und Verfahren
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ScA-Empfängervektoren
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Zur
Konstruktion einer Empfängerhülle, die
die Antigenbindungsstelle eines Antikörpers enthält, der gegen ein auf verschiedenen
menschlichen Tumorzellen exprimiertes Zelloberflächenprotein gerichtet ist,
wurde das entsprechende einkettige Antikörpergen (B6.2, Bird, R.E. et
al. 1988 und Colcher, D. et al. 1990) zur Expression in E. coli
auf folgende Weise modifiziert: Das B6.2-scA-Gen wurde mit Hilfe
der PCR-Technologie unter Verwendung des originalen E.coli-Expressionsplasmids
als Schablone amplifiziert (Bird, R.E. et al. 1988 und Colcher,
D. et al. 1990). Die verwendeten Primer besaßen folgende Sequenz:
Primer
A: 5' GGAGCGCTGACGTCGTGATGACCCAGTC
3'
Primer B:
5' CCTCGCGATCCACCGCCGGAGACTGTGAGAGTGGTGC
3'
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Die
PCR-Amplifikation führt
zu einem Fragment, das die bakterielle ompA-Signalsequenz und die Stopkodone
in dem originalen B6.2-Gen nicht enthält (Bird, R.E. et al. 1988
und Colcher, D. et al. 1990). Die PCR-Produkte wurden in die SmaI-Stelle
des pBluescript-Vektors
(Stratagene) kloniert und sequenziert, um einen korrekten Leserahmen
zu verifizieren. Das Plasmid hieß pTC9. Das B6.2-Gen wurde
durch Verdauen des pTC9-Plasmids
mit Eco47III plus Nrul isoliert. Die entsprechenden Restriktionsenzymerkennungsstellen wurden
mit den für
die PCR-Amplifikation verwendeten Primern eingeschleust. Das B6.2-Gen
(das Eco47III- bis Nrul-Fragment) wurde in pTC13, einen Genexpressionsvektor
kloniert (5). Der entsprechende Vektor (pTC23)
enthält
die ER-Transportsignalsequenz des mit dem B6.2-Gen fusionierten
SNV-Hüllproteins,
was den Transport durch das endoplasmatische Retikulum ermöglicht.
Durch das Klonieren wurde die Nrul-Stelle am 3'-Ende des B6.2-Gens wiederhergestellt. Die Carboxyenden
des SNV-Hüllgens
wurden isoliert und mit dem B.2-Gen (Nrul-Stelle) zu den Plasmiden
pTC24, pTC25 und pTC26 fusioniert ( 6). Diese
Konstrukte ähneln
den Plasmiden pTC4 und pTCS, die den Anti-DNP-Antikörper enthalten, stark. In Plasmid
pTC26 ist der Antikörper
mit dem Kodon 168 der SNV-Hülle
fusioniert.
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Chimären-SNV-MLY-Empfängerhülle
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Das
Rezeptorbindungspeptid eines anderen Virus enthaltende Empfängerhüllen wurden
wie folgt hergestellt: Das Gensegment des ökotropen Mäuseleukämievirus (ein HindIII-Ball-Fragment, das
fast den gesamten das SU-Peptid codierenden Abschnitt inklusive
der ER-Transportsignalsequenz umfasst) (Ott, D. und Rein., A. 1992)
wurde isoliert und in die Vektoren pSNV-env-mC und pSNV-env-mD (pSNV-env-mC
und pSNV-env-mD wurden in 2 beschrieben)
eingefügt,
so dass die Aminoendabschnitte des SNV-Hüllgens
ersetzt wurden. Die entstandenen Konstrukte sind mit den Plasmiden
pTC4 bzw. pTC5 identisch, mit der Ausnahme, dass das Anti-DNP-Antikörperpeptid
(Anti-DNP-scA) durch
das Rezeptorbindungspeptid von ecoMLV ersetzt ist (6,
pSNV-MLV-chiC bzw.
pSNV-MLV-chiD).
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Experimentalsystem
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Kurz
gesagt wurden Helferzellen wie zuvor beschrieben durch Transfektion
von Plasmiden hergestellt, die Retroviren-gag-pol-Proteine, die
Retrovirenempfängerhülle und
die Wildarthülle
in D17-Zellen exprimieren; gleichzeitig erfolgte die Transfektion
eines auswählbaren
Markers, um Helferzelllinien zu erhalten, die nur die Empfängerhülle enthalten,
oder Helferzellen, die sowohl die Empfänger- als auch die Wildarthülle enthalten. Infektiositätstests
wurden mit einer Vielzahl verschiedener Zelllinien durchgeführt, inklusive
D17-Zellen, den ökotropen
Mäuseleukämievirusrezeptor
(Albritton, L.M. et al. 1989) exprimierenden CHTG-Zellen und menschlichen
HeLa- und Col-1-Zellen. Die Infektiosität wurde wie beschrieben mit
Hilfe eines das bakterielle Betagalactosidase-Gen exprimierenden
Retrovirenvektors bestimmt (Mikawa, T. et al.).
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Ergebnisse
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Empfängerhülle
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In
vitro-Bindungstest. Die in vitro-Bindungstests zeigten, dass nur
mit pSNV-env-mD transfizierte Zellen Virenvektorpartikel produzieren,
die eine zur Bindung an DNP fähige
Chimärenhülle enthalten
(siehe auch Tabelle 1).
-
Infektiositätsstudien.
Die Ergebnisse der Infektiositätsexperimente
sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Wildarthülle enthaltende Vektorpartikel
(pSNV-env-mC) infizierten D17-Zellen mit einer Wirksamkeit von etwa
105 (=100.000) koloniebildenden Einheiten
pro ml Gewebekulturüberstandmedium.
Solche Viruspartikel infizierten auch DNP-konjugierte D17-Zellen.
Die Wirksamkeit der Infektion war jedoch um drei Größenordnungen
kleiner als die von nicht DNP-konjugierten Zellen. Dieser Abfall
des Virustiters resultiert hauptsächlich aus Schwierigkeiten
bei der Auswahl DNP-konjugierter
Zellen mit dem Antibiotikum. Es scheint, dass die Konjugationsreaktion
Zellen sehr anfällig
für das
Medikament macht und mehr als 90% der Zellen 2 bis 3 Tage nach der
Konjugationsreaktion abstarben. Viruspartikel mit Wildarthülle infizieren
CHO-Zellen nicht.
-
Die
Mutation der Spaltungsstelle des Hüllenvorstufenproteins (SNV-env-mD)
hob die Infektiosität
vollständig
auf. In nicht DNP-konjugierten D17-Zellen wurde nur eine Kolonie
beobachtet. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten überein,
dass Mutationen in der Hüllenvorstufen-spaltungsstelle
zu nicht-infektiösen
Viruspartikeln führen.
Mit pTC4 transfizierte Zellen (2)
produzierten keine Vektorpartikel, die D17- oder CHO-Zellen mit
signifikanter Effizienz infizieren konnten. Mit pTC5 transfizierte
Zellen erzeugten Viruspartikel, die D17- oder CHO-Zellen nicht infizieren
konnten. Solche Partikel infizierten DNP-konjugierte Zellen jedoch signifikant.
-
Wildarthülle
-
Zunächst wurde
die Gegenwart der Wildarthülle
in Partikeln mit einer Antigenbindungsstelle gegen DNP getestet,
um zu bestimmen, ob es zu einem Anstieg der Infektionseffizienz
DNP-konjugierter Zellen kommt. Es stellte sich heraus, dass DNP-konjugierte
HeLa-Zellen nicht mit Vektorviruspartikeln infiziert werden konnten, die
nur die Wildarthülle
enthielten. DNP-konjugierte Zellen konnten jedoch mit sehr geringer
Wirksamkeit mit Anti-DNP enthaltenden Retrovirenvektoren infiziert
werden. Der gemessene Titer lag bei etwa 10 infektiösen Einheiten
pro ml Gewebekulturüberstandmedium.
Viruspartikel, die zusätzlich
zu der Empfänger-Anti-DNP-Hülle die
Wildarthülle
enthielten, infizierten Zellen 10 bis 30 Mal wirksamer. Diese Daten
deuten darauf hin, dass die Gegenwart der Wildarthülle die
Infektionswirksamkeit von Empfängervektoren
erhöhen kann.
Zur Bestätigung
dieses Ergebnisses wurden zwei zusätzliche Versuchsreihen mit
anderen Empfängermolekülen durchgeführt.
- 1. Infektiositätsstudien mit Viruspartikeln,
die Antikörperhüllenfusionsproteine
enthalten. D17-Zellen, HeLa-Zellen und Col-1-Zellen wurden mit Viruspartikeln
infiziert, die eine Antigenbindungsstelle eines Antikörpers enthielten
(B62., Bird, R.E. et al. 1988 und Colcher, D. et al. 1990), der
gegen ein auf verschiedenen menschlichen Karzinomzellen exprimiertes
Zelloberflächenprotein
gerichtet war. Die Vektorvirenpartikel wurden aus einer Vielzahl
verschiedener Helferzelllinien gewonnen (Tabelle 2). Sämtliche
Viruspartikel trugen einen Vektor zur Transduktion des bakteriellen
Betagalactosidase-Gens.
Die Infektiosität
wurde durch Einfärben
der Zellen mit X-gal wie beschrieben bestimmt (Mikawa, T. et al.).
Die Anzahl blauer Zellkolonien wurde 2 bis 3 Tage nach der Infektion
bestimmt. Die nachfolgenden Viruspartikel wurden bezüglich ihrer Infektiosität getestet:
Viruspartikel, die keine Hülle
enthalten (sogenannte „non-env"), Viruspartikel,
die nur die Wildarthülle
enthalten (sogenannte wt-env-DSN), Viruspartikel, die nur Empfängerhüllen, d.h.
Antikörperhüllenfusionsproteine
enthalten (TC24, TC25 und TC26, wie in 6 beschrieben)
und Partikel, die die Wildart- und Empfängerhülle enthalten (TC24+wt-env,
TC25+wt-env und TC26+wt-env).
Es stellte sich heraus, dass
Partikel, die keine Hülle
enthalten, im Wesentlichen nicht infektiös sind. Partikel, die die Wildarthülle enthalten,
waren nur für
D17-Zellen infektiös,
die einen brauchbaren Rezeptor für
Wildart-SNV enthalten. Die Partikel waren für HeLa-Zellen oder Col-1-Zellen
nicht infektiös.
Partikel, die nur Empfängerhüllen enthielten,
waren für
D17- und HeLa-Zellen infektiös.
Die Infektionseffizienz bei D17-Zellen
betrug weniger als 5% der Infektionseffizienz des Virus mit Wildarthülle. Solche
Partikel waren für Col-1-Zellen
nicht infektiös.
Die Zugabe der Wildarthülle
erhöhte
die Wirksamkeit der Infektion um das 10- bis 50-fache. Weiterhin
konnten Col-1-Zellen, die mit Partikeln, die nur eine der beiden
Hüllen
enthielten, nicht infiziert werden konnten, mit Partikeln infiziert
werden, die sowohl die Wildart- als auch die Empfängerhülle enthielten.
Diese Daten deuten darauf hin, dass durch die Wildarthülle eine
Funktion hinzugefügt wird,
die das Eindringen des Virus verbessert oder sogar vollständig ermöglicht (Tabelle
2). Diese Daten zeigen auch, dass der Grad der Infektiosität von der
Position des mit der Hülle
fusionierten Antikörpers
in dem Hüllgen
abhängt.
- 2. Infektiositätsstudien
mit Viruspartikeln, die SNV-MLV-Fusionsproteine enthalten. CHTG-Zellen
(beschrieben von Albritton, L.M. et al. 1989), die den Rezeptor
des ökotropen
Mäuseleukämievirus
exprimieren, sowie D17-Zellen wurden mit einem Virus infiziert,
der aus Zellen gewonnen wurde, die nur Empfängerhüllen (SNV-MLV-chiC und SNV-MLV-chiD)
exprimieren, oder Helferzellen, die Empfängerhülle plus Wildarthülle exprimieren.
Die Viruspartikel besaßen
ein Hygromycin-B-Resistenz-Gen. Infizierte Zellen wurden nach Hygromycinresistenz
ausgewählt
und die Anzahl hygromycinresistenter Zellkolonien bestimmt. Retrovirenvektorpartikel,
die nur die Empfängerhülle enthielten,
waren nicht infektiös.
Die Partikel wurden nach Zugabe der Wildarthülle zu den Partikeln infektiös. Partikel
mit ausschließlich
der Wildarthülle
sind für
CHTG-Zellen nicht infektiös
(Tabelle 3).
-
Diskussion
-
Empfängerhülle
-
Die
Daten der Retrovirenpartikel, die Antikörperhüllenfusionsproteine enthalten,
zeigten, dass solche Partikel sich für eine Infektion eignen. Überraschenderweise
führte
TC4, ein Konstrukt, das das mit env in der Mitte von SU fusionierte
scFv-Gen enthält,
nicht zu Viruspartikeln, die DNP binden können. Dies kann die Folge eines
instabilen SU-TM-Komplexes
sein. Diese Hypothese wird durch die Erkenntnis gestützt, dass
sich solche Partikel nicht an DNP-BSA-Sepharose binden konnten.
Ein geringer Infektiositätsgrad
solcher Partikel für D17-Zellen
kann das Ergebnis einer unspezifischen Adsorption von ausschließlich TM
enthaltenden Viruspartikeln sein. Unspezifisch adsorbierte Viruspartikel
(mit wenig SU) können
gelegentlich in die Zelle eindringen.
-
Mit
pTC5 transfizierte Zellen erzeugen Viruspartikel mit Chimärenhüllen ohne
eine funktionsfähige
Retrovirenmembranfusionsdomäne.
Diese Annahme basiert auf der Erkenntnis, dass Viruspartikel, die
die nicht gespaltenen Hüllenvorstufenproteine
(SNVenv-mD) enthalten, nicht infektiös sind. Es ist jedoch bekannt,
dass einige Antikörpermoleküle nach
der Bindung an die Zelloberfläche
durch einen unbekannten Mechanismus von Zellen aufgenommen werden.
Die Daten zeigen, dass ein solcher Aufnahmemechanismus ausreichend sein
kann, die Aufnahme des Viruspartikels und die darauf folgende Etablierung
einer erfolgreichen Infektion zu ermöglichen.
-
Anwendungsmöglichkeiten
von Vektorpartikeln mit Antikörperhüllenfusionsproteinen
in der Gentherapie
-
Bei
allen Anwendungszwecken der Humangentherapie wurden die Zellen von
Interesse bislang aus dem Patienten isoliert, von anderen Zelltypen
gereinigt und in eine Gewebekultur mit aus Helferzellen gewonnenen
Retrovirenvektorpartikeln infiziert. Nach der Expansion der behandelten
Zellen in der Gewebekultur wurden sie erneut in den Patienten injiziert.
Die Infektion der Zellen muss in vitro erfolgen, da die verwendeten Retrovirenvektorpartikel
(abgeleitet von amphotropen Mäuseretroviren)
eine breiten Wirtsbereich haben. Daher würden sollte Viruspartikel bei
einer Injektion direkt in die Blutbahn des Patienten sämtliche
Gewebearten infizieren. Neben anderen Risiken wäre diese Behandlung unwirksam,
da die Wahrscheinlichkeit, dass das Gen zu seiner geeigneten Empfängerzelle
gelangt, sehr gering ist.
-
Dieses
klinische Gentherapieprotokoll genügt unter Umständen, um
einen Einblick darin zu gewinnen, wie wirksam und vorteilhaft die
Gentherapie für
den Patienten ist. In der Tat sehen die klinischen Daten sehr vielversprechend
aus (Eglitis, persönliches
Gespräch).
Das aktuelle klinische Protokoll ist jedoch sehr mühsam, zeitaufwendig
und kostspielig und eignet sich daher nicht zur allgemeinen klinischen
Anwendung. Zur allgemeinen klinischen Anwendung ist eine Injektion
des Gentransfervehikels direkt in den Körper des Patienten notwendig.
-
Die
Entwicklung eines Retrovirenvektorpartikels, der nur einen spezifischen
Zelltyp infiziert, ermöglicht unter
Umständen
die direkte Injektion des Vektors in die Blutbahn des Patienten.
Die Entwicklung von Vektorpartikeln, die Antikörperhüllenchimären enthalten, könnte der
erste Schritt in Richtung dieses Ziels sein und neue mögliche Anwendungsgebiete
der Gentherapie in vivo aufzeigen.
-
In vivo-Einschleusung
therapeutischer Gene mit Retrovirenvektoren, die über einkettige
Antikörper
verfügen
-
Um
die in vivo-Geneinschleusung mit Retrovirenvektorpartikeln mit einkettigen
Antikörpern
auf der Virusoberfläche
zu testen, wurden SCID-Mäuse
als erstes Modellsystem verwendet. Es ist bekannt, dass Retrovirenvektoren
durch Komplement rasch deaktiviert werden, wenn sie aus Zellen einer
heterologen Spezies erzeugt werden. SCID-Mäuse hingegen haben kein funktionsfähiges Immunsystem.
-
Bestätigung, dass SCID-Mäuseserum
SNV-Retrovirenpartikel nicht deaktiviert
-
In
unseren Experimenten wurden Retrovirenvektorpartikel aus DSH-cxl-Verpackungslinien
(beschrieben von Martinez und Dornburg, Virology, 208:234-241; Chu
und Dornburg, J. Virol. 69:2659-2663, 1995) gewonnen. Diese Verpackungszellen
führen
zu einer Transduktion eines Retrovirenvektors, der das bakterielle Betagalactosidase-Gen
(lacZ-Gen) exprimiert. Das Plasmid pCXL (Mikawa T.D. et al., Exp.
Cell Res. 195:516-523,
1992) enthält
einen von SNV abgeleiteten Retrovirenvektor, der das lacZ-Gen exprimiert.
Es wurden 100 μl-Aliquote
der Retrovirenvektorlösung
hergestellt und mit 0,1, 1, 10 bzw. 100 μl SCID-Mäuseserum 10 Minuten lang inkubiert.
In einem zweiten Experiment wurden 100 μl des Vektoransatzes mit dieselben Mengen
des wärmedeaktivierten
(60°C für 30 Minuten)
SCID-Mäuseserums
versetzt. Als Nächstes
wurden die Gemische in Infektiositätstests mit 2 × 105 D17-Zellen versetzt. 2 Tage nach dieser
Infektion wurden die Zellen wie beschrieben mit X-gal eingefärbt und
die Anzahl der blauen Kolonien bestimmt (Martinez und Dornburg, Virology,
208:234-241, 1995; Chu und Dornburg, J. Virol. 69:2659-2663, 1995).
Zwischen den mit frischem oder wärmedeaktiviertem
Serum inkubierten Proben wurden keine signifikanten Unterschiede
bezüglich
der Infektiosität
beobachtet. Daher kann geschlussfolgert werden, dass SCID-Mäuseserum keine Antikörper und/oder
Komplementfaktoren enthält,
die SNV-Retrovirenpartikel
deaktivieren.
-
Zelltypspezifische
Geneinschleusung in vivo. In einem anderen Experiment wurden hygromycinresistente
menschliche COLO320DM-Zellen, die den Zelloberflächenmarker Her2neu exprimieren
(ATCC-Zugangsnummer CCL 220), oder hygromycinresistente A431-Zellen,
die Her2neu nicht exprimieren (ATCC-Zugangsnummer HB-9629), in das
Peritoneum von Mäusen
injiziert. Am nächsten
Tage wurden Vektorvirenpartikel mit einkettigen Anti-Her2neu-Antikörpern (105 infektiöse
Partikel) injiziert. Die Herstellung dieser Viruspartikel wird nachfolgend
beschrieben. Die Vektorvirenpartikel führten zu einer Transduktion
eines Markergens, des bakteriellen Betagalactosidase-Gens, in infizierte
Zellen. Durch das Einfärben
der Zellen nach der Infektion verfärben sich Gentransduktionszellen
blau und können
daher leicht nachgewiesen werden.
-
Konstruktion
von Verpackungszelllinien. Die Konstruktion stabiler Verpackungszellen,
die Retrovirenvektorpartikel mit dem Anti-Her2neu-Antikörper produzieren,
erfolgte gemäß dem im
Detail von Chu, T.H. und Dornburg, R., J. Virol. 71:720-725, 1997
beschriebenen Protokoll. Kurz gesagt wurden unter Verwendung der von
Hunde-D17-Zellen abgeleiteten Zelllinie DSgp13-cxl, die die einkapselungsnegativen
SNV-gag-pol-Proteine und den verpackbaren Retrovirenvektor pCXL
exprimiert, Zelllinien hergestellt, die die Chimären-scA-env-Fusionsproteine
exprimierten. Zu diesem Zweck wurde der scA-env-Genexpressionsvektor
pAJ7 (nachfolgend beschrieben) zusammen mit einem ein auswählbares
Markergen exprimierenden Plasmid in DSgp13-xcl-Zellen transfiziert. In diesem Experiment
verwendeten wir das Puromycinresistenzgen, angetrieben von dem SNV-Promotor,
enthalten in pRD118-puro, abgeleitet von pRD118 (Chu, T.H. et al.,
Biotechniq. 18:890-899, 1995). Der Fachmann könnte jedoch leicht ein geeignetes
auswählbares
Markergen auswählen. Für jede Transfektion
wurden etwa 100 bis 200 einzelne antibiotikaresistente Zellkolonien
isoliert. Die Expression des scA-env-Proteins wurde mittels ELISA-Tests
und Infektiositätstests
getestet, sobald die Zellen auf 24-Well-Platten transferiert worden
waren. Der Grund für
die Herstellung der Helferzellen auf diese Weise ist, dass Plasmid-DNA
in relativ inaktive Chromosomenstellen transfiziert und häufig schlecht
transkribiert wird.
-
Als
Nächstes
wurde der Wildarthüllgenexpressionsvektor
pIM29 (Martinez, I. und Dornburg, R., J. Virol. 69:4339-4346, 1995
und Martinez, I. und Dornburg, R. Virology 208:234-241, 1995) in
Zelllinien aus den zuvor beschriebenen Einzelkolonien transfiziert.
-
Auch
hier erfolgte die Transfektion durch gleichzeitige Transfektion
eines einen auswählbaren
Marker (z.B. das Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen) exprimierenden
Plasmids. 100 bis 200 Einzelzellkolonien wurden isoliert und auf
ihre Infektiosität
für menschliche
Empfängerzellen
getestet. Die Zellklone mit der höchsten Infektiosität wurden
ausgewählt,
erneut ein- oder zweimal kloniert und schließlich für in vivo-Experimente verwendet.
-
pAJ7
ist ein Plasmid, das das mit dem SNV-env-TM-Codierungsabschnitt
fusionierte Anti-Herineu-scA enthält. Das Plasmid ähnelt dem
Plasmid pTC25 stark (6), wurde jedoch etwas anders
hergestellt. Zunächst
wurde mit Bezug auf die 7 und 8 ein
DNA-Linker, der die Aminosäuren
ala-gly-ala-ser-gly-ser codiert, am Carboxyende des Anti-Her2neu-scA-Gens
(das die authentische hydrophobe Leadersequenz des Antikörpergens
für den
Transport durch das ER enthält)
in das Plasmid N29-gamma eingefügt,
so dass das Plasmid pRD161 (nicht dargestellt) entstand. Ein aus
pRD161 isoliertes DNA-Fragment (SnaBI bis Eco47III), das das komplette
Anti-Her2neu-scA (inklusive der hydrophoben Leadersequenz) enthielt,
wurde in pTC53 kloniert (9) und mit Sac2 (stumpfendig)
plus NaeI verdaut, so dass das Plasmid pAJ7 entstand. Nach den Klonierungsschritten
erfolgte eine DNA-Sequenzierung, um die Aufrechterhaltung des korrekten
Leserahmens der das Chimärenprotein
codierenden Gene zu verifizieren.
-
Das
Plasmid pTC53 (9) ist ein Genexpressionsplasmid
für das
rasche Klonieren und die wirksame Expression einkettiger Antikörperhüllfusionsproteine
auf Retrovirenpartikeln. pTC53 wurde von pTC13 abgeleitet (Chu,
T.H. und R. Dornburg, 1995, J. Virol. 69:2659-2663 und Chu, T.H.
et al., 1995, Biotechniq. 18:890-899). Es enthält den MLV-U3-Promotor und
die dreiteilige Adenovirus 2-Leadersequenz sowie eine Sequenz, die
die hydrophobe Leadersequenz des SNV-Hüllgens codiert. Weiterhin enthält das Plasmid
eine einzige NaeI-Stelle (die zwischen 2 Kodone schneidet) zur Klonierung
einkettiger Antikörpergene
(z.B. PCR-Produkte). Der NaeI-Stelle nachgeschaltet befindet sich
ein DNA-Linker, der das Aminosäuremotiv
(gly4-ser) codiert, um die Flexibilität des scA
zu ermöglichen.
Dieser gly-ser-Linker ist innerhalb des Rahmens mit dem gesamten
Transmembranpeptid (TM)-Codierungsabschnitt des SNV-Hüllgens fusioniert. Die dem
TM-Codierungsabschnitt nachgeschaltete Polyadenylierungsstelle wurde
von dem Affenvirus 40 (SV40) abgeleitet. Das Plasmidgerüst ist das
von pUC19.
-
Konzentration
von Vektorvirusansätzen.
Es wurden, wie von Chu und Dornburg, J. Virol. 71:720-725, 1997
beschrieben, konzentrierte Vektorvirusansätze hergestellt. Kurz gesagt
wurden zur Konzentration der Viruspartikel durch Ultrafiltration
Filtrationsvorrichtungen (Amicon Centriprep), die MWCO-Membranen
mit einem Molekulargewicht von 100 oder 500 kD (Amicon, Beverly,
MA) enthielten, mit 15 ml Überstand
versetzt. Die 100 kD-Cut-off-Membranen bestehen aus Cellulose, die
500 kD-Membran aus
Polysulfon (David Brewster, Amicon, persönliches Gespräch). Die
Vektorpartikellösung
wurde in einer Tischzentrifuge mit ausschwenkbaren Schaufeln (Sorvall
RC5000B) mit 3000 UpM 30 Minuten lang bei 20°C zentrifugiert. Das Überstandmedium wurde
entsorgt und die Lösung
mindestens ein weiteres Mal 10 Minuten lang zentrifugiert, bis man
ein endgültiges
Volumen von 1 ml (oder weniger, z.B. 0,7 ml) erhielt. Das endgültige Konzentrat
wurde unverzüglich
für die
Infektiositätsexperimente
verwendet.
-
Bestätigung der
zelltypspezifischen Geneinschleusung in vivo. Am Tag nach der Vektorvirusinjektion wurden
die Mäuse
getötet.
Menschliche Zellen wurden durch Trypsinbehandlung des Peritoneums
gewonnen. Die Zellen wurden isoliert und verschiedenen Antibiotikaselektionen
in einer Gewebekultur unterzogen. Die Hygromycinselektion ermöglicht das
Wachstum menschlicher COLO320DM-Her2neu-Empfängerzellen
oder A431-Her2neu-Nichtempfängerzellen,
nicht aber der Mäusezellen.
In beiden Experimenten begannen menschliche Zellen als Kolonien
vor einem breiten Hintergrund von Mäusezellen zu wachsen. 4 Tage
nach der Selektion wurden die Zellen mit X-gal eingefärbt (Chu,
T.H. und R. Dornburg, 1997, J. Virol. 71:720-725). Wir stellten
fest, dass 2 bis 3% der COLO320DM-Empfängerzellen in vivo infiziert
worden waren. Keine der A431-Zellen war infiziert worden. Weiterhin
färbte
sich keine der Mäusezellen
(hauptsächlich
Epithelzellen des Peritoneums) blau, was zeigte, dass sie nicht
infiziert worden waren. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine zelltypspezifische
Geneinschleusung in vivo erfolgen kann und SCID-Mäuse geeignete
Modellsysteme zur Untersuchung der in vivo-Geneinschleusung sind.
-
Wildarthülle
-
Retrovirenvektorpartikel,
die eine Antigenbindungsstelle eines Antikörpers aufweisen, können Zellen mit
einem antikörperspezifischen
Antigen spezifisch infizieren. Die Wirksamkeit des Gentransfers
kann jedoch gering sein. Wir stellten die Hypothese auf, dass die
Fusion des Empfängerpeptids
mit der Hülle
die natürliche Fusionsfunktion
der Hülle,
die für
ein effizientes Eindringen des Virus ausschlaggebend ist, stört. Daher
wurde die Hypothese, dass die Zugabe einer Wildarthülle diesen
Nachteil ausgleichen kann, getestet.
-
Es
wurden neue Retrovirenvektorpartikel konstruiert, die zwei unterschiedliche
Arten von Empfängerhüllen enthielten.
Diese Empfängerhüllen waren
(1) Fusionsproteine mit der Antigenbindungsstelle eines mit verschiedenen
Carboxyendabschnitten des Hüllproteins
des Milznekrosevirus (SNV) fusionierten Antikörpers und (2) Fusionsproteine,
die aus der mit verschiedenen Carboxyendabschnitten von SNV fusionierten
Rezeptorbindungsdomänen
von eco-MLV bestehen und den Antikörperhüllkonstrukten ähneln (6).
-
Empfängerhüllen alleine
sind für
Zellen, die einen Rezeptor für
die Empfängerhülle enthalten,
kaum oder gar nicht infektiös.
Die Zugabe der Wildarthülle
zu Partikeln, die Empfängerhüllen enthielten,
erhöhte
die Infektiosität
von Empfängerzellen,
die mit den eine der Hüllen
alleine enthaltenden Viruspartikeln kaum oder gar nicht infiziert
werden konnten, dramatisch bzw. ermöglichte sie sogar vollständig. Diese
Daten zeigen, dass die Konstruktion von Partikeln, die gemischte
Hüllen
enthalten, die Wirksamkeit eines Gentransfers in spezifische Empfängerzellen
dramatisch verbessert und so ein wertvolles Instrument zur Einschleusung
von Genen in spezifische Empfängerzellen
darstellt.
-
Dieses
Verfahren kann wahrscheinlich durch Mutation der natürlichen
Rezeptorbindungsdomäne
der Wildarthülle
(z.B. durch ortsspezifische Mutagenese) verbessert werden. Bei Verwendung
einer Wildarthülle, die
eine nicht-funktionsfähige
Rezeptorbindungsstelle in gemischthülligen Retrovirenvektorpartikeln
enthält, können auch
Zellen angesteuert werden, die einen Rezeptor für die Wildarthülle enthalten,
ohne die Empfängerzellenspezifität zu verlieren. Tabelle
1 Infektiosität von Retrovirenvektorpartikeln
für D17-
und CHO-Zellen mit und ohne DNP-Konjugation*
- * Der Virus wurde aus Gewebekulturzellen
gewonnen, die das SNV-gag-pol- und das in der linken Spalte aufgeführte Hüllprotein
exprimieren (siehe auch 2). Alle Zellen
enthielten pJD214HY, einen Retrovirenvektor, der das Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen
exprimiert. Infizierte Zellen wurden nach Hygromycinresistenz ausgewählt. Die
Anzahl der hygromycinresistenten Zellkolonien wurde 2 bis 3 Wochen
nach der Infektion (nachdem alle Zellen in den nicht infizierten
Kontrollplatten abgestorben waren) bestimmt. Die DNP-Bindung der
Vektorpartikel wurde durch Messung der Aktivität der an die DNP-BSA-Sepharosepartikel
gebundenen reversen Transkriptase bestimmt.
- n.d.:
- Nicht bestimmt.
- 0:
- Es wurden keine hygromycinresistenten
Kolonien nachgewiesen. Die Virustiter sind als koloniebildende Einheiten
(cfu) pro ml des Gewebekulturüberstandmediums
ausgedrückt.
Tabelle
2 Infektiosität von Retrovirenvektorpartikeln
mit dem einkettigen B6.2-Antigenbindungspeptid - -*:
- Experiment nicht durchgeführt.
- n.d.:
- Es wurden in den Infektionsexperimenten
mit insgesamt 2 ml Überstandgewebekulturmedium
keine infizierten Zellen nachgewiesen.
-
Die
Plasmidkonstrukte pTC24, pTC25 und pTC26 wurden in D17-Zellen transfiziert,
die Retrovirenkernproteine (gag-pol) und den Vektor pCXL exprimieren
(Mikawa, T.), oder in die Retrovirenverpackungslinie DSN, die ebenfalls
den pCXL-Vektor enthält
(gleichzeitige Transfektion eines Plasmids, das ein Antibiotikaresistenzgen
exprimiert). Der pCXL-Vektor transferiert das bakterielle Betagalactosidase-Gen.
Der Virus wurde aus stabilen transfizierten Zelllinien und frischen
D17-Zellen gewonnen. HeLa-Zellen oder Col-1-Zellen waren infiziert.
2 Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit X-gal eingefärbt. Blaue
Zellen deuten auf infizierte, das lacZ-Gen exprimierende Zellen.
Die Virustiter werden als koloniebildende Einheiten pro ml Gewebekulturüberstandmedium
aus Helferzellen ausgedrückt
(cfu/ml). Tabelle
3 Infektiosität von Retrovirenvektorpartikeln
mit Chimärenhüllproteinen
von MLV und SNV
- n.d:
- Es wurden in insgesamt
5 ml Gewebekulturmedium keine hygromycinresistenten Kolonien nachgewiesen.
-
Der
Virus wurde aus Gewebekulturzellen gewonnen, die das SNV-gag-pol-
und das in der linken Spalte aufgeführte Hüllprotein exprimieren (siehe
auch 6). Sämtliche
Experimente wurden mit pJD214HY, einem Retrovirenvektor, der das
Hygromycinresistenzgen exprimiert, durchgeführt. Die Virustiter sind als
hygromycinresistente koloniebildende Einheiten pro ml des Gewebekulturüberstandmediums
ausgedrückt. SNV-MLV-chiC
+ wtSNV und SNV-MLV-chiD
+ wtSNV sind Zelllinien, die Chimärenhüllen von MLV und SNV plus die
Hülle von
Wildart (wt)-SNV exprimieren. DSN-Zellen sind Helferzellen auf SNV-Basis,
die gag-pol und SNV-env aus zwei unterschiedlichen Plasmidkonstrukten
exprimieren. Die Virustiter sind als koloniebildende Einheiten (cfu)
pro ml des Gewebekulturüberstandmediums
ausgedrückt.
-
Der
Begriff „Oligonukleotid", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf Primer, Sonden, nachzuweisende Oligomerfragmente,
Oligomerkontrollen und nicht markierte Sperroligomere. Oligonukleotide
sind Moleküle
aus zwei oder mehr Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden. Der
Begriff „Primer", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, vorzugsweise ein Oligodesoxyribonukleotid,
das entweder natürlich
vorkommt, z.B. ein gereinigtes Restriktionsdigest, oder synthetisch
erzeugt wird und unter Bedingungen, bei denen die Synthese eines
zu einem Nukleinsäurestrang
komplementären
Primerextensionsproduktes induziert wird, d.h. in Gegenwart von
Nukleotiden, einem Polymerisationsmittel wie z.B. DNA-Polymerase
und bei geeigneter Temperatur und geeignetem pH, als Syntheseinitiationspunkt
fungieren kann. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese
der Extensionsprodukte in Gegenwart des Polymerisationsmittels zu initiieren.
Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen
durch Polymerasekettenreaktion (PCR) sind im Detail in den US-Patenten
Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,288 beschrieben.
-
1 ist ein Diagramm, das Retrovirenproteine
exprimierende Helferzellen darstellt. A) Helferzellen werden durch
Transfektion von Plasmiden hergestellt, die sämtliche für die Bildung infektiöser Viruspartikel notwendigen
Retrovirenproteine exprimieren. Ein Plasmid soll alle Kernproteine
exprimieren (Expression von gag und pol). Das andere Plasmid soll
das Hüllenvorstufenprotein
exprimieren. Beide Plasmidkonstrukte enthalten keine Retroviren-cis-Funktionssequenzen
zur Virusreplikation (z.B. Einkapselungssequenzen, eine Primerbildungsstelle,
usw.). Die Polyadenylierung erfolgt in Nicht-Retrovirenpolyadenylierungserkennungssequenzen.
B) Nach der Transfektion des Retrovirenvektors wird das Vektor-RNA-Genom
in die Kernstrukturen eingekapselt. Die Helferzelle produziert Retrovirenpartikel,
die nur das Vektorgenom mit dem/den Genen) von Interesse enthält. Der
Vektor enthält
sämtliche
cis-Funktionssequenzen zur Replikation. Daher erfolgen in den infizierten
Empfängerzellen
eine reverse Transkription und die Aufnahme des Vektorgenoms in
das Genom. Infolge der fehlenden Retrovirenproteincodierungsgene
in dem Vektorgenom werden keine Viruspartikel aus infizierten Empfängerzellen
erzeugt. C) Helferzellen, die ein Plasmid enthalten, das ein modifiziertes
Hüllgen exprimiert.
Die Helferzelle ähnelt
der zuvor dargestellten stark. Es wurden jedoch Chimärenhüllgene konstruiert,
die die Antigenbindungsdomäne
eines Antikörpers
an dessen mit dem Carboxyende des Hüllgens fusionierten Aminoende
enthalten. Solche Partikel können
sich nur an Empfängerzellen
binden und diese infizieren, die eine Antigenstruktur enthalten,
die von der Antikörpereinheit
des Chimärenhüllproteins
erkannt wird.
-
2 ist ein Diagramm, das Plasmide darstellt,
die Mutantenhüllgene
des Milznekrosevirus (SNV) exprimieren. Die Gene werden aus dem
Rous-Sarkom-Viruspromotor
(RSV pro) exprimiert und in dem Polyadenylierungssignal des Herpes
simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (TK poly(A)) polyadenyliert. Der
Polylinker von pBluescript wurde zwischen den Promotor und die Polyadenylierungssequenz
eingefügt,
um ein leichtes Klonieren der Gene in diesen Vektor zu ermöglichen
(Plasmidsequenzen, die an den Vektor grenzen, sind nicht dargestellt).
a/b) Mittels ortsspezifischer Mutagenese wurden Punktmutationen
in das env-Gen eingeschleust, um neue, mit einem *) gekennzeichnete
Restriktionsenzymerkennungsstellen zu erzeugen. Alle Enzyme schnitten
genau zwischen 2 Kodone und erzeugten so stumpfe Enden für eine einfache
Ligation ohne Verschiebung des Leserahmens. c/d) Chimärenhülle, die
ein an das Carboxyende von env fusioniertes Antigenbindungspeptid
enthält.
e) pJD214HY, ein in sämtlichen
Studien zum Test des Gentransfers durch Retrovirenvektorpartikel
eingesetzter Retrovirenvektor.
-
3 stellt
die Sequenz des einkettigen Antikörpergens (scFv) gegen Hapten-DNP
dar.
-
4 stellt Retrovirenverpackungszellen dar.
A) Eine eukaryontische Zelle, die 2 verschiedene Plasmide für die Produktion
von Retrovirenvektorpartikelproteinen enthält. Ein in solche Zellen transfizierter
Retrovirenvektor, der das Gen von Interesse enthält, wird durch Retrovirenkernproteine
eingekapselt. Der Hüllexpressionsvektor
exprimiert Empfängerhüllen (z.B.
ein mit der Hülle
fusioniertes Antigenbindungspeptid). Es werden Viruspartikel produziert,
die nur Empfängerzellen
infizieren, die einen für
die Antigenbindungsstelle spezifischen Rezeptor enthalten. Der in
B) dargestellte Helfer ähnelt
dem zuvor dargestellten mit der Ausnahme, dass er darüber hinaus
einen Genexpressionsvektor enthält,
der die Wildarthülle
codiert. Aus solchen Helferzellen produzierte Viruspartikel enthalten „gemischte" Hüllen, die
aus der Empfängerhülle und
der Wildarthülle
bestehen. Die Bildung gemischter Oligomere ist möglich, da sowohl die Empfänger- als
auch die Wildarthülle
ein komplettes TM-Peptid enthält,
das die Bildung von Oligomeren vermittelt.
-
5 stellt
einen eukaryontischen Genexpressionsvektor (pTC13) dar, mit dessen
Hilfe sich eine große
Anzahl an Genprodukten gewinnen lässt, die eine ER-Erkennungssequenz enthalten.
Der dargestellte Vektor wurde von einem anderen, von Sheay, W. et
al. 1993 beschriebenen Genexpressionsvektor (pRD114) abgeleitet.
Der dargestellte Vektor unterscheidet sich von pRD114 darin, dass
er ein Genfragment enthält,
das eine ER-Erkennungsignalsequenz
codiert, um den Transport von Proteinen durch das endoplasmatische
Retikulum zu ermöglichen.
Er enthält
2 Erkennungsstellen für
die Restriktionsenzyme Nrul und StuI, die zwischen 2 Kodone unterhalb
des ER-Signalsequenzcodierungsabschnittes
schneiden. DNA-Fragmente, die ein Peptid codieren, können in
diesen Vektor eingefügt
werden. Die Translation des eingefügten Gens wird durch eines der
drei Stopkodone beendet. MLV-U3-pro: Promotor und Verstärker des
Mäuseleukämievirus.
Ad. V. leader: Dreiteilige Leadersequenz des Adenovirus. SV40 poly(A):
Polyadenylierungssignalsequenz des Affenvirus 40.
-
6 stellt
Plasmidvektoren dar, die Empfängerhüllproteine
exprimieren. Das PCR-Produkt
des Gens, das den einkettigen Antikörper B6.2 (ein Eco47III- bis
Nrul-Fragment, siehe „Material
und Verfahren") codiert,
wurde in die Nrul-Stelle von pTC13 kloniert (5), so dass
das Plasmid pTC23 entstand. Die Carboxyenden des SNV-Hüllgens wurden isoliert und
in die Nrul-Stelle unterhalb des B6.2-Antikörpergens kloniert. Das entstandene
Empfängerantikörperhüllfusionsgen
von pTC24 und pTC25 ähnelt
dem von pTC4 und pTC5. pTC24 und pTC25 speichern genau dieselbe
Menge der SNV-Hülle
wie pTC4 bzw. pTC5. In pTC26 grenzen die Antikörpercodierungsgene an den Hüllcodierungsabschnitt
bei Kodon 167 des Hüllgens.
Die Plasmide pSNV-MLV-chiC
und pSNV-MLV-chiD sind mit pTC4 und pTC5 identisch mit der Ausnahme,
dass das Antikörpergen
durch ein Genfragment ersetzt ist, das fast das gesamte SU-Peptid
von MLV codiert. In diesen Klonen stammt die ER-Transportsignalsequenz
(L) von MLV. MLV-pro: Promotor und Verstärker des Mäuseleukämievirus. Avt1: Dreiteilige
Leadersequenz des Adenovirus, L: ER-Transportsignalsequenz. B6.2scFv:
Den einkettigen Antikörper
codierendes Gen. poly(A): Polyadenylierungssignalsequenz von SV40.
SU: Oberflächenpeptidcodierungsabschnitt
der SNV-Hülle.
TM: Transmembrancodierungsabschnitt der SNV-Hülle. RSV: Promotor und Verstärker des
Rous-Sarkom-Virus.
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