DE69926116T9

DE69926116T9 - Optischer strecker

Info

Publication number: DE69926116T9
Application number: DE69926116T
Authority: DE
Inventors: Käs Josef; Guck Jochen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2006-08-10
Also published as: CA2322212A1; JP2002505200A; DE69926116D1; CA2322212C; DE69926116T2; EP1059871B1; AU2896299A; JP4456270B2; WO1999044488A3; EP1059871A2; HK1032726A1; EP1059871A4; WO1999044488A2

Description

Hintergrund zur Erfindung
Der erste direkte experimentelle Nachweis im Labor, dass Licht einen Impuls hat, wurde von E. F. Nichols und G. F. Hull in den USA (Nichols E. F., Hull G. F., Phys Rev. 13, p. 307 (1901)) und P. N. Lebedev in Russland (Lebedev P. N., Ann. Phys. (Leipzig) 6, p. 433 (1901)) um die Jahrhundertwende erbracht. In beiden Experimenten wurde der Strahlungsdruck einer Lichtquelle durch die Drehbewegung von an dünnen Drähten im Hochvakuum aufgehängten Spiegeln festgestellt. Das Vakuum war entscheidend, um Effekte der thermischen und radiometrischen Kräfte zu eliminieren. Niemand stellte sich zu dieser Zeit vor, dass es für diesen winzigen Effekt irgendeine praktische Anwendung geben könnte. Der erste Prozess, bei dem der Impuls von Photonen eine wichtige Rolle spielte, war der Compton-Effekt, d.h. die Streuung von Röntgenstrahlen an Elektronen. Weitere vier Jahrzehnte vergingen, bis zur Erfindung des Lasers im Jahre 1960. Die Möglichkeit räumlich kohärentes Licht mit sehr hoher Intensität zu erzeugen, brachte den Effekt des Strahlungsdrucks in die makroskopische Welt. Ein früher Pionier in diesem Feld war A. Ashkin von Bell Laboratories. Ashkin war der erste, der einen Laser benutzte, um in den späten 60ern transparente, mikrometergroße Latexkugeln zu manipulieren. Diese Kugeln, in Wasserlösung suspendiert, wurden zunächst mit einem horizontalen Laserstrahl beschleunigt und dann in einem zweiten Experiment zwischen zwei Strahlen eingefangen (Ashkin A., „Acceleration and Trapping of Particles by Radiation Pressure" Phys. Rev. Lett. 24(4) p. 156–159 (1970)).
Seitdem ist dieses Merkmal des Lichts auf viele Weisen ausgenutzt worden. Ein umfassendes Feld ist das Einfangen und Abkühlen von Atomen und Molekülen. Die Tatsache, dass der diesjährige Nobelpreis an Steven Chu, William D. Phillips und Claude Cohen-Tannoudji für die Entwicklung von Methoden, um Atome mit Laserlicht zu kühlen und einzufangen, verliehen wurde, illustriert die absolute Relevanz für die heutige Wissenschaft (Chu S., „Laser Trapping of Neutral Particles" Sci. Am., p. 71 (February 1992); Phillips W. D., Metcalf H. J., „Cooling and Trapping Atoms" Sci. Am., p. 36 (March 1987); Cohen-Tannoudji C., Phillips W. D., „New Mechanisms for Laser Cooling" Physics Today, p. 33 (October 1990); Chu S., „Laser Manipulation of Atoms and Particles" Science 253, p. 861–866 (1991)).
Die Wechselwirkungen von Licht mit dielektrischer Materie können in zwei vorherrschende Kraftwirkungsmechanismen eingeteilt werden. Die Gradientenkraft, die das Material mit dem höheren Brechungsindex in den Bereich der höchsten Intensität in einem Laserstrahl zieht, und die Streukraft, die aus der Impulsübertragung vom Photon auf das Material resultiert. Die meisten Geräte zur optischen Mikromanipulation machen sich die Gradientenkraft zunutze. Der „Optical Stretcher" in dieser Erfindung macht sich jedoch die Streukraft zunutze, um elastische dielektrische Proben zu verformen.
Die Eigenschaften dieser beiden Kräfte (Gradientenkraft und Streukraft) erlauben verschiedene mögliche Fallenkonstruktionen.
Eine der ersten stabilen Fallen erlaubte es mit einem vertikalen Laserstrahl Teilchen schweben zu lassen (Ashkin A., Dziedzic J. M., „Optical Levitation by Radiation Pressure" Appl. Phys. Lett. 19(6), p. 283–285 (1971); Ashkin A., „The Pressure of Laser Light" Sci. Am. 226, p. 63–71 (1972); Ashkin A., Dziedzic J. M., "Optical Levitation in High Vacuum" App. Phys. Lett. 28(6), p. 333–335 (1976); Ashkin A., Dziedzic J. M., "Observation of Light Scattering from Nonspherical Particles Using Optical Levitation" Appl. Opt. 19(5), p. 660–668 (1980)). Die streuende Kraft ist stark genug um die Gravitation auszugleichen, während die Gradientenkraft das Teilchen auf der optischen Achse festhält.
Eine große Verbesserung der Falle war die Benutzung eines stark fokussierten Laserstrahls, das erste Mal 1986 von Ashkin verwirklicht (Ashkin A., Dziedzic J. M., Bjorkholm J. E., Chu S., „Observation of a Single-Beam Force Optical Trap for Dielectric Particles" Opt. Lett. 11(5), p. 288–290 (1986)), weil sie so unabhängig von der Gravitation ist, und man die Falle in jede Raumrichtung ausrichten und sogar in Mikrogravitation nutzen kann (Gussgard R., Lindmo T., Brevik I., „Calculation of the Trapping Force in a Strongly Focused Laser Beam" J. Opt. Soc. Am. B 9(10), p. 1922–1930 (1992)). Die Idee ist dabei, dass die extreme Fokussierung zu einem Punkt sehr hoher Intensität führt (anstatt einer Achse). Dadurch zieht die Gradientenkraft ein dielektrisches Teilchen zu diesem Punkt. Die Fokussierung muss stark genug sein, um die Streukraft zu überwinden, die in diesem Fall ein ungewollter Effekt ist, weil sie das Teilchen vom Fokus wegschiebt. Dies wird normalerweise verwirklicht, indem der Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv mit großer numerischer Apertur (NA) geleitet wird. Eine experimentelle Verbesserung kann durch die Benutzung eines Objektivs mit zentralem Feldstop zur Erzeugung eines konischen Dunkelfeldes erreicht werden. Dies erhöht den relativen Beitrag der Belichtung mit großer NA und verringert den Einfluss der Streukraft. Das Teilchen wird gleichzeitig in der Nähe des Fokus festgehalten und kann mit dem Mikroskop beobachtet werden. Dieser einstrahlige Aufbau, der normalerweise Optical Tweezer genannt wird, wurde ausführlich untersucht (Ashkin A., Dziedzic J. M., Bjorkholm J. E., Chu S., „Observation of a Single-Beam Force Optical Trap for Dielectric Particles" Opt. Lett. 11(5), p. 288–290 (1986); Ashkin A., „Forces of a Single-Beam Gradient Laser trap on a Dielectric Sphere in the Ray Optics Regime" Biophys. J. 61, p. 569–582 (1992); Wright W. H., Sonek G. J., Berns M. W., "Radiation Trapping Forces on Microspheres with Optical Tweezers" App. Phys. Lett. 63, p. 715–717 (1993); Gussgard R., Lindmo T., Brevik I., "Calculation of the Trapping Force in a Strongly Focused Laser Beam" J. Opt. Soc. Am. B 9(10), p. 1922–1930 (1992); Visscher K., Brakenhoff G. J., "Theoretical Study of Optically Induced Forces on Spherical Particles in a Single Beam Trap I: Rayleigh Scatterers" Optik 89(4), p. 174–180 (1992); Kuo S. C., Sheetz M. P., "Optical Tweezers in Cell Biology" Trends in Cell Biology 2, p. 116–118 (1992)), und wird in vielfältigen biologischen Anwendungen eingesetzt. Die Leistung der benutzten Laser reicht von einigen mW bis zu 1,5 W zum einfangen von Glas- oder Latexkugeln und die erreichten Einfangkräfte variieren im Bereich von Pico- bis Nanonewton, abhängig von der Größe und dem Brechungsindex des Objekts. Für einen detaillierten Überblick siehe Kuo S. C., Sheetz M. P., „Optical Tweezers in Cell Biology" Trends in Cell Biology 2, p. 116–118 (1992); Berns M. W., Wright W. H., Steubing R. W., „Laser Microbeam as a Tool in Cell Biology" Int. Rev. Cytol. 129, p. 1–44 (1991); Block S. M., Optical Tweezers: A new Tool for Biophysics, in Noninvasive Techniques in Cell Biology, G. S. Foskett J. K., Editor. 1990, Wiley-Liss.: New York. p. 375–402; Greulich K. O., Weber G., "The Laser Microscope on its Way from an Analytical to a Preparative Tool" J. Microsc. 167, p. 127–151 (1991); Simmens R. M., Finer J. T., "Glasperlenspiel II: Optical Tweezers" Curr. Biol. 3, p. 309–311 (1993); und Weber G., Greulich K. O., "Manipulation of Cells, Organelles, and Genome by Laser Microbeams and Optical Traps" Int. Rev. Cytol. 133, p. 1–41 (1992).
Obwohl Optical Tweezers ein sehr wirkungsvolles Instrument sind, haben sie ihre Beschränkungen. Die Arbeitsreichweite von großen NA Objektiven ist sehr kurz und erlaubt keinen Einsatz von zusätzlichen Testgeräten zwischen Objektiv und Objekt. Das Gebiet, in dem die Falle wirkt, ist sehr klein (von der Größenordnung der Wellenlänge des Lichts). Es ist gezeigt worden, dass wegen des Verlusts der axialen Stabilität (wenn die Streukraft stärker wird, als die rückgerichtete Gradientenkraft) eine hohe Effizienz der Falle nur für Brechungsindizes kleiner als ≈ 1,7 erreicht werden kann (Svoboda K., Block S. M., „Biological Applications of Optical Forces" Annu. Rev. Biophys. Struct. 23, p. 147–285 (1994)). Außerdem führt die Fokussierung des Strahls bis zur theoretischen Begrenzung der Größe des Brennpunkts (die halbe Wellenlänge des benutzten Lichts wird verwendet) zu sehr hohen Intensitäten die die Integrität von biologischen Objekten gefährden. Die meisten Zellen, die mit Optical Tweezers eingefangen werden, überleben keine Leistungen die größer als 20–250 mW sind, weil die extrem hohe Fokussierung zu sehr hohen lokalen Intensitäten führt. Dies hängt natürlich auch von der spezifischen Zellart und der benutzten Wellenlänge ab (Ashkin A., Dziedzic J. M., Yamane T., „Optical Trapping and Manipulation of Single Cells Using Infrared Laser Beams" Nature 330(24), p. 769–771 (1987); Ashkin A., Dziedzic J. M., „Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria" Science 235, p. 1517–1520 (1987); Kuo S. C., Sheetz M. P., „Optical Tweezers in Cell Biology" Trends in Cell Biology 2, p. 116–118 (1992)).
Ein unterschiedlicher Aufbau, der die meisten dieser Probleme umgeht, ist eine zweistrahlige Falle (Ashkin A., „Acceleration and Trapping of Particles by Radiation Pressure" Phys. Rev. Lett. 24(4) p. 156–159 (1970); Roosen G., Imbert C., „Optical Levitation by means of Two Horizontal Laser Beams: A Theoretical and Experimental Study" Phys. Lett. 59A(1), p. 6–9 (1976); Roosen G., "La Lévitation Optique de Sphères" Can. J. Phys. 57, p. 1260–1279 (1979); Ashkin A., Dziedzic J. M., "Optical Levitation by Radiation Pressure" Appl. Phys. Lett. 19(6), p. 283–285 (1971)). Historisch wurde die zweistrahlige Falle mehr als ein Jahrzehnt vor den Optical Tweezers entwickelt, wurde aber seitdem nicht mehr benutzt. Zwei identische, entgegen gerichtete Laserstrahlen mit gaußschem Strahlenprofil können ein Teilchen im Symmetriepunkt festhalten. Die Gesamtkräfte auf eine Kugel sind die Überlagerung der Kräfte von zwei einzelnen Strahlen. Die Gradientenkraft beschränkt das Teilchen auf die Achse, während die Streukraft für Stabilität entlang der Achse sorgt. Dies ist eine stabile Anordnung, solange der Brechungsindex n des Teilchens größer ist, als der des umgebenden Mediums. Luftblasen in Wasser, ein Beispiel, bei dem diese Bedingung nicht erfüllt ist, werden aus dem Strahlengang herausgedrückt (wie ein Gummiball aus einem Wasserstrahl). Eine andere Bedingung, die etwas unerwartet ist, ist die, dass der Durchmesser des Teilchens kleiner sein muss als die Strahlenradien im Zentrum. In der Situation, in der der Strahlenradius kleiner ist als der Teilchenradius, und daher das Verhältnis größer als 1 ist, ist die näher am zentralen Strahl angreifende Kraft durch die Divergenz des Strahls kleiner als weiter außen. Dies führt zu einer Verstärkung von kleinen Auslenkungen der Kugel aus der Mitte, was heißt, dass das Teilchen nicht stabil eingefangen ist (Roosen G., „A Theoretical and Experimental Study of the Stable Equilibrium Positions of Spheres Levitated by Two Horizontal Laser Beams" Opt. Comm. 21(1), p. 189–195 (1977)).
Es wurde eine Verbesserung dieses Aufbaus demonstriert, bei dem single-mode (SM) Glasfasern benutzt werden, um die Laserstrahlen zum Einfanggebiet zu leiten (Constable A., Kim J., Mervis J., Zarinetchi F., Prentiss M., „Demonstration of a Fiber-Optical Light-Force Trap" Opt. Lett. 18(21), p. 1867–1869 (1993)). Dies vermeidet die Notwendigkeit von zusätzlichen optischen Elementen und deren Ausrichtung und es erlaubt eine sehr einfache und kostengünstige Einführung in spezifischere Messaufbauten. Diese Falle kann auch unabhängig von einem Mikroskop aufgebaut werden. Ein guter Überblick über all diese optischen Fallen und ihre Anwendungen in der Biologie kann in Svoboda K., Block S. M., „Biological Applications of Optical Forces" Annu. Rev. Biophys. Struct. 23, p. 147–285 (1994) nachgelesen werden.
Ein neues Mitglied in der Familie der optischen Fallen ist der Optical Spanner (Padget M., Allen L., „Optical Tweezers and Spanners" Physics World, p. 35–38 (September 1997). Der Grundaufbau ist derselbe, wie für den Optical Tweezer, aber anstatt eines Hermite-Gaußschen Laserprofils wird ein Laguerre-Gaußsches Profil verwendet. Diese Strahlen haben einen kreisförmigen Querschnitt, eine helikale Wellenfront und einen Poyntingvektor, der sich um die optische Achse dreht. Das bedeutet, dass ein solcher Strahl neben dem schon diskutierten Impuls der Translation zusätzlich einen umlaufenden Impuls hat. Da der Gesamtdrehimpuls des Systems auch erhalten bleiben muss, beginnt das Teilchen zu rotieren. Auf diese Weise können Teilchen nicht nur Geradlinig bewegt sondern auch rotiert werden.
Obwohl diese Fallen sehr nützlich für allerlei Arten der Manipulation von Objekten sind, können sie sie nur verschieben und/oder rotieren und sind nicht dafür ausgelegt sie zu deformieren. Der Optical Stretcher in dieser Erfindung erweitert die Reihe der optischen Werkzeuge und erlaubt das volle Spektrum der Manipulationen von Teilchen.
Alle existierenden Methoden zur Untersuchung der Zellelastizität haben ihre Einschränkungen. Bei Mikropipettenaspirationsexperimenten wird die Spitze einer Mikropipette mit einem Mikromanipulator auf einer Zelle platziert und ein negativer Druck wird angewandt, um einen Teil der Zelle in die Pipette zu saugen. Dies stellt nur sehr lokal gültige Informationen zur Verfügung und kann die Membran von der Zelle ablösen, was zu inakkuraten Messungen führt.
Eine andere Möglichkeit ist die Nutzung eines Atomic Force Microscopes (AFM) im Abklopf-Modus (Radmacher M., Fritz M., Kacher C. M., Cleveland J. P., Hansma P. K., "Measuring the Viscoelastic Properties of Human Platelets with the Atomic Force Microscope" Biophys. J. 70, p. 556–567 (1996)). Mit der oszillierenden AFM-Spitze wird der Zellkörper abgetastet, was es erlaubt, die Kraft und die Einbuchtungen zu messen. Normalerweise wird dann, unter Benutzung des Hertz-Modells, das von einem so gut wie unendlichen Stück Material ausgeht und Deformationen mit seinen Materialkonstanten in Beziehung setzt, das Elastizitätsmodul der Zelle bestimmt. Das Problem hierbei ist, dass die Federkonstante des AFM-Trägerarms ziemlich groß ist gegenüber der Stärke des Zytoskeletts, das bedeutet, dass es nicht möglich ist kleine Unterschiede in der Elastizität von Zellen zu erkennen – die Zelle wird entweder zusammengedrückt oder nicht. Diese Behandlung ist auch sehr grob und viele Zellen überleben sie nicht. AFM zieht auch nur die Elastizität von kleinen Bereichen der Zelloberfläche in Betracht. Diesem Ähnlich sind „Zellstech"-Experimente bei denen die AFM-Spitze von einer Glasnadel ersetzt wird (Elson E. L., „Cellular Mechanics as an Indicator of Cytoskeletal Structure and Function" Annu. Rev. Biophys. Chem. 17, p. 397–430 (1988)).
Ein anderer bedeutender Nachteil, den all diese Methoden gemeinsam haben, ist, dass sie nicht effizient sind. Es ist sehr unhandlich, die Mikropipette oder die AFM-Spitze per Hand über der Zelle zu positionieren, Daher ist es effektiv nicht möglich eine signifikante Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeit zu messen, was zu einem Mangel an guter Statistik führt.
Eine eher indirekte Herangehensweise war es, mit einem Rheometer einen ganzen Zellklumpen von dicht gepackten Zellen zu scheren (Eichinger L., Koppel B., Noegel A. A., Schleicher M., Schliwa M., Weijer K., Wittke W., Janmey P. A., „Mechanical Perturbation Eicits a Phenotypic Difference Between Dictyostelium Wildtype Cells and Cytoskeletal Mutants" Biophys. J. 70, p. 1054–1060 (1996)). Dies ist jedoch eine Massenmessung und bringt nur Mittelwerte und keine spezifischen Informationen über die einzelne Zelle hervor. Eine weitere Einschränkung ist, dass nicht nur die Zellelastizität, sondern auch Haftungskräfte und Reibung zwischen den Zellen das Ergebnis der Messung beeinflussen.
EP 0 437 043 A2 legt eine Lasermikrobearbeitung offen, die das Strahlen eines Lasers auf Teilchen, deren Einfangen und die Strahlung eines gepulsten Bearbeitungslasers zur Bearbeitung besagter Teilchen beinhaltet.
US 5,608,519 legt einen Apparat und eine Methode zur mikroskopischen und spektroskopischen Analyse und Bearbeitung von biologischen Zellen offen, die einen Laser beinhaltet, der einen optischen Resonanzraum gebildet von wenigstens zwei reflektierenden Spiegeln und eine Analyseregion innerhalb des optischen Resonanzraumes besitzt.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist Ziel dieser Erfindung, einen Apparat und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine verbesserte Untersuchung von mikrometergroßen, dielektrischen Teilchen wie biologischen Zellen ermöglichen.
Dies wird ermöglicht durch einen Apparat, der die in Anspruch 1 enthaltenen Merkmale hat, und ein Verfahren, das die in Anspruch 14 enthaltenen Merkmale hat. Weitere Verkörperungen der Erfindung werden in den davon abhängenden Ansprüchen dargestellt.
Es gibt verschiedene optische Geräte für die Manipulation von dielektrischen Teilchen wie zum Beispiel biologischen Zellen. Bisher war die Manipulation durch Strahlungsdruck auf Verschiebung und Rotation beschränkt. Dies ist das erste Mal, dass die Kräfte, die aus der Wechselwirkung von Licht mit Materie resultieren, absichtlich zur Verformung von Zellen auf eine kontrollierte und nichtdestruktive Art und Weise genutzt werden. Mit diesem neuartigen Gerät, dem „Optical Stretcher", ist es möglich, die Elastizität von deformierbaren Objekten, wie Zellen, mit typischen Durchmessern zwischen 5–50 Mikrometern zu messen. „Optical Stretcher" bezieht sich hierin auf die hier beschriebene Erfindung. Zellen verdanken ihre Stabilität einem dreidimensionalen Netzwerk von Polymerfilamenten, genannt Zytoskelett. Es ist nicht verstanden, wie das Zytoskelett der Zelle mechanische Stabilität verleihen kann, da klassische Konzepte der Physik der weichen kondensierten Materie bei der Erklärung dieses Phänomens versagen. Die Nutzung des Optical Stretchers, in Verbindung mit modernen Methoden der Molekularbiologie werden die Rolle der zytoskelettalen Bestandteile aufklären. Diese neuartige Symbiose von Physik und Molekularbiologie werden helfen ein klareres Bild von der Funktionsweise des Zytoskeletts zu gewinnen.
Weiterhin kann der Optical Stretcher zur analytischen Aufspürung von einzelnen bösartigen Zellen verwendet werden. Es zeigt sich, dass Krebszellen ihre Morphologie im Vergleich zu normalen Zellen ändern, was ihre Elastizität ändert. Dieses neuartige Gerät, der Optical Stretcher, wird beim Aufspüren dieser Änderungen sehr nützlich sein.
Der Optical Stretcher ist eine neuartige Methode die Elastizität einzelner Zellen zu messen, wobei die oben genannten Nachteile umgangen werden. Die grundlegende Idee ist die Benutzung von zwei entgegen gerichteten Laserstrahlen um eine einzelne Zelle, welche in einer Pufferlösung suspendiert ist, durch den Strahlungsdruck einzufangen. Die Durchführbarkeit des Einfangens selbst wurde schon von A. Ashkin in den späten 60er Jahren gezeigt. Seitdem hat das Einfangen von allerart Teilchen mit Größen, die von Angstrom (wie Atome und Moleküle) bis zum zweistelligen Mikrometerbereich (wie kleine Glaskugeln oder Zellen) reichen, viele Anwendungen gefunden.
Dies ist das erste Mal, dass dieser Aufbau nicht nur zum einfangen, verschieben und rotieren von Teilchen verwendet wird, sondern auch zur Verformung der untersuchten Teilchen auf eine nicht-invasive, nicht-destruktive und kontrollierte Weise. Die Idee dielektrische Oberflächen durch intensives Licht zu verformen ist nicht neu. Der Effekt wurde von Askar'yan, Kats und Kantorovich vorausgesagt (Askar'yan G. A., „Radiation Pressure on an Object with Varying Polarizability Changes. Deformation Absorption of a Wave by Variable Inhomogenities" JETP Lett. 9, p. 241–243 (1969); Kats A. V., Kantorovic V. M., "Bending of Surface and Self-Focusing of a Laser Beam in a Linear Medium" JETP Lett. 9, p. 112–114 (1969)) und später für eine freie flüssige Oberfläche von Ashkin experimentell gezeigt (Ashkin A., Dziedzic J. M., „Radiation Pressure on a Free Liquid Surface" Phys. Rev. Lett. 30(4), p. 139–142 (1973)). Dennoch hat niemand das ganze Potential dieses Effekts erkannt und er wurde folglich bis jetzt ignoriert.
Mit diesem neuartigen Ansatz können wir die Elastizität von Zellen messen und die meisten der oben genannten Probleme umgehen. Obwohl der Aufbau relativ einfach ist, kann diese Erfindung: einzelne Zellen untersuchen ohne sie zu töten, einen großen Bereich von Kräften anlegen und zeitabhängige Messungen über einen großen Frequenzbereich machen (im Prinzip von mHz bis MHz); einfach indem die Lichtintensität verändert wird. Außerdem ist es mit dem Einbau einer Flusskammer auch möglich eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeit zu messen.
Krankheiten, die das Zytoskelett beeinflussen, wie die maligne Transformation von Zellen, können mit dem Optical Stretcher auf einfache, kostengünstige und nichtinvasive Weise entdeckt werden. Daher wird er bisher existierenden Methoden überlegen sein und eine Grundlage zur erfolgreichen Bekämpfung dieser Krankheiten bilden.
Die dielektrischen Teilchen, die in der praktischen Anwendung dieser Erfindung eingesetzt werden, können sehr unterschiedlich sein und reichen von leblosen Teilchen wie Polymerkugeln wie Latex- oder Polystyrolkugel bis zu biologischen Zellen wie roten Blutkörperchen und Nervenzellen.
Ein weiterer wichtiger Teil dieser Erfindung umfasst eine Plattform, die die biologischen Zellen in einer wässrigen Lösung trägt. Die erste und zweite Laserquelle werden auf ein Gebiet auf der Plattform gerichtet in dem sich die Zellen befinden, wobei ein erster Detektor bestimmt, ob eine Zelle zwischen der ersten und zweiten Laserquelle eingefangen ist und ein zweiter Detektor die Verformung der Zelle bei Erhöhung der Intensität des Laserlichts bestimmt und/oder misst, wobei die erste und zweite Laserquelle eingestellt werden können, um die Leistung des Laserlichts zu ändern, um damit die Zelle entweder einzufangen oder zu strecken.
Außerdem ist diese Erfindung auch eine Methode zur Entdeckung von einzelnen Krebszellen, indem deren Verformbarkeit mit dem oben genannten Apparat gemessen wird.
Weiterhin ist diese Erfindung eine Methode zur kontrollierten Verformung von dielektrischen, mikrometergroßen Teilchen, bestehend aus: Der Belichtung des Teilchen mit mehreren Laserstrahlen genügender Intensität um das Teilchen zu verformen und wahlweise der Messung der Verformung der Zelle.
Es wird allgemein angenommen, dass die Kräfte die nötig sind, um Zellen von Säugetieren zu verformen, nicht mit Lasern erreicht werden können, ohne gleichzeitig Strahlungsschäden durch Hitze zu verursachen. Frühere Experimente benutzten fokussierte Strahlen und die hohen lokalen Intensitäten zerstörten die Zellen. Wir haben nun erkannt, dass man dieses Problem lösen kann, indem man Fallen mit Glasfasern, die bisher nur für das einfangen von GlasKugeln, jedoch nicht zum strecken von Zellen verwendet wurden, benutzt. Es wurde auch vorausgesagt, dass Laserlicht dielektrische Oberflächen verformen kann. Es verstößt jedoch etwas gegen die Intuition, dass der Strahlungsdruck von zwei entgegen gerichteten Laserstrahlen eine Zelle auseinander zieht. Man würde erwarten, dass die Zelle zusammengedrückt würde. Es ist völlig unerwartet und überraschend, dass zwei entgegen gerichtete Laserstrahlen eine Zelle nicht zusammendrücken, sonder dass der Strahlungsdruck die Zelle auseinander zieht. Dies ist nicht intuitiv klar und war nicht in der Literatur vorhergesagt. Ohne durch Theorie gebunden zu sein, können wir den Effekt nun durch die Erhöhung des Impulses des Laserstrahls beim Eintritt in die Zelle erklären. Wegen der Impulserhaltung muss diese Erhöhung durch eine Zugkraft ausgeglichen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt einen nicht einschränkenden, repräsentativen Aufbau für die Vorrichtung dieser Erfindung.
2A–2C zeigen eine nicht einschränkende, repräsentative Perspektive, Draufsicht und Seitenansicht einer Plattform, wie sie bei der praktischen Anwendung dieser Erfindung Verwendung finden könnte.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Optical Stretcher ist ein neuartiges Gerät, welches mittels einem oder mehrerer Laserstrahlen an transparenten, dielektrischen Materialien zieht. Insbesondere ein Aufbau mit zwei oder mehr entgegen gerichteten Strahlen, der benutzt werden kann um mikrometergroße, dielektrische Teilchen wie biologische Zellen stabil einzufangen und zu strecken. Die Tatsache, dass der Druck den die Photonen eines Laserstrahls beim Eintritt in- und Austritt aus einem Medium mit größerem Brechungsindex ausüben, an der Grenzfläche zieht, ist unerwartet, kann aber durch die Impulserhaltung erklärt werden.
Die Arten von Zellen die eingefangen und gestreckt werden, können sehr unterschiedlich sein. Zum Beispiel kann diese Erfindung zum einfangen und verformen von eukaryotischen Zellen, inklusive Zellen von Säugetieren, mit Ausnahme von Muskel- und Nervenzellen, die für die hierin vorgestellte Plattform zu groß sind, benutzt werden. Eine repräsentative, nicht einschränkende Liste von solchen Zellen, die in der praktischen Anwendung dieser Erfindung verwendet werden können enthält: Epithel Zellen, Lymphozyten, Makrophagen, Fibroblasten, PC12 Zellen, Keratinozyten und Melanom Zellen. Es könnte auch möglich sein, kleine Gewebecluster mit Durchmessern von ungefähr 100 Mikrometern zu verwenden.
1 zeigt den Aufbau unseres Experiments, das dem der zwei-Strahl Glasfaserfalle folgt, das in Constable A., Kim J., Mervis J., Zarinetchi F., Prentiss M., „Demonstration of a Fiber-Optical Light-Force Trap" Opt. Lett. 18(21), p. 1867–1869 (1993) beschrieben ist. Dieser Aufbau ist repräsentativ und sollte nicht als den Gültigkeitsbereich einschränkend aufgefasst werden.
In 1 pumpt ein erster Laser (10) wie z.B. ein Ar⁺-Laser (Spectra Physics Lasers, Inc., Beamlok 2080 RS), mit maximal 28W Pumpleistung, einen weiteren Laser (12), wie z.B. einen verstellbaren cw-Laser Ti-Saphir Laser (Spectra Physics Lasers, Inc., 3900S mit einer Wellenlänge von ungefähr 790 Nanometer). Obwohl andere Wellenlängen verwendet werden können, haben wir bemerkt, dass zum Strecken von lebenden biologischen Objekten eine Wellenlänge von ungefähr 700 Nanometer bis 900 Nanometer am besten funktioniert. Zwei Spiegel (14, 15) (Newport Corp.) werden für die Höheneinstellung des Laserstrahls (16) verwendet. Der Strahl (16) wird in einen Modulator (18) moduliert, wie z.B. ein akustisch-optischer Modulator (AOM) (IntraAction, AOM-802N), mit einem Strahlenteiler (20) (Newport Corp.) in zwei Strahlen (16a) und (16b) geteilt, und dann in Glasfasern (22, 24) eingekoppelt. Der Modulator (18) dient der Regulierung der Laserleistung, und kann über den Computer (32) über den Modulatortreiber (24) kontrolliert werden. Die Faserkoppler (23, 25) wurden von Oz Optics Ltd., die single-mode (SM) und multi-mode (MM)Glasfasern von Newport bezogen. Die Glasfasern wurden mit einer Plattform (einer Flusskammer) (26) verbunden. Die Flusskammer dient als Plattform, um die Zellen einzufangen und zu verformen, und auf der das Einfangen und die Verformung beobachtet werden können (manuell, elektronisch, automatisch oder auf andere Weise). In der Flusskammer (26) wurden die Strahlen (16a) und (16b) durch Glasfasern (22) und (24) auf eine Probe geleitet. Die Glasfasern werden so angeordnet, dass die gegenläufigen Strahlen aufeinander gerichtet werden. Das heißt, dass die Strahlen präzise aufeinander gerichtet werden. Dies ermöglicht erst, dass ein Einfangen und die Verformung stattfinden. Es existiert der Glaube, dass der Gradient in den Strahlen zur Streckung der Zelle führt, da die Gradientenkraft dielektrische Materialien, aus denen die Zelle besteht, zum Punkt der höchsten Intensität zieht. Frühere Versuche Licht zu benutzen, um eine Zelle zu verformen, führten aber zur Zerstörung der Zelle, weil die Intensität des Strahls zu hoch war. Bei früheren Methoden wurden zum Beispiel optische Instrumente benutzt um den Strahl zu fokussieren (intensivieren), um die Divergenz des Strahles nach dem Verlassen des Lasers zu einzuschränken. Bei der vorliegenden Erfindung sind im Unterschied dazu die Gradientenkräfte minimal. Der höhere Brechungsindex der Zelle führt zu einer Änderung des Impulses, der zu einer Streukraft führt. Der erhöhte Impuls des Strahls innerhalb der Zelle wird durch die Streckung der Zelle in Strahlrichtung kompensiert. Als alternative zu der Flusskammer in 1 und 2A–2C, kann ein dritter Kanal mit elliptischer Form in z-Richtung gebohrt werden. Die Kanäle für die Glasfasern und den Fluss der Zellen und der elliptische Kanal kreuzen ihre Bahn wie in 2B und 2C durch die gepunkteten Linien angedeutet. Wenn eine Zelle den elliptischen Kanal versperrt, wird die Leitfähigkeit entlang dieses Kanals sinken. Wird die Zelle parallel der Hauptachse der Ellipse gestreckt, wird die versperrte Fläche größer und die Leitfähigkeit sinkt weiter, was so ein Maß für den Grad der Streckung ist, falls Leitfähigkeit zur Detektion des Einfangens und der Verformung der Zelle verwendet wird. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass Zellen, die sich über die Plattform bewegen, mit einem, wie neuerdings von Coulter verkauften, automatischen Zellzähler gezählt werden können. Um auf die 2A–2C zurückzukommen: die Flusskammer (40) zur Benutzung im Aufbau von 1 kann etwa die Größe eines Objektträgers für Mikroskope haben, aber die Dimensionen können in einem großen Bereich variieren. Die Plattform (40) kann ein oder mehrere Objektträger, die an der Oberseite (48) und/oder an der Unterseite (49) befestigt werden, halten. In einer Verkörperung wird die Flusskammer (40) angebohrt, um Kanäle (42) zur Verfügung zu stellen, in die die Glasfasern (22) und (24) hineingesteckt werden. Die Kanäle (42), wie in 2B und 2C als gestrichelte Linien gezeigt, dienen also dazu, die Glasfasern zu führen. Ein anderer Kanal (44), im Allgemeinen senkrecht zu den Führungskanälen (42), dient als Leitungsrohr, durch welches der Strom von Zellen geleitet wird. Der Zellkanal (44) und der Führungskanal (42) können als in der xy-Ebene befindlich angesehen werden. Eine dritte Bohrung (46) kann noch so in der z-Richtung gemacht werden, dass sie den Kreuzungspunkt des Zellkanals (44) und des Führungskanals (42) schneidet. Die Bohrung (46) dient als Blende für die Belichtung bei der Phasenkontrastmikroskopie. Alternativ kann die dritte Bohrung (46) von elliptischer Form und mit angemessen befestigten Elektroden sein, um Leitfähigkeitsmessungen durchzuführen.
Alle optischen Halterungen wurden entweder von der Werkstatt des Instituts für Physik oder von den Erfindern in einer Werkstatt der University of Texas gemacht. Der Optical Stretcher wurde auf einem für Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie ausgerüsteten invertiertem Mikroskop 27 (Zeiss Axiovert TV100) aufgebaut. Wir verwendeten ein Olympus 20× Objektiv, um den Gesamtaufbau zu überprüfen. Das Mikroskop dient sowohl dazu das Einfangen der Zelle als auch die Streckung zu beobachten. Obwohl ein Mikroskop in 1 gezeigt wird, können auch andere Geräte, wie zum Beispiel zur Leitfähigkeitsmessung, genutzt werden. Die niedrige Vergrößerung dieses Objektivs ist ideal, um die Anordnung der Glasfasern zu überprüfen und Zellen einzufangen. Zur Beobachtung von kleinen Verformungen der Zellen benutzten wir ein Zeiss LD Achroplan (40×, NA 0,60) mit verschiedenen zusätzlichen Vergrößerungslinsen. Zellen sind im Allgemeinen sehr transparent und ihre Sichtbarkeit in einem normalen Durchlicht-Mikroskop ist beschränkt. Es gibt einige mikroskopische Methoden die verschieden optischen Eigenschaften von Zellen neben der Absorption ausnutzen, wie zum Beispiel die Phasenverschiebung von Licht, wenn es durch sie hindurchwandert. Phasenkontrastmikroskopie ist eine von ihnen, und diejenige, die wir in unseren Experimenten verwendeten, wenn nicht anders angegeben. Ein weiterer Vorteil von Phasenkontrastmikroskopie ist, dass die Größen von Objekten mit einer Genauigkeit von einigen hundertstel Mikrometern bestimmt werden können – sehr viel kleiner, als die optische Auflösung von Lichtmikroskopen. Bei der Phasenkontrastmikroskopie erscheinen die Objekte mit einem sehr hellen Halo um sie herum. Der Kontrastsprung ist also sehr stark und kann leicht mit bekannter, geeigneter Bildverarbeitungssoftware detektiert werden. Dies wurde ausgenutzt um die Deformationen von Zellen zu bestimmen. Die Bilder wurden mit einer CCD Kamera 28 (MIT-Dage CCD72S) aufgenommen, die über einen 4× Koppler mit dem Mikroskop verbunden wurde, und mit einem SVHS Recorder 30 (Panasonic DS550) aufgezeichnet. Die Kamera wird optional verwendet. Der Output der Kamera wird digitalisiert und von dem Computer nach dem Grad der Streckung analysiert. Bei dem in 1 gezeigten System kann das Mikroskop im Phasenkontrastmodus mit 20× und 40× vergrößernden Objektiven, die beide in einer Verkörperung dieser Erfindung verwendet wurden, arbeiten. Diese Aufnahmen wurden dann auf einem PowerComputing Computer (PowerTower Pro 225) mit einem NIH-Scion Bildbearbeitungsprogramm (V. 1.60) ausgewertet. Die Pixelgröße wurde für alle benutzten Vergrößerungen mit einem 100 Linien/mm Gitter kalibriert, was absolute Abstandsmessungen erlaubte.
Optische Komponenten
Eine wichtige Komponente des Aufbaus in 1 ist der akusto-optische Modulator (AOM). Der Hauptbestandteil eines AOM ist ein Kristall mit einem passenden Transmissionscharakter (in unserem Fall dichtes Flintglas um eine hohe Transmission im Bereich von 700–1300 nm zu erreichen). Wenn ein Radiofrequenz-Signal durch einen piezoelektrischen Signalgeber an den Kristall angelegt wird, pflanzt sich eine Schallwelle (Wellenlänge Λ) durch den Kristall fort und erzeugt einen stehende Welle. Diese stehende Welle erzeugt ein Dichtegitter in dem Kristall. Die Frequenz f des RF-Signals wird so gewählt, dass die Wellenlänge des Gitters von der Ordnung der optischen Wellenlänge λ des Lichts ist. Ein AOM kann zur Ablenkung, Intensitätskontrolle und optischen Frequenzverschiebung des Laserstrahls eingesetzt werden; und ebenfalls zur Erzeugung vieler Strahlen.
Wenn ein Laserstrahl unter einem bestimmten Winkel in den Kristall eintritt, so dass die Bragg-Bedingung erfüllt ist, wird der Strahl um vielfache des doppelten Braggwinkels θ_B abgelenkt.
Normalerweise wird der Strahl nullter Ordnung ausgeblendet und der Strahl erster Ordnung benutzt. Der Anteil des Lichts I₁ in der ersten Ordnung, auch Beugungseffizienz η genannt, wird durch
gegeben, wobei P_a die akustische Leistung und A eine Materialkonstante sind. Durch Veränderung der Leistung des RF-Signals kann die Beugungseffizienz zwischen 0–80% variiert werden. Auf diese Weise kann der AOM zur Modulierung der Intensität eines gesendeten Laserstrahls verwendet werden.
Eine weitere wichtige Komponente dieses Aufbaus sind die Glasfasern. Durch Einkopplung des Laserstrahls in eine Glasfaser ist es möglich das Licht sehr leicht zu irgendeinem gewünschten Ort zu leiten. Dies erlaubt uns den Laser und alle nötigen optischen Geräte auf einem Tisch zu haben und das Mikroskop an einem anderen zweckmäßigen Ort.
Man unterscheidet zwischen single mode (SM) und multimode (MM) Glasfasern. Aus der Elektrodynamik weiß man, dass die Lösungen für das transversale elektromagnetische Feld in einem Wellenleiter eine bestimmte Form haben, die man Moden nennt und mit TEM_xy (x und y stehen normalerweise für die Anzahl der Knoten in radialer und in azimutaler Richtung in Zylinderkoordinaten). Zum Beispiel hat TEM₀₀ ein exakt gaußsches Wellenprofil. Eine MM Glasfaser leitet viele verschiedene Moden weiter, wohingegen eine SM Glasfaser nur TEM₀₀ Moden weiterleitet und alle weiteren unterdrückt. Für alle oben beschriebenen optischen Fallen ist es entscheidend, dass das Profil des Lasers gaußförmig ist, so dass ein Intensitätsgradient zur Strahlenachse hin existiert. Daher ist eine SM Glasfaser normalerweise die beste Wahl (Constable A., Kim J., Mervis J., Zarinetchi F., Prentiss M., „Demonstration of a Fiber-Optical Light Force Trap" Opt. Lett. 18(21), p. 1867–1869 (1993)). Auch wenn die Modenqualität des Laserstrahls nicht besonders gut ist, dienen die SM Glasfasern als räumlicher Filter und garantieren ein sauberes gaußsches Profil. Ein Nachteil der SM Glasfasern ist, dass es schwieriger ist den Laserstrahl in die Glasfaser einzukoppeln (die mögliche Koppeleffizienz ist nur ungefähr halb so groß wie bei MM Glasfasern) und dass es nicht möglich ist so hohe Laserleistungen zu übertragen. Die höchsten übertragenen Leistungen mit SM Glasfasern lagen bei dieser Erfindung bei ungefähr 200 mW bei einer Eingangsleistung von 2,5 W. Mit den MM Glasfasern könnte es möglich sein mehr als 500 mW zu leiten. Ein weiterer Unterschied ist, dass diese Fasern speziell für ein bestimmtes Band von Wellenlängen konstruiert sind. Für SM Glasfasern steht der Moden-Feld-Durchmesser, der der Durchmesser des Teils der Glasfaser ist, der tatsächlich Licht transportiert, direkt zum Wellenlängenband in Beziehung: Je kürzer die Wellenlänge, desto kleiner der Moden-Feld-Durchmesser. Das heißt, dass man auf einen bestimmten Strahlendurchmesser eingeschränkt ist, sobald man sich für eine bestimmte Wellenlänge entschieden hat, mit der man arbeitet will. Für MM Glasfasern existiert keine feststehende Beziehung zwischen Wellenlänge und Moden-Feld-Durchmesser, so dass dies ein weiterer Parameter ist, der variiert werden kann.
Die Glasfasern sind auch die zerbrechlichste Komponente des Aufbaus. In einer Verkörperung ist der Durchmesser der abgezogenen Glasfaser nur 125 Mikrometer dick und bricht sehr leicht. Die optische Leistungsfähigkeit der Glasfasern hängt stark von der Qualität der Endstücke ab. Sie müssen sehr flach sein und idealerweise senkrecht zur Achsenrichtung. Gegenwärtig nutzen wir einen sehr einfachen Glasfaser-Schneider (Siecor Corp., FBC 001), der zufriedenstellende Ergebnisse liefert, obwohl ein erfolgreiches Abziehen normalerweise mehrere Anläufe benötigt.
Die Anordnung der Glasfasern ist entscheidend. Wenn sie nicht koaxial angeordnet sind, eine Fehlanordnung um nur einen Mikrometer reicht aus, dann ist die Falle nicht stabil. Die Lösung, die in Constable A., Kim J., Mervis J., Zarinetchi F., Prentiss M., „Demonstration of a Fiber-Optical Light-Force Trap" Opt. Lett. 18(21), p. 1867–1869 (1993) beschrieben wird, kann zum erreichen der nötigen Genauigkeit verwendet werden. Glasspipetten wurden erhitzt und gezogen, bis ihre Durchmesser etwa 250–400 μm betrugen. Diese kleinen Kapillare wurden auf ein Deckgläschen geklebt und die Glasfasern dagegengedrückt. In dieser V-förmigen Rille waren sie mit genügender Genauigkeit gegeneinander gerichtet. Wir haben die Kapillaren mit schwarzer Tinte gefüllt, um das von ihnen gestreute Licht zu reduzieren. Dies erhöhte die Sichtbarkeit der Zellen und ihrer Verformungen.
Dieser Aufbau ist nur eine vorübergehende Lösung und wurde benutzt, weil er einfach ist und schnelle Änderungen erlaubt. Die Nachteile sind, dass nur kleine Probengrößen gehandhabt werden können, das Einfangen der Zellen macht die manuelle Positionierung der Glasfasern entlang der Kapillaren mittels Mikrometermanipulator-Plattformen notwendig und dass das Experiment nicht sehr gut gesteuert werden kann. Es wäre einfacher die Zellen bei einer sehr hohen Zelldichte in Lösung einzufangen. Dies erhöht jedoch die Gefahr mehrere Zellen auf einmal einzufangen. Der Gebrauch von geschlossenen Flusskammern könnte diese Probleme lösen.
Erwägung der Wellenlänge
Ein wichtiger Gesichtspunkt beim Einfangen von lebenden Zellen ist die Wahl der richtigen zu benutzenden Wellenlänge. Es ist sehr wichtig, dass die Zelle die Laserbestrahlung und die Verformung überlebt, da nur eine lebende Zelle die charakteristischen Eigenschaften zeigt, die wir erforschen wollen. Offensichtlich kann eine tote Zelle kein repräsentatives Zytoskelett aufrechterhalten.
Als Ashkin mit seinen Experimenten begann, verwendete er die 530 nm Linie eines Ar⁺-Lasers, weil es der praktischste und stabilste Laser dieser Zeit war. Um unbelebte Materie, wie Glas- oder Silika-kugeln einzufangen, ist die Wellenlänge nicht besonders wichtig. Eine kurze Wellenlänge könnte erstrebenswert sein, weil die Photonen dann eine höhere Energie haben und sie ermöglich, da der Brennpunkt eines fokussierten Strahls in der Größenordnung der halben Wellenlänge ist, größere Gradienten und höhere Einfangeffizienzen. Außerdem ist das Kriterium für das Regime der Strahlenoptik leichter zu erfüllen und die Berechnung für die Kräfte auf kleinere Teilchen werden einfacher.
Als Ashkin diese Lichtfallen für die Manipulation von Zellen einsetzte, fand er jedoch schnell heraus, dass die Wellenlänge nicht geeignet ist diese Objekte zu erhalten. Er erfand den Ausdruck „Optikution" für das töten von Zellen durch Lichtabsorption. Er griff auf die 1064 nm Linie eines Nd-YAG Lasers und erzielte bessere Resultate (Ashkin A., Dziedzic J. M., Yamane T., „Optical Trapping and Manipulation of Single Cells Using Infrared Laser Beams" Nature 330(24), p. 769–771 (1987)). Die meisten Optical Tweezers sind immer noch mit einem Nd-YAG Laser ausgerüstet. Dies ist jedoch auch nicht optimal. Die Absorption von Chromophoren, was der Begriff für die überwiegend für die Absorption verantwortlichen Bestandteile in einer Zelle ist, ist niedrig im infraroten Bereich und steigt mit kleiner werdender Wellenlänge. Die Absorptionsspitzen von Proteinen zum Beispiel, liegen im ultravioletten Bereich. Diese Tatsache wird ausgenutzt um ihre Konzentration in einer Lösung durch Absorptionsspektroskopie zu messen. Der hauptsächliche Bestandteil einer durchschnittlichen Zelle jedoch ist Wasser (~70% des Gewichts), das größere Wellenlängen stärker absorbiert. Bei ungefähr 800 nm ist die Absorption von Licht minimal, und daher sollten auch die thermischen Probleme minimal sein. Aus diesem Grund verwenden wir einen Ti-Saphir Laser mit einer Hauptemission bei etwa 790 nm. Mit der Abstimmbarkeit von 600–1000 nm können wir im Prinzip den gesamten interessierenden Bereich abdecken.
Obwohl wir weit von den Absorptionsbanden der Proteine entfernt sind, könnten nichtlineare Effekte eine Rolle spielen. Im Allgemeinen ereignen sich nichtlineare Prozesse bei sehr hohen Lichtintensitäten, wenn zwei oder mehr Photonen mit einer bestimmten Energie dieselben Übergänge anregen, wie ein einzelnes Photon mit der doppelten (oder mehrfachen) Energie. Gepulste Ti-Saphir Laser werden in der Zweiphotonenspektroskopie verwendet um genau diese UV Absorptionsbanden anzuregen. In der praktischen Anwendung dieser Erfindung arbeit wir mit relativ hohen Lichtleistungen. Die Intensitäten sind jedoch weit von denen entfernt, auf die man bei gepulsten Lasern stößt und solchen, die für Multiphotonenübergänge benötigt werden, da ein cw-Laser verwendet und der Strahl nicht fokussiert wird. Folglich können diese nichtlinearen Effekte vernachlässigt werden, und sollten keine Probleme verursachen. Es existiert immer noch die Gefahr photochemische Vorgänge irgendeiner Art zu induzieren. Ein mögliches Szenario ist, dass Sauerstoff in Radikale zerlegt wird, die extrem giftig für die Vorgänge innerhalb der Zelle sind. Diese Effekte sind noch nicht erforscht.
Vorbereitung der Proben
Die ersten biologischen Zellen, die wir untersuchten waren menschliche Erythrozyten, auch rote Blutkörperchen (RBC-red blood cells) genannt. Diese Zellen wurden als Versuchsobjekt ausgesucht, weil sie so einfach zu bekommen und zu handhaben sind. RBCs sind verantwortlich für den Sauerstofftransport von der Lunge zu allen Teilen des Körpers. Der Sauerstoff wird von Hämoglobin gebunden, welches einen höheren Absorptionskoeffizienten hat als die meisten anderen biologischen Moleküle. Hämoglobin ist neben Wasser der Hauptbestandteil von RBCs. Da diese Erfindung versucht die thermische Erhitzung von Zellen zu minimieren, sind die vielabsorbierenden RBCs ein guter Test. Es gibt zwei weitere Aspekte von RBCs die für Untersuchungen von Vorteil sind. RBCs besitzen keine Organellen (Nukleus, Golgi-Apparat, Mitochondrien), was bedeutet, dass sie sehr nah an der idealisierten Vorstellung eines isotropischen dielektrischen Mediums ohne interne Struktur sind. Desweiteren haben RBCs nur eine dünne Schicht Zytoskelett direkt unterhalb ihrer Membran und kein dreidimensionales Netzwerk von Polymeren, das sich durch das gesamte Zellvolumen erstreckt. Das führt dazu, dass sie viel weicher sind als andere Zellen und es leichter ist Verformungen der Zelle zu beobachten. Dies machte sie zur perfekten Wahl als erste Testobjekte.
Alle Chemikalien, wenn nicht anders angegeben, wurden von Sigma bezogen. Der Puffer für die RBCs bestand aus: 100 mM NaCl, 20 mM HEPES Puffer, 25 mM Glukose, 5 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM Adenin, 0,1 mM Inosine, 1% (Volumen) antibiotisch-antimykotische Lösung, 0,25–1,5% Albumin und 5 Einheiten/ml Heparin. Dieser Puffer wurde adaptiert übernommen aus Strey H., Bestimmung elastischer Eigenschaften von Zellmembranen und Zytoskelett mittels Flickerspektroskopie, Ph. D. Thesis 1993, TU München, Germany und Zeman K., Untersuchung physikalisch und biochemisch induzierter Änderungen der Krümmungselastizität der Erythrozytenmembran mittels Fourierspektroskopie der thermisch angeregten Oberflächenwellen (Flickern), Ph. D. Thesis 1989, TU München, Germany. Dieser Puffer imitiert die physiologischen Bedingungen im Körper. Er erhält einen pH Wert von 7,4 aufrecht, das zusätzliche Heparin verhindert das Gerinnen des Blutes und die antibiotische Lösung hält den Puffer frei von Bakterien. Die RBCs wurden erhalten, indem Freiwilligen aus unserem Labor ein winziger Tropfen Blut (~10 μl) aus dem Ohrläppchen gezogen wurde. Das Blut wurde mit etwa 1 ml Puffer verdünnt und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Diese Behandlung konservierte sie ziemlich gut.
Unter physiologischen Bedingungen haben RBCs eine flache, bikonkave, diskusförmige Gestalt. Die Form kann sich jedoch, abhängig von der Osmolarität des Puffers, verändern. Wenn der Zustand des Puffers sich zum hypotonischen (geringere Konzentration, das heißt Osmolarität) hin ändert im Vergleich zum Innenraum, beginnt die Zelle anzuschwellen, um unter dem osmotischen Druck zu relaxieren. Wenn die Osmolarität richtig gewählt ist, nimmt die Zelle eine Kugelform an. Kurz vor dem eigentlichen Experiment wurde die Lösung auf Raumtemperatur erhitzt und im Verhältnis 1:2 mit Milipore Wasser verdünnt, was die Pufferlösung hypotonisch werden ließ. Nach einer kurzen Zeit (ca. fünf Minuten) waren fast alle RBCs kugelförmig und fertig für den Einsatz. Ein kugelförmiges Objekt ist wegen seiner Rotationssymmetrie anderen Formen zum einfangen und verformen vorzuziehen, weil seine Wechselwirkung mit Licht und die Berechnung der zugehörigen Kräfte weniger kompliziert sind.
Die ersten verwendeten Zellen waren Nervenzellen (PC12 Rattennervenzellen). Im Gegensatz zu RBCs, haben diese Zellen alle Organellen wie Nukleus, Mitochondrien und Golgi-Apparat, die normalerweise in Zellen gefunden werden. Sie besitzen auch ein dreidimensionales Zytoskelett, das sich über den gesamten Zellkörper erstreckt, was eine höhere mechanische Stärke nach sich zieht. In vivo haben Nervenzellen normalerweise zwei Arten von Auswüchsen, die Axone bzw. Dendriten genannt werden. Diese Nervenzellen waren noch nicht differenziert und zeigten noch keine Auswüchse. Diese Zellen wurden auf Petrischalen gezüchtet und sie haften normalerweise and der Oberfläche und drängen sich in Gruppen zusammen. Das Medium, in dem sie wuchsen war Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10% Pferdeserum, 5% FBS (fötales Rinderserum), und 1% antibiotisch-antimykotische Lösung (Penizillin/Streptomyzin). Um sie von der Oberfläche abzulösen, wurden sie mit 0,25% Trypsin-EDTA Lösung (TRED) behandelt. Trypsin ist eine Peptidase, die die extrazelluläre Matrix und Adhäsionsrezeptoren abbaut. EDTA ist ein Chelatkomplexbildner zweiwertiger Kationen (Ca²⁺, Mg²⁺), die für die richtige Konformation der Rezeptoren notwendig sind. Der Ablauf ist folgender: Als erstes wird das Medium vorsichtig von der Petrischale abgesaugt. Dann werden 1–2 ml 10 mM phosphatgepuffertes Salin (PBS) zugegeben, um die Trypsin Inhibitoren (Ca²⁺, Mg²⁺, Serum) zu entfernen. Nachdem das PBS auch abgesaugt wurde, werden 200–500 μl TRED auf die Petrischale gegeben. Klopft man nun sanft gegen die Schale, werden die Zellen gelöst und die Zellcluster aufgebrochen. Diese Behandlung mit TRED ist sehr grob und es muss darauf geachtet werden, dass es nach 30–60 s durch Zugabe von frischem Medium deaktiviert wird. Die gesamte Lösung mit den Zellen wird dann für 2–3 Minuten bei 800 U/min zentrifugiert, um die Zellen von der Lösung zu trennen. Die Zellen werden dann wieder in frischem Medium neu suspendiert. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist, dass die Zellen für 2–4 Stunden keine neuen Gruppen bilden, sich nicht wieder an der Oberfläche absetzen und fast kugelförmig werden.
Um das Aktin-Zytoskelett dieser Zellen sichtbar zu machen, wurden 1 μl Rhodamin-Phalloidin (TRITC) in DMSO zur Zellsuspension zugegeben. Durch wiederholtes triggern (einsaugen und ablassen der Suspension mit einer Pipette) wurde die Membran kurzzeitig durchlässig und der Farbstoff wurde von der Zelle aufgenommen. Rhodamin-Phalloidin ist ein fluoreszierender Marker, der selektiv an Aktinfilamente und nicht an Aktinmonomere bindet. Obwohl die Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin dreimal stärker ist, als die von nichtgebundenem Rhodamin musste die Menge des restlichen TRITC in der Suspension reduziert werden um die Fluoreszenz des Hintergrundes zu verringern. Dies wurde durch zentrifugieren und erneutes einbringen der Zellen in eine Suspension mit frischem Puffer erreicht. Die örtliche Verteilung der Aktinfilamente wurde dann mit Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Zur Aufnahme wurde ein Zeiss Plan Neofluar (100×, NA 1,30, Öl) Objektiv und eine SIT-Kamera (Dage-MIT, SIT68) mit einem 4× Koppler verwendet. Die Beobachtung des Zytoskeletts war wichtig, weil Manche glauben, dass Zellen ihr Zytoskelett auflösen, wenn sie nicht in Kontakt mit anderen Zellen oder einer Oberfläche sind. In diesem Fall wäre es nicht möglich mit einem Gerät wie dem Optical Stretcher relevante Informationen über Zellelastizitäten zu messen, weil die Zellen keinen Kontakt zu etwas derartigem haben.
Ergebnisse
Kräfte und verformbare Objekte
Bei den bisher beschriebenen Einfangszenarien wurden entweder nichtverformbare Teilchen verwendet (Glaskugeln, Latexkugeln) oder das Ziel war darauf beschränkt die Teilchen einzufangen, zu halten, zu verschieben und/oder zur rotieren. Was bisher noch niemand versucht hat ist die Kräfte, die bei der Wechselwirkung von Licht mit Materie entstehen, zu nutzen, um Teilchen auf kontrollierte Weise zu verformen. Biologische Zellen sind potentiell verformbare Objekte. Tatsächlich müssen sie verformbar sein, um ihre Aufgaben in vivo zu erfüllen. Ihre erstaunliche Elastizität gegenüber externen Drücken ist das, was wir aufklären wollen.
Die Idee war, den oben beschriebenen, zweistrahligen Aufbau zu verwenden, um eine einzelne Zelle einzufangen und zu halten und dann die Laserleistung bis zu dem Punkt zu steigern, an dem der Strahlungsdruck beginnt die Zelle zu verformen. Intuitiv würde man annehmen, dass die Zelle horizontal zusammengedrückt würde, da die Streukräfte in derselben Richtung wirken, in der sich das Licht ausbreitet. Es passiert aber genau das Gegenteil. Die Zelle wird in Achsenrichtung gestreckt und wir werden den Grund für diesen unerwarteten Effekt in diesem Abschnitt herleiten.
Da wir nur an Kräften auf Zellen (5–20 μm) interessiert sind und Licht mit einer Wellenlänge von 800 nm verwenden, machen wir von einem strahlenoptischen Ansatz gebrauch. Prinzipiell ist die Berechnung ähnlich der Herleitung der Streu- und Gradientenkräfte, die auf eine Kugel wirken. Wir nehmen an, dass der gesamte einlaufende Laserstrahl wie ein Ensemble von einzelnen Strahlen mit bestimmten Impulsen behandelt werden kann, die jeweils Kräfte auf die Grenzfläche ausüben. Der Unterschied zur vorhergehenden Herleitung ist der, dass für die Verformung des Teilchens die gesamte resultierende Kraft auf den Massenschwerpunkt keine Rolle spielt. Stattdessen sind wir and der Kraft an jedem einzelnen Oberflächenelement des Teilchens interessiert. Für die Berechnung der Streu- und Gradientenkraft wird der Lichtimpuls innerhalb des Teilchens nicht benötigt. Es genügt die Lichtimpulsänderungen beim Eintritt in – und beim Austritt aus dem Teilchen zu betrachten. Den Unterschied nimmt das Teilchen auf, das eine Kraft auf seinen Massenmittelpunkt spürt. Die Tatsache jedoch, das Licht seinen Impuls beim Ein- und Austritt in/aus einem Medium mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften ändert, ist wesentlich für die Berechnung der Kraft auf die Grenzfläche und darf nicht vernachlässigt werden. Dies ist genau der Punkt, der erklärt, weshalb eine Zelle gestreckt und nicht zusammengedrückt wird.
Wenn ein Laserstrahl in oder aus einer dielektrischen Flüssigkeit hinein/hinaustritt übt es eine insgesamt nach außen gerichtete Kraft aus, die eine Biegung der Oberfläche bewirkt. Der Impuls von Licht mit der Energie E in einem Medium mit Brechungsindex n ist
wobei c die Lichtgeschwindigkeit ist. Das bedeutet, dass der Impuls von Licht der gleichen Energie E in einem optisch dichteren Medium höher ist als außen. Es gab einige Kontroversen über die richtige Version des Impulses innerhalb von Dielektrika. Die obere Gleichung ist der sogenannte Minkowskiwert, wohingegen Abraham
vorschlug.
Heutzutage ist diese Debatte entschiede, und die Formel von Minkowski weitgehend akzeptiert [11]. Abhängig vom Einfallswinkel wird immer ein Teil des Lichts reflektiert und es tritt nicht die gesamte Energie in die Zelle ein. Fällt das Licht auf der Normalen der Oberfläche ein, beträgt die Gesamtänderung des Impulses Δp = p1(1 + R) – p2(1 – R) (24)wobei
und R der Reflektionskoeffizient für normale Einfälle sind. Diese Differenz wird durch eine mechanische Kraft proportional zu Δp ausgeglichen:
Es ist wichtig zu beachten, dass der Effekt der Impulssteigerung durch den höheren Brechungsindex die, durch die Reflektion von einem Teil des Lichts, hervorgerufene Verringerung überwiegt, da Zellen fast transparent sind. Dies führt zu einer nach außen, anstatt einer nach innen gerichteten Kraft.
Wir verwendeten Ashkins Arbeiten als Grundlage und erweiterten sie zu dieser Erfindung. Die Modellzelle wird als kugelförmiges, einheitliches und verlustfreies Teilchen, mit einem bestimmten Brechungsindex n₂, suspendiert in einer Flüssigkeit mit dem Brechungsindex n₁ angenommen. Zellen sind auch eher transparent und schwierig in einem Durchlichtmikroskop zu beobachten, was die Annahme eines nichtabsorbierenden Teilchens plausibel macht. Die Einheitlichkeit des Teilchens ist eine notwendige Annahme, um die Berechnung einfach zu halten, aber erscheint für eine Zelle mit all ihren kleinen lokalen Strukturen fragwürdig. Der relative Brechungsindex n = n₂/n₁ > 1 ist für biologische Materialien in wässriger Lösung von der Größenordnung 1,05–1,15.
Im Allgemeinen haben die unterschiedlichen Impulse der einfallenden, reflektierten und gebrochenen Strahlen bestimmte von relativ zueinander 0° unterschiedliche Winkel. Wir müssen folglich die Vektornatur von Impulsen in betracht ziehen. Δp → = p →1 – p →2 – p →R (26)
An dieser Stelle setzen wir den Impuls des einfallenden Strahls gleich der Einheit. Die anderen Impuls sind dann folgende:
Die y- und z-Komponenten der resultierenden Änderung des Impulses sind dann: Δpz = Δp·cos(0) = p1cosϕ – p2cos(2π – θ + r) – pRcos(π – 2θ) = 1 – T(θ)·n·cos(θ – r) + R(θ)·cos(2θ) (30) Δpy = Δp·sinϕ = p1sin(0) – p2sin(2π – θ + r) – pRsin(π – 2θ) = T(θ)·n·sin(θ – r) + R(θ)·sin(2θ) (31)
Der Betrag von Δp ergibt sich zu
wobei die Richtung
ist. Wir berechneten diese Größen numerisch mit Mathematica als Funktionen des Einfallswinkels θ für n = 1,1. Angenommen wurde ein Laserstrahl mit konstantem, von der Entfernung zur Strahlenachse d unabhängigen Intensität.
Die absolute Größe des Impulsübertrags steigt zu den Rändern der Kugel hin an und fällt dann schlagartig auf 0. Interessanterweise zeigt der übertragene Impuls überall weg von der Kugel. Tatsächlich steht er überall senkrecht auf der Oberfläche. Dies ist einfacher vorstellbar mit einer graphischen Visualisierung der Kräfte an einer bestimmten Anzahl von Punkten auf der Kugeloberfläche.
Die gebrochenen Strahlen hören innerhalb der Kugel nicht auf zu existieren (Absorption wird vernachlässigt), sondern verlassen das Teilchen auf der anderen Seite. Die Kugel wirkt wie eine Linse und sammelt sie nahe der Achse. Die Kräfte an dieser Grenzfläche zeigen ebenfalls weg von der Oberfläche. Der nächste Schritt ist, das gaußsche Intensitätsprofil mit zu berücksichtigen. Das bedeutet schlicht, dass die Leistung P eines Teilstrahls in einer Entfernung d von der Strahlenachse mit
multipliziert werden muss, wobei w der Radius des Laserstrahls ist. Es wird angenommen, dass sich der Mittelpunkt des Teilchens auf der optischen Achse befindet. Nun sind die Kräfte in der Mitte stärker als am Rand und liefern den größten Beitrag zur Verformung der Kugel.
Das Zytoskelett einer Zelle, das mit der Membran verbunden ist, wirkt ähnlich einer Feder und erzeugt eine rückgerichtete Spannung. Die Kräfte an der Oberfläche ändern sich entsprechend der Verformung bis das System einen Gleichgewichtszustand erreicht. Als abschließend erreichte Form des Teilchens wird eine Ellipse erwartet deren große Hauptachse parallel der Strahlenachse liegt. In einem anschaulichen Vergleich ist dieser Effekt ähnlich dem Fall, dass eine dielektrische Flüssigkeit in das Feld zwischen zwei Kondensatorplatten hineingezogen wird, weil dies eine energetisch günstigere Position ist. In diesem Fall wird die Zelle ebenfalls in das Gebiet der höheren Felder, also das Zentrum des Laserstrahls, gezogen.
Für eine quantitative Berechnung der verformenden Kräfte, müssen wir dem Impuls der einfallenden Strahlen wieder ihren realen Wert anstatt der Einheit zuordnen. Wir haben für die größtmöglichen Laserintensitäten eine von den SM Glasfasern geleitete Leistung von bis zu 220 +/– 20 mW gemessen. Durch einsetzen dieses Wertes in Formel (20) erhielten wir für den Impuls des Lichts das folgende Kräfteprofil auf beiden Seiten der Kugel, wenn diese zwischen zwei Laserstrahlen mit gleicher Leistung festgehalten wird. In diesem Fall sind Strahlenradius und Kugelradius gleich (ρ/w = 1). Die Kräfte in der Mitte sind von der Größenordnung von 0,17 nN und werden gegen die Ränder der Kugel kleiner. Der Sprung im Profil ereignet sich deshalb, weil der zweite Laserstrahl von der anderen Seite her kommend, zur Mitte hin kollimiert wird.
Bei den MM Glasfasern haben wir eine übertragene Leistung von 500 +/– 25 mW für die höchsten Laserintensitäten gemessen. Das entsprechende Kräfteprofil hat dieselbe Form, mit einer Kraft in der Mitte von 44,3 pN (bei d/ρ = 0).
Wenn eine Kraft F senkrecht an einer Oberfläche A eines Körpers angreift, wird dieser um einen Betrag ΔL gestreckt. Der Zusammenhang zwischen der angelegten Spannung σ = F/A und der Dehnung ε = ΔL/L ist über einen bestimmten Bereich linear und gegeben durch σ = E·ε (35)
Die Dehnung ε ist eine Zahl und die Spannung σ hat die Dimension Kraft pro Fläche. Daher hat die Proportionalitätskonstante E, genannt Elastizitätsmodul, auch die Dimension Kraft pro Fläche. Die Situation ist sehr viel einfacher, wenn eine konstante Kraft auf einer Seite eines Würfels wirkt, als auf der Oberfläche einer Kugel. Es stellt sich heraus, dass die Kräfte auf die Oberfläche nicht konstant sind, und auf eine gekrümmte Oberfläche wirken.
Um eine Abschätzung für die Elastizität der Zellen zu bekommen berechneten wir die Kraft pro Fläche, das heißt die Spannung. Da die Kräfte alle senkrecht auf der Oberfläche stehen, wird die Berechnung einfach dadurch durchgeführt, dass statt der Leistung P die Intensität I der einfallenden Strahlen in die obige Formel eingesetzt werden.
Die Intensität steht mit der Leistung durch
in Beziehung. Daher ist die Gestalt des Spannungsprofils dieselbe, wie die des Kräfteprofils. Die Lichtintensitäten eines Strahls mit 5 μm Radius auf der Oberfläche einer Kugel derselben Größe liegen ungefähr bei 5,0 × 10⁵ W/cm² (SM)/1,3 × 10⁶ W/cm² (MM) und liefern Kraftdichten in der Mitte von etwa 4,5 Pa respektive 11 Pa. Die gesamte die Verformung verursachende Spannung auf einer Seite der Zelle ist das Integral über das Spannungsprofil. Wir haben diese Rechnung numerisch durchgeführt und erhielten eine Gesamtspannung von 16 Pa für die 200 mW von der SM Glasfaser und 40 Pa für die 500 mW, wenn wir die MM Glasfaser verwendeten. Wir werden diese Größen verwenden um eine Abschätzung für das Elastizitätsmodul von Zellen zu erhalten.
Bisher nahmen wir immer einen relativen Brechungsindex n = 1,1 an. Ein geringer Anstieg dieser Zahl bis n = 1,2, was dem oberen Limit der Werte von biologischen Zellen entspricht, hat nur geringen qualitativen Einfluss auf das Kräfteprofil. Der Linseneffekt ist geringfügig stärker als bei n = 1,1 und führt zu einer stärkeren Kollimation der Strahlen auf der Rückseite der Zelle. Es stellt sich jedoch heraus, dass sich die Absolutwerte drastischer verändern. Die Kraft in der Mitte ist für die Situation einer Falle mit 2 Strahlen 35 (88) pN bei 200 mW (500 mW), das heißt etwa zweimal so groß wie bei n = 1,1. Die gesamte Spannung auf die Kugel mit n = 1,2 hat sich ebenfalls fast verdoppelt und liegt bei 26 (74) Pa bei Leistungen von 200 mW respektive 500 mW. Es wird also wichtig sein den wirklichen Brechungsindex so gut wie möglich zu bestimmen.
Experimentelle Ergebnisse
Einfangen von Zellen
Allgemein können alle Einfangsmerkmale der zweistrahligen Falle, wie in der Literatur vorhergesagt und berichtet, mit unserem Aufbau beobachtet werden. Das erste Kriterium, das der Brechungsindex n des einzufangenden Teilchens größer sein muss als der der Umgebung, wird schon an sich erfüllt. Der Brechungsindex von Wasser unter normalen Bedingungen beträgt n = 1,33 wohingegen von Zellen berichtet wird, dass sie einen Brechungsindex zwischen 1,4 und 1,6 haben. Zweitens muss der Radius des Laserstrahls w größer sein, als der Radius des einzufangenden Objekts. Der größte Radius eines RBC den wir gemessen haben betrug 4,0 μm. Der Strahlenradius w am Ende des Glasfaserkabels ist 2,5 μm (= w₀) und wird durch Divergenz mit steigendem Abstand z größer:
wobei λ = 790 nm die Wellenlänge des verwendeten Lichts ist. z_min ist genau der Abstand, bei dem der Strahlenradius genau dem Radius der Zelle entspricht. Für einen Abstand z > z_min = 31 μm ist der Strahlenradius größer als der Radius der RBC. Typische Abstände der Glasfasern sind in unseren Experimenten im Bereich 100–300 μm > 2z_min, so dass auch das zweite Stabilitätskriterium immer erfüllt ist. PC12 Zellen haben Durchmesser bis zu 15 μm und der benötigte minimale Abstand zwischen den Glasfasern für eine stabile Falle beträgt 140 μm.
Die MM Glasfasern haben einen Moden-Feld Durchmesser von 50 μm, was viel größer ist, als die Durchmesser der untersuchten Zellen. Deshalb können Zellen mit MM Glasfasern unabhängig vom Abstand der Glasfasern eingefangen werden.
Es könnte überraschend sein, dass wir mit den MM Glasfasern überhaupt Zellen stabil einfangen konnten und wir werden das weiter unten diskutieren.
In allen Fällen, bei denen darauf geachtet wurde, dass die Intensität der zwei Strahlen identisch war und der Abstand zwischen den Glasfasern ausreichte, gelang uns ein stabiles Einfangen in der Mitte zwischen den beiden Faserenden. Wenn die Enden zu nahe zueinander gebracht wurden, so dass der Durchmesser der divergierenden Strahlen kleiner wurde als der Durchmesser der eingefangenen Zelle, wurde die Falle instabil und die Zellen wanderten wie erwartet langsam in die Richtung einer der beiden Fasern.
Strecken von Zellen
Oben hatten wir das Kräfteprofil auf der Oberfläche eines kugelförmigen Objekts ausgerechnet, wenn es mit zwei engegengerichteten Laserstrahlen eingefangen wird. Die Verformung der Zellen in unseren Experimenten entsprach exakt den Erwartungen aus unseren Rechnungen. Es ist auch möglich Unterschiede in den Elastizitäten zweier unterschiedlicher Arten von Zellen festzustellen. Wir werden Beispiele von der Verformung von RBC und PC12 Zellen zeigen und einfache Abschätzungen für ihre Steifigkeit angeben. Fortgeschrittenere Experimente, die zum Beispiel die Frequenzabhängigkeit der gemessenen Steifigkeit untersuchen, werden folgen müssen. Bei extrem hohen Frequenzen könnte es sein, dass hydrodynamische Effekte eine Rolle spielen. Die Verformungen könnten so schnell werden, dass das Wasser den Bewegungen nicht mehr folgen kann, was eine scheinbar erhöhte Steifigkeit nach sich ziehen würde. Auf der anderen Seite könnte die Zelle bei sehr niedrigen Frequenzen genug Zeit haben, das Zytoskelett zu restrukturieren. Rheologische Experimente an Polymerlösungen enthüllen über einen großen Zwischenbereich so genannte Plateau-Module, in denen die Steifigkeit konstant und frequenzunabhängig ist. Wir legten Kräfte im Frequenzbereich 0,1–1 Hz, wo die Zellelastizität unabhängig sein sollte, an.
Das grundlegende Verfahren ist wie folgt: Nachdem eine einzelne Zelle bei Lichtleistungen von etwa 2–10 mW eingefangen wurde, erhöhten wir die Leistung per Hand bis auf die maximalen Werte von 200 mW SM/500 mW MM, indem wir die Treiberleistung des AOM erhöhten. Die Verformung der Zelle wird zunächst auf Band aufgezeichnet und später durch abzählen der kalibrierten Pixel analysiert. Zur Berechnung der gesamten Spannung an der Zelle gingen wir von einem relativen Brechungsindex von n = 1,1 und einem relativen Kugelradius von ρ/w = 1 aus.
Streckexperimente mit RBC
Die RBC wurden osmotisch angeschwollen um eine Kugelform zu erreichen, und es wurde eine Gesamtspannung von 16 +/– 1 Pa angelegt. Die Streckung der Zelle kann leicht beobachtet werden. Entlang der Hauptachse wurde in diesem Fall eine Verlängerung von 6,08 +/– 0,02 μm auf 6,54 +/– 0,02 μm gemessen. Dies entspricht einer Dehnung ε = 7,6 +/– 0,6%. Die durchschnittliche Dehnung lag bei ε = 7,5 +/– 0,3%. Wir verwendeten Formel (35) um eine Abschätzung den Elastizitätsmoduls E = 210 +/– 10 Pa zu erhalten. Dieser Wert spiegelt nicht die Steifigkeit des zweidimensionalen Zytoskeletts der RBC wieder, die sehr viel kleiner sein sollte, sondern eher einen Widerstand durch osmotischen Druck.
Auf diese Weise konnten wir alle RBC strecken, die wir einfingen. Dies ist der Beweis, dass unser Aufbau tatsächlich Zellen auf kontrollierte Weise verformen kann. Die Verformung von einigen hundert Nanometern kann in diesem Verfahren leicht festgestellt werden. In einigen Fällen, in denen wir scheinbar schwächere Zellen eingefangen hatten, war die Spannung ausreichend, um sie zu zerreißen.
Streckexperimente mit PC12 Zellen
PC12 Zellen, wie jede beliebige andere normale Zelle, haben ein ausgedehntes dreidimensionales Zytoskelett, wogegen RBCs nur eine Schicht Zytoskelett direkt unterhalb der Membran besitzen. Daher wurde erwartet, dass es viel schwieriger sein würde PC12 Zellen zu verformen. Wir verwendeten MM Glasfasern um stärkere Spannungen auf die Zelle anwenden zu können. Die allgemeine Vorgehensweise war dieselbe wie vorher. Zunächst fingen wir eine einzelne Zelle zwischen den zwei 2–10 mW starken Lasern ein und erhöhten dann die Leistung auf etwa 500 +/– 25 mW. Die Verformung war nicht so offensichtlich wie bei den RBCs. Der Vergleich der horizontalen Ausdehnung der zwei Bilder enthüllte jedoch eine klar erkennbare Streckung von 11,14 +/– 0,02 μm auf 11,69 +/– 0,02 μm entsprechend einer Dehnung ε = 4,9 +/– 0,4%. Um sicherzugehen, dass es sich um eine tatsächlich Streckung der Zelle handelt, schlossen wir die folgenden Artefakte aus: Da die Zelle nicht perfekt kugelförmig ist, könnte die größere Spannung zu einer Rotation der Zelle führen, die zu einer Erhöhung des gemessenen Durchmessers in horizontaler Richtung führen könnte. Wir werteten nur Aufnahmen aus, bei denen dies nicht der Fall war. Eine andere Möglichkeit wäre, dass sich die eingefangenen Zellen leicht außerhalb der Strahlenachse befinden. Wenn die Intensität dann erhöht wird und die Zelle in die Strahlenachse zurückgezogen wird, wandert die Hauptquerschnittsfläche aus der Fokusebene des Mikroskops. Dies kann ausgeschlossen werden, da es zu einer identischen Zunahme der Längen in vertikaler und horizontaler Richtung führen würde, was aber nicht der Fall ist. Die durchschnittliche Dehnung der PC12 Zellen betrug ε = 4,2 +/– 0,2% bei einer Gesamtspannung auf die Zelle von σ = 40 +/– 1 Pa. Das Elastizitätsmodul beträgt dann E = 950 +/– 50 Pa (Gleichung (35)). Dies ist nur eine erste Schätzung und wahrscheinlich eine untere Grenze für die reale Elastizität. Zum Vergleich: Mit einem AFM wurde das Elastizitätsmodul von menschlichen Thrombozyten gemessen und auf 1–50 kPa im Frequenzbereich zwischen 1–50 Hz bestimmt, nachdem erste experimentelle Messungen der Kräfte darauf hindeuten, dass die berechneten Spannungen zu gering sein könnten. PC12 Zellen sind also etwa mindestens 4–5 mal steifer als osmotisch angeschwollene RBCs.
Eichung der Kräfte
Solange wir nur an einem phänomenologischen Vergleichen zwischen zwei optisch ähnlichen Zellen interessiert sind, reicht es aus, die beobachteten Verformungen für gleiche Laserleistungen und Abstände der Glasfasern zu vergleichen. Ein verschiedenartiges Zytoskelett sollte in einer elastisch unterschiedlichen Reaktion resultieren, wie für RBCs und PC12 Zellen gezeigt. Dies wird exakt die Art und Weise sein, auf die wir zwischen normalen und bösartigen Zellen unterscheiden werden können. Für eine quantitativere Beschreibung benötigen wir jedoch eine Methode, um die tatsächlich angreifenden Kräfte zu messen oder sie zu eichen und zu berechnen. Insbesondere müssen wir exakte Werte für die Elastizitätskonstanten für die Untersuchung der physikalischen Eigenschaften des Zytoskeletts als polymerisches Verbundmaterial bestimmen.
Durch den Vergleich der gemessenen mit den vorher berechneten Kräften, haben wir dann auch eine Möglichkeit zu verifizieren, ob unser einfaches Modell der Kräfte, die auf die Zelle wirken, gültig ist. Die Messung der Kräfte ist nicht einfach, und wir müssen eine sehr simple Herangehensweise wählen: Wenn wir eine Zelle stabil eingefangen haben, schalten wir einen der Laserstrahlen aus. Die Situation ist nun die für einen Strahl beschriebene. Es wirkt eine resultierende Kraft in Ausbreitungsrichtung des Lichts auf das Teilchen, die das Teilchen durch die Flüssigkeit schiebt. Das Teilchen erreicht eine konstante Geschwindigkeit, wenn die Stokessche Reibungskraft FStokes = 6π·η·r·ν = Fnet (39)wobei η die Viskosität (Wasser: 1,0 Pa s bei 25°C), r der Radius des Teilchens, und ν die Geschwindigkeit sind, die beschleunigende Kraft ausgleicht. Durch Messung der Geschwindigkeit können wir eine Abschätzung der gesamten resultierenden Kraft erhalten. Die Geschwindigkeit in unserem Experiment war 11,2 +/– 2,7 μm/s bei etwa 100 mW für RBCs mit einem Radius von 5 μm. Diese Geschwindigkeit entspricht einer Kraft von ungefähr 1,1 +/– 0,2 nN. Die gesamte resultierende Kraft unseres Modells berechnet sich zu F = 27 pN für n = 1,1 und F = 85 pN für n = 1,2 bei 100 mW. Dies ist ein beachtlicher Unterschied, der auf verschiedenen Wegen erklärt werden kann:
Eine Möglichkeit ist, dass der Brechungsindex der Zelle größer als angenommen ist. Dies würde zu einer Unterschätzung der berechneten Kraft führen, da sie gegenüber dem Brechungsindex sehr empfindlich ist, wie hierin abgeleitet. Eine andere mögliche Erklärung ist, dass das Modell zu einfach sein könnte. Es sagt die qualitative Natur der verformenden Kräfte sehr gut voraus, könnte aber quantitativ daneben liegen. Da die Membran und die enthaltenen Phospholipide einen höheren Brechungsindex als das Zytoplasma haben, könnte es realistischer sein eine Kugelschale mit einem bestimmten Brechungsindex, die mit einem weiteren Dielektrikum gefüllt ist, das einen geringeren Brechungsindex als die Schale, aber einen Höheren, als das umgebende Medium besitzt, anzunehmen. Eine weitere im Modell nicht enthaltene Tatsache ist die, dass Licht absorbiert wird, wenn es die Zelle passiert. Dies einzubeziehen würde die berechnete resultierende Kraft in Vorwärtsrichtung ebenfalls vergrößern, weil von der Zelle mehr Impuls vom einfallenden Licht aufgenommen wird.
Einige der vorhergehend erwähnten Probleme können durch zusätzliche Experiment angegangen werden. Anstatt Zellen mit einem Strahl zu beschießen, um die resultierende Kraft zu messen, können wir Glaskugeln benutzen. Dies hat den Vorteil, dass wir den Brechungsindex exakt kennen und wir den Einfluss anderer Variablen wie der Intensität testen können.
Dasselbe Experiment kann mit kugelförmigen Vesikeln durchgeführt werden. Eine Doppelschicht aus Phospholipiden in einer wässrigen Lösung wird eine abgeschlossene Oberfläche bilden, weil dies energetisch günstiger ist. Diese Objekte werden Vesikel genannt. Sie sind ein ideales Testobjekt, weil Phospholipide der Hauptbestandteil von Zellmembranen sind. Dies war ähnlich bei den RBCs und einer der Gründe, weshalb sie als erstes Testobjekt ausgewählt wurden. Der Vorteil von Vesikeln über RBCs ist, dass wir den Brechungsindex des Innenraumes variieren können, indem wir die Vesikel in Zuckerlösungen unterschiedlicher Konzentration produzieren. Nachdem sich die Vesikel gebildet haben, kann auch ihre Umgebung durch die Art des gelösten Zuckers und seine Konzentration variiert werden. Wenn die für Vesikel gemessenen Kräfte sich qualitativ von denen für Glasskugeln, die mit unserem gegenwärtigen Modell exakt beschrieben werden, unterscheiden, werden wir die schalenartige Beschaffenheit der Zellen mit einbeziehen müssen.
Eine andere Möglichkeit bei Vesikeln besteht darin, dass der innere osmotische Druck des Systems durch eine Veränderung der Osmolarität der umgebenden Lösung bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu geladenen und größeren Molekülen können Wassermoleküle relativ einfach durch die Membran diffundieren. Wenn die ionische Stärke der äußeren Lösung verändert wird, baut sich ein osmotischer Druck auf, der exakt berechnet werden kann. Dies stimmt genauso für das osmotische anschwellen von RBCs. Wird ein Vesikel zwischen zwei Lasern eingefangen, werden die verformenden Kräfte an der Oberfläche jedoch einzig durch den osmotischen Druck ausgeglichen, der nicht durch ein Zytoskelett unterstützt wird, wie bei RBCs. Die Membran selbst ist so weich, dass sie ignoriert werden kann. Dies ist eine weitere Möglichkeit die verformende Spannung direkt zu messen.
Lebensfähigkeit von Zellen
Ein wichtiges Thema ist die Lebensfähigkeit von Zellen, da dies einer der Kritikpunkte an den existierenden Methoden war. Es ist nicht offensichtlich, dass es möglich ist hochintensive Laserstrahlen zur Verformung von solch anfälligen Objekten wie Zellen einzusetzen, ohne ihnen irgendeinen Schaden zuzufügen. Es wurde gezeigt, dass 1064 nm Licht mit 250 mW die meisten Zellen beschädigen wird. Dies stimmt aber nur für Optical Tweezers, da in ihnen der Laserstrahl zu sehr kleinen Brennpunktgrößen fokussiert werden muss. Die Intensität ist in diesem Fall von der Größenordnung 10⁸ W/cm², was drei Größenordnungen höher ist, als die Intensitäten, die man in einem Optical Stretcher beobachten kann. Ein anderer großer Unterschied ist die sorgfältige Wahl der am wenigsten Schaden verursachenden Wellenlänge. Der Absorptionskoeffizient wird um einen Faktor zehn verringert, wenn 780 nm Licht, anstatt von dem 1064 nm Licht eines Nd-YAG Lasers, verwendet wird. Dies ist wichtig, da die lokale Erwärmung von Wasser ein beschränkender Schlüsselfaktor für das Überleben von Zellen ist, die, in den meisten Fällen, nur in einem Temperaturbereich von 35–42°C überleben. Andere schädigende Effekte, wie die direkte Absorption von Licht durch Chromophore oder photochemische Vorgänge, wie oben diskutiert, können aber nicht ausgeschlossen werden.
Wir haben die Lebensfähigkeit der verwendeten Zellen (PC12) auf verschiedene Arten untersucht. Zunächst ist das Erscheinungsbild der Zellen bedeutend anders dem, wenn sie nicht leben. Unter einem Phasenkontrastmikroskop ist um lebende Zellen ein charakteristischer heller Rand um die Kontur herum zu sehen; sie scheinen zu leuchten. Tote Zellen haben diese Eigenschaft nicht. Sie haben normalerweise keinen scharfen Umriss und erscheinen verwischt.
Nachdem wir eine Zelle eingefangen und für einige Minuten gestreckt hatten, folgten wir immer ihrem absinken auf das Deckglas, wo wir ihr Aussehen mit anderen Zellen, die wir nicht bestrahlt hatten, verglichen. In allen Fällen sahen sich die Zellen sehr ähnlich. Der geringe Unterschied im Aussehen ist darauf zurückzuführen, dass die eingefangenen Zellen weniger Zeit hatten wieder an der Oberfläche anzuhaften. Der charakteristische helle Rand deutete aber darauf hin, dass die Zellen in diese Bildern immer noch lebten.
Ein sorgfältigerer Ansatz ist die Benutzung eines Vitalfarbstoffs wie Trypan Blau. Solange die Zelle lebt, kann sie verhindern, dass der Farbstoff ins Zytosol eindringt. Wenn die Zelle tot ist, oder ihre normalen Funktionen nicht aufrechterhalten kann, wird der Farbstoff durch die Zellmembran eindringen, und die gesamte Zelle erscheint blau. Wir gaben 5% (Volumen) Trypan Blau zur Zelllösung, nachdem wir die Zellen eingefangen und verformt hatten, und haben keinerlei Färbung beobachtet.
Ein dritter, analytischer Test wurde mit Zellen auf einer Petrischale gemacht. Vier Petrischalen wurden jeweils mit (1,6 +/– 0,2) × 10⁵ Zellen präpariert. Zwei davon wurden mit 500 mW eines 790 nm Laser für 5 Minuten bestrahlt, indem eine der MM Glasfasern direkt auf die Zellen gerichtet wurden, und die anderen beiden wurden als Kontrollen behalten. Die Zellen konnten unter idealen Bedingungen in einem Brutschrank bei 37°C und in einer 5% CO₂ Atmosphäre wachsen. Nach vier Tagen zeigten die bestrahlten Zellen keinerlei Anzeichen einer Veränderung gegenüber den Kontrollzellen, die nicht bestrahlt worden waren. Die Anzahl der Zellen pro Petrischale erhöhte sich in vier Tagen auf (4,1 +/– 0,2) × 10⁵ (Kontrolle) und (4,2 +/– 0,3) × 10⁵ (bestrahlt). Dies war der Aussagekräftigste der drei Tests, weil hiermit überwacht wurde, ob die Zellen auch weiterhin fähig sind, sich normal zu teilen. Alle drei Tests beweisen, dass die Zellen die Bedingungen in einem Optical Stretcher ohne irgendeinen erkennbaren Schaden überleben.
Eine weitere wichtige Frage für die Anwendbarkeit des Optical Stretcher auf Messungen der Zellelastizität ist, ob die Zellen überhaupt ein Zytoskelett aufrechterhalten, wenn sie trypsiniert werden und in Suspension sind. Um diese Bedingung zu überprüfen färbten wir das Aktin-Zytoskelett von lebenden, frisch trypsinierten PC12 Zellen. TRITC färbt ausschließlich Aktinfilamente und keine einzelnen Monomere, und seine Fluoreszenz steigt um den Faktor 3, wenn es an ein Filament gebunden ist. Dieses Vorgehen sichert, dass wir Aktin in Filamenten und keine Aktin Monomere sehen. Die Zellen haben ein ausgedehntes Aktinnetzwerk über das gesamte Zellvolumen. Auch der Aktinkortex ist am Rand der Zelle sichtbar. Das einzige Merkmal des Zytoskeletts, das nicht vorhanden ist, sind Stressfasern. Diese sollten jedoch nur eine geringe Rolle bei der Elastizität der Zelle spielen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Optical Stretcher wirklich die Elastizität von lebenden, normalen Zellen misst, und ihre Integrität bewahrt.
Vergleich von SM und MM Glasfasern
Alle Realisierungen von Lichtfallen mit Glasfasern wurden mit SM Glasfasern gebaut. Der Grund dafür war, dass ein gaußsches Strahlenprofil für eine effiziente, axiale Begrenzung durch die Gradientenkraft sehr wichtig ist. Wir fanden heraus, dass auch die Benutzung von multimode (MM) Glasfasern möglich ist. Das Strahlenprofil ist nicht mehr gaußförmig, aber die höchste Intensität befindet sich immer noch im Zentrum, und Teilchen werden durch dieses starke Feld angezogen. Das zweite Stabilitätskriterium, nämlich, dass der Durchmesser des Laserstrahls größer ist, als der der Zelle, wird einfacher erfüllt, da der Moden-Feld Durchmesser der MM Fasern (50 μm–500 μm) viel größer ist, als der von SM Fasern. Der große Vorteil besteht darin, dass MM Glasfasern mehr Licht leiten können als SM Glasfasern, 500 mW anstatt von 200 mW, und daher größere Kräfte erlauben. Tatsächlich mussten wir für die Verformung von PC12 Zellen MM Glasfasern verwenden. Mit den MM Glasfasern können wir die größtmöglichen Intensitäten für die Verformung erreichen. Die Intensität wird nur durch die Absorption von Wasser beschränkt. Bei sehr hohen Intensitäten wurde das Wasser so stark erhitzt, dass das System instabil wurde, und eine Konvektionsrolle entstand, die die Zelle aus der Falle spülte. An diesem Punkt waren die Zellen aber vermutlich ohnehin schon tot. Bei noch höheren Intensitäten ist Wasser verdampft und es entstanden Bläschen.
Obwohl es also möglich ist MM Glasfasern zu verwenden, ist es sehr viel praktischer SM Fasern zu verwenden, solange nicht wirklich hohe Intensitäten benötigt werden.
Alle Realisierungen von Lichtfallen mit Glasfasern wurden mit SM Glasfasern gebaut. Der Grund dafür war, dass ein gaußsches Strahlenprofil für eine effiziente, axiale Begrenzung durch die Gradientenkraft sehr wichtig ist. Wir fanden heraus, dass auch die Benutzung von multimode (MM) Glasfasern möglich ist. Das Strahlenprofil ist nicht mehr gaußförmig, aber die höchste Intensität befindet sich immer noch im Zentrum, und Teilchen werden durch dieses starke Feld angezogen. Das zweite Stabilitätskriterium, nämlich, dass der Durchmesser des Laserstrahls größer ist, als der der Zelle, wird einfacher erfüllt, da der Moden-Feld Durchmesser der MM Fasern (50 μm–500 μm) viel größer ist, als der von SM Fasern. Der große Vorteil besteht darin, dass MM Glasfasern mehr Licht leiten können als SM Glasfasern, 500 mW anstatt von 200 mW, und daher größere Kräfte erlauben. Tatsächlich mussten wir für die Verformung von PC12 Zellen MM Glasfasern verwenden. Mit den MM Glasfasern können wir die größtmöglichen Intensitäten für die Verformung erreichen. Die Intensität wird nur durch die Absorption von Wasser beschränkt. Bei sehr hohen Intensitäten wurde das Wasser so stark erhitzt, dass das System instabil wurde, und eine Konvektionsrolle entstand, die die Zelle aus der Falle spülte. An diesem Punkt waren die Zellen aber vermutlich ohnehin schon tot. Bei noch höheren Intensitäten ist Wasser verdampft und es entstanden Bläschen. Obwohl es also möglich ist MM Glasfasern zu verwenden, ist es sehr viel praktischer SM Fasern zu verwenden, solange nicht wirklich hohe Intensitäten benötigt werden.
Es kann beobachtet werden, dass diese Erfindung ein nichtschädigendes, optisches Werkzeug zur Verformung von Zellen bereitstellt. Der Strahlungsdruck zweier entgegen gerichteter Laserstrahlen eines cw Ti-Saphir Laser bei 790 nm reicht aus, um eine Zelle zu verformen, wobei diese keine Anzeichen einer beobachtbaren Beschädigung zeigt und ihr normales Zytoskelett aufrechterhält. Überraschenderweise wird die Zelle entlang der optischen Achse auseinandergezogen und nicht zusammengedrückt. Dieser Effekt wurde nie vorher beobachtet und kann benutzt werden, um zwischen verschiedenen Zellen zu unterscheiden. Wir haben auch ein einfaches Modell der Kräfte auf die Zelle entwickelt, das das Kräfteprofil auf der Zelloberfläche vorhersagt und qualitativ die beobachteten Verformungen ziemlich gut erklärt.
Wenn Zellen zwischen den beiden Strahlen stabil eingefangen waren, führte eine Erhöhung der Leistung des Lichts zu einer deutlichen Streckung der Zellen. Auf diese Weise konnten wir osmotisch angeschwollene RBCs, als erste Testobjekte, bei Leistungen von 200 mW von einer kugelförmigen zu einer elliptischen Gestalt verformen. Die Hauptachse der Zelle wurde um durchschnittlich 7,5 +/– 0,3% verlängert. Das Elastizitätsmodul berechnet sich bei einer Spannung σ = 16 +/– 1 Pa zu E = 210 +/– 10 Pa. Dies resultiert nicht allein aus der Elastizität des Zytoskeletts, sondern auch aus dem osmotischen Druck innerhalb der Zelle.
Wir haben auch gezeigt, dass Zellen mit einem ausgedehnten dreidimensionalen Zytoskelett, die sehr viel steifer als RBCs sind, auf dieselbe Art und Weise verformt werden können. Die Verformung um einige hunderte Nanometer kann mit unserer Methode deutlich gemessen werden. Als erste beliebige Zellen, verwendeten wir PC12 Zellen, Nervenzellen von Ratten, die noch nicht differenziert sind. Wir konnten sie bei Lichtleistungen von 500 mW um durchschnittliche 4,2 +/– 0,2% entlang der optischen Achse strecken. Für eine Spannung σ = 40 +/– 1 Pa betrug in diesem Fall das berechnete Elastizitätsmodul E = 950 +/– 50 Pa. Deshalb sind PC12 Zellen ungefähr 4–5 mal stärker als osmotisch angeschwollene RBCs.
Diese Ergebnisse zeigen, dass mit dieser Erfindung, durch das Aufspüren phänomenologischer Unterschiede der Elastizitäten, zwischen verschiedenen Zellen unterschieden werden kann.
Mehrere Tests bestätigten, dass Streckung und Bestrahlung der lebenden Zellen mit bis zu 500 mW bei 790 nm Laserlicht, wie es in diesen Experimenten auftritt, zu keiner Einschränkung der Lebensfähigkeit führen. Dies wird durch die sorgfältige Wahl der Wellenlänge, um optische Schäden zu minimieren, und der spezifischen Situation dieser zweistrahligen Falle, bei der die Laserstrahlen nicht fokussiert werden, erreicht. Daher können wir Laserleistungen verwenden, die in Optical Tweezers tödlich wären, weil dort die Fokussierung zu extrem hohen Intensitäten führt. Wir sind auch die Frage angegangen, ob trypsinierte Zellen in Lösung ihr normales Zytoskelett aufrechterhalten und dieselbe mechanische Stärke vorweisen, wie an einer Oberfläche haftende Zellen. Entgegen dem allgemeinen Irrglauben konnten wir mit umfangreicher Fluoreszenzmikroskopie zeigen, dass sie tatsächlich ein normales Zytoskelett besitzen, selbst wenn sie kugelförmig und in Lösung suspendiert sind. Der einzige Unterschied ist, dass die Zelle Stressfasern abbaut, was aber eine untergeordnete Rolle für die gesamte Elastizität der Zelle spielen sollte. Abgesehen davon misst diese Erfindung relevante Elastizitäten.
Wir haben auch ein einfaches Modell für die Wechselwirkung der zwei Laserstrahlen mit Zellen entwickelt, dass es ermöglicht die beobachteten Verformungen recht gut qualitativ zu beschreiben. Die Eichung der Kräfte erscheint eher schwierig, da sie sich von Objekt zu Objekt ändern. Die genauen Kräfte hängen von lokalen Strukturen in der Zelle und ihrem nicht-einheitlichen Brechungsindex ab. Die mögliche Gesamtspannung auf eine Zelle ist, nach Berechnungen mit dem gegenwärtigen Modell, im Bereich von 10–100 Pa für die angenommenen relativen Brechungsindizes zwischen 1,1–1,2 und Lichtleistungen bis zu 500 mW. Der relative Brechungsindex n hat einen starken Einfluss auf die Größe der Gesamtspannung. Die Änderung von n = 1,1 auf n = 1,2 erhöht die Spannung um einen Faktor zwei. Erste Experimente deuten darauf hin, dass die tatsächlichen verformenden Kräfte um einen Faktor 20 höher sein könnten, als die berechneten Werte. Die berechneten Zellelastizitäten oben sind daher nur erste Abschätzungen und sollten als untere Grenzen für die realen Elastizitäten angesehen werden.
Eine Flusskammer wird einige Vorteile über den gegenwärtigen offenen Aufbau (2) haben. Diese Kammer könnte mittels Mikroherstellungstechniken konstruiert werden. Die nötige Anordnung wird durch einätzen zweier V-förmiger Rillen entlang der 111-Ebene des Kristalls erreicht. Eine der Rillen wird als Führung der Glasfasern eine ausreichende Ausrichtung garantieren. Die zweite, dazu senkrechte Rille wird als Kanal für die Zelllösung dienen. Ein Loch in der Mitte wird es optisch ermöglichen, das Einfangen und die Verformung zu verfolgen. Eine andere Idee ist es, mit Synchrotronstrahlung zwei zueinander senkrechte Kanäle mit hoher Genauigkeit in PMMA zu bohren. Da PMMA transparent ist, wird das Beobachtungsloch überflüssig, das in der anderen Version Probleme wie Turbulenzen oder Auslaufen verursachen könnte.
Auf beiden Wegen wird eine geschlossen Flusskammer uns erlauben einen kontrollierten Fluss von Zellen in das Gebiet zu befördern, in dem die Falle wirkt. Es wird uns möglich für frisches Medium zu sorgen oder das Medium auszutauschen, während die Zelle eingefangen ist. Zur Erhaltung von empfindlichen Zellen wird es nötig sein, die Umgebungstemperatur auf 37°C zu halten, was leicht durch eine beheizte Flusskammer erreicht werden kann. Am wichtigsten, gegenüber dem bisherigen Aufbau und allen bisherigen Techniken, ist die Möglichkeit, eine höhere Probenzahl zu analysieren. Selbst in derselben Zelllinie variiert die Größe und Form der Zellen, und es wird daher erwartet, dass die Elastizität eine hohe Varianz hat.
Deshalb ist es von grundlegender Bedeutung die Elastizität von vielen Zellen zu messen, um statistisch relevante Ergebnisse zu bekommen. In der Flusskammer werden die Zellen durch den Spalt zwischen den beiden Glasfaserenden fließen. Wenn der Laser angeschaltet wird, wird die Zelle schließlich eingefangen werden, der Zellfluss daraufhin gestoppt und die Elastizität kann gemessen werden. Diese Prozedur kann sooft wiederholt werden, wie gewünscht. Die Steuerung des Zellflusses, die Beobachtung des Einfangens und der Streckung und die Auswertung der Daten kann im Prinzip von einem Computer gesteuert werden.
Es wird vermutet, dass in Zukunft Laserdioden mit genügend Leistung, Modenqualität und -stabilität und mit direkt angeschlossenen Glasfasern verfügbar werden, die die Notwendigkeit von großen und teuren Lasersystemen und zusätzlichen optischen Elementen veralten lassen werden. Der Optical Stretcher kann dann in einer sehr kleinen Version verwirklicht werden und hat das Potential als klinisches Instrument Verwendung zu finden.
Trotz der enormen Fortschritte in der Krebstherapie innerhalb der letzten 30 Jahre, steigt weltweit der Anteil von Krebs als Todesursache rapide an. Krebs wird oft erst sehr spät diagnostiziert, wodurch die Behandlung ineffektiv wird. Biopsie von Gewebeproben, die unter dem Lichtmikroskop untersucht werden ist immer noch die meistverbreitete Methode, um Krebs festzustellen. Wenn Zellen in einer dünnen Gewebesektion eine stark ungewöhnliche Form haben, ist dies ein deutliches Zeichen für bösartige Zellen. Biopsie ist invasiv und sowohl Arbeits- als auch Kostenintensiv. Daher wird sie nur bei deutlichen Anzeichen von Krebs angewendet, wie erkennbaren Massen oder Geschwulsten. Fortgeschrittenere Methoden zur Krebserkennung haben jedoch ihre eigenen Beschränkungen. Existierende zytologische Analysen – Untersuchung der Zellen aus einem Abstrich unter dem Mikroskop beispielsweise – sind oft unzulänglich, um eine kleine Zahl von Abnormalen Zellen nur durch Größe und Form zu identifizieren. Flusszytometrie hat sich rapide von der Grundlagenforschung bis in klinische Labore ausgebreitet. Unter den klinischen Anwendungen von Flusszytometrie ist Krebs eine der bedeutendsten. Die Probleme durch die Probenqualität, das Einfärben und instrumentell bedingte Artefakte begrenzen aber eine genaue Interpretation der Daten. Gentests, molekulare DNA Sonden und Enzymmarker werden dadurch beschränkt, dass jede Krebsart ihre eigene molekulare Signatur hat und daher ein eigenes Testverfahren benötigt.
Weitere Modifikationen und alternative Verkörperungen dieser Erfindung werden denjenigen, die Erfahrung im Bereich dieser Erfindung haben, ersichtlich erscheinen. Entsprechend ist diese Beschreibung nur als veranschaulichend aufzufassen, und dient dem Zweck, denen, die Erfahrung im Bereich dieser Erfindung haben, die Art der Handhabung dieser Erfindung zu erläutern. Die hierin beschriebenen und gezeigten Ausgestaltungen der Erfindung verstehen sich als veranschaulichende Verkörperungen. Ähnliche Elemente oder Materialien können statt der hierin gezeigten und beschriebenen eingesetzt werden und einige Eigenschaften der Erfindung können unabhängig von anderen verwendet werden, was alles demjenigen, der Erfahrung im Bereich dieser Erfindung hat ersichtlich ist, nachdem er den Vorteil dieser Beschreibung der Erfindung hatte.

Claims

Vorrichtung, aufweisend: eine Plattform (26), die in der Lage ist, mikrometergroße dielektrische Teilchen zu tragen; zwei oder mehr Quellen von Laserlicht (22, 24), die auf ein Gebiet der Plattform (26) gerichtet sind, in dem sich die Teilchen befinden, wobei die Laserquellen (22, 24) eine Leistung haben, um sowohl ein Teilchen einzufangen als auch auf nichtschädigende Weise zu dehnen; einen ersten Detektor (27), der ermittelt, ob ein Teilchen zwischen den Laserquellen (22, 24) eingefangen ist; und einen zweiten Detektor (27), der die Verformung eines Teilchens bei Erhöhung der Intensität des Laserlichts ermittelt und/oder misst.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei der erste Detektor Veränderung im Stromfluss misst.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei der erste und der zweite Detektor eine einzige Einheit sind.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Teilchen kleine Gewebeproben oder einzelne biologische Zellen sind.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Laserquellen (22, 24) durch Single-Mode-Glasfasern gelenkt werden.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Laserquellen (22, 24) durch Multi-Mode-Glasfasern gelenkt werden.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Laserquellen (22, 24) bei einer Wellenlänge von etwa 740 nm bis etwa 840 nm arbeiten.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei der Detektor die Verformung durch die Veränderung im Stromfluss durch ein wässriges Medium zwischen zwei asymmetrischen Löchern, zwischen denen das Teilchen eingefangen ist, misst.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Teilchen durch eine Flusskammergeometrie in die Laserfalle eingeführt werden.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei es sich bei den Teilchen um biologische Gewebeproben oder Zellen handelt.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Laserquellen (22, 24) Glasfasern aufweisen, die mit einem einzelnen Ti-Saphir Laser (12) verbunden sind, der Laserlicht durch die Glasfasern leitet.
Vorrichtung aus Anspruch 1, wobei die Laserquellen Quellen von entgegengerichtetem Laserlicht sind.
Verwendung der Vorrichtung aus Anspruch 1 für die Erkennung einzelner Krebszellen.
Verfahren zur kontrollierten Verformung von mikrometergroßen dielektrischen Teilchen, bei dem: ein Teilchen zwei oder mehr entgegengerichteten Laserstrahlen ausgesetzt wird bei einer Intensität, um dabei das Teilchen einzufangen und auf nichtschädigende Weise zu dehnen; und bei dem optional die Verformung des Teilchens gemessen wird.
Verfahren aus Anspruch 14, bei dem die Vorrichtung aus Anspruch 1 verwendet wird.
Verfahren aus Anspruch 14, wobei die Strahlen eine Wellenlänge von etwa 740 nm bis etwa 840 nm haben.
Verfahren aus Anspruch 14, wobei die Teilchen biologische Gewebeproben oder Zellen sind.
Verfahren aus Anspruch 14, wobei die Messung durch visuelle Untersuchung erfolgt.
Verfahren aus Anspruch 14, wobei die Messung elektronisch erfolgt.
Verfahren aus Anspruch 14, wobei die Messung durch Messung der Veränderung des Stromflusses durch ein wässriges Medium zwischen zwei asymmetrischen Löchern, zwischen denen das Teilchen gefangen ist, geschieht.
Verfahren aus Anspruch 14, wobei das Verfahren in Abwesenheit optischer Linsen durchgeführt wird, die die Strahlen zu den Teilchen führen.