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Gebiet der
Erfindung
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Es
werden Materialien und Verfahren zu ihrer Verwendung für die Herstellung
einer dreidimensionalen Matrix in Knochen, die ein physisches Aussehen
und eine mechanische Stabilität
hat, die demjenigen bzw. derjenigen von trabekulärem Knochen ähnlich ist,
unter Einsatz eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymers,
vorzugsweise in Verbindung mit einem osteokonduktiven, osteoinduktiven
und/oder puffernden Füllstoff,
offenbart.
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Hintergrund
der Erfindung
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Ein
Trauma, eine krankhafte Degeneration oder eine angeborene Missbildung
von Geweben kann der Grund dafür
sein, dass deren chirurgische Rekonstruktion oder chirurgischer
Ersatz erforderlich ist. Die Wiederherstellungschirurgie basiert
auf dem Prinzip des Ersatzes dieser defekten Gewebe durch brauchbare, funktionierende
Alternativen. Chirurgen haben in der Vergangenheit Knochentransplantate
zur Korrektur von Skelettdefekten eingesetzt. Die beiden Haupttypen
von Knochentransplantaten, die derzeit verwendet werden, sind Autotransplantate
und Allotransplantate. Ein Autotransplantat ist ein Teil eines Knochens,
der dem Körper des
Patienten selbst entnommen wird, während ein Allotransplantat
einer Leiche entnommen wird. Dieses Transplantationsverfahren liefert
der defekten Stelle eine strukturelle Stabilität und die natürlichen
osteogenen Eigenschaften. Allerdings werden beide Transplantattypen
durch bestimmte, nicht steuerbare Faktoren limitiert. Bei Autotransplantaten
ist die Haupteinschränkung
die Morbidität
der Stelle des Spenders, an der das an der Entnahmestelle verbleibende
Gewebe durch die Entfernung des Transplantats geschädigt wird.
Weitere Überlegungen
beinhalten die beschränkte
Menge an Knochen, die für
eine Entnahme zur Verfügung
steht, sowie ein unvorhersagbares Verhalten bezüglich der Resorption des Transplantats.
Allotransplantate aus großen eingefrorenen
kortikalen Knochen werden in zunehmendem Umfang in Gliedmaßen erhaltenden
Verfahren nicht nur für
die Behandlung von Knochentumoren, bei massivem Knochenverlust nach
traumatischen Verletzungen oder bei der Behandlung der avaskulären Nekrose
eingesetzt, sondern auch bei misslungenen Gelenkarthroplastiken,
bei denen es häufig
zu einem extensiven Knochenverlust durch eine Osteolyse kommt.
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Menschlicher
Knochen, der von toten Spendern erhalten wird, wird typischerweise
unter sterilen Bedingungen in einem Operationssaal eines örtlichen
Krankenhauses beschafft. Der Knochen wird eingefroren aufbewahrt,
bis er unter sterilen Bedingungen oder Reinraumbedingungen weiter
zu kleinen Transplantaten verarbeitet wird. Die Beschaffung und
Verarbeitung menschlicher Gewebe wird typischerweise von Gruppen, die
von der American Association of Tissue Banks dafür zertifiziert sind, mittels
Standard-Operationsverfahren für
die Verarbeitung eines jeden spezifischen Knochentransplantats durchgeführt. Große Knochen,
wie der Oberschenkelknochen, werden aufgetaut und von überschüssigem Gewebe
befreit, ehe sie zu kleineren Transplantaten zerschnitten werden.
Die Verarbeitung der kleineren Transplantate umfasst das Entfernen
des Knochenmarks aus den Spongiosahohlräumen. Das Entfernen des Knochenmarks
aus kleinen Knochentransplantaten wird in der wissenschaftlichen
Literatur und in Broschüren
und Texten beschrieben, die von Gruppen veröffentlicht wurden, die in die
Beschaffung und Verarbeitung menschlicher Gewebe involviert sind.
Diese Verfahren entfernen Knochenmarkgewebe, Lipide und Blutbestandteile,
wobei verschiedene Materialien, einschließlich von Lösemitteln und Tensiden, eingesetzt
werden.
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Diese
Typen von Transplantaten werden bei der Behandlung großer Skelettschäden eingesetzt,
die nach wie vor eine Herausforderung für orthopädische Chirurgen darstellen,
insbesondere wenn das Problem bei jungen Patienten entsteht, bei
denen es wahrscheinlich ist, das künstliche Vorrichtungen und
Gelenkimplantate schnell versagen werden. Die Haupteinschränkung ist
bei Allotransplantaten die immunologische Reaktion auf das fremde
Gewebe des Transplantats. Das Gewebe ist Ziel einer Entzündungsreaktion
und kann abgestoßen
werden. Allotransplantate können
auch Krankheiten übertragen.
Ein gründliches
Screening-Verfahren
eliminiert zwar die meisten der krankheitstragenden Gewebe, aber
dieses Verfahren ist nicht völlig
effektiv.
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Zwar
liegt die letztliche Häufigkeit
des Erfolgs, der eine Wiederaufnahme der Arbeit und die Beschäftigung
mit relativ normalen Aktivitäten
ohne Krücken
oder Schienen bedeutet, bei 75–85%,
aber nur 50% dieser Patienten zeigen einen völlig unkomplizierten postoperativen
Verlauf. Ungefähr
ein Viertel der gesamten Gruppe benötigt wiederholte Operationen,
wie eine autologe Transplantation oder eine erneute Operation von durch Überlastungsbrüche gestörten Verbindungen.
Bei einigen Patienten ist ein Herausschneiden des Transplantats
aufgrund einer Infektion, eine erneute Implantation, eine langfristige
Schienung oder, in einigen Fällen, eine
Amputation erforderlich. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass
bezüglich
dieser Verfahren immer noch Probleme bestehen und dass die Technik,
wenn sie in größerem Umfang
angewendet werden soll, intensiver untersucht und grundlegend verbessert
werden muss.
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Klinische
und experimentelle Berichte liefern genügend Hinweise für die Schlussfolgerung,
dass Allotransplantate aus massiven kortikalen Knochen in erster
Linie als osteokonduk tive Gerüste
mit schlechtem osteoinduktivem Potenzial dienen. Tatsächlich wird
häufig
gefunden, dass neuer Knochen nur einige wenige Millimeter von den äußeren Oberflächen des
Transplantats in dieses eindringt. Die Resorption von nicht lebensfähigem Knochen
allogener Implantate aus Leichenknochen ist oft der Grund für klinische
Komplikationen. Somit könnte
eine bessere Steuerung der Knochenresorption und die Stimulation
der Bildung von neuem Knochen letztlich die klinischen Ergebnisse
verbessern.
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In
früheren
Untersuchungen wurde versucht, die Inkorporation in den Empfänger durch
die Veränderung
der geometrischen Oberflächenkonfiguration
von kortikalem Knochen zu verbessern (Bernick, 1989; Gendler, 1986,
1990; O'Donnell,
1996; Scanlon, 1991; Sires, 1992). Der Mechanismus, über den
das Vorliegen von Perforationen die Osteogenese und die Inkorporation
entmineralisierter Transplantate fördert, kann eine Funktion entweder
der größeren Oberfläche der
teilweise entmineralisierten Knochen oder der erhöhten Zugänglichkeit
für Gefäßgewebe
oder von beidem sein. Frühere
Untersuchungen haben gezeigt, dass die Form eines Implantats das
Ausmaß der
Knochenbildung beeinflussen kann. Zum Beispiel hat man das osteokonduktive
Potenzial von korallinem Hydroxylapatit („HA") mit einer Porengröße von 0,6 μm, zumindest zum Teil, seiner
morphometrischen Ähnlichkeit
mit der Spongiosa zugeschrieben (Holmes, 1986). Als solches könnte das
osteokonduktive Potenzial von Transplantaten aus kortikalem Knochen,
die so behandelt wurden, dass sich ähnliche Strukturen ergeben, ähnlich sein.
Gendler verwendete vollständig
entmineralisierte diaphysäre allogene
Stützen,
die unter Verwendung eines mechanischen Bohrers perforiert wurden
(1986). Demgegenüber
verwendeten O'Donnell
et al. entmineralisierten kortikalen Knochen des Schädeldachs
(1996). Bernick et al. (1989) charakterisierten die induktiven zellulären Ereignisse
in einem ähnlichen
System. Scanlon implantierte stützende
Allotransplantate aus dem entmineralisierten Oberschenkelknochen
eines Hundes in ein orthotopes Modell (1991). Die letzteren beiden
Untersuchungen haben die Verwendung eines Erbium:Yttrium-Scandium-Gallium-Garnet-Lasers
(Er:YSGG) für
das Bohren von Allotransplantaten aus kortikalem Knochen demonstriert,
wodurch die Porosität
erhöht
und es möglich
gemacht wurde, dass die Entmineralisierung auch in Bereichen erfolgte,
die normalerweise nicht für
Entmineralisierungsverfahren zugänglich
sind. Nach der Reimplantation sind diese Transplantate offenbar
osteogener als kortikale Transplantate ohne Löcher.
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Zwar
ist die Entmineralisierung bezüglich
der Verbesserung der osteoinduktiven Eigenschaften von Knochen erfolgreich
gewesen, wie man anhand der großen
Zahl einschlägiger
Veröffentlichungen über experimentelle
und klinische Untersuchungen sehen kann, aber vollständig entmineralisierter
kortikaler Knochen ist klinisch nur in begrenztem Umfang eingesetzt
worden. Das ist offenbar in erster Linie der Tatsache zuzuschreiben,
dass kortikaler Knochen, nachdem er einer extensiven Entmineralisierung
unterzogen worden ist, seine essentiellen biomechanischen Eigenschaften
verloren hat.
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Defekte
der Prozesse der Knochenreparatur und -regeneration sind mit der
Entwicklung verschiedener menschlicher Erkrankungen und Störungen,
z. B. der Osteoporose und der Osteogenesis imperfecta, assoziiert.
Eine Störung
des Mechanismus der Knochenreparatur ist natürlich auch mit erheblichen
Komplikationen in der klinisch orthopädischen Praxis assoziiert,
zum Beispiel einer fibrösen,
fehlenden Verbindung nach einem Knochenbruch, Störungen an Grenzflächen von
Implantaten und dem Versagen großer Allotransplantate. Das
Leben vieler Personen würde
durch die Entwicklung neuer Typen von Knochentransplantaten verbessert,
die so ausgelegt sind, dass sie die Heilung und Reparaturprozesse
stimulieren und stärken.
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Herkömmliche
orthopädische
Implantate, wie Schrauben, Platten, Zapfen und Stäbe, dienen
als ein lasttragender Ersatz geschädigter Knochen und bestehen üblicherweise
aus einem Metall oder einer Legierung. Zwar können diese Implantate eine
feste Fixierung und Stabilisierung der Knochen bereit stellen, aber sie
verursachen wegen des großen
Unterschieds des Modulus zwischen dem Knochen und dem Metall eine fehlerhafte
Remodellierung des Knochens an der Stelle des Implantats.
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Die
Probleme mit diesen Materialien haben zur Suche nach zuverlässigen synthetischen
Hilfsmitteln für
Knochentransplantate und Ersatzmaterialien für Knochentransplantate geführt. Jedoch
muss ein Implantat, wenn es als Ersatz für Knochen verwendet werden
soll, sowohl zur Osteointegration als auch zur Osteokonduktion fähig sein.
Osteointegration bezieht sich auf die direkte chemische Bindung
eines Biomaterials an die Oberfläche
von Knochen ohne eine dazwischen liegende Schicht aus fibrösem Gewebe.
Diese Bindung wird als die Grenzschicht zwischen Implantat und Knochen
bezeichnet. Ein primäres
Problem bei Skelettimplantaten ist die Beweglichkeit. Eine Bewegung
des Implantats limitiert nicht nur seine Funktion, sondern sie prädisponiert
die Implantatstelle auch für
eine Infektion und eine Knochenresorption. Bei einer festen Grenzfläche zwischen
Implantat und Knochen wird jedoch die Beweglichkeit eliminiert,
was eine gute Heilung ermöglicht. Osteokonduktion
bezieht sich auf die Fähigkeit
eines Biomaterials, ein Zellwachstum und eine Zellproliferation auf
seiner Oberfläche
zu unterstützen,
während
es gleichzeitig den zellulären
Phänotyp
aufrecht erhält.
Für Osteoblasten
schließt
der Phänotyp
die Mineralisierung, die Collagenbildung und die Proteinsynthese
ein. Eine normale Osteoblastenfunktion ist insbesondere für poröse Implantate
wichtig, die ein Einwachsen von Knochen für eine angemessene Stabilität und eine
geeignete Oberfläche
für die
Bindung an den Knochen benötigen.
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Materialien
auf der Basis von Calciumphosphat sind in großem Umfang bezüglich einer
Verwendung als Knochenersatzmaterialien untersucht worden. Die meisten
Biomaterialien aus Calciumphosphat sind polykristalline Keramikmaterialien,
die durch ihre hohe Biokompatibilität, ihre Fähigkeit zur Osteointegration
und eine in unterschiedlichem Ausmaß ausgeprägte Resorbierbarkeit gekennzeichnet
sind. Aus diesen Materialien hergestellte Implantate können entweder
von poröser
oder von nicht-poröser
Form sein. Beispiele für
im Handel erhältliche
Calciumphosphat-Materialien sind InterporeTM 2000
und InterporeTM 5000. Chirurgische Modelle unter
Verwendung von Implantatmaterialien auf der Basis von porösem Calciumphosphat
haben jedoch gezeigt, dass poröse
Implantate langsamer als Autotransplantate und als leere Schäden heilen.
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Jede
beliebige neuartige Technik für
die Stimulation der Knochenreparatur wäre ein wertvolles Werkzeug
für die
Behandlung großer
Knochenschäden.
Eine sehr wichtige Gruppe von Patienten, die von neuen Therapien,
die für
eine Förderung
der Inkorporation von Knochen-Allotransplantaten
ausgelegt sind oder sogar Brüche
und Infektionen verhindern oder deren Häufigkeit vermindern, profitieren
würden,
sind diejenigen Patienten, die unter großen Schäden ihres Skelettsystems leiden.
Eine geschätzte
Zahl von 20–25
Millionen Menschen hat aufgrund eines ortsspezifischen Knochenverlustes
ein erhöhtes
Bruchrisiko. Die Kosten der Osteoporosebehandlung in den Vereinigten
Staaten von Amerika werden derzeit auf eine Größenordnung von 10 Milliarden
Dollar pro Jahr geschätzt.
Demographische Trends, d. h. das allmählich ansteigende Alter der US-Bevölkerung,
legen nahe, dass diese Kosten bis zum Jahr 2020 auf das 2–3-fache
ansteigen könnten, wenn
keine sichere und wirkungsvolle Behandlung gefunden wird.
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Es
ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Allotransplantat-
und Implantatmaterialien bereit zu stellen, die biokompatibler sind
und eine bessere Osteointegration und Osteokonduktion fördern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
werden Methoden und Materialien für das Füllen von Perforationen in Allotransplantaten
aus einem teilweise entmineralisierten kortikalen Knochen mit Matrices,
die ein biologisch abbaubares, biokompatibles Polymer einschließen, vorzugsweise
zusammen mit einem osteokonduktiven, osteoinduktiven Füllstoff
oder Streckmittel und/oder einem puffernden Material, wie HA, offenbart.
Die Matrix verbessert die Steuerung der Resorption und das Einwachsen
von Knochen in die Allotransplantate aus dem kortikalen Knochen.
Die Matrix kann dazu verwendet werden, den Knochenvorläuferzellen
in vivo Faktoren für
die Knochenstimulation zuzuführen.
Die Matrix kann auch dazu verwendet werden, den stimulatorischen
Faktor in die Zellen der weichen Gewebe, die das Allotransplantat
aus dem kortikalen Knochen umgeben, oder in kultivierte Zellen oder
rekombinante Zellen, die in vitro gehalten werden, zu transferieren,
wobei das einzige, was benötigt
wird, die Zugabe der Zusammensetzung mit dem stimulatorischen Faktor
zu den Zellen ist, z. B. indem sie den Kulturmedien zugesetzt wird.
Die Matrix kann dazu eingesetzt werden, die Expression eines gewünschten
Gens in Knochenzellen oder in Geweben, die das Allotransplantat
aus dem kortikalen Knochen umgeben, zu fördern und den Zellen einen bestimmten
gewünschten
Phänotyp
zu verleihen. Diese Expression könnte
die erhöhte
Expression eines Gen sein, das auch normalerweise exprimiert wird
(d. h. „Überexpression"), oder sie könnte dazu verwendet
werden, ein Gen zu exprimieren, das normalerweise nicht mit Knochenvorläuferzellen
in ihrer natürlichen
Umgebung assoziiert ist. Alternativ kann die Matrix dazu verwendet
werden, die Expression eines Gens zu unterdrücken, das in solchen Zellen
und Geweben natürlich
exprimiert wird, und, wiederum, um den Phänotyp zu verändern oder
abzuändern.
Die Gensuppression kann über
die Expression eines Gens erfolgen, das für ein Protein codiert, das
eine herunterregulierende Funktion ausübt, oder sie kann über den
Einsatz der Antisense-Technologie erfolgen.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Der
Prozess der Knochenreparatur und -regeneration ähnelt dem Prozess der Wundheilung
in anderen Geweben. Eine typische Abfolge von Ereignissen beinhaltet
eine Blutung, die Bildung eines Gerinnsels, die Auflösung des
Gerinnsels unter gleichzeitiger Entfernung des geschädigten Gewebes,
das Einwachsen von Granulationsgewebe, die Bildung von Knorpel,
das Einwachsen von Kapillaren und den Umsatz von Knorpel, die schnelle
Bildung von Knochen (Kallusgewebe) und, schließlich, die Remodellierung des
Kallus zu kortikalem und trabekulärem Knochen. Die Knochenreparatur
ist ein komplexer Prozess, an dem viele Zelltypen und regulatorische
Moleküle
beteiligt sind. Zu den diversen Zellpopulationen, die in die Reparatur
eines Bruches verwickelt sind, gehören Stammzellen, Makrophagen,
Fibroblasten, Gefäßzellen,
Osteoblasten, Chondroblasten und Osteoklasten.
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Wie
hier beschrieben wird werden Polymer-Allotransplantate mit verbesserten
Eigenschaften durch das Auftragen und/oder Injizieren des Polymers
allein oder zusammen mit bioaktiven Materialien in das Knochenmaterial
gebildet, vorzugsweise nachdem die Porosität der Knochen erhöht oder
die Oberflächentextur verändert worden
ist. Bei der bevorzugten Ausführungsform
schließt
das Polymermaterial osteotrope Faktoren ein, mit denen es assoziiert
oder imprägniert
ist. Dieses polymere Verbundmaterial wird hier als eine knochenkompatible
Matrix bezeichnet, und es wird dazu verwendet, eine „Matrix-Knochen-Allotransplantat-Zusammensetzung" zu bilden. Die Matrix-Knochen-Allotransplantat-Zusammensetzung
wird dann vor der Implantation oder bei der Implantation in Kontakt
mit den Knochenvorläuferzellen
oder dem Knochenvorläufergewebe angeordnet.
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I. Materialien für die Herstellung
von Polymer-Allotransplantat-Zusammensetzungen
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Biologisch abbaubare polymere
Materialien und knochenkompatible Matrices
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Die
prinzipielle Komponente der Matrix ist ein Polymer oder sind mehrere
Polymere, Copolymere oder Blends von Polymeren, das oder die dann
osteoinduktive, osteokonduktive Füllstoffe und/oder puffernde
Mittel einschließen
kann bzw. können.
Polymere sind eine Klasse synthetischer und natürlich vorkommender Materialien,
die durch ihre große
Vielseitigkeit gekennzeichnet sind. Die Auswahl des Polymermaterials
hängt von den
jeweiligen Umständen
und der Lage des Knochens, der behandelt werden soll, ab. Physikalische
und chemische Eigenschaften, wie z. B. die Biokompatibilität, die biologische
Abbaubarkeit, die Stabilität,
die Festigkeit, Grenzflächeneigenschaften
und sogar das kosmetische Erscheinungsbild sind Faktoren, die bei
der Auswahl eines Polymers berücksichtigt
werden können.
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Es
wurde eine Anzahl biologisch abbaubarer, biokompatibler Polymere
entwickelt, und zwar in erster Linie für den Einsatz in medizinischen
Anwendungen, und sie werden hier für den Einsatz bevorzugt. Der
Begriff „biokompatibel", so wie er hier
verwendet wird, bedeutet, dass das Material keine adverse, allergische
oder andere inakzeptable Reaktion hervorruft, wenn es in ein Tier
implantiert wird, und dass es mit Knochengewebe kompatibel ist.
Der Begriff „biologisch
abbaubar" bezieht
sich darauf, dass das Material innerhalb eines gewissen Zeitraums
nach seiner Einbringung in den Körper
zu seinen Grundbestandteilen abgebaut wird, typischerweise durch
Hydrolyse und/oder Enzymolyse, und zwar gewöhnlich innerhalb eines Zeitraums
von unter zwei Jahren, typischer von unter einem Jahr.
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Eines
der üblichsten
Polymere, die als Biomaterial verwendet werden, ist das Polyester-Copolymer Poly(milchsäure-glycolsäure) (PLGA).
PLGA ist äußerst biokompatibel,
zersetzt sich zu biokompatiblen Monomeren und hat einen breiten
Bereich mechanischer Eigenschaften, die dieses Copolymer und seine
Homopolymere, PLA und PGA, nützlich
für die
Skelettreparatur und -regeneration machen. Es wurden poröse, dreidimensionale,
diese Polymere umfassende Matrices für die Verwendung als Knochenersatz
mittels verschiedener Techniken hergestellt. Ein biologisch abbaubarer,
biokompatibler Polymerschaum aus Poly(milchsäure-co-glycolsäure) [PLGA],
vorzugsweise hergestellt als ein Verbundmaterial mit einem keramischen
Material aus Calciumphosphat, beispielsweise HA, ist ein bevorzugtes
Material für
die Konstruktrion von Oberflächenmodifikationen
von Allotransplantaten aus kortikalem Knochen. Zusammen mit einem
osteokonduktiven Puffermittel wie HA sind diese porösen polymeren
Matrices besonders als zelluläre
Gerüste
für die
Knochenregeneration nützlich.
Matrices wie diejenigen, die im US-Patent Nr. 5 270 300 beschrieben werden,
können
ebenfalls eingesetzt werden.
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Diese
Materialien können
dazu verwendet werden, Allotransplantate aus kortikalem Knochen
zu modifizieren, um ein Material für die Knochenrekonstruktion
zu erhalten, das exakt in eine geschädigte Stelle passt, wobei es
temporär
als Matrize für
die Erzeugung von neuem Knochen dient. Es stellt eine stützende Struktur
für ein
Gerüst
für das
Wachstum von neuem Knochen bereit. Das Konzept der Steuerung der
Porosität basiert
auf der Verwendung abbaubarer Polymere in Verbindung mit einem Allotransplantat
aus porösem
kortikalem Knochen. Die chemische Hydrolyse des hydrolytisch instabilen
Rückgrats
der PLGA-Polymere ist der vorherr schende Mechanismus für den Polymerabbau.
Dieser erfolgt in zwei Phasen. In der ersten Phase dringt Wasser
in die Masse der polymergefüllten
Poren ein, wobei es vorzugsweise die chemischen Bindungen in der amorphen
Phase angreift und lange Polymerketten in kürzere, wasserlösliche Fragmente
umwandelt. Da das anfangs in der amorphen Phase erfolgt, kommt es
zu einer Verminderung des Molekulargewichts ohne einen Verlust der
physikalischen Eigenschaften, da die Polymermatrix noch durch die
kristallinen Bereiche zusammengehalten wird. Der Verminderung des
Molekulargewichts folgt bald eine Verminderung physikalischer Eigenschaften,
wenn das Wasser beginnt, das Material zu fragmentieren. In der zweiten
Phase kommt es zu einem enzymatischen Angriff und einer Metabolisierung
der Fragmente, was zu einem schnellen Verlust an Polymermasse führt. Dieser
Abbautyp, bei dem die Geschwindigkeit, mit der Wasser das Material
durchdringt, größer als
die Geschwindigkeit ist, mit der das Polymer in wasserlösliche Materialien
umgewandelt wird (was zu einer Erosion in der gesamten Matrix führt), wird
als „Massenerosion" („bulk erosion", Hubbell und Langer, 1995)
bezeichnet. Die Geschwindigkeit des Abbau von PLGAs kann zum Teil über das
Verhältnis
der Copolymere gesteuert werden, wobei höhere Glycolid- oder Lactidanteile
längere
Abbauzeiten begünstigen.
Polymere mit unterschiedlichen Verhältnissen der Copolymere, einschließlich von
PLA, PLGA 75 : 25 und PLGA 50 : 50, wurden im folgenden Beispiel
verglichen, um die Wirkungen der Abbaugeschwindigkeiten zu untersuchen.
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Zu
anderen polymeren Materialien, die verwendet werden können, gehören synthetische
und natürliche
Polymere, einschließlich
anderer Polyester, Polyanhydride, Polyhydroxyalkanoate, Poly(glaxanon),
Poly(orthoester) und Poly(phosphazene), Ethylenvinylacetat, Polycarbonate,
Proteine und Polysaccharidmaterialien. Geeignete Acrylesterpolymere
und Milchsäurepolymere
werden in den US-Patenten Nr. 4 526 909 und 4 563 489 offenbart.
Zu anderen biologisch abbaubaren Materialien gehören beispielsweise Matrices
aus gereinigten Proteinen und Zusammensetzungen aus semi-gereinigter
extrazellulärer
Matrix. Bevorzugte Matrixmaterialien sind diejenigen, die aus Sehnen-
oder Hautcollagen präpariert
werden und von verschiedenen kommerziellen Quellen bezogen werden
können,
wie z. B. von Sigma und der Collagen Corporation. Collagenmatrices
können
auch präpariert
werden, wie es in den US-Patenten
Nr. 4 394 370 und 4 975 527 beschrieben wurde. Derzeit ist das am
stärksten
bevorzugte Collagenmaterial UltraFiberTM,
das von Norian Corp. (Mountain View, Kalifornien) bezogen werden
kann.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
können
nicht biologisch abbaubare Matrices eingesetzt werden, beispielsweise
gesinterter HA, Bioglas, Aluminate, andere biokeramische Materialien
und Metallmaterialien, insbesondere Titan. Ein geeignetes Keramikmaterial
wird im US-Patent Nr. 4 596 574 beschrieben. Biologisch abbaubares
und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat und HA
können
auch verwendet werden. Implantate, die aus dem auf Calciumphosphat
basierenden Material HA, dem mineralischen Hauptbestandteil des
Knochens, synthetisiert wurden, sind im Handel in poröser und
in nicht-poröser
Form erhältlich. Synthetische
HA-Implantate haben eine exzellente Biokompatibilität. Blöcke aus
dichtem HA sind in der Wiederherstellungschirurgie nicht nützlich,
da sie schwierig zu formen sind und kein Einwachsen von Gewebe erlauben.
Allerdings wurde HA in einer nicht-porösen, teilchenförmigen Form
erfolgreich sowohl als Verbundmaterial (CollagraftTM)
als auch in Zementform (HapsetTM) verwendet
(Chow et al., Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1993, 179: 3–24; Cornell,
C. N., Tech. Orthop. 1992, 7: 55). Wegen seiner Zerbrechlichkeit
und seiner fehlenden Nachgiebigkeit ist die Verwendung von porösem HA im
wesentlichen auf die Dental- und Maxillofazialchirurgie beschränkt.
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Tricalciumphosphat
(TCP) ist der andere Haupttyp von Implantatmaterialien auf der Basis
von Calciumphosphat. Es hat eine Biokompatibilität, die der von HA ähnlich ist,
aber es ist aufgrund seiner Kristallstruktur besser resorbierbar
sls HA. Die chemische Struktur von TCP erlaubt es, es als einen
Calciumphosphatzement (CPC) zu verwenden (Chow, L. C., Centen. Mem.
Issue Ceramics Soc. Jpn 1991, 99: 954; Mirtchi et al., Biomaterials
1989, 10: 475), der im Operationssaal gemischt werden kann und somit
leicht so geformt werden kann, dass er für die Implantationsstelle passt.
Die Nachgiebigkeit von TCP-Materialien ermöglicht es, sie in einem breiteren
Bereich als herkömmliche
Keramikmaterialien in chirurgischen Anwendungen einzusetzen.
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Andere
Typen von keramischen Knochenersatzmaterialien basieren auf Silikat.
Die Verwendung von Materialien auf Silikatbasis für den Knochenersatz
steht mit ihrer Biokompatibilität
in Zusammenhang. Im Gegensatz zu Calciumphosphat-Materialien kommt
Silikat nicht natürlicherweise
im Körper
vor. Seine Biokompatibilität
ist jedoch derjenigen natürlich
vorkommender Mineralien ähnlich.
Zu Beispielen für
Knochenersatzmaterialien auf Silikatbasis gehören bioaktive Gläser.
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In
einigen Fällen
können
diese Materialien osteoinduktive oder osteokonduktive Eigenschaften
haben, wie unten detaillierter diskutiert wird. Diese Materialien
können
auch als Füllstoffe
oder Streckmittel oder als puffernde Verbindungen verwendet werden.
HA ist eine bevorzugte puffernde Verbindung, da er saure Abbauprodukte
biologisch abbaubarer Polymere, wie Milchsäure und Glycolsäure enthaltender
Polymere, neutralisiert, wodurch er die Wahrscheinlichkeit vermindert,
dass diese Materialien zytotoxisch wirken und die Abtrennung des
Implantats und eine Sepsis verursachen.
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Knochenvorläuferzellen
und -gewebe
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Die
Matrix kann als Zufuhrmittel für
Moleküle
verwendet werden, die das Einwachsen von Knochen stimulieren (d.
h. von osteokonduktive Mitteln), und/oder die die Rekrutierung von
Knochenzellen stimulieren (d. h. von osteoinduktiven Mitteln), oder
als ein Gerüst
für Knochen vorläuferzellen,
die vor der Implantation oder bei der Implantation auf oder in die
Matrix gesät
werden und die selbst osteokonduktive und/oder osteoinduktive Agenzien
produzieren können.
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Der
Begriff „Knochenvorläuferzellen" bezieht sich, so
wie er hier verwendet wird, auf Zellen, die die Fähigkeit
besitzen, letztlich neues Knochengewebe zu bilden oder zu dessen
Bildung beizutragen. Das schließt
verschiedene Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien
ein, z. B. Stammzellen, Makrophagen, Fibroblasten, Gefäßzellen,
Osteoblasten, Chondroblasten und Osteoklasten. Knochenvorläuferzellen schließen auch
Zellen ein, die isoliert und in vitro manipuliert wurden, z. B.
einer Stimulation mit Agenzien wie Cytokinen oder Wachstumsfaktoren
unterzogen wurden, oder sogar gentechnologisch konstruierte Zellen.
Der jeweilige Typ oder die jeweiligen Typen von Knochenvorläuferzellen,
der stimuliert wird bzw. die stimuliert werden, ist bzw. sind nicht
wichtig, so lange die Zellen auf eine Weise stimuliert werden, dass
sie aktiviert werden und, im Kontext der In-vivo-Ausführungsformen,
letztlich zur Entstehung von neuem Knochengewebe führen.
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Der
Begriff „Knochenvorläuferzelle" wird auch verwendet,
um insbesondere diejenigen Zellen zu bezeichnen, die sich in Knochenvorläufergewebe
befinden, in Kontakt mit diesem stehen oder in dessen Richtung (d.
h. „nach
Hause") wandern,
und diese Zellen stimulieren direkt oder indirekt die Bildung von
reifem Knochen. Als solche können
die Vorläuferzellen
Zellen sein, die letztlich selbst zu reifen Knochenzellen differenzieren,
d. h. Zellen, die „direkt" neues Knochengewebe
bilden. Zellen, die nach einer Stimulation weitere Vorläuferzellen
anziehen oder die Differenzierung nahegelegener Zellen zu knochenbildenden
Zellen fördern
(z. B. zu Osteoblasten, Osteozyten und/oder Osteoklasten), werden
auch als Vorläuferzellen
betrachtet, da ihre Stimulation „indirekt" zur Knochenreparatur oder -regeneration
führt.
Zellen, die die Knochenbildung indirekt beeinflussen, können das
tun, indem sie verschiedene Wachstumfaktoren oder Cytokine hervorbringen,
oder sie tun es über
ihre physische Wechselwirkung mit anderen Zelltypen.
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Was
die Knochenvorläuferzellen
betrifft, so können
diese auch Zellen sein, die in ein derartiges Gebiet angezogen oder
rekrutiert werden. Sie können
Zellen sein, die in einer künstlich
erzeugten Osteotomiestelle in einem Tiermodell vorhanden sind. Knochenvorläuferzellen
können
auch aus tierischen oder menschlichen Geweben isoliert und in einer
in-vitro-Umgebung gehalten werden. Geeignete Bereiche des Körpers, aus
denen Knochenvorläuferzellen
gewonnen werden können,
sind Bereiche wie das Knochengewebe und die Flüssigkeit, die einen Bruch oder
einen anderen Skelettschaden umgeben (unabhängig davon, ob es sich um eine künstlich
erzeugte Stelle handelt oder nicht), oder tatsächlich das Knochenmark. Isolierte
Zellen können
stimuliert und dann wieder einer geeigneten Stelle in einem Tier
zugeführt
werden, an der die Knochenreparatur stimuliert werden soll. In derartigen
Fällen
können
die Zellen als therapeutische Mittel verwendet werden. Solche Ex-vivo-Protokolle
sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt.
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Biometrische knochenstimulierende
Faktoren
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Es
sind verschiedene biomimetische und/oder biologisch abbaubare Materialien
als Stimulatoren einer Bildung von neuem Knochen eingesetzt worden.
Ein besonders wichtiger Aspekt des Matrixmaterials, speziell des
Polymermaterials, ist seine Verwendung in Verbindung mit orthopädischen
Allotransplantaten aus kortikalem Knochen und mit Grenzflächen mit
künstlichen
Gelenken, einschließlich
den Implantaten selbst sowie funktionellen Teilen eines Implantats,
wie z. B., chirurgischen Schrauben und Zapfen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Oberflächen
des Allotransplantats und/oder Implantats aus dem Knochen oder ein
Teil davon, wie eine Oberfläche
aus Titan, mit einem Material beschichtet, das eine Affinität für einen
knochenstimulierenden Faktor aufweist, am bevorzugtesten mit HA,
und dann wird das beschichtete Metall weiter mit einem Gen, das
für einen
knochenstimulierenden Faktor codiert, oder mit dem knochenstimulierenden
Faktor selbst, den man inkorporieren möchte, beschichtet. Das Gen
oder das Protein kann unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten
auf diesem Gebiet bekannt sind, an das Matrixmaterial in den Poren
des Knochentransplantats oder an die Oberfläche des Implantats adsorbiert,
in dieses inkorporiert oder chemisch an diese gekoppelt werden.
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Beispiele
für stimulatorische
Moleküle
sind regulatorische Faktoren, die in die Knochenreparatur involviert
sind, wie Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren und andere Moleküle, die
das Wachstum und die Differenzierung regulieren, sowie osteoinduktive
Agenzien wie die bone morphogenetic oder morphogenic proteins (BMPs).
Die letzteren werden auch als osteogenic bone inductive proteins
oder osteogenic proteins (OPs) bezeichnet. Verschiedene BMP-Gene
(oder OP-Gene) sind mittlerweile kloniert worden, und die üblichen
Bezeichnungen sind BMP-1 bis BMP-8. Die BMP-Terminologie wird zwar
allgemein verwendet, aber es könnte sich
herausstellen, dass es für
jedes einzelne BMP als Gegenstück
eine OP-Bezeichnung gibt (Alper, 1994). Von den BMPs 2–8 nimmt
man allgemein an, dass sie osteogen sind, auch wenn BMP-1 ein allgemeineres Morphogen
ist (Shimell et al., 1991). BMP-3 wird auch Osteogenin genannt (Luyten
et al., 1989), und BMP-7 wird auch OP-1 genannt (Ozkaynak et al.,
1990). BMPs sind mit der Superfamilie des transforming growth factor-beta
(TGF-beta) verwandt oder gehören
zu dieser, und sowohl TGF-beta-1 als auch TGF-beta-2 regulieren ebenfalls
die Funktion von Osteoblasten (Seitz et al., 1992). Mehrere Nucleotidsequenzen
und Polypeptide von BMPs (oder OPs) sind in US-Patenten beschrieben
worden, z. B. in den US-Patenten Nr. 4 795 804, 4 877 864, 4 968
590 und 5 108 753; einschließlich
insbesondere von BMP-1, das im US-Patent Nr. 5 108 922 offenbart wird;
BMP-2A wird in den US-Patenten Nr. 5 166 058 und 5 013 649 offenbart,
BMP-2B wird im US-Patent Nr. 5 013 649 offenbart, BMP-3 im US-Patent Nr.
5 116 738, BMP-5 im US-Patent Nr. 5 106 748, BMP-6 im US-Patent
Nr. 5 187 076, BMP-7 in den US-Patenten Nr. 5 108 753 und 5 141
905, und OP-1, COP-5 und COP-7 im US-Patent Nr. 5 011 691.
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Zu
anderen Wachstumsfaktoren oder Hormonen, für die berichtet wurde, dass
sie die Fähigkeit
zur Stimulierung einer Bildung von neuem Knochen besitzen, gehören der
acidic fibroblast growth factor (Jingushi et al., 1990), Östrogen
(Boden et al., 1989), der macrophage colony stimulating factor (Horowitz
et al., 1989) und Calcium-regulierende Agenzien wie das Parathormon
(PTH) (Raisz & Kream,
1983). Verschiedene Gruppen haben die Möglichkeit der Verwendung knochenstimulierender
Proteine und Polypeptide, insbesondere rekombinanter BMPs, zur Beeinflussung
der Knochenreparatur in vivo untersucht. Zum Beispiel wurde rekombinantes
BMP-2 zur Reparatur chirurgisch erzeugter Schäden im Unterkiefer adulter
Hunde eingesetzt (Toriumi et al., 1991), und für hohe Dosen dieses Moleküls wurde
gezeigt, dass sie segmentale Schäden
der Oberschenkelknochen von Ratten funktionell reparieren (Yasko
et al., 1992). Chen und Kollegen zeigten, dass eine einzige Verabreichung
von 25–100
ng rekombinantem TGF-beta-1 in Nachbarschaft zum Knorpel im Kaninchenohr
eine Bildung von endochondralem Knochen in Wunden durch die volle
Hautdicke induzierte (Chen et al., 1991). Es wurde auch berichtet,
dass eine Verabreichung von TGF-beta-1 in einem 3%igen Methylcellulosegel
zur Reparatur chirurgisch induzierter Schädeldefekte fähig war,
die ansonsten über
fibröses
Bindegewebe heilen und niemals Knochen bilden (Beck et al., 1991).
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Zu
den osteotropen Proteinen gehören
neben dem transforming growth factor der fibroblast growth factor,
der granulocyte/macrophage colony stimulating factor, der epidermal
growth factor, der platelet derived growth factor, der insulin-like
growth factor und der leukemia inhibitory factor.
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Bei
einer Ausführungsform
wird das Gen oder ein anderes Nucleotidmolekül, das für den stimulatorischen Faktor
codiert, und nicht das Protein verabreicht. Zum Beispiel kann das
Nucleotidmolekül
DNA (doppel- oder einzelsträngig)
oder RNA (z. B. mRNA, tRNA, rRNA) sein, oder es kann ein Antisense-Nucleinsäuremolekül sein,
beispielsweise Antisense-RNA, die eine Störung der Genexpression bewirken
könnte,
oder von Wachstumsfaktoren, einschließlich von TGF-beta-1 und -2
und IGF-1. Die Nucleinsäureabschnitte
können
genomische Sequenzen sein, einschließlich von Exons oder Introns
allein oder Exons und Introns, oder codierende cDNA-Bereiche oder
tatsächlich
jedes beliebige Konstrukt, das man einer Knochenvorläuferzelle
oder einem Knochenvorläufergewebe
zuführen
möchte.
Geeignete Nucleinsäureabschnitte
können
auch in praktisch jeder beliebigen Form vorliegen, z. B. als nackte
DNA oder RNA, einschließlich
linearer Nucleinsäuremoleküle und Plasmide,
oder als ein funktionales Insert in den Genomen verschiedener rekombinanter
Viren, einschließlich
von Viren mit DNA-Genomen
und Retroviren.
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II. Verfahren zur Herstellung
der Polymer-Allotransplantat-Verbundmaterialien oder Beschichtungen
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Es
wird eine dreidimensionale Matrix mit einem physischen Erscheinungsbild
und einer mechanischen Stabilität,
die denjenigen von trabekulärem
Knochen ähnlich
sind, unter Verwendung eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen
Polymers gebildet, vorzugsweise in Verbindung mit einem osteokonduktiven,
puffernden Füllstoff,
wie einem Material auf der Basis von Calciumphosphat, um eine poröse, osteokonduktive
Struktur durch das Füllen
von Perforationen im Allotransplantat aus dem teilweise entmineralisierten
kortikalen Knochen mit dem Polymer zu erzeugen. Calciumphosphate
können
dazu verwendet werden, Abbauprodukte der Polymerkomponenten abzupuffern,
so dass es nicht zu einer lokalen Akkumulation von sauren Nebenprodukten
des Abbaus, wie Milchsäure,
kommt. Beispiele für
Polymere, die verwendet werden können,
sind Poly(milchsäure-glycolsäure) [PLGA],
Poly(milchsäure)
[PLA], Poly(glycolsäure)
[PGA], Poly(glaxanon), Poly(orthoester) und Poly(phosphazene). Beispiele
für Materialien
auf der Basis von Calciumphosphat, die verwendeten werden können, sind
HA und TCP.
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Beschichtungen
oder Füllungen
von Knochentransplantaten können
für eine
große
Zahl im wesentlichen intakter oder perforierter Knochentransplantate
verwendet werden, einschließlich
des Oberschenkelknochens, des Kopfes des Oberschenkelknochens, des
distalen Endes des Oberschenkelknochens, des proximalen Endes des
Oberschenkelknochens, des Wadenbeins, des Schienbeins, des Darmbeins,
des Unterkiefers, des Oberarmknochens, der Speiche, der Elle, des
Wirbels, der Rippe, des Schulterblatts, von Fußknochen und von Handknochen,
und zwar vor der anschließenden
Verarbeitung zu kleinen, spezifischen Transplantaten aus zerschnittenem
Knochen, und sie sind für
kleine Transplantate aus zerschnittenem Knochen, einschließlich von
Stücken
des Darmbeinkamms, Dübeln
für die
Cloward-Operation, Rippen, Spongiosablöcken und Wadenbeinstützen verwendbar.
Das Verfahren beinhaltet das Reinigen des Knochentransplantats durch
das Entfernen des Knochenmarks aus dem Interstitialraum und dem
Spongiosaraum großer
Knochentransplantate und das Beschichten oder Füllen über die knorpeligen Enden der
Knochen des gesamten Lumens und Spongiosaraums oder des Inneren
des Spongiosaraums klein geschnittener Transplantate mit einem Polymer.
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Repräsentative
Verfahren schließen
eine Verdampfung des Lösemittels
ein. Das Polymer ist in einem Lösemittel
gelöst.
Beispiele organischer Lösemittel,
die zur Auflösung
des Polymers verwendet werden können,
sind in diesem Gebiet gut bekannt, und zu ihnen gehören Eisessig,
Methylenchlorid, Chloroform, Tetrahydrofuran und Aceton. Knochenproben
für das
Allotransplantat, perforiert und vorzugsweise entmineralisiert, werden
in die Polymerlösung
eingetaucht. Die Polymerlösung
wird durch den Einsatz einer kontinuierlichen Anlegung und Entfernung
eines Vakuums in die Perforationen gezwungen, wobei der ermittelte
Endpunkt für die
Füllung
der Löcher
das Fehlen von aus den Löchern
entweichenden Bläschen
ist. Es wird dann eine Mikrostruktur aus einem Polymerschaum im
Inneren der Perforationen erzeugt, indem der Knochen mit dem Polymer
eingefroren und das Lösemittel
lyophilisiert wird.
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Die
exakte Steuerung der Porengröße im Polymerschaum
korreliert mit einer genauen Steuerung der Porengröße in der
rekonstruierten Knochenmatrix. Die für eine Matrix für den Knochenersatz
gewünschte
Porengröße liegt
zwischen 150 und 250 μm
(Hulbert et al., J. Biomed. Mat. Res. 1970, 4: 443). Dementsprechend ist
die Steuerung der Porengröße des Polymerschaums
ein wichtiger Faktor bezüglich
der Fähigkeit
von Matrices, erfolgreich in Verfahren für den Knochenersatz eingesetzt
zu werden.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
dieser Ausfüllung
der Perforationen wird eine Matrix aus einem Polymer und einem Keramikmaterial
aus einer Mischung einer Polymerlösung mit einem Calciumphosphat hergestellt.
Lösungen
des Polymers werden mit dem Material auf der Basis von Calciumphosphat
gemischt. Der Knochen wird dann in diese Mischung eingetaucht, und
der Verbundkörper
wird eingefroren und lyophilisiert.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird eine Polymerlösung
mit einem osteoinduktiven Material mit einem oder ohne einen puffernden
oder osteokonduktiven Füllstoff
vereinigt. Die Polymerlösungen
werden mit dem osteoinduktiven Mittel mit dem oder ohne den Füllstoff,
wie einem Material auf der Basis von Calciumphosphat, gemischt.
Der Knochen wird dann in diese Mischung eingetaucht, und der Verbundkörper wird
eingefroren und lyophilisiert.
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Bei
noch einer anderen Ausführungsform
wird ein lösemittelgegossenes
Polymer in Form von Mikrokügelchen
hergestellt. Bei diesem Verfahren werden Mikrokügelchen aus dem Polymer mit
Teilchen, die Hohlräume
bilden, und einem Material auf der Basis von Calciumphosphat gemischt.
Ein organisches Lösemittel, das
das Polymer lösen
kann, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrahydrofuran oder Aceton,
wird der Mischung unter Rühren
tropfenweise zugesetzt, so dass die Polymer-Mikrokügelchen
der Mischung aggregieren.
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Alternativ
kann das Implantatmaterial in einer formbaren, kittartigen Form
vorliegen, die letztlich hart wird und imstande ist, normalen physiologischen
Beanspruchungen zu widerstehen. Da das Material in kittartiger Form
vorliegt, sind Implantate dieses Typs im allgemeinen weniger porös. Herkömmliche
Materialien dieses Typs werden als Knochenzemente bezeichnet. Knochenzemente
liegen zwar in einer von selbst aushärtenden, kittartigen Form vor
und haben die erforderlichen mechanischen Eigenschaften, aber sie
sind im allgemeinen nicht resorbierbar und versagen schließlich nach
längerfristiger
Implantation. Durch den Einsatz biologisch abbaubarer, kittartiger
Materialien kann die Dynamik der Knochenresorption und der Bildung
von neuem Knochen nach der Transplantation eines Knochen-Allotransplantats
moduliert und gesteuert werden, und dadurch können Probleme, die mit ihrer
Implantation assoziiert sind, vermieden werden. Dieser schrittweise Abbau
der Matrix innerhalb der Perforationen von Allotransplantaten aus
teilweise entmineralisiertem kortikalem Knochen stellt der Implantationsstelle
eine abnehmende Verstärkung
bereit, was das allmähliche
Einwachsen von neu gebildetem Knochen ermöglicht. Da Knochen ein dynamisches
Gewebe ist, das auf Veränderungen
der Belastung reagiert, stimuliert eine allmähliche Belastung des sich regenerierenden
Knochens die Bildung von weiterem Knochen, ohne dass es zu einer
Schädigung
des Allotransplantats aus dem kortikalen Knochen durch die Belastung
kommt. Somit macht es das Verbundmaterial des Allotransplantats
aus kortikalem Knochen und osteoinduktiven und/oder osteokonduktiven
Polymerfüllungen
dem Implantat möglich,
multifunktionell zu sein. Außerdem
kann die letztliche Geschwindigkeit seiner Inkorporation in den
Knochen des Empfängers
auf der Basis der Abbaugeschwindigkeiten der verwendeten Polymermatrices
möglicherweise
besser vorhergesagt werden.
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Wie
oben festgestellt wurde, können
stimulatorische Faktoren, einschließlich osteoinduktiver und osteokonduktiver
Moleküle,
in oder an das Polymermaterial und/oder den Füllstoff adsorbiert oder an
diese gekoppelt werden. Es können
auch Zellen auf oder in das Transplantat oder die polymere Matrix
gesät werden. Alternativ
können
in einer klinischen Behandlung Zellen in eine Stelle eines Patienten
mit Knochenvorläufergewebe
gegeben und die Zusammensetzung mit dem stimulatorischen Faktor
dieser Stelle zugeführt
werden, um den Transfer des stimulatorischen Faktors in Knochenvorläuferzellen
in vivo zu bewirken oder zu fördern. Bezüglich des
Transfers von stimulatorischen Faktoren in Knochenzellen des Menschen
sieht ein bevorzugtes Verfahren so aus, dass zuerst das stimulatorische
Material zu einer knochenkompatiblen Matrix gegeben wird und dann
die imprägnierte
Matrix dazu verwendet wird, die Perforationen innerhalb des Allotransplantats,
das sich in Kontakt mit einem geeigneten Gewebe befindet, zu füllen.
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Die
folgenden, nicht-limitierenden Beispiele werden gebracht, um die
hier allgemein offenbarten Verfahren und Materialien weiter zu veranschaulichen.
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Beispiel 1: Herstellung
des Polymer-Allotransplantat-Verbundkörpers
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Materialien und Methoden
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Polymere
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Es
wurden drei Typen von PLGA-Polymeren auf der Basis ihrer unterschiedlichen
Abbaugeschwindigkeiten ausgewählt:
Polymere aus Poly(D,L-milchsäure-co-glycolsäure), die
aus Milchsäure
und Glykolsäure
im Molverhältnis
50 : 50 (PLGA 50 : 50), im Molverhältnis 75 : 25 (PLGA 75 : 25)
und im Molverhältnis
100 : 0 (PLA, Poly(70-L-milchsäure-co-30-D,L-milchsäure)) bestanden.
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Lewis
(1990) fasste die Abbauzeiten von Poly(lactid-co-glycoliden) zusammen,
wie es in der folgenden Tabelle 1 dargestellt ist.
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TABELLE
1: Abbaugeschwindigkeiten der Polymere
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Diese
Abbauzeiten stellen Werte für
definierte Formen und Massen dar. Die drei Polymere für dieses Phase-I-Projekt
repräsentieren
einen weiten Bereich von Abbaugeschwindigkeiten, und nominal sollten
sie die Poren des Allotransplantats zu frühen (PLGA 50 : 50), mittleren
(PLGA 75 : 25) und späteren
(PLA) Zeitpunkten öffnen.
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Probenherstellung
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Proben
aus kortikalem Knochen (12 mm × 5
mm × 5
mm) wurden mit einem gepulsten Erbium:YAG-Laser (SEO-Laser 1-2-3,
Schwartz Electro Optics, Concord, Massachusetts) perforiert, der
bei einer Wellenlänge
von 2940 nm arbeitete. Es wurden Löcher mit einem Durchmesser
von 610 μm
durch den gesamten Cortex gebohrt. PLGA 50 : 50 und PLGA 75 : 25
wurden in Eisessig gelöst,
so dass eine Lösung
mit einer Konzentration von 50 mg/ml (5% Gew./Vol.) erhalten wurde.
Das PLA wurde so in Eisessig gelöst,
dass eine Lösung
mit einer Konzentration von 35 mg/ml (3,5% Gew./Vol.) erhalten wurde.
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Die
Polymerlösung
wurde durch den Einsatz einer kontinuierlichen Anlegung und Entfernung
eines Vakuums in die Löcher
gezwungen, wobei der ermittelte Endpunkt das Fehlen von aus den
Löchern
entweichenden Bläschen
war. Es wurden ungefähr
1,5 μl der
Lösung
in jedes Loch gezwungen. Zur Entfernung des restlichen Eisessig-Lösemittels
wurden die Konstrukte aus dem Polymer und dem Knochen dann in einem
Bad aus Isopropanol und Trockeneis (–79°C) eingefroren.
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Das
resultierende gefrorene Konstrukt wurde dann in einen Lyophilisierungskolben
von 300 ml überführt und
für einen
Zeitraum von 48 Stunden an einem Lyophilisator (Labconco, Freezedryer
8) angeschlossen, der bei –40°C und einem
Vakuum von unter 5 mmHg arbeitete. Das führte zur Bildung von Pfropfen
aus Polymerschaum in den mittels des Lasers gebohrten Löchern.
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In-vitro-Verfahren
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Die
Konstrukte aus dem Schaum von PLGA 50 : 50, PLGA 75 : 25 und PLA
und dem Knochen wurden in Röhrchen
von 20 ml gegeben, die 10 ml Phosphat-gepufferte Saline (pH 7,4)
enthielten. Man inkubierte die Röhrchen
dann in einem Wasserbad, das auf 60 Zyklen pro Minute und 37°C eingestellt
war. Die Konstrukte wurden nach 1, 2 und 3 Wochen untersucht. Es
wurden mittels Scanning-Elektronenmikroskopie zu unterschiedlichen
Zeitpunkten Aufnahmen der Oberfläche
gemacht, um das Ausmaß des
Abbaus des Polymers aus den mittels des Lasers gebohrten Löchern in
Abhängigkeit
von der Zeit visuell zu bestimmen. Die Bilder wurden mittels eines
Amray-1000-SEM aufgenommen.
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Ergebnisse
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Die
mittels der Scanning-Elektronenmikroskopie gemachten Beobachtungen
bestätigten
die unterschiedlichen Abbaugeschwindigkeiten der Polymere. Zum Zeitpunkt
0 füllten
die Polymere die gebohrten Löcher
vollständig
aus. Nach einer Woche Inkubation füllte das PLGA 50 : 50 (das
sich am schnellsten zersetzende Polymer) die gebohrten Löcher nur
teilweise aus. Das PLGA 75 : 25 zeigte nach einer Woche einen leichten
Abbau (wie er anhand einer Aufrauung der Oberfläche gesehen wurde), aber das
Polymer füllte
das Loch im wesentlichen noch aus. Das PLA zeigte andererseits nur
einen minimalen Abbau; auf der Oberfläche des Polymers wurde nur
eine leichte Krümmung
beobachtet. Zum Zeitpunkt nach zwei Wochen hatte sich das PLGA 50
: 50 vollständig
zersetzt, und das Loch war praktisch leer, wobei nur leichte Reste
am Rand des Lochs beobachtet wurden. Nach zwei Wochen zeigte das
PLGA 75 : 25 einen teilweisen Abbau; das Loch war zum Teil mit dem
Polymer gefüllt.
Im Vergleich dazu füllte
das PLA das Loch noch aus, und es zeigte sich nur ein leichter Abbau
am Rande des Lochs.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass Verbundkörper
aus dem Polymer und dem Allotransplantat hergestellt worden waren,
wie anhand der adäquaten
Haftung des Polymers am Knochen in den Poren des Allotransplantats
gezeigt wurde.
