DE69908308T2 - Molekular-rechenelemente : gates und flip-flops - Google Patents

Description

• BEREICH DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf innovative Molekularkonstrukte, die als diverse logische Elemente agieren, nämlich als Gatter und Flip-Flops. Diese Konstrukte sind in zahlreichen Zusammenhängen nützlich, zu denen Rechen- und Steuersysteme gehören, die sich jedoch nicht darauf beschränken.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Im Laufe der Geschichte von Recheneinrichtungen ist man von großen und langsamen Einrichtungen auf kleinere und schnellere übergegangen. Diese Entwicklung wurde von enormen Fortschritten begleitet, die mit bedeutenden Veränderungen in der damit verbundenen Technologie Hand in Hand gingen. So hat zum Beispiel eine beachtliche Steigerung der Rechengeschwindigkeiten den Übergang von mechanischen und manuellen Verfahren, wie z. B. Rechentafeln und Registrierkassen oder manuelle Taschenrechner, zu mit Strom betriebenen mechanischen Computern (z. B. elektrische Registrierkassen und Taschenrechner) begleitet. Auf die gleiche Art haben eine starke Geschwindigkeitszunahme und wesentlich geringere Abmessungen den Übergang von mechanischen Einrichtungen zu mit Röhren bestückten elektronischen Computern, sowie den Übergang von mit Röhren bestückten elektronischen Computern zu Transistor-betriebenen elektronischen Computern und schließlich den Übergang von Transistorschaltkreisen zu integrierten Schaltkreisen begleitet, welche anschließend wiederum von großflächig integrierten Schaltkreisen (LSI) abgelöst wurden.
• Die fortlaufende Reduzierung der Abmessungen und Steigerung der Rechengeschwindigkeiten der großflächig integrierten elektronischen Vorrichtungen hat kürzlich Aufsehen und erhöhtes Interesse hinsichtlich der theoretischen und praktischen Grenzen dieses Fortschritts hervorgerufen. Diese theoretischen Grenzen werden durch die systemeigenen Geräusche der elektronischen Systeme, durch die Notwendigkeit, an mit immer geringeren Abmessungsmerkmalen auf immer kleineren Oberflächen der diversen Elemente die Hitze abzuleiten und durch « anomales » Verhalten der Vorrichtungen eingeschränkt, da ihre physische Größe bis zu einem Punkt abnimmt, an dem eher quantenmechanische als makroskopische Eigenschaften dominieren. (Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass das Aufkommen von quantenmechanischen Eigenschaften bei einer geringen charakteristischen Größe Grundlage für Quanten-Recheneinrichtungen und dieses Gebiet von höchstem Interesse sein könnte). Praktische Grenzen werden durch die mit einer vorhersehbaren und zuverlässigen Mikrofertigung verbundenen Kosten und Schwierigkeiten gesetzt.
• Ein weiterer Ansatzpunkt der Rechenleistungs- und/oder Effizienzsteigerung hat die Ablösung « linearer » Rechensysteme, bei denen ein einziger Prozessor nacheinander die zu einer Berechnung erforderlichen Operationen ausführt, durch ein „paralleles" Rechensystem bedingt, in dem die Komponenten jeder Berechnung an zwei oder mehr Bearbeitungselemente verteilt werden. Parallele Rechensysteme können die Rechendauer erheblich verkürzen. Zum Beispiel kann ein parallel an 100 Rechenelementen ausgeführter Algorithmus ca. 100 mal so schnell erfolgen wie derselbe Algorithmus, der nur an einem Element ausgeführt wird, das jede Operation nacheinander bearbeiten muss. Selbstverständlich erreicht der reelle Effizienzgewinn nicht 100, da es zu einem Zeitverlust während der Aufteilung des Algorithmus zwischen den einzelnen Rechenelementen und auch während der Integration der Elemente kommt und da es sein kann, dass bestimmte Elemente warten müssen, bis andere Elemente ihre Berechnung abgeschlossen haben, bevor die nächste Operation beginnen kann. Trotzdem waren massiv parallele Systeme dazu in der Lage Probleme zu lösen (z. B. Identifizieren großer Primzahlen), die in der Praxis an linearen Rechensystemen nicht gelöst werden konnten.
• Die Verbindung beider Ansatzpunkte, d. h. der massive Parallelismus in Verbindung mit einer geringen Größe der Rechenelemente, war der Grundstein für den Bereich des molekularen Rechnens. Diese Idee wird im Referenzartikel von Adleman (1994) Science 266: 1021–1024 dargestellt. Darin wurden molekulare biologische Tools verwendet, um ein Beispiel des gerichteten Hamilton-Pfad-Problems zu lösen. Insbesondere hat Adleman das Problem (einen gerichteten Graphen) in Nucleinsäuresequenzen codiert, dann eine Reihe von Ligationen durchgeführt, die schließlich eine codierte Lösung hervorgebracht haben, die anschließend decodiert werden konnte. Gemäß Schneider (1991) J. Theoret. Biol., 148: 125 zog Adleman in Erwägung, dass derartige Molekularsysteme mit einem Maximum von 34 × 10¹⁹ Operationen je Joule eine beachtliche Energieeffizienz aufweisen könnten, während traditionelle Supercomputer höchstens 10¹⁹ Operationen je Joule ausführen.
• Adleman räumte ein, dass die DNA-Molekularberechnung gewisse Schwierigkeiten und Grenzen birgt, insbesondere hinsichtlich dem Codieren einzelner Probleme und dass herkömmliche elektronische Computer einen Vorteil in Hinsicht auf die Vielfalt der zu erbringenden Operationen und die Flexibilität haben, mit der diese Operationen umgesetzt werden können. Er hat jedoch auch darauf hingewiesen, dass für manche wirklich komplexe Probleme, wie das gerichtete Hamilton-Pfad-Problem, für die bestehende elektronische Computer sehr unwirksam sind und für welche massiv parallele Suchvorgänge organisiert werden können, um die von der Molekularbiologie gelieferten Operationen zu nutzen, derartige Molekularberechnungen von Vorteil sein können.
• Wie von Adleman gezeigt, lag eine der Einschränkungen der vorausgehenden Molekularrechensysteme in mangelnder Operationsvielfalt und Flexibilität, mit der die Operationen angewendet werden können.
• Durch das Dokument nach dem Stand der Technik von J. WATSON « Recombinant DNA – A short course », SCIENTIFIC AMERICAN BOOKS/W. H. FREEMAN AND COMPANY, 1983, XP002108084, Seiten 45–54 ist auch bekannt, dass sich ein Enzym (z. B. RNA-Polymerase) an eine als Promoter bezeichnete DNA-Stelle binden und so durch Transkription die Synthese eines vorbestimmten organischen Moleküls starten kann (z. B. β-gal mRNA). Das Dokument stellt im Übrigen dar, dass wenn sich ein Repressor an die als Operator bezeichnete DNA-Stelle bindet, dies sterisch das besagte Enzym daran hindert, sich an den besagten Promoter zu binden, wodurch die Transkriptionssynthese nicht starten kann.
• Das Vorhandensein eines Induktors (z. B. Lactose) kann den Repressor daran hindern, sich an den Operator zu binden, indem sich der besagte Induktor an den Repressor bindet und so den Start der Transkriptionssynthese ermöglicht. In diesem Dokument wird auch dargestellt, dass sich die Operator- und die Promoterstelle auf dem DNA-Doppelstrang „in der Nähe" bzw. „ganz nah beieinander" befinden.
• Ein anderes Dokument nach dem Stand der Technik, nämlich R. SCHLIEF « Molecular recognition : Feeling for the bumps », NATURE, Vol. 325, 1. Januar 1987 (01-01-1987), Seiten 14–15, XP002108081 stellt dar, dass es in einer DNA-Sequenz eine Vielzahl von « eng verbundenen » Bindungsstellen geben kann, z. B. die drei Operatorstellen O_R3, O_R2, O_R1, an die sich zwei Proteine – z. B. Cro und ein Repressor – auf kompetitive Weise binden können. Jedes dieser beiden Proteine kann sich ausnahmslos an alle besagten Bindungsstellen binden. Allerdings haben diese zwei Proteine mit bestimmten, unterschiedlichen Stellen unter diesen Bindungsstellen stärkere Affinitäten und binden sich vorzugsweise an bestimmte, unterschiedliche Stellen unter diesen Bindungsstellen.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung wird in den beiliegenden Patentansprüchen definiert und behebt eine gewisse Anzahl dieser Einschränkungen, indem sie molekulare logische Vorrichtungen vorschlägt, die auf ähnliche Weise funktionieren wie ihre elektronischen Gegenstücke und eine breite Operationsvielfalt ermöglichen. So schlägt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsweise molekulare bistabile Elemente (Flip-Flops) und eine große Zahl von logischen Elementen (Gatter) wie z. B. UND-, ODER, NICHT-UND, NICHT-ODER, NICHT-Gatter und andere vor.
• Das zentrale Operationselement dieser Vorrichtungen ist eine Nucleinsäure mit zwei oder mehr Proteinbindungsstellen (z. B. eine erste Proteinbindungsstelle und eine zweite Proteinbindungsstelle). Die Stellen sind so angeordnet, dass wenn die erste Proteinbindungsstelle spezifisch durch ein Protein gebunden ist, die zweite Bindungsstelle nicht von einem Protein gebunden werden kann, das ansonsten die zweite Bindungsstelle erkennt und sich spezifisch daran bindet; und wenn die zweite Bindungsstelle spezifisch durch ein Protein gebunden ist, die erste Bindungsstelle nicht von einem Protein gebunden werden kann, das ansonsten die erste Bindungsstelle erkennt und sich spezifisch daran bindet. Folglich schließen sich die Bindungsstellen also gegenseitig aus. Bei der Nucleinsäure kann es sich um eine einsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure handeln. Doppelsträngige Nucleinsäuren (z. B. DNA) werden allerdings vorgezogen. Die erste und zweite Bindungsstelle können die gleichen oder unterschiedliche Nucleotidsequenzen haben. In einer bevorzugten Ausführungsart sind die erste und zweite Bindungsstelle identisch und besitzen die in der vorliegenden Beschreibung aufgeführte Nucleotidsequenz SEQ ID N°1.
• Die Bindungsstellen können so gewählt werden, dass sie spezifisch von einem beliebigen der hier beschriebenen nucleinsäurebindenden Proteine (z. B. Fis, modifiziertes EF-tu, Tus und LexA) erkannt (gebunden) werden können.
• Wie vorausgehend erläutert, werden die Bindungsstellen so voneinander beabstandet, dass sie sich gegenseitig ausschließen (es kann nur jeweils eine einzige gebunden sein). Vorzugsweise liegt die erste Bindungsstelle weniger als 20 Nucleotide (Basenpaare) von der zweiten Bindungsstelle entfernt, noch besser ist, wenn sie weniger als 15 Basenpaare entfernt ist und am besten ist es, wenn sie 11 oder noch weniger Basenpaare von der zweiten Bindungsstelle entfernt ist. Die bevorzugten Bindungsstellen haben, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Kraft von mindestens 2,4 Bit. Der Kraftunterschied zwischen den beiden Stellen beträgt, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, mindestens 0 Bit.
• Das « Flip-Flop » kann darüber hinaus eine oder mehrere selektive Bindungsstellen (z. B. eine dritte Proteinbindungsstelle) umfassen. In diesem Fall befindet sich die selektive Bindungsstelle in der Nähe der ersten oder der zweiten Proteinbindungsstelle, sodass die spezifische Bindung der dritten Bindungsstelle (z. B. mit einem Protein) die Bindung des spezifischen Proteins der ersten oder zweiten Proteinbindungsstelle verhindert.
• In einer bevorzugten Ausführungsweise umfasst das Flip-Flop die oben beschriebene Nucleinsäure, bei der die erste Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist, die zweite Proteinbindungsstelle ebenfalls eine Fis-Bindungsstelle ist und die Bindungsstellen durch weniger als 12 Nucleotidbasenpaare voneinander getrennt sind. In einem besonders bevorzugten Flip-Flop ist die Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure, welche die in der vorliegenden Ausführung beschriebene SEQ ID N°2 oder SEQ ID N°3 umfasst.
• In einer anderen Ausführungsart sieht die vorliegende Erfindung die in der vorliegenden Ausführung beschriebenen unterschiedlichen logischen Gatter (NICHT-ODER, ODER, NICHT, UND, NICHT-UND) vor. Die grundlegende Einheit dieser Gatter ist das NICHT-ODER-Gatter. In einer Ausführungsart ist das NICHT-ODER-Gatter eine Zusammensetzung aus einer isolierten Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 5 Basenpaaren und einer Nucleotidsequenz, die Für eine erste Proteinbindungsstelle, eine zweite Proteinbindungsstelle und eine dritte Proteinbindungsstelle codiert, wobei die Proteinbindungsstellen so in Nähe zueinander angeordnet sind, dass wenn die erste Proteinbindungsstelle oder die dritte Proteinbindungsstelle spezifisch durch ein nucleinsäurebindendes Protein gebunden ist, die zweite Bindungsstelle nicht durch ein nucleinsäurebindendes Protein gebunden werden kann, das ansonsten die zweite Bindungsstelle erkennt und sich spezifisch daran bindet und dass die erste und dritte Proteinbindungsstelle gleichzeitig spezifisch durch ein nucleinsäurebindendes Protein gebunden sein können. Das NICHT-ODER-Gatter kann sich in einem Zustand befinden, in dem die erste oder dritte Bindungsstelle durch ein nucleinsäurebindendes Protein (z. B. Fis oder ein beliebiges der in der vorliegenden Ausführung beschriebenen Bindungsproteine) gebunden ist und so auf den HIGH-Zustand eingestellt ist. Ebenso kann die zweite Bindungsstelle durch ein nucleinsäurebindendes Protein gebunden werden, jedoch nicht wenn die erste oder zweite Bindungsstelle gebunden ist.
• Das an der zweiten Bindungsstelle gebundene Bindungsprotein kann an einen Aktivator (z. B. ein Gen-Transaktivator wie Gal4) gebunden sein. Außerdem kann das NICHT-ODER-Gatter zudem ein Gen oder eine cDNA unter der Kontrolle des Aktivators umfassen. Das Gen oder die cDNA können praktisch jedes beliebige Strukturprotein codieren. So kann in einer Ausführungsweise das Gen ein Reporter-Gen (z. B. FFlux, GFP, usw.) sein oder in einem anderen Ausführungsbeispiel kann das Gen für ein nucleinsäurebindendes Protein codieren. Dies stellt eine Methode zur Verfügung, um den Ausgang eines Gatters oder eines Flip-Flops mit dem Eingang desselben Gatters oder Flip-Flops oder mit dem Eingang eines anderen Gatters oder Flip-Flops zu koppeln.
• Wie bei oben beschriebenem Flip-Flop kann in einem Ausführungsbeispiel die zugrundeliegende Nucleinsäure eine doppelsträngige Nucleinsäure sein (eine DNA zum Beispiel). Die drei Bindungsstellen mit dem NICHT-ODER-Gatter können alle unterschiedlich sein (in diesem Fall sind keine Selektoren erforderlich, obwohl diese wahlweise vorhanden sein können). In einer alternativen Ausführung können die erste und dritte Bindungsstelle dieselbe Nucleotidsequenz besitzen (d. h. dasselbe Protein mit der gleichen Kraft binden); in diesem Fall wirkt das NICHT-ODER-Gatter als ein NICHT-Gatter (wenn I₁ = I₂, NICHT-ODER(I₁,I₂)=NICHT(I₁)). In einer anderen Ausführungsweise können die erste oder die dritte Bindungsstelle und die zweite Bindungsstelle die gleiche Nucleotidsequenz haben. Die Bindungsstellen können so gewählt werden, dass sie für jedes einzelne Bindungsprotein verwandte Bindungsstellen bilden. Die bevorzugten Abstände zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle und zwischen der zweiten und dritten Bindungsstelle entsprechen den weiter oben angegebenen.
• Die bevorzugten Bindungsstellen haben, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Bindungskraft von mindestens 2,4 Bit. In einem Ausführungsbeispiel beträgt der Kraftunterschied zwischen der ersten und dritten Stelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, mindestens 0 Bit. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die erste Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle und die dritte Proteinbindungsstelle ebenfalls eine Fis-Bindungsstelle (z. B. die Bindungsstelle der SEQ ID N°1).
• In einer anderen Ausführungsart schlägt die vorliegende Erfindung eine Verbindung zum Speichern von binären Informationen vor. Die bevorzugte Speicherverbindung umfasst ein beliebiges der vorausgehend beschriebenen Flip-Flops mit einem nucleinsäurebindenden Protein, das an der ersten Proteinbindungsstelle oder an der zweiten Proteinbindungsstelle gebunden ist. Die zugrundeliegende Nucleinsäure kann an einem ihrer Enden oder an beiden Enden Restriktionsstellen, vorzugsweise an jedem Ende unterschiedliche Restriktionsstellen aufweisen. Die Restriktionsstellen sind vorzugsweise so situiert, dass wenn die neben einer Restriktionsstelle liegende Bindungsstelle durch ein Bindungsprotein besetzt ist, eine Ligase nicht in der Lage ist, den Paarungsstrang zu dieser Restriktionsstelle zu verknüpfen.
• Die Speicherverbindung kann in freier Form in einer Lösung oder auf einem festen Träger fixiert vorliegen. Das Bindungsprotein kann auf kovalente Art an die zugrundeliegende Nucleinsäure gebunden sein. Das Bindungsprotein kann auf vorausgehend beschriebene Art an einen Gen-Transaktivator fixiert sein. Zudem kann, wie vorausgehend beschrieben, die Speicherverbindung ein oder mehrere Gene oder cDNAs einschließen, die vorzugsweise der Kontrolle des Aktivators unterliegen.
• In einem wieder anderen Ausführungsbeispiel schlägt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Informationsspeicherung vor. Dabei wird ein nucleinsäurebindendes Protein an eine erste Proteinbindungsstelle einer Nucleinsäure mit einem beliebigen der vorausgehend beschriebenen Flip-Flops oder an einer Nucleinsäure mit einem der in der vorliegenden Ausführung beschriebenen Gatter gebunden. Bei dieser Methode kann auch der Schritt zur Anwendung kommen, bei dem bestimmt wird, welche Bindungsstelle an der Nucleinsäure durch das besagte Bindungsprotein gebunden wird.
• Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Methode zur Umwandlung binärer Informationen. Dabei wird ein nucleinsäurebindendes Protein an eine Eingangs-Proteinbindungsstelle an einem beliebigen oder mehreren der in der vorliegenden Ausführung beschriebenen Gatter gebunden und bestimmt, ob sich ein nucleinsäurebindendes Protein an einer Ausgangs-Proteinbindungsstelle binden kann oder nicht. Die Ausgangs-Bindungsstelle kann sich am gleichen oder an einem anderen Gatter befinden. Sie kann sich auch an derselben oder an einer anderen Nucleinsäure befinden. In einer bevorzugten Ausführungsweise hat eine zu diesem Zweck ein Gatter umfassende Nucleinsäure eine Länge von mindestens 3 Basenpaaren, vorzugsweise eine Länge von mindestens 5 Basenpaaren, noch besser eine Länge von mindestens 7 Basenpaaren und am besten eine Länge von mindestens 22 Basenpaaren.
• DEFINITIONEN
• Die Begriffe « Polypeptid », « Peptid » und « Protein » werden in der vorliegenden Ausführung als Synonyme verwendet und bezeichnen ein Polymer aus Aminosäureresten. Die Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste künstliche chemische Analoga einer entsprechenden natürlichen Aminosäure sind, sowie für natürliche Aminosäurepolymere.
• Der Begriff « Nucleinsäure » bezeichnet ein Polymer aus einsträngigen oder doppelsträngigen Desoxyribonucleotiden bzw. Ribonucleotiden und falls nicht anderslautend, umfasst er auch die bekannten Analoga natürlicher Nucleotide, die ähnlich wie natürliche Nucleotide funktionieren können. Der Begriff schließt auch die wie in « Peptid »-Nucleinsäuren über Peptidverbindungen gebundene Nucleotide ein.
• Der wie in der vorliegenden Ausführung benutzte Ausdruck « bindet sich spezifisch » bezeichnet, wenn er sich auf eine Bindung eines Proteins oder eines Polypeptids an eine Nucleinsäure bezieht, eine Protein-/Nucleinsäure-Wechselwirkung, bei der sich das Protein stark an ein spezifisches Nucleinsäuresequenzprofil (Nucleotidsequenz) und nicht so stark an andere, sich unterscheidende Nucleinsäureprofile bindet (z. B. weist in einem Gel-Shift Assay eine spezifische Bindung eine starke Migration auf dem Gel im Vergleich zur Gelmigration desselben Proteins mit anderen, sich unterscheidenden Nucleinsäuresequenzen der gleichen Länge auf).
• Der Ausdruck « nucleinsäurebindendes Protein » wird hier zur Bezeichnung eines Proteins verwendet, das sich im Bereich einer besonderen Nucleotidsequenz spezifisch an eine Nucleinsäure bindet. Die nucleinsäurebindenden Proteine umfassen DNA-bindende, mRNA-bindende, tRNA-bindende Proteine sowie Proteine, die spezifisch modifizierte oder ansonsten Nicht-Standard-Nucleinsäuren wie oben beschrieben binden. Nucleinsäurebindende Proteine umfassen, beschränken sich jedoch nicht auf DNA-bindende Proteine wie Fis, Lacl, lambda cl, lambda cro, LexA, TrpR, ArgR, AraC, CRP, FNR, OxyR, IHF, GaIR, MalT, LRP, SoxR, SoxS, Sigma-Faktoren, chi, T4 MotA, P1 RepA, p53, NF-kappa-B und RNA-bindende Proteine bzw. Protein/RNA-Komplexe wie Ribosome, T4 regA, Spleißosome (Spender und Empfänger), PolyA-Bindungsfaktor und ähnliche. Eine große Anzahl von nucleinsäurebindenden Proteinen wird in der TransFac-Datenbank (ftp://transfac.gbf-braunschweig.de/pub/transfac/ascii/, siehe auch Nucleic Acids Res. (25(1)265–268 (1997)) beschrieben.
• Eine « Proteinbindungsstelle » bezeichnet eine Nucleotidsequenz in einer Nucleinsäure, an die sich ein bestimmtes nucleinsäurebindendes Protein spezifisch bindet.
• Die Ausdrücke «verwandtes Protein » oder « verwandte Bindungsstelle » bezeichnen jeweils das Protein, das sich spezifisch an die Bindungsstelle bindet bzw. die durch ein bestimmtes Bindungsprotein spezifisch gebundene Bindungsstelle.
• Eine « Blocker »-, « Selektor »- oder « Modulator »-Bindungsstelle bezeichnet eine Gruppe, welche, wenn sie neben, in der Nähe oder an einer Bindungsstelle gebunden ist, das Binden dieser Stelle durch ihr verwandtes nucleinsäurebindendes Protein teilweise oder vollständig blockiert.
• Der Begriff « Flip-Flop » bezeichnet eine bistabile Vorrichtung, die in einem oder dem anderen der sich gegenseitig ausschließenden Zustände vorliegt. So hat das molekulare Flip-Flop dieser Erfindung zwei Bindungsstellen, von denen nur jeweils eine gebunden sein kann.
• Der Begriff « Gatter » wird zur Bezeichnung einer Vorrichtung verwendet, die einen bestimmten (vorbestimmten) Ausgang als Antwort für einen oder mehrere Eingänge produziert. So erzeugt zum Beispiel ein UND-Gatter nur dann einen HIGH-Ausgang, wenn alle Eingänge HIGH sind. Ein ODER-Gatter erzeugt einen HIGH-Ausgang, wenn irgendein Eingang HIGH ist und nur dann einen LOW-Ausgang, wenn alle Eingänge LOW sind. Eine NICHT-Funktion liefert ein HIGH, wenn der Eingang LOW ist und ein LOW, wenn der Eingang HIGH ist. Gatter und ihre Anwendungen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe zum Beispiel Horowitz and Hill (1990) The Art of Electronics, Cambridge University Press, Cambridge).
• Der Begriff « Zustand » wird zur Bezeichnung des Signalzustands einer bestimmten Bindungsstelle eines Flip-Flops oder eines logischen Gatters der vorliegenden Erfindung verwendet. Man bezeichnet eine an ein Protein gebundene bzw. eine dazu fähige Bindungsstelle als HIGH, während eine nicht gebundene und nicht zur Bindung durch ein Bindungsprotein fähige Bindungsstelle als LOW bezeichnet wird.
• Der Begriff « Eingang » wird in der vorliegenden Ausführung zur Bezeichnung einer Bindungsstelle angewendet, an der ein Signal angewendet werden kann, um einen Ausgang zu erzeugen. Der Begriff « Eingang » kann auch das Signal selbst bezeichnen (zum Beispiel ein Signalpolypeptid). Die Differenzierung kann anhand des Anwendungszusammenhangs gemacht werden. Der Ausdruck « Eingangs-Bindungsstelle » bezeichnet eine als Eingang angewendete Proteinbindungsstelle.
• Der Begriff « Ausgang » wird in der vorliegenden Ausführung zur Bezeichnung einer Bindungsstelle verwendet, die zur Bindung mit ihrem verwandten Protein als Folge eines Eingangs-Bindungsereignisses oder Ereignisse befähigt bzw. dazu unfähig gemacht wurde. Der Begriff Ausgang kann sich auch auf den Zustand der Ausgangs-Bindungsstelle beziehen. Der Ausgang kann ein Eingang für ein anderes Gatter oder Flip-Flop dieser Erfindung sein.
• Ein « Signalprotein » ist ein nucleinsäurebindendes Protein, das den (logischen) Zustand eines molekularen Flip-Flops oder eines molekularen Gatters dieser Erfindung einstellt. Wie hier beschrieben, stellt das Binden eines Signalproteins an eine Proteinbindungsstelle an einer Nucleinsäure den Zustand dieser Bindungsstelle auf HIGH um. Ein Signalprotein kann auch verwendet werden, um den Zustand des Flip-Flops oder Gatters abzulesen. Im letzteren Fall bezeichnet man den Zustand des Ausgangs, wenn das Protein zum Binden einer Ausgangs-Bindungsstelle fähig ist (d. h. die Bindungsstelle ist nicht blockiert), als HIGH. Wenn dagegen die Ausgangs-Bindungsstelle blockiert ist, bezeichnet man den Zustand als LOW.
• Der Ausdruck « Einstellen des Zustands » bezeichnet, wenn er sich auf eine Bindungsstelle bezieht, das selektive Binden oder Lösen eines Signalproteins an einer bestimmten Bindungsstelle. Wenn das Signalprotein an der Bindungsstelle gebunden wird, wird der Zustand dieser Bindungsstelle auf HIGH gestellt. Wenn dagegen das Signalprotein von der Stelle gelöst wird, wird der Zustand auf LOW gestellt. In Bezug auf ein Flip-Flop entspricht das Einstellen des Zustands dem Einstellen des Flip-Flops auf einen der sich gegenseitig ausschließenden stabilen Zustände. So kann der erste Zustand eingestellt werden, indem ein Signalprotein an die erste Bindungsstelle gebunden wird, während der zweite Zustand eingestellt werden kann, indem ein Signalprotein an die zweite Bindungsstelle gebunden wird. Da sich die beiden Zustände gegenseitig ausschließen, bedingt das Einstellen des Zustands einer Stelle automatisch die Einstellung (oder Umschaltung) des Zustands der anderen Stelle.
• Der Begriff « Reinitialisieren des Zustands » bezeichnet die Zustandsänderung (z. B. von HIGH auf LOW oder von LOW auf HIGH) einer Eingangs-Bindungsstelle, einer Ausgangs-Bindungsstelle oder eines Flip-Flops.
• Der Begriff « GTPase-ähnliches » Protein bezieht sich auf ein Bindungsprotein, das eine gebundene Nucleinsäure durch Dissipation der Energie (z. B. Hydrolyse einer Energiequelle wie GTP, ATP usw. oder Lichtzufuhr) lösen kann. Ein derartiges Freisetzen kann eventuell durch zusätzliche Anwendung eines Cofaktors erreicht werden. Ein GTPase-ähnliches Protein schließt natürliche GTPase-ähnliche Proteine (inklusive GTPasen) sowie modifizerte und nicht natürliche GTPase-ähnliche Proteine ein.
• Eine « rekombinante Expressionskassette » oder einfach eine « Expressionskassette » ist ein Nucleinsäuregebilde, das auf rekombinante Weise oder durch Synthese hergestellt wird und Nucleinsäureelemente aufweist, die dazu fähig sind, die Expression eines oder mehrerer Strukturgene in mit derartigen Sequenzen kompatiblen Wirten zu modifizieren. Die Expressionskassetten umfassen zumindest Promotoren und wahlweise Transkriptionsendsignale. Üblicherweise umfasst die rekombinante Expressionskassette eine zu transkribierende Nucleinsäure (z. B. eine Nucleinsäure, die für ein gewünschtes Polypeptid codiert) und einen Promoter. Wie aus der vorliegenden Ausführung hervorgeht, können auch zusätzliche erforderliche oder nützliche Faktoren zur Expression verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Expressionskassette auch Nucleotidsequenzen umfassen, die eine Signalsequenz codieren, welche die Sekretion eines von der Wirtzelle exprimierten Proteins steuert.
• Eine « logische Kassette » bezeichnet eine Expressionskassette, in der die Expression eines oder mehrerer Gene der Kontrolle eines oder mehrerer molekularer Gatter bzw. Flip-Flops der vorliegenden Erfindung unterliegt.
• Der Ausdruck « Expression unter Kontrolle von », weist darauf hin, wenn er sich auf ein logisches Element bezieht (z. B. ein Gatter oder Flip-Flop), dass die Zustandsänderungen) (Eingang und/oder Ausgang) des Gatters bzw. des Flip-Flops den Expressionsgrad des oder der kontrollierten Gene modifiziert(en).
• Auf gleiche Weise bezeichnet ein « operationell gebundenes >> oder « kontrolliertes » Gen eines Aktivators ein Gen, dessen Expression durch die An- bzw. Abwesenheit eines bestimmten Aktivators modifiziert wird.
• Ein « angehängter Aktivator » bezeichnet einen Gen-Aktivator (z. B. Gal4), der direkt oder über einen Linker an ein nucleinsäurebindendes Protein (LexA zum Beispiel) gebunden ist. Das Anhängen kann durch chernisches Konjugieren oder durch rekombinante Expression eines Hybridproteins erfolgen. In manchen Fällen kann anstatt des Aktivators ein Repressor verwendet werden. Der Begriff „angehängter Aktivator" schließt diese Möglichkeit ein.
• Der in der vorliegenden Ausführung angewendete Ausdruck « Bindungskraft » bezeichnet die, wie durch die individuelle Informationstheorie (z. B. wie in Schneider (1997) J. Theoret. Biol., 189(4) : 427–441 beschrieben) berechnete bzw. durch die Bindungsenergie (-ΔG) gemessene Bindungskraft.
• Die Begriffe « isoliert », « gereinigt » oder « biologisch rein » beziehen sich auf ein Material, das größtenteils bzw. im wesentlichen frei von Komponenten ist, die es normalerweise im natürlichen Vorkommen begleiten. Im Fall einer Nucleinsäure ist eine isolierte Nucleinsäure normalerweise frei von Nucleinsäuresequenzen, von denen sie in der Natur umgeben ist. Eine isolierte Nucleinsäure kann wieder in eine Zelle eingeführt werden, wobei diese „heterologen" Nucleinsäuren in der vorliegenden Ausführung als isoliert betrachtet werden. Außerdem werden de novo synthetisierte oder durch Klonen (z. B. rekombinante DNA-Technologie) erzeugte Nucleinsäuren als „isoliert" betrachtet.
• Der Begriff « Sequenzlogo » bezeichnet eine grafische Methode zur Anzeige der Profile in einer Reihe von gerade ausgerichteten Sequenzen. Die für die Sequenz stehenden Zeichen werden für jede Position in den gerade ausgerichteten Sequenzen übereinander gestapelt. Die Höhe jedes Buchstabens ist proportional zu seiner Frequenz, wobei die Buchstaben so sortiert werden, dass der häufigste obenauf liegt. Die Höhe des gesamten Stapel wird anschließend justiert, um den Informationsinhalt der Sequenzen an dieser Position anzuzeigen. Ausgehend von diesen « Sequenzlogos » kann nicht nur die Konsensus-Sequenz definiert werden, sondern auch die relative Frequenz der Basen und des Informationsinhalts (in Bit gemessen) an jeder Position einer Stelle oder einer Sequenz. Das Logo zeigt sowohl signifikante Rückstände als auch diskrete Sequenzprofile auf. Die Sequenzlogos werden im Detail in Schneider & Stephens (1990) Nucl. Acids Res., 18: 6097–6100 und Schneider (1996) Meth. Enzym., 274: 445–455 beschrieben.
• Der Begriff « Sequenz-Walker » bezieht sich auf eine grafische Methode zur Visualisierung der Wechselwirkung zwischen Bindungsproteinen und anderen Makromolekülen mit einzelnen Basen von Nucleotidsequenzen. Die Sequenz darstellenden Zeichen sind entweder normal ausgerichtet und über einer Linie angeordnet, die einen günstigen Kontakt bedeutet, oder auf den Kopf gestellt und unterhalb einer Linie angeordnet, die einen ungünstigen Kontakt bedeutet. Die positive bzw. negative Höhe jedes Buchstabens zeigt, wie durch ein Sequenzlogo dargestellt, den Beitrag dieser Base zur durchschnittlichen Sequenzkonservierung der Bindungsstelle auf. Diese Sequenz-« Walker » können entlang der rohen Sequenzdaten aufgestellt werden, um auf visuelle Art Bindungsstellen zu finden. Viele Walker können gleichzeitig für gleiche oder unterschiedliche Proteine neben einer Sequenz angeordnet werden, um eine quantitative Darstellung einer komplexen genetischen Region zu bilden. Man kann die Sequenz modifizieren, um mehr Bindungsstellen zu schaffen. Anomalien der Datenbank können gesichtet werden, indem ein Walker an den für ein Bindungsmolekül aufgezeichneten Positionen angebracht und dies mit den Stellen verglichen wird, die man durch Scannen der benachbarten Sequenzen findet. Die Sequenz kann auch modifiziert werden, um vorauszusagen, ob eine Änderung ein Polymorphismus oder eine Mutation für die als Modell genommene Erkennungssequenz bedeutet. Die Berechnung und Anwendung der « Sequenz-Walker" wird in Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415 und in der am 23. Juni gemeinsam eingereichten Patentanmeldung USSN 08/494,115 beschrieben. Die mathematischen Grundlagen der Walker werden von Schneider (1997) J. Theor. Biol. 189(4): 427–441 gegeben.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Die 1a und 1b stellen die beiden Zustände eines molekularen Flip-Flops in der Grundausführung dar. Die waagrechte Linie steht für eine Nucleinsäure, während die Kästchen BS1 und BS2 die Proteinbindungsstellen darstellen. Die mit BP1 und BP2 bezeichneten Kreise stellen die Bindungsproteine dar, die sich jeweils an BS1 und BS2 binden. Die Bindungsstellen sind so angeordnet, dass wenn BP1 an BS1 gebunden ist, BS2 nicht besetzt sein kann. Umgekehrt kann BS1 nicht besetzt sein, wenn BP2 an BS2 gebunden ist. BS1 und BS2 können Proteinbindungsstellen gleicher oder unterschiedlicher Art sein (d. h. sich an unterschiedliche Proteine binden). Ebenso können BP1 und BP2 Bindungsproteine gleicher oder unterschiedlicher Art sein. Die Kreise S₁ und S₂ stellen die fakultativen « Selektions »-Bindungsstellen dar, die, wenn sie gebunden sind, BS1 und BS2 blockieren und somit das selektive Einstellen des Flip-Flop-Zustands ermöglichen.
• 2 stellt das Lesen eines Flip-Flops unter Anwendung eines Nucleinsäure-Lesemolekül und eine Ligationsreaktion dar. Das Flip-Flop wird mit zwei Lesemolekülen inkubiert, von denen eines ein komplementäres Ende zu einem der Enden der Flip-Flop-Nucleinsäure und das andere ein komplementäre, Ende zum anderen Ende der Flip-Flop-Nucleinsäure aufweist. Unter Hybridisierungsbedingungen binden sich die Lesemoleküle an die jeweiligen Enden der Nucleinsäure des Flip-Flops. Dann erfolgt eine Ligasereaktion. Das gebundene nucleinsäurebindende Protein (in 2 Fis) blockiert den Zugang der Ligase zur Stelle neben der gebundenen Bindungsstelle (in 2 BS1) und verhindert somit die Verknüpfung dieses Lesemoleküls. Das andere Lesemolekül wird mit Erfolg mit der Nucleinsäure verknüpft und gibt ein Signal ab, das angibt, welche Bindungsstelle nicht blockiert war.
• 3 zeigt ein molekulares NICHT-ODER-Gatter, ein NICHT-Gatter, das Aktivieren eines Gens unter der Kontrolle eines Gatters, eine Signalkoppelung zwischen zwei Gatter und ein molekulares ODER-Gatter. Das Gatter A wirkt als einfaches NICHT-ODER-Gatter, wobei der Ausgang O₁, wie in der vorliegenden Ausführung beschrieben, eine NICHT-ODER-Antwort für die Eingänge I₁ und I₂ abgibt. Das Gatter B, an dem I₃ und I₄ identisch sind, wirkt als molekulares NICHT-Gatter, wobei O₂, wie in der vorliegenden Ausführung beschrieben, eine NICHT-Antwort für die Eingänge I₃ et I₄ abgibt. Das Gatter A stellt auch die Regulierung der Expression eines Gens dar. Wenn der Ausgang O₁ HIGH ist, kann sich das Protein BP1 an diese Stelle binden. Dies verankert den angehängten Aktivator (A), der dann die Expression des Gens aktiviert. In 3 exprimiert das Gen ein Bindungsprotein, das sich spezifisch an I₃ oder I₄ des Gataers B binden kann, was die Koppelung des Ausgangs des Gatters A mit dem Eingang des Gatters B verdeutlicht. Der Ausgang des Gatters B (O₂) erzeugt ein ODER als Ansprechen der Eingänge (I₁ oder I₂) des Gatters A. Eine beliebigte der dargestellten Bindungsstellen kann wahlweise auch mit einem Selektormolekül vorliegen.
• 4 zeigt ein UND-Gatter und ein NICHT-UND-Gatter. Zwei NICHT-ODER-Gatter – die Gatter A und B – bilden Eingänge für ein drittes NICHT-ODER-Gatter (Gatter C). Dies erzeugt einen Ausgang im Bereich von O₃, welcher eine UND-Funktion der Eingänge an den Gattern A und B (I₁ und I₂) bildet. Die Umkehrung des UND-Signals durch das NICHT-Gatter D bewirkt ein NICHT-UND am Ausgang O₄ als Ansprechen der Eingänge I₁ und I₂. Die Eingangs-Stellen der Gatter A, B und D sind identisch ; diese NICHT-ODER-Gatter wirken also als einfache Umrichter.
• 5a zeigt ein vereinfachtes UND-Gatter, in dem dieselbe Bindungsstelle sowohl als Eingang als auch als Ausgang für die Gatter A und B wirkt.
• 5b zeigt ein zweites vereinfachtes UND-Gatter mit fünf Proteinbindungsstellen. Das UND-Gatter wird mit einem angehängten Bindungsprotein dargestellt, das ein Gen aktiviert.
• 6 zeigt ein reinitialisierbares Flip-Flop, bei dem GTPase-ähnliche Proteine zum Einsatz kommen. Das Flip-Flop besteht aus einer Nucleinsäure mit 4 Bindungsstellen, die mit c, a₁, b und a₂ bezeichnet werden. Die Stelle kann durch σ_x gebunden werden, einem nucleinsäurebindenden Protein. Die σ-Proteine sind GTPase-ähnliche Proteine, welche nach Auslösung die Nucleinsäure freisetzen. Die Proteine enthalten auch einen GAP-Finger, der die Freisetzung des anliegenden σ-Proteins auslösen kann, jedoch nicht seine eigene Freisetzung. Das Protein σ_c bindet sich anschließend an die Stelle c und bewirkt aufgrund seines GAP-Fingers die Entfernung eines σ_a an der Stelle a₁. So bleibt nur σ_a an der Stelle a₂ gebunden, wenn das Flip-Flop mit σ_a in Kontakt gebracht wird. Das Flip-Flop ist somit an der Stelle a₂ stabil. Um seinen Zustand zu ändern, wird das Flip-Flop mit σ_b in Kontakt gebracht, welches sich an die Stelle b bindet und so zur Entfernung von σ_a führt, wobei das Flip-Flop auf stabile Art an der Stelle b gebunden bleibt, was dem zweiten Zustand des Flip-Flops entspricht. Das Flip-Flip kann in den Zustand a zurückversetzt werden, indem man es mit σ_a in Kontakt bringt, das sich an die Stellen a₁ und a₂ bindet. Die Stelle a₁ bleibt für einen ausreichend langen Zeitraum gebunden, um die Freisetzung von σ_b zu bewirken, bevor das Molekül σ_a durch σ_c entfernt wird. Dies lässt das Flip-Flop in den Zustand a zurückversetzt, wobei die Stelle a₂ durch σ_a gebunden ist. Der Zyklus kann bis ins Unendliche wiederholt werden.
• 7 zeigt die Ähnlichkeit von Fis-Bindungsstellen untereinander. Das Sequenzlogo für Fis (Schneider & Stephens (1990) Nucl. Acids Res., 18: 6097-6100; Hengen et al. (1997) Nucl. Acids Res., 25(24): 4994–5002) ist dreimal dargestellt. Die oberen und unteren Logos sind um +11 und +7 Basen in Bezug auf das mittlere Logo nach rechts versetzt. Die Kosinus-Kurve mit einer Wellenlänge von 10,6 Basen zeigt an, dass die vergleichsweise um +11 versetzten Fis-Stellen sich auf der gleichen DNA-Seite befinden würden, während die vergleichsweise um +7 versetzten Fis-Stellen auf den gegenüberliegenden Seiten lägen. Die Pfeile befinden sich an Stellen, an denen das Logo sieh nach einer Verschiebung selbst ähnelt. Die nach unten gerichteten Pfeile bedeuten, dass die Kontakte durch Fis mit den Basen sich behindern würden, da sie sich auf der gleichen DNA-Seite befinden würden. Die Pfeile nach oben bedeuten, dass die Kontakte gleichzeitig sein könnten, da sie sich auf den gegenüberliegenden Seiten befinden.
• Die 8a, 8b und 8c zeigen das Oligonucleotidprofil von sich überlappenden und getrennten Fis-Bindungsstellen. Die vorgesehenen Fis-Stellen sind durch unter jeder DNA-Sequenz laufende Walker dargestellt (Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415 ; Hengen et al. (1997) supra.). In einem Walker zeigt das senkrechte Kästchen die Nullbasis der Bindungsstelle. Das Kästchen gibt auch den senkrechten Maßstab an, dessen Obergrenze bei +2 Bit: und Untergrenze bei –3 Bit liegt. Die Höhe jedes Buchstabens wird ausgehend vom Bitwert in der Riw (b, l)-Matrize bestimmt (Schneider (1997) J. Theoret, Biol, 189(4): 427–441 ; Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415 ; Hengen et al. (1997) supra.). Negativwerte werden durch auf den Kopf gestellte und unterhalb des dem 0-Bit entsprechenden Bereichs liegende Buchstaben dargestellt. Es wurden drei DNAs erstellt mit jeweils zwei Fis-Stellen, die 11, 7 und 23 Basen voneinander entfernt sind. Die Entwurfdetails werden im Beispiel 1, Material und Methoden, aufgeführt. Die Gesamtkraft einer Stelle ist die Summe der Informationsgewichte jeder Base. Die 18,1 Bit-Fis-Stellen liegen um 3,4 Standardabweichungen höher als eine durchschnittliche Fis-Stelle in natürlichen Sequenzen (Hengen et al. (1997) supra.; Schneider (1997) J. Theoret. Biol., 189(4): 427–441). Die 12,7 und 15,0 Bit-Stellen liegen um 1,6 und 2,4 Standardabweichungen (jeweils) über dem Durchschnitt.
• 9 stellt die Mobility-Shift-Experimente für Fis-Stellen auf, die sich mit 11 und 7 Basenpaaren überlappen bzw. um 23 Basenpaare getrennt sind. Jedes Band enthält steigende Konzentrationen an Fis-Protein, wobei ganz ohne Fis begonnen wird, anschließend wird Fis mit 1 : 64 verdünnt usw. Die 1 : 1 Verdünnung entspricht 2200 nM Fis. Diese Konzentration wurde bewusst so gewählt, damit mit 1 nM DNA je Reaktion das Protein-/DNA-Verhältnis doppelt so hoch ist wie zur starken Modifizierung der DNA mit der 8,9 Bit-Wildtyp-hin distalen Fis-Stelle erforderlich ist (Bruist et al. (1987) Genes Dev. 1: 762–772). Die Sequenzen werden in 8 gezeigt. Die Markerspuren (M) enthalten 10 ng biotinylierte durch ϕX174 hinfl verdaute DNA-Kontrolle (Life Technologies, Inc.). Die Größen werden in Basenpaaren (bp) angegeben. Der unterste Streifen bei den meisten Bändern der Figur ist eine einzelsträngige Oligonucleotid-DNA. Im « Separated 23 »-Experiment sind bei hohen Konzentrationen die Fis-Proteine offensichtlich fähig, die einsträngige DNA einzufangen, nachdem sie in Haarnadelform gefaltet wurde. Dies ruft einen kaum sichtbaren Streifen neben dem 100 bp-Marker hervor.
• 10 zeigt die Positionen von Fis- und DnaA-Stellen am Escherichia coli-Replikationsausgangspunkt (oriC). Die Sequenzdaten stammen vom GenBank-Zugang K01789. Die waagrechten Striche unter der Sequenz stellen die durch Fis geschützten Regionen dar. Die Orte der DnaA-Stellen gehen auf Messer et al. (1991) Res. Microbiol, 142: 119–125) zurück. Die asymmetrische DnaA-Einzelinformationsmatrize wurde ausgehend von 27 experimentativ nachgewiesenen DnaA-Bindungsstellen angelegt (Daten nicht dargestellt). Die DNA-Synthese-Startstellen werden durch die unteren Pfeile dargestellt (Seufert & Messer (1987) EMBO J. 6: 2469–2472). Die Kästchen stellen zwei durch 11 Basen getrennte Fis-Stellen dar. Die Fis-Stellen mit positiver Einzelinformation werden mit –7 bis +7 angegeben, jedoch gemäß der Matrize mit –10 bis +10 eingeteilt. Die Richtungsfähigkeit der DnaA-Stelle wird in der Richtung, in der DnaA bindet, durch seitwärts gedrehte Buchstaben angegeben (Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415).
• 11 stellt das Oligonucleotidprofil aus Beispiel 2 dar.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
• Die vorliegende Erfindung schlägt ein innovatives Nucleinsäure-/Protein-Konstrukt vor, das in charakteristischer Weise in einem oder im anderen der beiden sich gegenseitig ausschließenden Zustände vorliegen kann. Im Allgemeinen umfasst das in der vorliegenden Ausführung überall als „Flip-Flop" bezeichnete Konstrukt eine Nucleinsäure mit mindestens zwei Proteinbindungsstellen. Die Bindungsstellen befinden sich in nächster Nähe zueinander, sodass, wenn eine erste Stelle durch ihr verwandtes nucleinsäurebindendes Protein gebunden ist, die zweite Stelle nicht gebunden werden kann (z. B. aufgrund sterischer Behinderungen). Wenn dagegen die zweite Stelle durch ihr verwandtes nucleinsäurebindendes Protein gebunden ist, kann die erste Stelle nicht gebunden werden. So kann das Flip-Flop in zwei möglichen, sich gegenseitig ausschließenden Zuständen vorliegen: es ist entweder die erste Stelle gebunden oder die zweite.
• Es ist klar, dass 2-Zustands-Elemente wie das in der vorliegenden Ausführung beschriebene Flip-Flop den Kern einer Vielzahl von digitalen Datenverarbeitungs- und Steuersystemen bilden. Insbesondere wird in dieser Beschreibung erläutert, dass die Flip-Flops als statische oder dynamische Datenspeicherelemente wirken können (d. h. jedes Flip-Flop wirkt als ein Bit, z. B. in einem Lesespeicher). Außerdem können die Flip-Flops als „logische" Gatter (z. B. UND, ODER, NICHT-UND, NICHT-ODER, NICHT) zusammengefügt werden, die als Rechenelemente wirken oder welche verbunden werden können, um den Zellmechanismus zu steuern (z. B. die Expression eines oder mehrerer Gene). So schlägt die vorliegende Erfindung innovative Methoden zur Regulierung der Genexpression in Zellen vor. Darüber hinaus können die Flip-Flops der vorliegenden Erfindung in sequentiellen logischen Systemen (d. h. als echte reinitialisierbare Flip-Flops) eingesetzt werden, um so ein echtes molekulares binäres Rechen- oder Steuersystem zu bilden.
• I. Flip-Flops, Gatter und deren Anwendungen
• A) Einfache Datenspeicherung : Lesespeicher (ROM)
• Die molekularen Flip-Flops der vorliegenden Erfindung können für eine einfache Datenspeicherung verwendet werden. Da nämlich die molekularen Flip-Flops aus einer Nucleinsäure mit zwei sich gegenseitig ausschließenden Proteinbindungsstellen bestehen, weisen sie drei Einzelzustände auf: keine Bindung vorhanden, erste Stelle gebunden oder zweite Stelle gebunden (siehe z. B. 1a und 1b). Die „Flip-Flops" könnten zum Speichern von in einem Trinärsystem codierten Informationen verwendet werden.
• Aufgrund der allgemeinen Bedeutung, die der Binärspeicherung eingeräumt wird, werden üblicherweise nur zwei Zustände verwendet. Vorzugsweise umfassen diese entweder den gebundenen Zustand im Gegensatz zum ungebundenen Zustand oder Stelle eins gebunden im Gegensatz zu Stelle zwei nicht gebunden (BS1 im Gegensatz zu BS2 in den 1a und 1b). Im ersten Fall könnte der ungebundene Zustand mit null und der gebundene mit eins bezeichnet werden, während im zweiten Fall die erste gebundene Stelle mit null und die zweite Stelle mit eins bezeichnet werden könnten.
• Der Zustand des einzelnen Nucleinsäuremoleküls (nicht gebunden im Gegensatz zu gebunden) oder (Stelle eins im Gegensatz zu Stelle zwei gebunden) oder einer Vielzahl dieser Nucleinsäuremoleküle kann zum Codieren und Speichern von Informationen eingesetzt werden.
• Zum Beispiel kann die Herkunft von Produkten im Molekularbereich markiert werden. Wenn z. B. ein Produkt aus dem Werk A kommt, kann die Stelle eins des Flip-Flops ungebunden sein (zum Beispiel: Zustand 0), während wenn ein Produkt aus dem Werk B kommt, die Stelle eins des Flip-Flops gebunden sein kann (zum Beispiel: Zustand 1). Ein einzelnes Protein /Nucleinsäure-« Flip-Flop » speichert so 1 Bit Information und kann in diesem Beispiel zwei unterschiedliche Herkunftsstandorte anzeigen. Natürlich können viele « Flip-Flops » kombiniert werden, um „Register" zu bilden, die eine nahezu unbegrenzte Informationsmenge codieren.
• Das Lesen kann auf einfache Art mit diversen Mitteln erfolgen. Zum Beispiel wird in einem Ausführungsbeispiel die Flip-Flop-Nucleinsäure mit Restriktionsstellen umfassenden Überhängen enden, wobei jedes Ende eine unterschiedliche Restriktionsstelle umfasst (z. B. einen EcoRI Überhang neben der Bindungsstelle 1 und einen HindIII Überhang neben der Bindungsstelle 2, wie in 2 dargestellt). Anschließend wird das Flip-Flop mit zwei « Lese »-Molekülen in Kontakt gebracht, die ein doppelsträngiges Nucleinsäureende mit entweder einem EcoRI Überhang oder einem HindIII Überhang umfassen. Anschließend wird eine Ligationsreaktion durchgeführt. Die Ligase wird aufgrund der Behinderung durch das Bindungsprotein (z. B. Fis) nicht dazu fähig sein, an der Restriktionsstelle neben der blockierten (gebundenen) Stelle zu reagieren. Hingegen wird die Ligase an der Restriktionsstelle neben der blockierten (gebundenen) Stelle reagieren und dabei das „Lese"-Molekül mit der entsprechenden Restriktionsstelle anfügen. Folglich hängt sich das Lesemolekül, wenn die Bindungsstelle eins gebunden ist, neben der Bindungsstelle zwei an, und wenn die Bindungsstelle zwei gebunden ist, hängt sich das Lesemolekül neben der Bindungsstelle eins an.
• Das Lesemolekül kann durch diverse Mittel detektiert werden. Zum Beispiel können die beiden Lesemoleküle mit unterschiedlichen Markern markiert werden (z. B. fluoreszierende Moleküle unterschiedlicher Farbe). Die Lesemoleküle können wahlweise eine Primer-Stelle einschließen, um die PCR-Amplifikation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz zu vereinfachen, die nur dann amplifiziert wird, wenn das Lesemolekül einwandfrei verknüpft wunde.
• Die Nucleinsäure jedes Flip-Flops kann auch für einen einzigen Identifikator codieren, der angibt, welches Bit im Register oder in der Meldung durch dieses Flip-Flop dargestellt wird. Die PCR-Reaktion kann dazu sowohl die Identität oder die Adresse des Bits und seines Zustands aufzeigen. In einer anderen Ausführungsweise kann die Lesesequenz wahlweise ein Hybridisierungsziel für das Einfangen des Bits auf einem festen Träger liefern (z. B. in einer Kavität in einer Mikrotiterplatte oder PCR-Platte).
• Das Flip-Flop kann in freier Form in Lösung oder auf einen festen Träger verankert vorliegen (z. B. durch eine Biotin-/Streptavidin-Reaktion). Nach der Verankerung kann der Anker so angeordnet werden, dass beide Enden der Nucleinsäure frei sind (z. B. zur Anwendung von zwei Lesemolekülen) oder es wird an einem Ende verankert.
• Wenn ein Ende des Flip-Flops verankert ist, kann das Lesen mit einem einzigen Lesemolekül erfolgen, das eine zum freien Ende komplementäre Restriktionsstelle hat. Eine erfolgreiche Verknüpfung wird anzeigen, dass die Bindungsstelle neben dem freien Ende ungebunden ist, während ein gescheitertes Verknüpfen anzeigen wird, dass die Bindungsstelle neben dem freien Ende besetzt (gebunden) ist.
• In einer anderen Ausführungsart kann der Speicher einfach aus einer Nucleinsäure mit einer einzigen Proteinbindungsstelle und einem einzigen Protein bestehen. In dieser Ausführungsweise zeigt die gebundene Nucleinsäure einen Zustand an, während die ungebundene Nucleinsäure den anderen anzeigt. Dieser Speicher kann, wie in der vorliegenden Ausführung beschrieben, mit zahleichen Mitteln gelesen werden. Auch hier kann in einer bevorzugten Ausführungsweise das Lesen durch eine Ligationsreaktion erfolgen. In diesem Fall kann das Nucleinsäuremolekül eine einzige Restriktionsstelle neben der Proteinbindungsstelle umfassen. Das Molekül wird mit einer Nucleinsäure in Kontakt gebracht, die den komplementären Restriktionsstellen-Überhang besitzt. Anschließend wird, wie in 2 gezeigt, eine Ligationsreaktion durchgeführt. Wenn das Protein gebunden ist, kann die Ligase nicht mit der Restriktionsstelle reagieren, so dass es nicht zu einer Ligationsreaktion kommt. Wenn dagegen die Bindungsstelle nicht gebunden ist, kann die Ligation erfolgen und das angehängte Lesemolekül detektiert werden.
• Nachdem der Zustand des Flip-Flop-Molekularspeichers eingestellt ist, kann der Zustand durch Quervernetzung des nucleinsäurebindenden Proteins und der Nucleinsäure verriegelt werden. Es sind zahlreiche geeignete Quervernetzer für eine derartige Immobilisierung bekannt. Dazu zählen unter anderen Substanzen wie Gluteraldehyd, Avidin-Biotin und ähnliche. Auf diese Weise bildet das Flip-Flop einen « nicht überschreibbaren » Speicher (WORM), der gegenüber Änderungen der Umgebungsbedingungen extrem stabil ist. Wie bereits vorausgehend angedeutet, kann auf diese Weise praktisch jede Art von Information in einer Reihe von „Flip-Flops" codiert und später wieder gelesen werden. Solche Kombinationen von Flip-Flops liefern wertvolle Informationen im Molekularbereich (z. B. Fertigungsort von kontrollierten Substanzen wie Drogen oder Sprengstoff, einzigartige Identifikatoren oder Kennziffern, z. B. Währung, Dokumente usw. und ähnliche).
• Wenn ein Bindungsprotein mit einer hohen Affinität und Stabilität (z. B. Tus) verwendet wird, ist die Meldung relativ stabil und bei einer Querverneztung sehr stabil in Bezug auf extreme Umgebungsbedingungen. Die Meldung wird auch extrem schwer bzw. gar nicht über eine schnelle Beobachtung zu detektieren sein und erfordert die Anwendung des entsprechenden Versuchs (z. B. Ligasereaktion mit den entsprechenden Lesemolekülen) zum Detektieren und/oder Lesen.
• Es ist darauf hinzuweisen, dass in einer bevorzugten Ausführungsweise das Lesemolekül so ausgelegt ist, dass es außer der (den) gewünschten Proteinbindungsstelle(n) keine anderen enthält. Dies kann üblicherweise, wie von Schneider (1997) Nucleic Acids Res., 25: 4408–4415 beschrieben, mit Hilfe von „Sequenz-Walker" bewerkstelligt werden.
• B) Molekulares Rechnen
• 1) Kombinatorische Aufgaben
• In binären Systemen werden binäre Ausgänge oft ausgehend von binären Eingängen erzeugt. Zum Beispiel kann ein Addierer zwei 16 Bit-Zahlen als Eingang nehmen und eine 16 Bit-Summe erzeugen (plus Übertrag). In einer anderen Ausführung kann ein System zwei Zahlen multiplizieren. Eine andere Aufgabe läge darin, zwei Zahlen zu vergleichen, um festzustellen, welche die größere ist, oder eine Reihe von Eingängen mit einem gewünschten Eingang zu vergleichen, um sicherzustellen, dass die Systeme gleichwertig sind. In einer anderen Ausführungsart kann es wünschenswert sein, an eine Zahl ein „Paritäts-Bit" anzuhängen, um die Gesamtzahl der 1 auszugleichen, z. B. vor der Übertragung über eine Datenverbindung. Anschließend könnte die Parität sofort bei Eingang (z. B. spätere Analyse) geprüft werden, indem ganz einfach geprüft wird, ob die Übertragung in Ordnung ist. All diese Aufgaben sind Aufgaben, bei denen der oder die Ausgänge vorbestimmte Funktionen des Eingangs oder der Eingänge sind. Als Gesamtheit sind sie als kombinatorische Aufgaben gekannt.
• Sie können alle mit als Gatter bezeichneten Einrichtungen durchgeführt werden, die die für binäre (zwei Zustände) Systeme geltenden Operationen der Booleschen Algebra ausführen.
• Der wie in der vorliegenden Beschreibung angewendete Begriff „Gatter" bezeichnet eine Vorrichtung, die einen Ausgang, der Funktion eines Eingangs oder mehrerer Eingänge ist, erzeugt. Sowohl Eingang als auch Ausgang sind (ein) HIGH- oder LOW-Signal(e), und in den Molekulargattern der vorliegenden Erfindung werden die Signale durch Signalproteine übertragen (angezeigt), welche in einer bevorzugten Ausführungsart nucleinsäurebindende Proteine sind, die sich an bestimmte Nucleinsäuresequenzen (Bindungsstellen) binden.
• In den molekularen Computern und Steuerungen der vorliegenden Erfindung werden die zwei (binären) Signalzustände entweder durch ein arg einer bestimmten Proteinbindungsstelle an eine Nucleinsäure gebundenes Protein (analog zu elektronischen Systemen als HIGH betrachteter Signalzustand) oder durch eine ungebundene Bindungsstelle (analog zu elektronischen Systemen in der vorliegenden Ausführung als LOW betrachtet) dargestellt.
• Es ist klar, dass der Zustand der diversen Gatter gelesen werden kann und so Informationen bereitstellt (z. B. das Ergebnis eines Rechenschritts) oder zur Steuerung eines Prozesses eingesetzt werden kann. Im letzten Ausführungsbeispiel braucht der Ausgangszustand nicht direkt gelesen zu werden, sondern kann einfach eine AUF-Regulierung nach sich ziehen (z. B. wenn das ausgehende Signalprotein ein Transkriptionsfaktor/-enhander ist) oder eine AB-Regulierung (z. B. wenn das ausgehende Signalprotein ein Repressor ist) eines oder mehrerer Gene sein. Die Gatter können auch gestapelt werden, so dass der Ausgang eines Gatters als Eingang für ein anderes Gatter wirkt (z. B. aktiviert ein Gatter die Transkription eines proteinbindenden Moleküls (Signalmolekül), das als Eingang des folgenden Gatters wirkt).
• Gatter sind dem Fachmann gut bekannt. Basis-Gatter umfassen ein UND-Gatter, ein ODER-Gatter und einen Umrichter (NICHT-Funktion). Andere Gatter umfassen die NICHT-ODER (NOR)-Gatter, NICHT-UND (NAND), ausschließliches ODER (XOR)-Gatter und so weiter. Eine ausführliche Beschreibung der Gatter ist z. B. in Horowitz and Hill (1990) The Art of Electronics, Cambridge University Press, Cambridge zu finden.
• Erstellen und Anwenden des NICHT-ODER-Gatters werden nachfolgend beschrieben. Im Allgemeinen gilt, dass das NICHT-ODER-Gatter zum Erstellen aller anderen Gattertypen verwendet werden kann und somit zur Bereitstellung eines funktionsfähigen Computers ausreicht. Die Anwendung des NICHT-ODER-Gatters zur Herstellung der NICHT-, ODER-, UND- und NICHT-UND-Gatter wird im Anschluss beschrieben. Unter Anwendung der hier aufgeführten Grundlagen können nach Wunsch andere Gatter erstellt werden.
• al NICHT-ODER-Gatter
• Der Ausgang eines NICHT-ODER-Gatters ist nur dann HIGH (zur Bindung an ein Protein fähig), wenn die beiden Eingänge LOW (nicht gebunden) sind. Dies kann in einer wie in Tabelle 1 abgebildeten „Wahrheitstabelle" dargestellt werden. In den hier aufgeführten Wahrheitstabellen beziehen sich die Eingänge und Ausgänge auf bestimmte vorab ausgewählte Bindungsstellen auf einer zugrundeliegenden Nucleinsäure. Die Eingänge werden als HIGH angesehen, wenn sie durch ein nucleinsäurebindendes Protein (z. B. Fis, Lacl, lambda cl, lambda cro, LexA, TrpR, ArgR, AraC, CRP, FNR, OxyR, IHF, GaIR, MalT", LRP, SoxR, SoxS, Sigma-Faktoren, chi, T4 MotA, P1 RepA, p53, NF-kappa-B, Ribosome, T4 regA, Spleißosome (Spender und Empfänger), PolyA-Bindungsfaktor und ähnliche) gebunden sind, das in der vorliegenden Ausführung auch aus « Signalprotein » bezeichnet wird. Sie gelten als LOW, wenn sie nicht auf diese Weise gebunden sind. Die Ausgänge werden als in einem HIGH-Zustand angesehen, wenn sie gebunden sind oder zu einer Bindung durch ein nucleinsäurebindendes Protein fähig sind. (Eine Stelle, die zur Bindung durch ein Polypeptid fähig ist, kann als HIGH gelesen werden, da das Signalprotein unter Umständen abgegeben wird, unter denen es zu einer Bindung kommt, wenn der Zustand der Stelle HIGH ist und anschließend das gebundene Protein detektiert wird). Im Gegensatz dazu werden die Ausgänge als LOW angesehen, wenn sie nicht gebunden sind oder nicht durch ein nucleinsäurebindendes Protein gebunden werden können (d. h. das Protein, das diese Bindungsstelle erkennt und sich spezifisch daran bindet). Eine „1" in den hier aufgeführten Wahrheitstabellen entspricht dem HIGH-Zustand, während eine „0" denn LOW-Zustand entspricht.
• Tabelle 1

  
• Wie in Tabelle 1 dargestellt, ist der Ausgang des NICHT-ODER-Gatters nur dann HIGH, wenn beide Eingänge LOW sind. Wenn mehr als zwei Eingänge vorhanden sind, ist das NICHT-ODER-Ausgangsgatter nur dann HIGH, wenn alle Eingänge LOW sind. Wenn einer der Eingänge auf den HIGH-Zustand eingestellt ist, ist der Ausgang des NICHT-ODER-Gatters LOW.
• Ein Beispiel eines molekularen NICHT-ODER-Gatters der vorliegenden Erfindung wird in 3 dargestellt. Ein bevorzugtes molekulares NICHT-ODER-Gatter umfasst eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens drei Proteinbindungsstellen, zwei peripheren « Eingangs »-Bindungsstellen (als I₁ und I₂ in 3 bezeichnet), die eine „Ausgangs"-Bindungsstelle (in 3 mit O₁ bezeichnet) einschließen. Die Proteinbindungsstellen sind derart beabstandet, dass wenn die eine oder andere Eingangsstelle (I₁ oder I₂) gebunden ist, nämlich durch ein Signalprotein, das gebundene Protein ein nucleinsäurebindendes Protein (z. B. ein zweites Signalprotein) daran hindert, sich an der mittleren „Ausgangs"-Bindungsstelle (O₁) zu binden.
• Unter diesen Umständen sind die Bedingungen der Tabelle 1 erfüllt. Wenn eine der beiden Eingangs-Proteinbindungsstellen an ein Protein gebunden ist, kann die Ausgangs-Proteinbindungsstelle nicht gebunden werden. Die einzige Bedingung, unter der der Ausgang HIGH ist (die Ausgangsstelle kann gebunden werden), ist, wenn beide Eingänge LOW (nicht gebunden) sind.
• Es versteht sich, dass in diesem Gatter sowie in anderen in der vorliegenden Beschreibung aufgeführten Gattern die Proteinbindungsstellen so gewählt werden können, dass sie sich an die gleichen oder an unterschiedliche Proteine binden. Wenn sich allerdings mehrere Stellen an dasselbe Protein binden (oder vom selben erkannt werden), existiert vorzugsweise ein „Selektions"-Mechanismus, der den Stellen ermöglicht (z. B. den beiden Eingängen), vom Bindungsprotein differenziert werden zu können. In einer bevorzugten Ausführungsweise kann der Selektor ein zweites Molekül sein (z. B. ein DNA-bindendes Protein, das in gebundenem Zustand die Bindung eines Proteins an den jeweiligen Eingangs- oder Ausgangs-Bindungsstellen blockiert). Wenn an jeder Stelle unterschiedliche Selektionsmoleküle vorhanden sind, können die Signalmoleküle einfach zu dem bestimmten Ort geleitet werden, indem die richtigen Selektoren angewendet werden.
• In einem Ausführungsbeispiel bindet jeder Eingang spezifisch ein anderes Bindungsprotein und der Ausgang bindet ein drittes, wieder anderes Bindungsprotein. Alternativ können die beiden Eingänge den gleichen Typ Bindungsprotein binden, während der Ausgang ein unterschiedliches Protein bindet. In diesem Fall können nur zwei Selektoren erforderlich sein, z. B. ein Selektor an jedem Eingang, um anzuzeigen, ob I₁ oder I₂ (oder I₃... wenn mehrere Eingänge vorhanden sind) gebunden ist. Nach dem Bindungsschritt des Eingangs kann also das Lesebindungsprotein hinzugefügt werden, wobei für die Ausgangs-Bindungsstelle kein Selektor mehr erforderlich ist. Ausgehend von der vorherigen Erklärung werden vom Fachmann auf geläufige Art andere Kombinationen gleicher oder unterschiedlicher Bindungsproteine und/oder Selektoren gewählt werden können. Es ist darauf hinzuweisen, dass in einer bevorzugten Ausführungsweise die Eingangs- und/oder Ausgangs-DNAbindenden Proteine Lacl, lambda cl, lambda cro, LexA, TrpR, ArgR, AraC:, CRP, FNR, OxyR, IHF, GaIR, MalT, LRP, SoxR, SoxS, Sigma-Faktoren, chi, T4 MotA, P1 RepA, p53, NF-kappa-B einschließen, sich jedoch nicht darauf beschränken, während die bevorzugten Eingangs- und/oder Ausgangs-RNA-bindenden Proteine Ribosome, T4 regA, Spleißosome (Spender und Empfänger), PolyA-Bindungsfaktor und ähnliche einschließen, sich jedoch nicht darauf beschränken.
• Es versteht sich, dass diese und weitere nucleinsäurebindenden Proteine auch als Selektor wirken können. Alternativ können die Selektoren derart modifizierte Restriktionsendonucleasen sein, dass sie die gebundene Nucleinsäure binden, jedoch nicht durchschneiden. Die Auswahl und/oder die Bildung von DNA-Bindungsproteinen und/oder Selektoren wird nachfolgend in Teil II beschrieben.
• b) Koppeln des NICHT-ODER-Gatters mit einem anderen Gatter
• Wie bereits vorausgehend erläutert, ist es bei der Konzeption diverser Gatter und weiterentwickelterer molekularer Rechenschaltkreise oft wünschenswert, den Ausgang eines Gatters mit dem Eingang eines anderen Gatters zu koppeln. Genauer gesagt wirkt der Ausgang eines Gatters als Eingang eines anderen oder mehrerer anderer Gatter.
• Zum Beispiel kann der Ausgang eines NICHT-ODER-Gatters als Eingang eines NICHT-ODER-Gatters wirken, um ein ODER-Gatter zu erzeugen. In diesem Fall wird der von zwei Eingängen (I₁ und I₂) erzeugte Ausgang (O₁) algebraisch wie folgt dargestellt: O1 = ODER (I1, I2) = NICHT(NICHT-ODER(I1, I2))
• Das Koppeln des Ausgangs eines Gatters (oder Flip-Flops) mit dem Eingang eines anderen Gatters (oder Flip-Flops) kann auf diverse Arten erfolgen. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsweise eine einzige Bindungsstelle sowohl als Ausgang eines Gatters und als Eingang eines anderen Gatters wirkten. In einer bevorzugten Ausführungsweise wird jedoch in der Regel bevorzuge, dass der Ausgang eines Gatters oder Flip-Flops und der Eingang eines anderen Gatters oder Flip-Flops unterschiedliche Bindungsstellen umfassen. In diesem Fall können die logischen Elemente (Gatter oder Flip-Flops) die Expression eines Signalmoleküls (Bindungsprotein) regulieren, welches als Eingang an einem bzw. mehreren logischen Elementen wirkt.
• Ein die Expression eines Bindungsproteins regulierendes Gatter wird in 3 dargestellt. Obwohl diese Figur ein NICHT-ODER-Gatter darstellt, das die Expression eines Gens reguliert, kann dies im Wesentlichen mit einem beliebigen Gatter erfolgen.
• Wie in 3 gezeigt, erfolgt das Ablesen des NICHT-ODER-Gatters, indem die Ausgangs-Bindungsstelle (0₁ in 3) mit einem angehängten Aktivator in Kontakt gebracht wird. Der angehängte Aktivator umfasst ein Bindungsprotein, das sich spezifisch an die Ausgangs-Bindungsstelle (O₁ zum Beispiel) binden kann, die (direkt oder über einen Linker) an einen Genaktivator angehängt ist (z. B. Gal4, siehe zum Beispiel Ptashne (1985) Cell 43(3) : 729-736). Wenn die Ausgangs-Bindungsstelle auf HIGH eingestellt ist (z. B. indem die beiden Eingänge des in 3 dargestellten NICHT-ODER-Gatters auf LOW eingestellt sind), bindet das Bindungsprotein des angehängten Aktivators an die Ausgangs-Bindungsstelle. Dadurch wird der Aktivator verankert, der anschließend die Transkription eines Gens unter der Kontrolle des Aktivators aktiviert.
• Das Gen codiert für ein Bindungsprotein (Signalmolekül), das sich nach seiner Expression an die Eingangs-Bindungsstellen anderer logischer Elemente (z. B. Gatter oder Flip-Flops) binden kann und damit den Eingang/die Eingänge auf HIGH setzt. Wenn die Ausgangsstelle auf LOW eingestellt ist, kann sich der angehängte Aktivator nicht anbinden und es kommt zu keiner Transkription. Es wird kein Signalprotein exprimiert und der bzw. die Eingänge von „nachgeschalteten" logischen Elementen bleibt/bleiben auf LOW. Somit koppelt die durch logische Elemente regulierte Expression eines Signalmoleküls (Bindungsprotein) den Ausgang eines logischen Elements mit dem Eingang eines anderen logischen Elements.
• Es ist wohl bekannt, dass die Verankerung eines angehängten Aktivators die Aktivierung eines Gens exprimieren kann. Dies wurde zum ersten Mal von Ptashne (1985) Cell 43(3): 729–736 nachgewiesen, der gezeigt hat, dass GAL4, ein Saccharomyces cerevisiae transkriptioneller Aktivator, der an ein LexA – einem Escherichia coli Repressorprotein – angehängt ist, die Transkription eines Gens aktivieren kann, wenn und nur wenn ein LexA-Operator (eine Bindungsstelle zur Verankerung des Konstrukts) in der Nähe der Transkriptionsstartstelle vorhanden ist. Auf ähnliche Weise wurde nachgewiesen, dass zahlreiche andere angehängte Aktivator-/Bindungsprotein-Konstrukte die Transkription aktivierten (siehe z. B. Silverman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11665–11668, Chrivia et al. (1993) Nature, 365: 855–859, und Pfisterer et al. (1995) Biol. Chem., 270(50): 29870–29880).
• Das Koppeln kann ebenfalls mit dem entgegengesetzten „Zeichen" erfolgen. In dieser Ausführungsart kann das für das Bindungsprotein codierende Gen auf konstitutive Art aktiv sein. In diesem Fall kann der Ausgang des logischen Elements durch einen angehängten Repressor gebunden sein, der in gebundenem Zustand die Genexpression stoppt. Nachdem das Bindungsprotein vom System ausgeschieden ist, gehen die vorausgehend gebundenen (HIGH) Eingangsstellen wieder in einen LOW-Zustand über. In einer bevorzugten Ausführungsweise erfolgt das Koppeln logischer Elemente jedoch unter Anwendung von Aktivatoren, um das ungewünschte und unbeabsichtigte Ausscheiden des Signalproteins durch einen in der Lösung freien Repressor zu vermeiden.
• c) Umrichterfunktion (NICHT)
• Eine zweite wichtige kombinatorische logische Funktion ist die Umrichter- bzw. NICHT-Funktion. Die NICHT-Funktion erzeugt die Ergänzung eines logischen Levels. Die NICHT-Funktion wird durch die Wahrheitstaballe in Tabelle 2 dargestellt.
• Tabelle 2

  
• Eine NICHT-Funktion erzeugt einen LOW-Signalzustand, wenn der Eingang HIGH ist und einen HIGH-Signalzustand, wenn der Eingang LOW ist. Im Zusammenhang eines molekularen Umrichters verhindert das Binden eines Proteins an einen Eingang (wodurch der Eingang in einen HIGH-Zustand versetzt wird) das Binden eines Proteins an der Ausgangs-Bindungsstelle (wodurch der Ausgang in einen LOW-Zustand versetzt wird).
• Die Untersuchung der Tabelle 1 zeigt, dass ein NICHT-ODER-Gatter, in dem beide Eingänge gleich sind, zu einem NICHT-Gatter wird (Umrichterfunktion). So ist, wenn beide Eingänge auf HIGH eingestellt sind, der Ausgang eines NICHT-ODER-Gatters auf LOW, und umgekehrt, wenn beide Eingänge auf LOW eingestellt sind, ist der Ausgang des NICHT-ODER-Gataers auf HIGH.
• In 3 wird eine Ausführungsweise des NICHT-Gatters durch das Gatter B dargestellt. Bei diesem Gatter entsprechen die beiden Eingänge der gleichen Bindungsstelle und es wird kein Selektor verwendet, um zu steuern, welche der beiden Stellen spezifisch gebunden wird.
• Wenn ein Eingangs-Bindungsprotein (BP3 in 3) vorhanden ist, sind I₃ und/oder I₄ gebunden und stehen auf HIGH. Die Ausgangsstelle (O₂) ist blockiert und befindet sich daher auf LOW. Wenn dagegen kein Eingangs-Bindungsprotein (BP3) vorhanden ist, sind weder I₃ noch I₄ gebunden und daher auf LOW eingestellt. Die Ausgangsstelle (O₂) ist frei und kann also gebunden werden. Der Ausgang steht also auf HIGH. Das Gatter B entspricht also der in Tabelle 2 dargestellten Wahrheitstabelle.
• Auch wenn das NICHT-Gatter wie ein ODER-Gatter dargestellt ist, in dem die Einstellung der Eingänge gleich ist, wird deutlich, dass einer der Eingänge im Wesentlichen ohne Funktionsänderung eliminiert werden kann. Wenn zum Beispiel der Eingang 3 (I₃) eliminiert wird, führt ein LOW-Eingang 4 (I₄) immer zu einem HIGH-Ausgang und umgekehrt. Beide Eingänge können nämlich eliminiert werden und eine einzige Stelle kann als Eigen-NICHT angesehen werden. In diesem Fall wird es allerdings schwierig, den Eingang vom Ausgang zu unterscheiden, außer die Signal- und Leseschritte sind deutlich zu unterscheiden (zum Beispiel, wenn sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten stattfinden oder dabei unterschiedliche Eingangs- und Lesemoleküle verwendet werden).
• In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das NICHT-Gatter ein NICHT-ODER-Gatter mit zwei gleichen Eingangs-Bindungsstellen (I₁ und I₂). Die Anwendung von zwei Eingangsstellen erhöht die Wahrscheinlichkeit, ein Eingangssignal zu detektieren, wenn die Konzentration des Signalproteins gering ist.
• d) ODER-Gatter
• Ein NICHT-ODER-Gatter ist im Wesentlichen ein umgekehrtes ODER-Gatter. Dies trifft auch in umgekehrter Richtung zu. Wenn man also den Ausgang eines NICHT-ODER-Gatters durch ein NICHT-Gatter führt, erhält man ein ODER(Gatter). Algebraisch wird dies wie folgt zum Ausdruck gebracht: O1 = NICHT(NICHT-ODER(I1, I2)) = ODER(I1, I2)
• Ein ODER-Gatter zeichnet sich durch die in Tabelle 3 abgebildete Wahrheitstabelle aus.
• Tabelle 3

  
• In der Regel erzeugt ein ODER-Gatter einen HIGH-Ausgang (die Ausgangs-Proteinbindungsstelle ist für eine Bindung frei oder durch ein Signalprotein gebunden), wenn ein beliebiger Eingang oder alle Eingänge HIGH sind (Bindungsstellen sind gebunden).
• Ein molekulares ODER-Gatter wird in 3 dargestellt, in der ein NICHT-ODER-Gatter einen Ausgang (BP3) zu einem NICHT-Gatter speist. Der Ausgang des NICHT-Gatters (O₂) ist ein NICHT-ODER der Eingänge I₁ und I₂ des ODER-Gatters (Gatter A). Das NICHT-ODER-Gatter reguliert die Expression eines Gens, wie bereits vorausgehend beschrieben. Das Gen codiert ein Bindungsprotein (BP3 in 3), das sich spezifisch an den einen oder anderen der beiden Eingänge (BS3 in 3) eines NICHT-Gatters bindet. Wenn einer der Eingänge oder beide des ersten NICHT-ODER-Gatters (Gatter A) auf einen HIGH-Zustand eingestellt sind, ist der Aktivator nicht an den Ausgang gebunden und es kommt zu keiner Aktivierung des Gens. Der Eingang des NICHT-Gatters (Gatter B) ist auf LOW eingestellt, wodurch der Ausgang auf HIGH steht. Wenn dagegen die beiden Eingänge des NICHT-ODER-Gatters nicht gebunden sind (LOW), kann sich der Transaktivator (A) an O₁ verankern und damit die Aktivierung des Gens bewirken, das ein Bindungsprotein (BP3 in 3) erodiert. Das Bindungsprotein versetzt den bzw. die Eingänge des NICHT-Gatters in einen HIGH-Zustand, was an O₂ zu einem LOW-Ausgang führt. So ist die einzige Voraussetzung, unter der O₂ LOW ist, dass weder der eine noch der andere der Eingänge (I₁ oder I₂) HIGH ist. Dies stimmt mit der in Tabelle 3 dargestellten Wahrheitstabelle überein.
• Wie weiter oben bereits erläutert, kann wahlweise einer der Eingänge bzw. beide der NICHT-Funktion (Gatter B in 3) eliminiert werden. Insbesondere wenn das NICHT-Gatter einen Eingang für ein anderes Gatter bzw. andere Funktion bildet, indem ein zweiter Transaktivator verankert wird, können beide Eingänge eliminiert werden. Wenn also die zwei Eingänge zum Gatter A (I₁ und I₂) auf LOW stehen, wird das Bindungsprotein BP3 exprimiert, bindet es sich an die einzige Stelle (O₂) und verhindert dadurch die Verankerung des zweiten Transaktivators.
• e) UND-Gatter
• Der Ausgang eines UND-Gatters ist nur dann HIGH (zur Bindung an ein Protein fähig), wenn beide Eingänge HIGH sind. Ein UND-Gatter kann ausgehend von NICHT-ODER-Gattern wie folgt gebildet werden: UND(I1,I2)=NICHT-ODER(NICHT-ODER(I1,I1), NICHT-ODER(I2,I2))
• Dies kann in einer wie in Tabelle 4 abgebildeten „Wahrheitstabelle" zum Ausdruck gebracht werden. Wie bereits vorausgehend beschrieben, beziehen sich die Eingänge und Ausgänge auf besondere vorab ausgewählte Proteinbindungsstellen.
• Tabelle 4

  
• Ein UND-Gatter der vorliegenden Erfindung wird in 4 dargestellt. Das UND-Gatter besteht aus drei NICHT-ODER-Gattern (vorausgehend beschrieben). Die beiden ersten NICHT-ODER-Gatter (Gatter A und B in 4) akzeptieren jeweils die Eingänge I₁ und I₂. Es ist erkennbar, dass in jedem NICHT-ODER-Gatter zwei Eingangs-Bindungsstellen gleich sind, so dass die NICHT-ODER-Gatter in Wirklichkeit als NICHT-Funktionen wirken. Wenn die Eingänge der NICHT-ODER-Gatter auf LOW eingestellt sind, bindet sich ein Bindungsprotein (BP1 in 4) an die Ausgangsbindungsstelle(n) (O₁ und/oder O₂), wodurch ein Transaktivator verankert wird, der ausgehend von jedem ODER-Gatter (BP4 und/oder BP3 in 4) die Transkription von Bindungsproteinen aktiviert. Die Bindungsproteine wirken dann als Eingänge im dritten Gatter (Gatter C). Die einzige Voraussetzung, unter der der Ausgang (O₃) des dritten NICHT-ODER-Gatters HIGH ist, ist, wenn beide Eingänge I₁ und I₂ des Gatters A HIGH sind, was zu keiner Transkription von BP4 oder BP3 führe. Dies entspricht den Bedingungen der Tabelle 4.
• Obwohl das UND-Gatter in 4 als Reihe von NICHT-ODER-Gattern dargestellt ist, da die beiden Gatter A und B in Wirklichkeit NICHT-Funktionen sind, kann in manchen Ausführungsarten einer der Eingänge bzw. beide eliminiert werden. So kann das UND-Gatter, wie in 5a dargestellt, auf eine Einheit von fünf Bindungsstellen reduziert werden. In diesem Fall ist es jedoch vorzuziehen, für die Eingänge unterschiedliche Bindungsstellen zu verwenden, um sie unterscheiden zu können.
• Ein weiteres vereinfachtes UND-Gatter wird in 5b dargestellt. Dieses UND-Gatter besteht ebenfalls aus fünf Proteinbindungsstellen. Jedes Paar anliegender Bindungsstellen kann als Flip-Flop wirken (d. h. die ein Paar bildende Stellen schließen sich gegenseitig aus). Wenn einer der Eingänge I₁ und I₂ bzw. beide ungebunden sind (LOW), kann sich ein Bindungsprotein an die Stelle(n) BS2 binden. Wenn eine der Stellen BS2 gebunden ist, ist die Stelle BS3 blockiert, so dass sich O₁ folglich in einem LOW-Zustand befindet. Die einzige Voraussetzung, unter der BS3 auf HIGH eingestellt werden kann, ist gegeben, wenn beide Eingänge I₁ und I₂ gebunden sind. Dann bindet sich kein Protein an BS2, und BS3 (O₁) ist frei (HIGH).
• f) NICHT-UND-Gatter
• Der Ausgang eines NICHT-UND-Gatters wird in Tabelle 5 dargestellt. Das NICHT-UND-Gatter ist im Wesentlichen ein umgekehrtes UND-Gatter. Dieses Gatter erzeugt nur dann einen LOW-Ausgang, wenn sich beide Eingänge in einem HIGH-Zustand befinden.
• Tabelle 5

  
• Ein molekulares NICHT-UND-Gatter der vorliegenden Erfindung ist in 4 dargestellt. Wie bereits erläutert, bilden die Gatter A, B und C ein UND-Gatter. Der Ausgang dieses UND-Gatters (BP5) wird über ein NICHT-Gatter (Gatter D) geleitet, das das Signal umkehrt und dabei im Bereich des Ausgangs O₄ ein NICHT-UND-Gatter als Reaktion für die Eingänge I₁ und I₂ erzeugt.
• g) Andere Gatter
• Unter Anwendung der vorausgehend beschriebenen Prinzipien kann dank einer geeigneten Kombination von NICHT-ODER und NICHT praktisch jede Art von Gatter gebildet werden. Die Kennzeichen der einzelnen Gatter sind dem Fachmann gut bekannt und können auch ausgehend von den Grundsätzen der Booleschen Algebra bestimmt werden. Diverse Gatter werden in Horowitz and Hill, supra. dargestellt, sowie in zahlreichen anderen Referenzen über binäre Schaltungen.
• Obwohl die die diversen Konstrukte der 3, 4 und 5 umfassenden NICHT-ODER- und NICHT-Gatter als separate Nucleinsäuren dargestellt sind, wird erkenntlich, dass die diversen Elemente, Gatter und sogar komplexe binäre Schaltungen an einer einzigen Nucleinsäure bestehen und von ihr codiert sein können.
• Es ist auch darauf hinzuweisen, dass dieselben Typen des angehängten Transaktivators (d. h. dieselben Kombinationen an Bindungsproteinen, Aktivatorproteinen) zahlreiche verschiedene Gatter koppeln können. Dadurch, dass dieser Aktivator unter einer logischen Kontrolle steht, können sämtliche Schaltungen über einen einzigen Eingang gesteuert werden.
• 2) Sequentielle Logik: Das Basis-Flip-Flop
• In kombinatorischen Schaltungen wird der Ausgang ganz und gar vom bestehenden Zustand der Eingänge bestimmt. In diesen Systemen gibt es keinerlei „Gedächtnis" weder eine Geschichte. Dagegen wird der Ausgang in sequentiellen logischen Systemen nicht ganz und gar vom Eingang bestimmt, sondern auch von der Geschichte des Systems beeinflusst.
• Wenn dem System Vorrichtungen mit einem « Gedächtnis » hinzugefügt werden, können Zähler, Akkumulatoren und andere Funktionen gebildet werden, die ein historisches Element besitzen.
• Die Basisspeichereinheit ist das « Flip-Flop ». Generell ist ein Flip-Flop eine Vorrichtung (oder ein System) mit zwei stabilen Zuständen und wird daher als bistabil bezeichnet. Der Zustand, in dem sich das Flip-Flop befindet, hängt von seiner vorausgehenden Geschichte ab.
• a) Basis-Flip-Flops und Speicherregister
• Ein erfindungsgemäßes Basis-Flip-Flop ist in den 1a und 1b dargestellt. Dabei wird eine Nucleinsäure mit zwei Proteinbindungsstellen so positioniert, dass sie nicht gleichzeitig durch ein nucleinsäurebindendes Protein besetzt werden können. Folglich ist, wenn eine erste Stelle (z. B. BS51 in 1a) gebunden ist (HIGH), die zweite Stelle (BS2 in 1a) nicht gebunden (LOW). Wenn dagegen die zweite Stelle gebunden ist (HIGH), ist die erste Stelle nicht gebunden (LOW). Auf diese Weise besitzt das Flip-Flop zwei stabile Zustände: erste Stelle HIGH und zweite Stelle LOW oder zweite Stelle HIGH und erste Stelle LOW.
• Das Binden des Signalpolypeptids (BP1 oder BP2 in den 1a und 1b) kann reversibel bzw. irreversibel sein. Wenn die Bindung irreversibel ist, wirkt das Flip-Flop wie ein Lesespeichersystem (Lesespeicher oder ROM- Speicher), wobei jedes Flip-Flop ein Bit Information speichert. Wie bereits erläutert, können die Flip-Flops kombiniert werden (z. B. um Speicherregister zu bilden) und sehr umfangreiche Informationsmengen codieren. Derartige Register umfassen mindestens zwei Flip-Flops, sie können aber auch mehrere besitzen (z. B. bis zu 3, 4, 5, 6 ,... 4096 Flip-Flops und mehr).
• Ein besonders bevorzugtes Flip-Flop umfasst eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) mit zwei Fis-Bindungsstellen. Die Stellen liegen weniger als 23 Basenpaare (bp) voneinander entfernt, vorzugsweise weniger als ca. 20 bp, noch besser weniger als ca. 15 bp und am besten weniger als ca. 12 bp. In einer besonders bevorzugten Ausführungsweise liegen die Fis-Bindungsstellen um 7 oder 11 Basenpaare auseinander (siehe z. B. Beispiel 1), aber es wird ersichtlich, dass die Stellen sich ganz überlappen können und mit einem Abstand von 1 bis 11 Basenpaaren voneinander getrennt sein können. Wie in 8 dargestellt, bezieht sich der Abstand (in Basenpaaren ausgedrückt) auf die Verschiebung der Basenpaare in Bezug auf die sich ganz überlappenden Stellen. So bedeutet der Abstand 0, dass sich die beiden Stellen ganz überlappen. Ein Abstand von 7 bp bedeutet, dass die Bindungsstellen um 7 Basenpaare zueinander verschoben sind. Im Fall der Fis-Bindungsstellen aus 8, bei dem die Bindungsstelle eine Länge von 21 bp aufweist, besteht noch, obwohl die Stellen um 7 bp voneinander entfernt sind, eine Überlappung von 14 bp (siehe z. B. 8).
• In einer bevorzugten Ausführungsweise werden die Fis-Bindungsstellen so gewählt, dass sie, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Bindungskraft von mindestens rund 0 Bit aufweisen, vorzugsweise mindestens rund 1 Bit, noch besser mindestens rund 2 Bit und am besten mindestens rund 2,4 Bit (siehe Hengen et al. (1997) supra.). In einer bevorzugten Ausführungsweise sind ein oder mehrere Bindungsstellen eines molekularen Flip-Flops oder Gatters der vorliegenden Erfindung eine Fis-Bindungsstelle mit der Sequenz (TTTG(G/C)TCAAAATTTG A(G/C)CAAA, SEQ ID N°1). Die Bindungsstellen liegen vorzugsweise 7 bis ca. 11 Basenpaare voneinander entfernt, noch besser um 7 oder 11 Basenpaare (siehe z. B. Beispiel 1). Besonders vorteilhaft gepaarte Bindungsstellen umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, einen Abstand von 11 bp (z. B.. 5'-TATTCTTTGCTCAAAATTTGATCAAATTTT-GAGCAAAGAATA-3', SEQ ID N°2) und einen Abstand von 7 bp (z. B. 5'-AGGCTTTTGCTCAAAGTTTAAACTTTGAG- CAAAAGCCT-3', SEQ ID N°3), deren Walker-Karten in 8 dargestellt sind. Besonders bevorzugte Fis-basierende Flip-Flops werden in den Beispielen dargestellt.
• b) Einstellen des Flip-Flop-Zustands
• Der Zustand des Flip-Flops wird eingestellt, indem ein Protein entweder an der ersten oder an der zweiten Bindungsstelle gebunden wird (BS1 oder BS2 in den 1a und 1b). Der Zustand kann zufällig eingestellt werden oder in einer Variante kann das Flip-Flop auf einen bestimmten vordefinierten Zustand eingestellt sein (d. h. man bestimmt im Voraus, ob die erste oder die zweite Bindungsstelle besetzt sein wird). Wenn sich die beiden Bindungsstellen an nucleinsäurebindende Proteine mit unterschiedlichen Eigenschaften binden (z. B. Fis bindet sich an die erste Bindungsstelle und CRP an die zweite Bindungsstelle), kann der Zustand des Flip-Flops eingestellt werden, indem man eins der beiden Bindungsproteine bereitstellt. In einer Variante kann das Flip-Flop zum Ablesen des relativen Überflusses der beiden Proteine verwendet werden. Sofern ein Bindungsprotein in einer höheren Konzentration als das andere vorhanden ist, gibt das Überwiegen der Flip-Flops in einem Zustand in Bezug zum anderen den relati/en Überfluss der Proteine an. Zu dieser Art des Ablesens kann ein Flip-Flop alleine eingesetzt werden oder aber auch zusammen mit einem oder mehreren ande en Flip-Flops und/oder Gattern, um ein wie folgt beschriebenes Ablesen zu ermöglichen.
• In einer Variante können die beiden Bindungsstellen des Flip-Flops sich an das gleiche Bindungsprotein binden (z. B. Fis). In diesem Fall kann es erforderlich sein, einen Selektor zu benutzen, um das Flip-Flop in einen bestimmten vordefinierten Zustand zu setzen.
• Ein Selektor ist eine Gruppe, die das Binden des Bindungsproteins an eine bestimmte Bindungsstelle verhindert. So kann z. B. in 1b, wenn an der Selektor-Bindungsstelle S₁ ein Selektor gebunden ist, die Bindungsstelle BS1 nicht besetzt werden und das Flip-Flop ist mit der Bindungsstelle BS2 auf HIGH eingestellt. Wenn dagegen der Selektor 5₁ aus 1b besetzt ist, kann sich das Bindungsprotein ausschließlich an der Stelle BS1 binden und BS1 befindet sich dann im Zustand HIGH.
• Die Selektoren werden nachfolgend erläutert. Jedoch sollte bereits jetzt festgehalten werden, dass der Selektor ein Bindungsprotein oder irgendeine andere Gruppe sein kann, die auf selektive Art die ihr zugeordnete Bindungsstelle blockiert. So kann der Selektor eine modifizierte Restriktionsendocuclease (EcoRI z. B.) sein, die sich an die zugrundeliegende Nucleinsäure bindet, sie jedoch nicht durchschneidet (siehe zum Beispiel King et al. (1989) J. Biol. Chem., 264(20): 11807–11815). Der Selektor könnte auch eine chemische Substanz sein, die auf selektive Art die zugrundeliegende Nucleinsäure modifiziert (z. B. Modifizierung der Basen, Dimerisieren von Thymidin usw.), um das Anhängen des Bindungsproteins zu verhindern. Andere mögliche Selektoren umfassen Nucleinsäuren (z. B. Antirichtungsmoleküle), Peptidnucleinsäuren, Streptavidin/Biotin und ähnliche.
• Reinitialisieren des Flip-Flop-Zustands
• Wie bereits erläutert, können im Flip-Flop Proteine eingesetzt werden, die sich auf irreversible Weise an Nucleinsäuren binden und daher wie eine Lesespeicherkomponente wirken. Alternativ dazu können Bindungsproteine eingesetzt werden, die sich vom Flip-Flop lösen lassen. Folglich kann der Zustand des Flip-Flops eingestellt werden, indem ein Bindungsprotein an eine Stelle gebunden wird und anschließend reinitialisiert, indem dieses Protein wieder gelöst wird (und vorzugsweise, indem ein Protein an die andere Stelle gebunden wird).
• Die nucleinsäurebindenden Proteine, die sich auf reversible Weise binden, sind dem Fachmann bekannt und umfassen, beschränken sich jedoch nicht auf Lacl, lambda cl, lambda cro, LexA, TrpR, ArgR, AraC, CRP, FNR, OxyR, IHF, GaIR, MalT, LRP, SoxR, SoxS, Sigma-Faktoren, chi, T4 MotA, P1 RepA, p53, NF-kappa-B, Ribosome, T4 regA, Spleißosome (Spender und Empfänger), PolyAbindenden Faktor und ähnliche.
• Außerdem können künstliche Bindungsproteine durch Mutation und Selektion von natürlichen Bindungsproteinen oder durch De novo-Synthese erzielt werden. Die Identifizierung und Präparation von geeigneten nucleinsäurebindenden Proteinen wird im Anschluss in Teil II beschrieben.
• 3) Gatterkombinationen zur Bildung von logischen Schaltungen
• Es ist ersichtlich, dass die logischen Gatter und Flip-Flops der vorliegenden Erfindung auf sehr unterschiedliche Arten zur Bearbeitung der Signale assoziiert werden können. Dies setzt voraus, dass der Ausgang eines Gatters mit dem Eingang eines anderen Gatters gekoppelt wird, was vorausgehend dadurch dargestellt wird, dass der Ausgang des NICHT-ODER-Gatters mit dem Eingang des Umrichters gekoppelt ist, um ein ODER-Gataer zu erzeugen. Auf gleiche Weise wird der Ausgang des UND-Gatters mit einem Umrichter gekoppelt, um ein NICHT-UND-Gatter zu ergeben. Selbstverständlich können mehr als zwei Gatter in einer Schaltung gekoppelt werden, und die Koppelung kann an anderen Gattern als einem Umrichter erfolgen. In Wirklichkeit kann praktisch jede Art von Gatter mit jeder beliebigen anderen Art von Gatter gekoppelt werden.
• Unter Anwendung der hier dargestellten Gatter wird der Fachmann auf zahlreiche andere logische Funktionen kommen. Außerdem können durch Erweitern der Bildungs- und Koppelprinzipien der vorausgehend beschriebenen Gatter diverse Kombinationen von Gattern und/oder Flip-Flops assoziiert werden, um ein Rechensignal und/oder komplexe Steuerkreise zu erzeugen. Ein Schaltungsbeispiel dieser Art wird durch die Anwendung von Gattern zur Bildung eines einfachen Addierers gegeben. Der Addierschaltkreis ist gut bekannt und wird z. B. von Gonick (1983) The Cartoon Guide to Computer Science, Barnes & Noble Books, New York, N.Y. beschrieben.
• Kurz gesagt können die Komponenten eines 1-Bit-Addierers ausgehend von ausschließlichen ODER-Gattern, UND-Gattern und einem Übertragungsbit erzielt werden. Wenn der Übertrag 0 ist, entspricht die SUMME dem ausschließlichen ODER der Addenden, während der ÜBERTRAG dem UND der Addenden entspricht. Wenn c also ein vorausgehender Übertrag ist, ist a ein Addend und b der andere Addend, so erfüllt der Addierer die Bedingungen der Tabelle 6.
• Tabelle 6

  
• 
• Wie in Tabelle 6 deutlich gezeigt, entspricht dies tatsächlich der Summe und dem Übertrag. Wenn der Eingangsübertrag 1 ist, ändert sich, wie dies die Tabelle 7 zeigt, die Tabelle leicht.
• Tabelle 7

  
• Wenn es einen Übertrag vom vorausgehenden 1-Bit-Addierer gibt, ist die Summe NEIN(ausschließliches ODER(a,b)) und der ÜBERTRAG ist ODER(a,b). Der Eingangs-Übertrag c kann zur Auswahl dieser Zustände und zum Erstellen der Gleichungen verwendet werden:

  

  
• Wie bereits erläutert, können unter Anwendung ähnlicher Ansätze andere logische Funktionen erzeugt werden. Die Verarbeitung des Signals und die eine Vielzahl gekoppelter Gatter umfassenden Steuerkreise sind dem Fachmann gut bekannt (siehe Horowitz and Hill, supra).
• Obwohl die NICHT-ODER- und NICHT-Gatter mit den diversen Konstrukten aus 3, 4 und 5 als unterschiedliche Nucleinsäuren dargestellt wurden, wird deutlich, dass die diversen Elemente, Gatter und selbst die komplexen binären Systeme an einer einzigen Nucleinsäure vorhanden und von ihr codiert sein können. Die Kombination von Flip-Flops und NICHT-ODER-Gattern mit Aktivatoren, die zur Transkription des nächsten logischen Levels führt, bedeutet, dass einzelne Hefezellen (oder andere) zur Ausführung der molekularen Logik verwendet werden können.
• Es ist auch verständlich, dass diese Schaltkreise im Wesentlichen mit ihren binären elektronischen Gegenstücken vergleichbar sind. Diese Schaltkreise existieren allerdings im Molekularbereich. Im Übrigen können sie in hoher Zahl erzeugt werden (z. B. anhand einer einfachen Expression ausgehend von geeigneten Vektoren) und sie bieten dementsprechend umfangreiche Möglichkeiten einer Parallelstellung, weshalb sie gut für die Lösung von bestimmten komplexen Rechenaufgabenkategorien geeignet sind.
• Zum Beispiel stellt man fest, dass Nucleinsäurekonstrukte für die Lösung eines gerichteten Hamilton-Pfad-Problems (Adleman (1994) Sciences, 266: 1021–1024) verwendet wurden. Außerdem ist Adleman gemäß Schneider (1991) J. Theoret. Biol., 148 : 125 zu dem Schluss gekommen, dass molekulares Rechnen eine bis zu 10-fach höhere theoretische Effizienz aufweist als die herkömmlicher Supercomputer.
• 4) Lesen des Signals
• Zum Ablesen des Zustands eines bzw. mehrerer Gattenausgänge oder Flip-Flops können äußerst verschiedene Mittel eingesetzt werden. Wie vorausgehend erläutert, wird ein Gattenausgang als HIGH abgelesen, wenn er gebunden ist oder dazu fähig ist, durch ein Signalprotein gebunden zu werden. So kann in einer bevorzugten Ausführungsweise der Zustand des Ausgangs bestimmt werden, indem man sich einfach vergewissert, dass die Ausgangsstelle mit einem geeigneten Signalprotein in Kontakt gebracht wird und zwar unter Bedingungen, unter denen, wenn die Stelle HIGH und nicht gebunden ist, sich das Signalprotein anbinden kann und so das Vorhandensein bzw. das Fehlen eines gebundenen Signalproteins angibt.
• Die Identifikationsmethoden der Bindung von Proteinen an Nucleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt. In einer Ausführungsart kann dies wie hier in den Beispielen beschrieben über Gel-Shift-Untersuchungen erfolgen (siehe auch Lane et al. (1992) Microbiol. Rev. 56(4): 509–528) und Garnen et al. (1981) Nucl. Acids Res., 9(13): 3047–3060).
• Die Bindung kann jedoch auch einfacher durch Detektion eines markierten Signalmoleküls geprüft werden. Die Mittel zum Markieren von Proteinen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Kapitel 4 in Monoclonal Antibodies : Principles and Applications, Birch and Lennox, eds. John Wiley & Sons, Inc. N.Y. (1995), in dem das Konjugieren von Antikörpern und Markern und anderen Verbindungen beschrieben wird). Die Proteine enthalten eine Vielzahl von funktionellen Gruppen, z. B. Carboxylgruppen (COOH) oder freie Aminogruppen (-NH₂), die zu einer Reaktion mit einer geeigneten funktionellen Gruppe entweder am Marker oder an einem am Marker fixierten Linker bereit sind.
• Die zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten detektierbaren Marker umfassen alle durch spektroskopische, photochernische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische, genetische oder chemische Mittel erfassbaren Verbindungen. Die für die vorliegende Erfindung nützlichen Marker umfassen Biotin zur Färbung mit einem markierten Streptavidinkonjugat, magnetische Mikrokügelchen (z. b. Dynabeads^TM), fluoreszierende Farbstoffe (z. B. Fluorescein, Texasrot, Rhodamin, grün fluoreszierendes Protein und ähnliche, (siehe z. B. Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), radioaktive Marker (z. B. ³H, ¹²⁵I ³⁵S ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z. B. Meerrettichperoxydase, alkalische Phosphatase und andere bei einem ELISA-Test häufig eingesetzte Enzyme), selektive Marker (Antibiotika-resistente Gene z. B.) und kolorimetrische Marker wie z. B. Kolloidgold (z. B. streuen Goldpartikel mit einem Durchmesser von rund 40 bis 80 nm grünes Licht sehr gut) oder farbige Glas- oder Kunststoffperlen (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, usw.). Die Patente, in denen die Anwendung dieser Art von Marker erklärt wird, umfassen die US-Patente Nr. 3 817 837 ; 3 850 752 ; 3 939 350 ; 3 996 345 ; 4 277 437 ; 4 275 149 und 4 366 241.
• In einer anderen Ausführungsweise kann das Binden eines Proteins an einer besonderen Stelle einer Nucleinsäure durch Fluoreszenzänderungen eines entweder am Bindungsprotein oder an der Nucleinsäure angehängten Fluorophors bestimmt werden, die von der Energieübertragung zwischen dem Fluorophor und einem Schluckermolekül oder einem zweiten Fluorophor (z. B. ein Fluoreszenz- und Resonanzenergieübertragungssystem) an der Proteinbindung verursacht werden. So wurde zum Beispiel ein Lumazinderivat zusammen mit einem Bathophenantrolin-Ruthenium-Komplex als Energieübertragungssystem eingesetzt, in dem das Lumazinderivat als Energiespender und der Rutheniumkomplex als Energieempfänger wirken. Das Lumazinderivat und der Rutheniumkomplex waren an verschiedenen Nucleinsäuren fixiert. Die Energieübertragung erfolgte, als sich die beiden Verbindungen näher kamen, was zu einer Fluoreszenz führte. Das System lieferte einen Mechanismus zur Untersuchung der Wechselwirkung von Molekülen mit den beiden Gruppen (siehe z. B. Bannwarth et al. (1991), Helvetica Chimica Acta. 74: 1991–1999, Bannwarth et al. (1991), Helvetica Chimica Acta. 74: 2000–2007, und Bannwarth et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0439036A2).
• Diese Resonanzenergieübertragungssysteme werden einfach angepasst, um auch die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Nucleinsäuren zu erfassen. Dazu muss man das Fluorophor oder den Schlucker in der Nähe der besonderen Bindungsstelle anbringen, die man „lesen" möchte und anschließend die Fluoreszenzänderung erfassen, wenn sich das entsprechend markierte Protein an diese Stelle bindet. Als Variante kann das Bindungsprotein das Fluorophor tragen, während die DNA den Schlucker trägt oder umgekehrt. In diesem Fall zeigt die Intensität der Fluoroszenz den Zustand des Flip-Flops an. Dem Fachmann sind noch weitere Energieübertragungssysteme bekannt (siehe zum Beispiel Tyagi et al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 303–308). Mit derartigen Systemen können die zwei stabilen Zustände eines Flip-Flops sehr einfach unterschieden werden. Dazu braucht man nur an jeder Bindungsstelle unterschiedliche Schlucker oder Fluorophore bereitstellen.
• Wie bereits angedeutet, kann der Zustand eines Flip-Flops oder eines Gatters vor dem Ablesen verriegelt werden, indem das nucleinsäureindende Protein (wenn vorhanden) auf kovalente Weise an die zugrundeliegende Nucleinsäure fixiert wird. Dies kann mit Quervernetzern erfolgen. Protein- und Nucleinsäurequervernetzer sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, Gluteraldehyd, DSS (Disuccinimidylsuberat) (Pierce, Rockford, Illinois, USA), aktive Ester von N-Ethylmaleimid (siehe z. B. Lerner et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 3403–3407 und Kitagawa et al. (1976) J. Biochem., 79: 233–236) und ähnliche.
• In einer anderen Ausführungsart kann der Zustand des Flip-Flops und/oder Gatters unter Anwendung eines Ersatzmarkers (ein Lesemolekül) abgelesen werden, der wahlweise die Zustandsinformation behalten kann, selbst nachdem das oder die Bindungsproteine von der zugrundeliegenden Nucleinsäure entfernt wurden. Ein Anwendungsbeispiel eines solchen Lesemoleküls wird vorausgehend unter Anwendung von Ligationsreaktionen zur Fixierung einer Lesenucleinsäure an einem der beiden Enden eines Flip-Flops beschrieben.
• Ein anderes Ersatzlesemolekül benutzt eine Avidin(Streptavidin)/Biotinwechselwirkung. Bei dieser Ausführungsart wird ein Biotin an die zugrundeliegende Nucleinsäure angehängt (vorzugsweise über einen Linker). Das Biotin befindet sich in der Nähe einer der Flip-Flop-Bindungsstellen oder in der Nähe der Ausgangsstelle eines Gatters. Nach dem Einstellen des Gatters bzw. des Flip-Flops wird das logische Element mit einem Avidin- oder Streptavidinmolekül in Kontakt gebracht. Wenn die Bindungsstelle durch ein nucleinsäurebindendes Protein besetzt ist (HIGH), wird das Bindungsprotein die Wechselwirkung zwischen Streptavidin und Biotin blockieren. Wenn die Bindungsstelle dagegen nicht gebunden ist (LOW), kann sich das Streptavidin an das Biotin binden. Das gebundene Streptavidin kann mit den Standardmethoden (Gel-Shift-Assay oder markiertes Streptavidin zum Beispiel) detektiert werden, wobei gebundenes Streptavidin einen LOW-Zustand der Bindungsstelle anzeigt. Die Biotin-/Streptavidin-Wechselwirkung ist äußerst stabil, und der Zustand kann sogar noch abgelesen werden, nachdem sich das nucleinsäurebindende Protein von der zugrundeliegenden Nucleinsäure gelöst hat. Eine Darstellung dieses Lesesytems wird im Beispiel 2 gegeben.
• e) Komplexe (« binäre ») Steuerung der Genexpression
• In einer anderen Ausführungsart braucht das Signalprotein überhaupt nicht markiert zu werden, um den Zustand der Ausgangsstelle zu detektieren. Zum Beispiel wird, wenn ein angehängter Aktivator verwendet wird, um sich an die Ausgangsstelle zu binden (z. B. in der in 3 dargestellten Weise), das Binden des angehängten Aktivators die Aktivierung des an der richtigen Stelle situierten Gens induzieren. Wenn das Eingangssignal zum Blockieren einer Ausgangsstelle dient (zum Beispiel in einem NICHT-ODER-Gatter), wird der angehängte Aktivator sich nicht binden können und die Transkription des Gens wird nicht stattfinden. Die Detektion der Expression eines oder mehrerer Gene unter Kontrolle dieser angehängten Aktivatoren (oder Repressoren) gibt dann einen Hinweis auf den Zustand des Ausgangs. So zeigt zum Beispiel, wenn der angehängte Aktivator ein Transkriptionsaktivator ist, die AUF-Regulierung der Gentranskription einen HIGH-Zustand am Ausgang an. Wenn dagegen das angehängte Konstruktprotein ein Repressor ist und das Gen konstitutiv aktiviert wird, zeigt eine Transkriptionsabnahme einen HIGH-Zustand am Ausgang an.
• In diesem Fall, wenn man also nur den Ausgangszustand « ablesen » möchte, ist das Gen bzw. sind die Gene unter der Kontrolle des Gatter in der Regel Reporter-Gene. Bei einem Reporter-Gen handelt es sich um ein Gen, das ein Protein codiert, dessen Aktivität leicht zu detektieren ist, was den Zellen ermöglicht, einen Marker zu exprimieren, der leicht identifiziert werden kann. Derartige Marker sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, Glucuronidase, bakterielle Chlorampüenicol-Acetyltransferase (CAT), Beta-Galactosidase ((3-gal), diverse von Vibrio harveyi, Vibrio fischeri und Xenorhabdus luminescens codierte Gene der bakteriellen Luciferase, das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen FFlux, grün fluoreszierendes Protein und dergleichen.
• Selektive Marker (z. B. Antibiotika-resistente Gene) liefern einen anderen einfachen Mechanismus zum Ablesen des Zustands eines Flip-Flops. Bei dieser Ausführungsart ist das Gen oder eins der Gene unter der Kontrolle eines logischen Elements der vorliegenden Erfindung ein selektiver Marker. Dabei werden die logische Kassette enthaltenden Zellen unter Selektionsbedingungen kultiviert (z. B. in Gegenwart eines Antibiotikums oder mehrerer Antibiotika), wobei das Überleben der Zellen den Zustand des logischen Elements anzeigt.
• In einer anderen Ausführungsweise können die logischen Gatter der vorliegenden Erfindung eher zur Expressionssteuerung als zu Rechenvorgängen eingesetzt werden. In diesem Fall kann das Reporter-Gen durch ein oder mehrere Gene ersetzt werden, dessen/deren Expression man unter Anwendung der logischen Einrichtung der vorliegenden Erfindung zu regulieren wünscht. Solche Gene umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, das Multidrugresistance-Gen (MDR1), zum Beispiel um gesunden Zellen während einer Chemotherapie eine Resistenz gegenüber Medikamenten zu verleihen, das p53 Tumorsuppressorgen, zum Beispiel bei manchen Brustkrebsen, das Telomerasegen und ähnliche.
• Die vorliegende Erfindung liefert auf diese Weise Mittel zur Regulierung der Genexpression als Reaktion auf komplexe Stimuli. Ein einfaches Beispiel ist in 3 dargestellt, in dem ein Gen unter der Kontrolle eines NICHT-ODER-Gatters steht. Der Ausgang des NICHT-ODER-Gatters wird von einem angehängten Aktivator « gelesen », der an einem Ende ein Bindungsprotein besitzt, das spezifisch die Ausgangsbindungsstelle erkennt und am anderen Ende einen Genaktivator (A). Wenn in diesem Fall der Eingang 1 (I₁) oder der Eingang 2 (I₂) gebunden ist, kann sich das angehängte Konstrukt nicht an der Ausgangsstelle (O₁) verankern und der am angehängten Konstrukt fixierte Aktivator kann das Gen nicht aktivieren. Wenn jedoch beide Eingänge nicht gebunden sind, bindet sich das angehängte Konstrukt an der Ausgangsstelle (O₁) und verankert den Aktivator an der Nucleinsäure, an der er dann die Transkription des Gens aktivieren kann.
• Die Herkunft der beiden Eingangsproteine (Signal) kann exogen (vorzugsweise an die Zelle über einen Transporter übertragen, z. B. durch ein Liposom oder anderen Vektor) oder heterolog sein. Als Variante können ein oder mehrere Signalproteine das Produkt von endogenen Stoffwechselvorgängen in der Zelle sein oder sie sind entweder oder gleichzeitig das Produkt von heterologen Expressionskassetten, welche selbst einfache traditionelle Kassetten (induzierbar oder konstitutiv) oder « logische » Kassetten mit Genen sein können, deren Expression der Kontrolle eines oder mehrerer logischer Gatter und/oder Flip-Flops der vorliegenden Erfindung unterliegt. Ebenso können der oder die angehängten Aktivatoren exogen bereitgestellt werden oder, als Variante, insbesondere wenn der das Bindungsprotein und den Aktivator verbindende Linker selbst ein Polypeptid ist (wodurch ein angehängter Aktivator bereitgestellt wird, der ein Hybridprotein ist), kann der angehängte Aktivator als heterologes Polypeptid durch eine geeignete Expressionskassette bereitgestellt werden.
• In einer Ausführungsart kann das regulierte Gen selbst eine für ein Bindungsprotein codierende Nucleinsäure sein, oder es können mehrere Gene von der „logischen Kassette" exprimiert werden, von denen eins oder mehrere, wie bereits beschrieben, ein anderes Signalprotein (nucleinsäurebindendes Protein) ist/sind. Die exprimierten nucleinsäurebindenden Proteine können als Eingänge der logischen Kassette wirken und eine negative oder positive Regulierung der Genexpression durch diese Kassette gewährleisten. In einer Variante oder in Verbindung mit dieser Feedback-Regulierung können die exprimierten Bindungsproteine als Eingänge in anderen logischen Kassetten wirken und dabei eine Kaskadenregulierung zahlreicher logischer Kassetten und eine extrem komplexe Regulierung des bzw. der durch die logischen Kassetten exprimierten Gene ermöglichen.
• Die auf einer Logik basierenden Expressionssteuersysteme der vorliegenden Erfindung liefern so eine beachtliche Verbesserung in der Expressionsregulierung von heterologen Genen (oder cDNAs). In traditionellen Expressionssystemen von heterologen Genen wird die Expression der Gene in der Regel von einem einzigen Induktor gesteuert (z. B. IPTG). Dagegen kann die, wie vorausgehend beschrieben, der Kontrolle eines oder mehrerer logischer Elemente unterliegende Expression eines Gens (oder cDNA) das Ergebnis einer komplexen Kombination von Stimuli sein, die einen oder mehrere Induktoren, eine positive oder negative Feedback-Regulierung und ähnliches umfasst.
• D) Affinitätschromatographie/Analytenquantifizierung
• In einer geläufigeren, jedoch sehr nützlichen Anwendung können die Flip-Flops der vorliegenden Erfindung zur effizienten Quantifizierung der Menge eines Analyts in einer Lösung eingesetzt werden (z. B. in biologischen Proben wie Zellhomogenaten, Blutproben). In dieser Ausführungsweise sind die beiden Bindungsdomänen des Flip-Flops identisch und werden so ausgewählt, dass sie sich spezifisch an das relevante Analyt binden (z. B. ein nucleinsäurebindendes Protein (z. B. Fis) oder eine Nucleinsäure usw.). Jedoch sind die Stellen weiterhin so angeordnet, dass die Bindung des Target-Analyts an einer Stelle eine Bindung an einer anderen Stelle ausschließt.
• Das Vorhandensein von zwei Bindungsstellen an jedem Nucleinsäuremolekül erhöht die Bindungswahrscheinlichkeit im Vergleich zu einem System, in dem jede Nucleinsäure nur eine einzige Bindungsstelle aufwies. Da die Anzahl der Bindungsstellen doppelt so hoch ist, ist die Wahrscheinlichkeit, dass das Target-Analyt eine geeignete Bindungsstelle findet und sich richtig in deren Richtung orientiert, erhöht. Sobald allerdings die zweite Bindungsstelle gebunden ist, wird sie unverfügbar. Folglich entspricht die Anzahl der gebundenen Nucleinsäuren der Anzahl der gebundenen Target-Analyten. Die Quantifizierung der gebundenen Nucleinsäuren bietet so eine direkte Messung der Menge an gebundenen Target-Analyten und eine indirekte Messung der Analytenmenge in der Lösung.
• Die Menge an gebundener Nucleinsäure kann durch zahlreiche, dem Fachmann gut bekannte Methoden ermittelt werden. Zum Beispiel kann ein Elektrophoresegel eingesetzt werden, um die gebundene Nucleinsäure von der ungebundenen und den ungebundenen Analyten zu trennen. Die auf diese Weise abgetrennte gebundene Nucleinsäure kann dann quantifiziert werden, z. B. kann ein Elektrophoresegel verwendet werden, um die gebundene Nucleinsäure von der ungebundenen und den ungebundenen Analyten zu trennen. Die auf diese Weise abgetrennte gebundene Nucleinsäure kann dann quantifiziert werden, z. B. durch die Quantifizierung eines Markers, der an die Nucleinsäure gehängt wird. Die Nucleinsäure kann wie bereits beschrieben auf diverse Arten markiert werden.
• Untersuchungen dieser Art werden auf ähnliche Art wie Immunoassays durchgeführt, bei denen auch einfach die Bindung eines Antikörpers ein eine Zielsubstanz erfasst und/oder quantifiziert wird. Die Formate dieser Bindungsassays sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen, beschränken sich jedoch nicht auf, kompetitive Assayformate, nicht kompetitive Assayformate und andere Formate (siehe z. B. US-Patente 4 366 241, 4 376 110, 4 517 288 und 4 837 168). Als Überblick der allgemeinen Immunoassays und Bindungstestformate siehe auch Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993) ; Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991).
• II. Aufbau von molekularen Flip-Flops und Gattern
• A) Konzept/Auswahl der Bindungsproteine/Nucleinsäuren
• 1) Identifizierung und Auswahl der Bindungsstellen
• Zur Umsetzung dieser Erfindung sind zahlreiche nucleinsäurebindende Proteine und ihre verwandten Bindungsstellen geeignet. In der Regel wird sich ein geeignetes Protein im Bereich einer durch eine besondere Nucleotidsequenz gekennzeichnete Stelle an eine « Substrat »-Nucleinsäure binden (z. B. einsträngige oder doppelsträngige RNA, DNA, Peptidnucleinsäure usw.). Diese, als eine Proteinbindungsstelle bezeichnete Stelle kann hinsichtlich ihrer Sequenz variieren, und es wird ersichtlich, dass es für ein bestimmtes Bindungsprotein eine gewisse Anzahl an unterschiedlichen Nucleotidbindungsstellen geben kann, die sich, selbst wenn sie immer für das Bindungsprotein spezifisch sind, mit unterschiedlichen Kräften an dieses Protein binden (siehe z. B. Hengen et al. (1997) supra).
• Die zu verwendenden Bindungsprotein-/Bindungsstelle-Kombinationen werden unter Berücksichtigung einer Reihe von verschiedenen Faktoren bestimmt. Dazu zählen die Anzahl der verschiedenen Bindungsproteine, die man in einem bestimmten System verwenden möchte, die Kenntnis, ob die Erfindung im Bereich einer bestimmten Stelle reversibel oder irreversibel sein soll sowie der gewünschte Abstand zwischen den Bindungsstellen.
• Dem Fachmann sind eine große Anzahl geeigneter Bindungsproteine bekannt. Dazu zählen in nicht einschränkender Weise Fis, Lacl, lambda cl, lambda cro, LexA, TrpR, ArgR, AraC, CRP, FNR, OxyR, IHF, GaIR, MalT, LRP, SoxR, SoxS, Sigma-Faktoren, chi, T4 MotA, P1 RepA, p53, NF-kappa-B, Ribosome, T4 regA, Spleißosome (Spender und Empfänger), PolyA-bindender Faktor und ähnliche.
• Besonders bevorzugt werden die Bindungsproteine, die, wenn ihre Bindungsstellen in geeignetem Abstand voneinander entfernt, jedoch auch nah genug sind, das Binden des verwandten Proteins der „anliegenden" Stelle blockieren. Diese Proteine können durch einfaches Screening identifiziert werden. Dazu ist eine Nucleinsäure (z. B. doppelsträngige DNA) mit den Bindungsstellen in unterschiedlichen Abständen erforderlich. Anschließend wird bestimmt, bei welchem Abstand sich die beiden Proteine auf sich ausschließende Weise binden. Ein solcher Test wird in den Beispielen dargestellt.
• Geeignete Bindungsstellenabstände (z. B. sich überlappende Stellen) können unter Anwendung der individuellen Informationstheorie gebildet werden (siehe z. B. USSN 08/494, 115, eingereicht am 23. Juni 1995, Hengen et al. (1997) supra., Schneider (1991) J. Theoret. Biol., 148 : 25, und Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415). In einem Ansatz werden die Sequenz-Walker für alle erforderlichen Komponenten für eine Sequenz dargestellt. Die Sequenz wird anschließend modifiziert, während man die quantitative Auswirkung an jedem Walker beobachtet (siehe z. B. Beispiel 1 und 8). Zum Beispiel kann eine Restriktionsenzymstelle in einer Fis-Stelle angelegt und dabei die gleiche Kraft der Fis-Stelle bewahrt werden (siehe z. B. Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415). Das Anlegen der sich überlappenden Stellen für die logischen Komponenten ist also einfach und kann anhand von Berechnungen ausgeführt werden.
• Nucleinsäurebindende Proteine, deren Bindungsstellen in der Natur eng miteinander verbunden erscheinen (z. p. paarweise), dürften besonders gute natürliche Blockierstellen bilden. Die Untersuchungen hinsichtlich dem Auftreten von solchen Bindungsstellen können anhand von Berechnungen mit Hilfe hinterlegter Sequenzinformationen erfolgen (z. B. GenBank). Forschungs- und Identifikationsmethoden dieser Bindungsstellen unter Anwendung der Sequenz-Walker werden in Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25: 4408–4415 und in der gemeinsam am 23. Juni 1995 eingereichten Anmeldung USSN 08/49, 115, beschrieben.
• Man nimmt an, dass für die meisten Proteinbindungsstellen der ausschließende Abstand zwischen 0 Basenpaare (völlige Überlappung) und rund 60 Basenpaare, vorzugsweise zwischen 0 Basenpaare und ca. 40 Basenpaare, noch besser zwischen 0 oder 1 Basenpaar und ca. 20 Basenpaare und am besten von allen zwischen rund 7 und 11 Basenpaare liegt.
• Wenn der Zustand des Flip-Flops bzw. die Eingänge oder Ausgänge modifiziert werden müssen (reinitialisiert), sollten nucleinsäurebindende Proteine verwendet werden, die sich auf reversible Art an die Nucleinsäure binden. Diese reversiblen Bindungsproteine sind dem Fachmann bekannt und umfassen zum Beispiel Fis, Lacl, lambda cl, lambda cro, LexA, TrpR, ArgR, AraC, CRP, FNR, OxyR, IHF, GaIR, MalT, LRP, SoxR, SoxS, Sigma-Faktoren, chi, T4 MotA, P1 RepA, p53, NF-kappa-B, während die bevorzugten Eingangs- und/oder Ausgangs-RNA-bindenden Proteine Ribosome, T4 regA, Spleißosome (Spender und Empfänger), den PolyA-bindenden Faktor und ähnliche umfassen, sich jedoch nicht darauf beschränken.
• 2) GTPase-ähnliche Bindungsproteine
• Eine besonders bevorzugte Gruppe von reversiblen Bindungsproteinen sind die, deren Freisetzung mit dem Verbrauch einer Energiequelle erfolgen kann (z. B. Hydrolyse von ATP oder GTP in ADP oder entsprechend in GDP). Eine besonders bevorzugte Kategorie dieser Proteine sind die GTPase-ähnlichen bzw. ATPase-ähnlichen Bindungsproteine. GTPase-Proteine, z. B. EF-Tu, binden an eine Nucleinsäure (in diesem Fall tRNA) und werden freigesetzt, wenn ihnen eine Energiequelle geliefert wird (z. B. GTP). Die Proteine können auch einen Cofaktor für ihre Freisetzung erfordern (z. B. GAP), welche durch Begrenzung der Bereitstellung entweder der Energiequelle oder des Cofaktors moduliert werden kann. Detaillierte Beschreibungen von GTPase-ähnlichen Proteinen sind in Scheffzek et al. (1997) Science, 277(18): 333–338, und Ahmadian et al. (1997) Nature Structural Biology, (4(9): 686–689) zu finden.
• Die GTPase-ähnlichen Proteine bilden ein praktisches Mittel zum Einstellen und Reinitialisieren des Flip-Flops. Ein derartiges, reinitialisierbares Flip-Flop ist in 6 dargestellt. Dieses besteht aus einer Nucleinsäure mit 4 Bindungsstellen, die mit c, a₁, b, und a₂ bezeichnet sind. Die Stelle kann durch σ_x gebunden werden, wobei es sich um ein nucleinsäurebindendes Protein handelt. Die σ-Proteine sind GTPase-ähnliche Proteine, die nach Auslösung die Nucleinsäure freisetzen. Die Proteine enthalten auch einen GAP-Finger, der das Freisetzen des anliegenden σ-Proteins auslösen kann, der jedoch nicht seine eigene Freisetzung auslösen kann (siehe Scheffzek et al. supra und Ahmadian et al. supra).
• Das σ_c-Protein bindet sich dann an die Stelle c und verursacht aufgrund seines GAP-Fingers die Entfernung aller σ_a. Auf diese Weise bleibt nur σ_a im Bereich der Stelle a₂ gebunden, wenn das Flip-Flop mit einem σ_a in Kontakt gebracht wird. Das Flip-Flop ist also im Bereich der Stelle a₂ stabil. Um seinen Zustand zu ändern, wird das Flip-Flop mit σ_b in Kontakt gebracht, das sich im Bereich der Stelle b anbindet, die Entfernung von σ_a verursacht und das Flip-Flop im Bereich der Stelle b stabil im zweiten Zustand des Flip-Flops gebunden lässt. Dieses kann in den Zustand a zurückversetzt werden, indem es mit σ_a in Kontakt gebracht wird, welches sich an die Stellen a₁ und a₂ bindet. Wenn a₁ durch σ_a gebunden wird, führt dies zur Freisetzung von σ_b. Obwohl σ_a nur vorübergehend gebunden werden kann, gewährleistet das in der Lösung freie σ_a, dass die Stelle lange genug besetzt ist, um die Bewegung von σ_b zu veranlassen, wodurch das Flip-Flop im Zustand a zurückversetzt bleibt, wobei die Stelle a₂ durch σ_a gebunden ist. Der Zyklus kann bis ins Unendliche wiederholt werden.
• Es wird erkennbar, dass nicht natürlich auftretende freisetzbare Proteine mittels geläufiger Auswahlverfahren erzielt werden können. Zum Beispiel können das Protein EF-Tu (oder andere Bindungsproteine, wie z. B. Restriktionsnucleasen) üblicherweise mutagenisiert und an der Oberfläche eines fadenförmigen Phagen in einer „Phagenbibliothek" exprimiert werden (siehe z. B. Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581–597, Vaughn et al. (1996) Nature Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309–314 und ähnliche).
• Gute freisetzbare Proteine können also üblicherweise durch Screening der Bibliothek identifiziert werden, um die Phagen (Klone) herauszufinden, die sich an eine Nucleinsäure mit den geeigneten Bindungsstellen binden und sich in Gegenwart einer Energiequelle (GTP) mit oder ohne Cofaktor (z. B. GAP) freisetzen. Die Fortsetzung der Mutagenese- und Auswahlzyklen kann Bindungsproteine erzeugen, die eine hohe Affinität und Spezifität sowie eine effiziente Freisetzung aufweisen, die dem Versetzen und der Auswahl von Antikörpern mit einer hohen Spezifität und Affinität entspricht (siehe z. B. Vaughn et al. supra, Marks et al. supra).
• 3) Nucleinsäureherstellung
• Die zugrundeliegende Nucleinsäure kann gemäß diversen dem Fachmann gut bekannten Methoden erzeugt werden. In einer Ausführungsart kann die Nucleinsäure eine isolierte, natürlich vorkommende Nucleinsäure sein (z. B. eine Fis-Bindungsstelle mit einem Segment von E. coli). In einer bevorzugten Ausführungsweise wird die Nucleinsäure jedoch de novo erzeugt, z. B. mittels chemischer Synthese.
• Die Nucleinsäuren (z. B. Oligonucleotide) werden in der Regel gemäß der von Beaucage und Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22(20): 1859–1862 beschriebenen Festphasen-Phosphoramidittriester-Methode unter Anwendung eines wie in Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 beschriebenen automatischen Synthesizers durch chemische Synthese hergestellt. Die Reinigung der Oligonucleotide erfolgt, wenn erforderlich, wie in Pearson et Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137–149 beschrieben, entweder durch Elektrophorese auf natürlichem Acrylamidgel oder durch Anionenaustausch-HPLC. Die Sequenz der Syntheseoligonucleotide kann unter Anwendung der chemischen Abbaumethode von Maxam und Gilbert (1980) in Grossman und Moldave (eds) Academic Press, New York, Methods in Enzymology 65: 499–560 geprüft werden.
• Man wird dabei merken, dass die chemisch hergestellten Oligonucleotide einsträngig sind. Doppelsträngige Nucleinsäuren (z. B. für Bindungsproteine wie Fis) können durch Synthese des komplementären Oligonucleotids und durch anschließende Anelierung der beiden Fragmente durch eine einfache Hybridisierung nach dem Fachmann gut bekannten Methoden erzeugt werden (siehe z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
• Als Variante kann ein einzelnes Oligonucleotid erzeugt werden, das die komplementären Regionen besitzt. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen wird das Oligonucleotid selbst hybridisiert und bildet dabei eine Haarnadelform mit einer doppelsträngigen Region, die die gewünschte Bindungsstelle enthält (siehe z. B. Beispiel 2).
• 4) Herstellen des Bindungsproteins al Isolieren
• Das nucleinsäurebindende Protein kann aus natürlichen Quellen isoliert, ausgehend von isolierten Proteinen mutagenisiert oder de novo synthetisiert werden. Die Methoden zum Isolieren natürlicher nucleinsäurebindender Proteine sind dem Fachmann gut bekannt. Diese umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, die gut bekannten Proteinreinigungsmethoden inklusive Ammoniumsulfatfällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und ähnliches (siehe allgemein R. Scopes, (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182 : Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y.).
• Wenn sich das Bindungsprotein reversibel bindet, können Nucleinsäureaffinitätssäulen, die eine Nucleinsäure mit einer spezifischen Bindungsstelle für das betroffene Protein tragen, zur Affinitätsreinigung des Proteins verwendet werden. Alternativ kann das Protein mit einem HIS-Tag rekombinant exprimiert und unter Anwendung einer Ni²⁺/NTA-Chromatographie gereinigt werden.
• b) Chemische Synthese
• In einer anderen Ausführungsweise kann das Bindungsprotein unter Anwendung der Standardtechniken der chemischen Peptidsynthese chemisch hergestellt werden. Wenn die gewünschten Subsequenzen relativ kurz sind, kann das Molekül in Form eines einzelnen angrenzenden Polypeptids hergestellt werden. Wenn man größere Moleküle möchte, können die Subsequenzen separat hergestellt (als eine Einheit oder mehrere) und anschließend durch Kondensieren des Amino-Terminus eines Moleküls mit dem Carboxyl-Terminus des anderen Moleküls unter Bildung einer Peptidbrücke verschmolzen werden. Dies wird in der Regel unter Anwendung der gleichen chemischen Substanzen (z. B. Fmoc, Tboc) wie beim Koppeln der einfachen Aminosäuren in im Handel erhältlichen Peptidsynthesizern erreicht.
• Die Festphasensynthese, bei der die C-terminale Aminosäure der Sequenz an einen unlöslichen Träger angehängt wird mit anschließender sequentieller Addition der restlichen Aminosäuren in der Sequenz, ist die bevorzugte Methode für die chemische Synthese der Polypeptide dieser Erfindung. Techniken der Festphasensynthese werden von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, pp. 3-284 in The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2 : Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149–2156, und Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III beschrieben.
• c) Rekombinante Expression
• In einer bevorzugten Ausführungsweise werden die Bindungsproteine unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. In der Regel bedingt dies die Schaffung einer DNA-Sequenz, die das Bindungsprotein codiert, wobei die DNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle eines besonderen Promoters angeordnet, das Protein in einem Wirt exprimiert, das exprimierte Protein isoliert und, wenn erforderlich, das Protein renaturiert wird.
• Die DNA-codierenden Bindungsproteine oder Subsequenzen der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe jeder geeigneten vorausgehend beschriebenen Methode präpariert werden. Dazu zählen zum Beispiel auch das Klonen und die Restriktion von geeigneten Sequenzen bzw. die direkte chemische Synthese mit Methoden wie z. B. der Phosphotriestermethode von Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90–99, der Phosphodiestermethode von Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109–151, der Diethylphosphoramiditmethode von Beaucage et al. (1981) Tetra, Lett., 22 1859–1862 und der Festträgermethode des US-Patents Nr. 4 458 066.
• Die Aminosäuren- und Nucleinsäuresequenzen von buchstäblich Hunderten von nucleinsäurebindenden Proteinen sind dem Fachmann gut bekannt. So entspricht zum Beispiel die Aminosäurensequenz von Fis (E. coli Factor for Inversion Stimulation) dem Swiss-Prot-Eingang P11028.
• Die Nucleinsäuresequenzen, die für das bzw. die gewünschten Bindungsproteine codieren, können in unterschiedlichen Wirtszellen exprimiert werden. Dazu zählen E. coli, andere bakterielle Zellen, Hefen und andere höher eukaryotische Zellen wie die Zelllinien COS, CHO und HeLa sowie Myelomzelllinien. Das rekombinante Proteingen wird bei jedem Wirt funktionstüchtig an die geeigneten Expressionssteuerungssequenzen angehängt. Bei E. coli schließt dies einen Promoter ein, wie z. B. die Promoter T7, trp oder lambda, eine Ribosombindungsstelle und vorzugsweise ein Signal für das Transkriptionsende. Bei Eukaryoten umfassen die Steuerungssequenzen einen Promoter und vorzugsweise einen von Immunglobulingenen abgeleiteten Enhancer, SV40, Cytomegalovirus, usw. und eine Polyadenylationssequenz und können Spleißspender- und Spleißempfängersequenzen einschließen.
• Die Plasmide der Erfindung können durch gut bekannte Methoden wie die Kalziumchloridumwandlung bei E. coli und Kalziumphosphatbehandlung oder Elektroporation bei Säugetierzellen in den gewählten Wirt übertragen werden. Die durch die Plasmide verwandelten Zellen können durch Antibiotikaresistenz ausgewählt werden, die von in den Plasmiden enthaltenen Genen verleiht wird, wie z. B. durch die amp-, gpt-, neo- und hyg-Gene.
• Nach der Expression können die rekombinanten Bindungsproteine, wie bereits vorausgehend beschrieben, gemäß den Standardverfahren der Technik gereinigt werden.
• Der Fachmann wird erkennen, dass das bzw. die Bindungsproteine nach der chemischen Synthese, biologischen Expression oder Reinigung eine von natürlichen Polypeptiden geringfügig abweichende Konstitution haben. In diesem Fall kann es erforderlich sein, das Polypeptid zu denaturieren und reduzieren und es anschließend in seiner bevorzugten Konstitution falten zu lassen. Die Methoden zur Reduzierung und Denaturierung der Proteine und zur Faltungsinduzierung sind dem Fachmann gut bekannt (siehe Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065–14070 ; Kreitman und Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581–585 ; und Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263–270). Debinski et al. beschreibt zum Beispiel die Denaturierung und Reduzierung von Proteinen in Form von Inklusionskörperproteinen in Guanidin-DTE. Das Protein wird dann in einem Redoxpuffer mit oxydiertem Glutathlon und L-Arginin neu gefaltet.
• Der Fachmann wird erkennen, dass an den Bindungsproteinen Änderungen vorgenommen werden können, ohne deren biologische Aktivität zu beeinträchtigen. Einige Änderungen können angebracht werden, um das Klonen, die Expression oder Eingliederung des angestrebten Moleküls in ein Hybridprotein zu vereinfachen. Derartige Änderungen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Beispiel ein Methionin, das am Amino-Terminus hinzugefügt wird, um eine Initiationsstelle zu bilden oder zusätzliche Aminosäuren (z. B. Poly His), die an einem der Enden angeordnet werden, um richtig angeordnete Restriktionsstellen, Endcodone oder Reinigungssequenzen zu bilden.
• Ebenfalls ist bekannt, dass sehr zahlreiche Bindungsproteine geklont wurden und mit Hilfe einer DNA-Rekombinationsstandardtechnik reproduziert werden können. Zudem sind bestimmte (insbesondere die normalen und modifizierten Restriktionsenzyme) im Handel erhältlich.
• B) Selektoren/Modulatoren/Blocker der Bindungsstellen
• Vorausgehend wurde festgestellt, dass das Binden von Bindungsproteinen an besonderen Bindungsstellen durch die Anwendung verschiedener Selektoren (auch als Modulatoren oder Blocker bezeichnet) gesteuert werden kann. Der Selektor kann ein Bindungsprotein oder irgendeine andere Gruppe sein, die auf selektive Art die ihr zugeordnete Bindungsstelle blockiert. So kann der Selektor eine modifizierte Restriktionsendoculease sein (z. B. mutiertes EcoRI, um die Spaltungsfunktion zu eliminieren, siehe z. B. King et al. (1989) J. Biol. Chem., 264(20): 11807–11815 und Wright et al. (1989) J. Biol. Chem., 264(20) 11816–11821), die sich an die zugrundeliegende Nucleinsäure bindet, diese jedoch nicht durchtrennt. Der Selektor könnte auch eine chemische Substanz sein, die auf selektive Art die zugrundeliegende Nucleinsäure modifiziert (z. B. Modifizierung der Basen, Dimerisieren von Thymidin usw.), um das Fixieren des Bindungsproteins zu verhindern. Andere mögliche Selektoren umfassen Nucleinsäuren (z. B. Antirichtungsmoleküle), Peptidnucleinsäuren, Streptavidin, Avidin und ähnliche.
• Die Selektoren können auch durch Licht abspaltbare Blocker umfassen. Diese Blocker bleiben solange am Substratmolekül fixiert, bis sie einer Lichteinstrahlung mit einer bestimmten Wellenlänge ausgesetzt werden. Nach der Lichteinstrahlung trennen sie sich ab, wodurch die Stelle frei und so das Anbinden des Signalmoleküls ermöglicht wird. Dies gestattet die Anwendung eines optischen Signals zum Einstellen des Zustands diverser Elemente der logischen Schaltung. Ebenso wird durch die Anwendung von vorausgehend beschriebenen fluoreszierenden Lesemethoden ein optischer Ausgang bereitgestellt. Auf diese Weise können sowohl Eingang und Ausgang des Systems durch optische Signale erzielt werden.
• Dies ist für Rechenein- und ausgänge von Vorteil. Es ist festzustellen, dass wenn die Rechenelemente Komponenten von « logischen Kassetten" sind, dies auch eine optische Steuerung der Genexpression liefert. Es ist zu erwarten, dass sich diese optischen Steuersysteme in vitro als sehr wirksam erweisen.
• Die durch Licht spaltbaren Blocker sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, NVOC, MeNPOC, Dimethoxybenzoinyl oder DDZ (siehe auch US-Patente 5 679 773, 5 639 603, 5 525 735, 5 709 848, 5 556 961 und 5 550 215).
• C) Angehängter) Aktivator(en)
• Vorausgehend wurde erklärt, dass durch das Anhängen eines Genaktivators (z. B. Gal4) an eine « Ausgangs »-Nucleinsäurebindungsstelle ein Mechanismus zum Koppeln des Ausgangs eines logischen Elements (Flip-Flop oder Gatter zum Beispiel) mit einem anderen bereitgestellt wird. Es wurde nachgewiesen, dass eine bestimmte Anzahl von Genaktivatoren selbst in Abwesenheit des natürlichen Reaktionselements ein Gen aktivieren, wenn der Aktivator an die zugrundeliegende Nucleinsäure angehängt ist. Dies wurde zum ersten Mal von Ptashne nachgewiesen, der gezeigt hat, dass ein nucleinsäurebindendes Protein (ein Escherichia coli Repressorprotein; LexA), das mit einem Aktivator (ein Saccharomyces cerevisiae transkriptioneller Aktivator; Gal4) fusionierte, die Transkription eines Gens aktivierte, wenn und zwar nur wenn eine Proteinbindungsstelle (IexA Operator) in der Nähe der Transkriptionsstartstelle vorhanden war (siehe Ptashne (1985) Cell 43(3): 729-736, und Farrell et al. (1996) Genes Dev., 10(18 ; 2359–2367).
• Es wurden andere angehängte Aktivatoren geschaffen, zum Beispiel durch Fusion einer heterologen DNA-Bindungsdomäne (Gal4) und einem Hefe-ADA2-Protein (siehe Silverman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 11665–11668). Ebenso hat die Fusion einer heterologen DNA-Bindungsdomäne mit dem Amino-Terminus des CREB-Bindungsproteins dem Chimärenprotein erlaubt, wie ein Proteinkinase-A-regulierter transkriptioneller Aktivator zu funktionieren (Chrivia et al. (1993) Nature, 365: 855–859). Auf gleiche Weise können die mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne fusionierten, auf B-Zellen beschränkte BOB.1/OBF.1-Cofaktoren wirksam Octamer-abhängige Promoter in Fibroblasten aktivieren (siehe Pfisterer et al. (1995) Biol. Chem., 270(50) 29870–29880). Dem Fachmann sind noch andere Genaktivatoren und – repressoren bekannt.
• Wenn die Bindungsproteine durch einen Linker verbunden sind, wird die Länge des Linkers so gewählt, dass, wenn ein Ende des angebundenen Konstrukts an sein verwandtes Target gebunden ist (z. B. dem Ausgang eines logischen Gatters), das Bindungsprotein am entgegengesetzten Ende ganz in die Nähe (z. B. darüber) der Transkriptionsinitiationsstelle gebracht wird, mit der es eine Wechselwirkung eingehen soll.
• Die Methoden zum Verbinden von Proteinen sind dem Fachmann gut bekannt. In der Regel können die Bindungs- und Aktivatorproteine durch einen chemisch konjugierten Linker in Verbindung gebracht werden oder in einer Variante können sie als ein Hybridprotein exprimiert werden, in dem die beiden Bindungsproteine durch ein Polypeptid miteinander verbunden sind.
• Die Mittel der chemischen Konjugation von Molekülen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Kapitel 4 in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox, eds. John Wiley & Sons, Inc. N.Y. (1995), in dem das Konjugieren von Antikörpern mit Zytostatika, Markern, einschließlich radioaktive Marker, Enzymen und ähnlichem beschrieben wird). Die Proteine enthalten eine Reihe funktioneller Gruppen ; z. B. Carboxyl-Gruppen (COOH) oder freie Aminogruppen (-NH2), die für eine Reaktion mit einer geeigneten funktionellen Gruppe an einem geeigneten Linker zur Verfügung stehen, um das Protein daran zu binden.
• Alternativ können das oder die Bindungsproteine auch deriviert werden, um zusätzliche reaktive funktionelle Gruppen bereitzustellen bzw. anzuhängen. Das Derivieren kann das Anhängen irgendeines Linkers aus einer Reihe von Linkern wie z. Bei den bei Pierce Chemical Company, Rockford Illinois erhältlichen, bedingen.
• Ein wie hier verwendeter « Linker » ist ein Molekül, das zum Verbinden der Bindungsproteine eingesetzt wird. Der Linker ist zur Bildung kovalenter Brücken sowohl mit dem Zielmolekül als auch dem Effektormolekül fähig. Die geeigneten Linker sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, gerade bzw. verzweigte Kohlenstofflinker, heterozyklische Kohlenstofflinker oder Peptidlinker. Die Linker können über ihre seitlichen Gruppen mit den konstitutiven Aminosäuren verbunden sein (z. B. über eine Disulfid-Brücke mit Cystin). In einer bevorzugten Ausführungsweise sind die Linker jedoch mit den Alpha-Kohlenstoffamino- und -carboxylgruppen der terminalen Aminosäuren verbunden.
• Es kann ein Zweifunktions-Linker mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Gruppe an einem bestimmten Wirkstoff reagiert, sowie einer anderen Gruppe, die mit einem Antikörper reagiert, zur Bildung des gewünschten angebundenen Konstrukts verwendet werden. Alternativ kann das Derivieren eine chemische Behandlung des Bindungsproteins einschließen, z. Glykolabspaltung einer mit Periodat an das Protein angehängten Zuckerverbindung, um freie Aldehydgruppen zu erzeugen. Man kann die freien Aldehydgruppen am Protein mit den freien Hydrazin- oder Aminogruppen an einem Wirkstoff reagieren lassen, um den Wirkstoff mit diesen zu verbinden. (Siehe US-Patent 4 671 958). Die Verfahren zur Erzeugung von freien Sulfhydrylgruppen an Polypeptiden sind ebenfalls bekannt (siehe US-Patent 4 659 839).
• Es sind zahlreiche Verfahren und Linker zum Anhängen diverser Proteine bekannt. Siehe zum Beispiel die europäische Patentanmeldung Nr. 188 256 ; US-Patente Nr. 4 671 958, 4 659 839, 4 414 148, 4 699 784 ; 4 680 338 ; 4 569 789 und 4 589 071 ; sowie Borlinghaus et al. Cancer Res. 47: 4071–4075 (1987). Diese Linker werden in großem Umfang in der Herstellung von Immunotoxinen verwendet und sind z. B. in « Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet », Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168–190 (1982), Waldmann, Science, 252 : 1657 (1991), sowie in den US-Patenten Nr. 4 545 985 und 4 894 443 vorzufinden.
• In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das angehängte Konstrukt in Form eines rekombinanten Hybridproteins exprimiert (d. h. die beiden Bindungsdomänen sind über eine Polypeptidverbindung miteinander verbunden). Das bedeutet grundsätzlich, dass eine Expressionskassette bereitgestellt wird, die sowohl die Bindungsproteine als auch, wenn erforderlich, einen Linker codiert, dass eine Zelle mit der Expressionskassette transfiziert wird, wodurch das angehängte Konstrukt exprimiert werden kann. Die Expressionsmethoden heterologer Nucleinsäuren werden weiter oben in der Diskussion über die rekombinante Expression von Bindungsproteinen erläutert, und die rekombinante Expression von Bindungsprotein-Aktivatorhybridproteinen ist gut bekannt (Silvermann et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 : 11665-11668, Chrivia et al. (1993) Nature, 365: 855–859 und Pfisterer et al. (1995) Biol. Chem., 270(50); 29870–29880).
• Es wird erkenntlich, dass die an die Aktivatoren angehängten Bindungsproteine keine Bindungsproteine der ganzen Länge zu sein brauchen. Im Gegenteil: in einer bevorzugten Ausführungsweise ist nur die Bindungsdomäne der Nucleinsäure an die Termini des angebundenen Konstrukts angehängt.
• III. Flüssigphasen-, Festphasen- und In vivo-Systeme
• A) Ex vivo-Systeme
• Wenn die logischen Konstrukte (Flip-Flops und/oder Gatter zum Beispiel) der vorliegenden Erfindung für Rechenvorgänge und/oder für die Affinitätschromatographie eingesetzt werden, wird die Anwendung vorzugsweise ex vivo ausgeführt. In diesem Fall können die Rechenelemente in gelöster Form verwendet und/oder sie können auf einen festen Träger fixiert werden. Wenn sie auf einen festen Träger fixiert werden, wird der Rechen- und/oder Affinitätstest wirksam in der Festphase ausgeführt. Der Begriff « fester Träger » bezieht sich auf ein festes Material, dem Funktionen verliehen wurden, um das Koppeln der Nucleinsäure oder des Bindungsproteins mit der Oberfläche zu ermöglichen. Zahlreiche feste Träger (zum Beispiel Nitrocellulose) bedürfen allerdings keiner derartigen Derivisierung. Es eignet sich jedes Material, an das die Nucleinsäure oder das Bindungsprotein angehängt werden kann und das hinsichtlich der Reagenzien, mit denen es in Kontakt gebracht wird, stabil ist. Die festen Trägermaterialien umfassen in nicht einschränkender Weise Polacryloylmorpholid, Metalle, ebene Glasplatten, Silizium, kontrolliertes Porenglas (CPG), Polystyrol, Polystyrol/Latex und Carboxyl-modifiziertes Teflon.
• In einer Ausführungsart können die einzelnen logischen Elemente in Matrizenform angeordnet werden. Die Methoden zum Anlegen der einsträngigen bzw. doppelsträngigen Nucleinsäurematrizen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. US-Patent 5 143 854 und Patentschrift PCT Nr. WO 90/15070).
• Sowohl in gelöster Form als auch in Festphasenform können die Eingangs-Signalproteine, die Ausgangs-Signalproteine, die Blocker und das/die angehängte(n) Konstrukte) gleichzeitig oder je nach Bedarf nacheinander hinzugefügt werden. Ebenso erfolgt das Ablesen durch ein beliebiges der wie bereits beschriebenen geläufigen Mittel.
• Die Genexpression kann auch ex vivo in extrahierten natürlichen, oder künstlichen Expressionssystemen ablaufen. Derartige Systeme umfassen in der Regel einen Puffer und alle zur Transkription und Translation eines Gens erforderlichen Elemente (z. B. ATP, Mg, Ribozyme, Nucleotidtriphosphate, usw.).
• In einer Variante können die Gatter der vorliegenden Erfindung zu Bioreaktoren hinzugefügt werden, um gleichzeitig das Reaktorumfeld zu testen und modulieren. So wird zum Beispiel das vorausgehend beschriebene ODER-Gatter, wenn es einem Bioreaktor hinzugefügt wird, ein oder mehrere Analyte binden, wenn sie im Reaktorsystem vorhanden sind. Durch diese Bindung wird der Ausgang auf HIGH gestellt. Die HIGH-Ausgangs-Bindungsstelle kann dann ein drittes Analyt im Bioreaktor binden und ihn damit für die sich darin entwickelnden Organismen weniger verfügbar oder überhaupt nicht verfügbar machen.
• B) In vivo-Systeme
• In einer anderen Ausführungsart können die logischen Steuerungen der vorliegenden Erfindung zur Regulierung der Genexpression verwendet werden. Wie bereits erklärt, kann eine Zelle mit einer oder mehreren « logischen Kassetten » transfiziert werden, wobei diese Expressionskassetten Nucleinsäuren umfassen, die ein oder mehrere Gene codieren, deren Expression der Kontrolle eines logischen Elements (z. B. ein oder mehrere Gatter und/oder Flip-Flops) der vorliegenden Erfindung unterliegt.
• Die logische Kassette kann, wie bereits beschrieben, unter Anwendung von Standardvektoren in eine Zelle transfiziert werden. Die logische Kassette kann zudem ein oder mehrere Bindungsproteine codieren und/oder ein oder mehrere angehängte Konstrukte. In einer Variante können die Bindungsproteine endogen exprimierte Proteine sein oder durch andere Expressions- oder logische Kassetten bereitgestellt werden. Ebenso können die angehängten Konstrukte auch von einer oder mehreren separaten Expressionskassetten oder logischen Kassetten exprimiert werden.
• IV. Auf anderen Substraten basierende logische Elemente
• Auch wenn die hier aufgeführten Beispiele logische Elemente (Flip-Flops und Gatter) beschreiben, bei denen Nucleinsäurebindungsstellen zum Einsatz kommen, sind andere Substrate geeignet, unter der Voraussetzung natürlich, dass diese spezifisch gebunden werden können. Diese Substrate umfassen in nicht einschränkender Weise Proteine, Glykoproteine, Zuckermoleküle und ähnliches. Proteine bilden ein besonders bevorzugtes alternatives Substrat. Es ist bestens bekannt, dass ein einzelnes Protein eine große Anzahl verschiedener Epitope aufweisen kann, von denen jedes durch einen besonderen Antikörper spezifisch gebunden ist (z. B. durch einen monoklonalen Antikörper oder ein Fv-, Fab'-Antikörperfragment, usw. oder durch ein single chain Fv usw.). Man weiß auch, dass Epitope so übereinander liegen können, dass sie nicht gleichzeitig durch ihre jeweiligen Antikörper gebunden werden können. Dieses Prinzip bildet die Grundlage der Epitopkartographie.
• So bildet ein Protein mit zwei Epitopen, bei denen die Bindung mit dem Antikörper gegenseitig ausschließlich ist, die Grundlage eines Flip-Flops auf einem Proteinsubstrat. Nach dem gleichen Prinzip können auch Zucker und Glykoproteine ein Substrat für die gegenseitig ausschließliche Bindung von Lektin bilden.
• V. Kits für molekulares Rechnen und/oder für komplexe Expressionssteuerung
• Die vorliegende Erfindung schlägt auch Kits für molekulares Rechnen und/oder zur Regulierung der Genexpression vor. Die Kits umfassen einen oder mehrere Behälter mit logischen Elementen (z. B. Flip-Flops, Gatter, logische Kassetten) der vorliegenden Erfindung. Der oder die Behälter können einfach die zugrundeliegende Nucleinsäure oder die kombinierte Nucleinsäure und/oder das Signalpolypeptid und/oder ein oder mehrere angehängte Konstrukte enthalten. Wenn das Kit für eine Ex vivo-Anwendung bestimmt ist, können die einzelnen Elemente auf einer oder mehreren Oberflächen eines festen Trägers fixiert geliefert werden (z. B. eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten).
• Das Kit kann wahlweise auch Reagenzien, Puffer, fluoreszierende Marker usw. für die Durchführung einer der hier beschriebenen Methoden enthalten.
• Die Kits können wahlweise auch Dokumente mit Anleitungen (d. h. Protokolle) in Hinblick auf die Anwendung der logischen Elemente (Flip-Flops, Gatter usw.) der vorliegenden Erfindung in molekularen Rechensystemen, in der Gensteuerung und ähnlichem enthalten. Selbst wenn diese Dokumente in der Regel schriftliche oder gedruckte Dokumente umfassen, beschränken sie sich nicht darauf. Jeder Träger zur Speicherung dieser Anleitungen und zur Übermittlung an einen Endanwender ist von der vorliegenden Erfindung abgedeckt. Derartige Datenträger umfassen in nicht einschränkender Weise elektronische Speichermittel (z. B. Magnetplatten, Bänder, Kassetten, Chips), optische Träger (CD-ROM zum Beispiel) und dergleichen. Diese können Supports mit Adressen von Websites enthalten, die diese Dokumente und Anleitungen bereitstellen.
• BEISPIELE
• Zur Darstellung, nicht jedoch zur Einschränkung der beanspruchten Erfindung werden folgende Beispiele aufgeführt.
• Beispiel 1 : Um 7 oder 11 Basenpaare beabstandete sich überlappende Fis-Stellen werden nicht gleichzeitig gebunden
• Bei diesem Beispiel wurde die Informationstheorie eingesetzt, um die Fis-Bindungsstellen (Fis = Factor for Inversion Stimulation) in Escherichia coli-DNAs vorherzusagen. Diese Vorhersagen wurden durch vorausgehend existierende DNase I-Abdrücke oder durch Gel-Shift-Tests bestätigt. In zahlreichen diversen genetischen Systemen, inklusive den sechs Stellenspezifischen Inversionsregionen λ att, dif, nrd, ndh und im fis-Promoter, wird auch für die Fis-Stellen vorausgesagt, dass sie um 7 oder 11 Basenpaare beabstandet sind. Diese sich überlappenden Fis-Stellen stimmen häufig mit Bindungsstellen anderer Proteine überein, was annehmen lässt, dass Fis den Zugang zur DNA blockieren kann. Die Struktur des Fis-Sequenzlogos, das molekulare Modellieren sowie die Gel-Shift-Untersuchungen zeigen, dass um 7 oder 11 Basen getrennte Fis-Stellen nach einem antagonistischen Prinzip gebunden weden. Zwei um 11 Basenpaare getrennte sich überlappende Fis-Stellen spielen auch im E. coli Ausgangspunkt der chromosomischen Replikation (oriC) eine Rolle. Die hier aufgeführten Daten weisen darauf hin, dass sich die zwei Stellen an Fis binden und dass sie, um sich zu binden, im Wettbewerb zueinander stehen, um zwei zu unterscheidende molekulare Zustände in vitro zu schaffen. Dadurch, dass immer nur eine der zwei sich überlappenden Fis-Stellen durch Fis gebunden sein kann, bildet die Struktur ein molekulares Flip-Flop. Diese zwei Fis-Stellen befinden sich genau zwischen zwei DnaA-Stellen im oriC, was darauf hinweist, dass das Flip-Flop das abwechselnde Auslösen von Replikationskomplexen in entgegengesetzten Richtungen steuert.
• Fis ist ein gut identifiziertes, Stellen-spezifisches DNA-Bindungsprotein. Wenn Escherichia coli auf einen reichen Nährboden stößt, steigt die Anzahl von Fis-Molekülen von praktisch null auf bis zu 25 000 bis 50 000 Dimere pro Zelle (Ball et al. (1992) J. Bact. 174: 8043–8056). Auf durchschnittliche Informationen über Fis-Stellen beruhende Schätzungen der Anzahl von Fis-Stellen im E. coli-Genom ergeben eine ähnliche Zahl, was darauf hinweist, dass die meisten dieser Moleküle genetische Systeme im gesamten Genom steuern (Hengen et al. (1997) Nucl. Acids Res., 25(24): 4994–5002). Fis ist dafür bekannt, die DNA zu krümmen und es ist an vielen Stellen-spezifischen Rekombinationssystemen beteiligt. Zudem reguliert es selbst seinen eigenen Promoter und aktiviert andere Promoter (Johnson & Simon (1987) Trends in Genetics, 3: 262–267 ; Finkel & Johnson (1992) Molec. Microb., 6: 3257–3265 ; Finkel & Johnson (1992) Molec. Microb., 6 : 1023).
• Die Informationsanalyse von Fis-Bindungsstellen und deren umliegenden Sequenzen hat bislang nicht identifizierte Stellen neben bekannten aufgedeckt (Hengen et al. (1997) supra). Es wurde beobachtet, dass in zahlreichen genetischen Systemen Paare von Fis-Stellen oft durch 7 oder 11 Basen getrennt sind. Diese Fis-Stellen überlappen oft die Bindungsstellen anderer Proteine an bedeutenden Stellen wie der Xis-Stelle von λ att (Schneider (1997) Nucl. Acids. Res., 25: 4408–4415). Zum Verständnis der Bedeutung dieser Paare haben wir versucht festzustellen, ob Fis sich zusammenwirkend oder entgegenwirkend an die anliegenden Stellen bindet. In dieser Studie zeigen wir, dass in einem künstlichen DNA-Konstrukt die Stellen nicht gleichzeitig gebunden werden können und daher als ein molekulares Flip-Flop wirken.
• Die DNA-Replikation beginnt nach 83 Minuten am E. coli Chromosom am oriC genannten Genort. Die an oriC beginnende Replikation in zwei Richtungen endet in der terminalen Region auf halbem Weg des Chromosoms. Die Replikation hängt vom DnaA-Protein ab, das an 5 Stellen in oriC bindet. Unter Anwendung der Sequenz-Walker (Schneider (1997) Nucl. Acids. Res., 25 4408-4415) haben wir beobachtet, dass es wahrscheinlich zwei Fis-Stellen gibt, die genau zwischen zwei der DnaA-Stellen positioniert sind.
• Ergebnisse und Diskussion
• Eigenkonkurrenz zwischen natürlichen Fis-Stellen
• Bei der Untersuchung von DNA-Sequenzen auf Fis-Stellen unter Berücksichtigung einer auf der Informationstheorie basierenden Gewichtsmatrize haben wir um 11 Basenpaare beabstandete Fis-Stellen in hin gin und min beobachtet (siehe 5 in (Hengen et al., 1997, supra)). Dadurch, dass sich die B-Form-DNA alle 10,6 Basenpaare aufrollt, müssten die Stellen auf der gleichen DNA-Seite liegen. Auch wenn in Erwägung zu ziehen ist, dass sieh zwei anliegende Proteine durch eine subtile Verflechtung ihrer DNA-Kontakte gleichzeitig binden können, scheint es wahrscheinlicher, dass sie in Konkurrenz zueinander stehen, um sich in der großen Furche zu binden, da nach einer Verschiebung um 11 Basen das Sequenzlogo zeigt, dass das dominierende C bei –7 dem G bei +4 und das C bei –4 dem C bei +7 entspricht (nach unten gerichtete Pfeile in 7). Die Konkurrenz zwischen diesen intern abundanten Profilen (7) (Schneider & Mastronarde (1996) Discrete Applied Mathematics, 71: 259–268) würde Fis ermöglichen, seine DNA-Faltstelle zu wechseln, was vielleicht für die Inversion wichtig ist.
• Im Gegensatz dazu beträgt der Abstand zwischen den Paaren in den P1 cin, P7 cin und E. coli e14 pin Stellen nur 7 Basen, was die Fis-Dimere auf der B-DNA 122° voneinander beabstandet plazieren würde (360°–360° pro Wicklung x 7 Basen/10,6 Basen pro Wicklung = 122°). Nach einer Verschiebung von 7 Basen zeigt das Sequenzlogo, dass das G bei –7 dem A/T der kleinen Furche auf der gegenüberliegenden Seite der DNA in der Koordinate 0 entsprechen würde, während das C/T bei –4 dem T/C bei +3 sowie A/G bei –3 dem C/A bei +4 entsprechen würde (nach oben gerichtete Pfeile in 7). Dies bietet die Möglichkeit, dass die beiden Proteine gleichzeitig binden, was auch für die Funktion dieser Region wichtig sein könnte.
• Zur Prüfung der Konsequenzen der Bindung von zwei Fis-Molekülen an nahe liegenden Stellen haben wir dreidimensionale Modelle aufgebaut (Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25 : 4408-4415). Wir haben dabei entdeckt, dass zwei an um 11 Basenpaare getrennten Stellen gebundene Fis-Proteine sich sehr stark gegenseitig durchdringen können. Dagegen dürfte eine Trennung um 7 Basenpaare nur einen minimalen Van der Waals-Kräftekonflikt zwischen den beiden zentralen D-Spiralen geben. Dies könnte durch die Flexibilität des DNA-Protein-Komplexes ausgegelichen werden, da eine leichte Ungewissheit gesteht, wie Fis sich an die DNA bindet. Wir dachten, dass die um 11 Basen getrennten Fis-Moleküle im Wettbewerb zueinander stehen, um sich zu binden, während eine Trennung um 7 Basen ein gleichzeitiges Binden ermöglichen würde.
• Diese Annahmen werden durch die vorausgehende Beobachtung verstärkt, gemäß der künstliche DNA, die entweder die proximale oder mediane hin Fis-Stelle enthält, von Fis in Elektrophorese-Gel-Shift-Untersuchungen gebunden wird (Hengen et al. (1997) supra). Wenn diese sich überlappenden Stellen gemeinsam am gleichen Fragment mit einem Abstand von 11 Basen waren, konnte nur eine Bandverschiebung beobachtet werden, was darauf schließen lässt, dass nur jeweils eine Stelle auf einmal gebunden werden kann. Um festzustellen, um dem wirklich so ist, muss man hohe Fis-Konzentrationen und starke Fis-Stellen verwenden, um zu gewährleisten, dass beide Stellen gebunden werden würden, wenn dies möglich wäre.
• Test des 7-11-Wechselmodells
• Um zu prüfen, ob sich überlappende Fis-Stellen gleichzeitig Fron Fis gebunden werden können, haben wir starke Fis-Stellen synthetisiert, die sich mit 7 oder 11 Basenpaaren (8a, 8b) überlappen bzw. um 23 Basenpaare ( 7c) getrennt waren. Anschließend haben wir ihre Eigenschaften durch eine Gel-Shift-Untersuchung geprüft. Keine der sich überlappenden Stellen, weder die mit 7 noch die mit 11 Basenpaaren, hat ein zweifach verschobenes Band aufgewiesen, auch nicht mit einem extrem hohen Fis/DNA-Verhältnis und mit außergewöhnlich starken Fis-Bindungsstellen (>12 bits) (9), was andeutet, dass sich nur ein einziges Fis-Molekül an jedes DNA-Fragment binden konnte. Das DNA-Fragment mit zwei um 23 Basenpaare getrennte Fis-Stellen wies eine doppelte Migration auf, was nachweist, dass richtig getrennte Fis-Stellen zwei verschiedene Bandverschiebungen hervorrufen können (9). Allerdings kann Fis eine Leiter auf unspezifischen Sequenzen bilden (Betermier et al. (1994) Biochimie, 76: 958–967), und dies könnte die zweifachen Migrationen erklären. Bei unseren Voraussetzungen mit kurzen DNAs wanderte ein unspezifisches 66 bp DNA-Fragment (alle Positionen < 1 Bit) bei einer hohen Fis-Konzentration (Daten nicht aufgeführt) kaum, so dass die sekundären Migrationen nicht von einer unspezifischen Bindung stammten. Diese Ergebnisse zeigen, dass um 7 oder 11 Basen getrennte Fis-Stellen nicht gleichzeitig gebunden werden können. Wir konnten nicht die Möglichkeit ausschließen, dass die einfach verschobenen Bänder bei hoher Fis-Konzentration zwei Fis-Moleküle pro DNA als Komplex enthalten, der genau wie eine durch ein Fis-Molekül gebundene DNA funktioniert. Dies scheint jedoch aufgrund der Sensibilität der Gel-Shift-Untersuchungen gegenüber den Molekulargewichtsveränderungen und den für die um 23 Basen getrennte DNA erzielten Ergebnisse höchst unwahrscheinlich.
• Ein zweites Fis-Molekül könnte durch eine direkte sterische Behinderung blockiert sein, aber es ist auch möglich, dass das erste Protein die DNA ausreichend verformt, um die zweite Stelle zu eliminieren oder verschließen. Wenn ein Verwindungsmechanismus angewendet wird, ist weiterhin möglich, dass zwei schwache Fis-Stellen gleichzeitig gebunden werden können. Außerdem können die Stellen, die sich mit 7 Basen überlappen, bei niedrigeren Temperaturen gleichzeitig gebunden werden, da eine schwache Wärmebewegung trotz gewissen mechanischen Belastungen eine Bindung zulassen dürfte. Außerdem dürften eine superspiralisierte DNA und andere Bedingungen eine gleichzeitige Bindung erlauben.
• Fis-Umschaltung : Genetische Implikationen des 7-11-Flip-Flop-Modells
• Der tyrT Promoter hat wie in unserem durch 23 Basenpaare getrennten Kontrollexperiment drei durch 20 und 31 Basenpaare getrennte Fis-Stellen ( 8 et 9). Die Trennung in tyrT reicht aus, damit sich drei Fis-Dimere selbst gleichzeitig auf der gleichen Seite der DNA plazieren, um sich zusammenwirkend an eine σ⁷⁰ Untereinheit zu binden und die Transkription von stabilen RNA-Promotoren zu aktivieren (Muskhelishvili et al. (1995) EMBO J., 14: 1446–1452). Außer diesem Aktivierungsmechanismus, der auf getrennten Stellen beruht, kann Fis auch einen anderen Kontrollmechanismus erarbeitet haben, der überlappende Stellen benutzt.
• Als wir unser Fis-Einzelinformationsmodell in diversen Sequenzen scannten, haben wir an Inversionsregionen, den fis, nrd und ndh-Promotern und an dif, E. coli oriC und λ att 7 und 11 Beabstandungen entdeckt (Hengen et al., 1997 supra, Schneider (1997) Nucleic Acids Res., 25 : 4408-4415). In den letzten drei Systemen überlappen Fis-Stellen Bindungsstellen von Binderen Proteinen an bedeutenden Orten, weshalb wir nicht glauben, dass Fis-Stellen in dieser Beabstandung einfach aufgrund der internen Abundanz der Stelle auftreten. Zum Beispiel bringt das Scannen mit der Fis-Gewichtsmatrize zwei vorausgehend in oriC an den Koordinaten 202 und 213 identifizierte Fis-Stellen zum Vorschein (Roth et al. (1994) Biochimie, 76: 917–923). Die Daten der Abdrücke von zwei verschiedenen Gruppen zeigen einen Schutz, der die eine, die andere sowie beide Stellen abdeckt (10). Die beiden Fis-Stellen passen genau zwischen die R2 und R3 DnaA-Stellen und haben ähnliche Inhalte hinsichtlich der Einzelinformation, was darauf hinweist, dass ihre Bindungsenergien ähnlich sind. Wenn keine anderen Wirkungen vorhanden sind, könnte Fis diese also innerhalb annähernd des gleichen Zeitraums besehen wie ein Flip-Flop. Ein Binden durch DnaA und durch Fis schließt sich gegenseitig aus (Lille et al. (1991) Nucl. Acids. Res., 19: 4167–4172), was bedeutet, dass die Position einer Fis-induzierten DNA-Krümmung von DnaA gesteuert und die Bindung von DnaA durch Fis gesteuert werden könnte. Bei einer Zunahme der Ernährung, wenn die Fis-Konzentration also hoch ist (Ball et al. (1992) supra), dürfte das Besetzen einer Fis-Stelle gewährleisten, dass nur jeweils eine DnaA-Stelle verfügbar ist. Da ein Fehlen von Fis zu einer asynchronen Replikation führt (Boye et al. (1982) in DNA Replication and the Cell Cycle, Fanning Knippers and Winnacker eds., vol. 43: 15–26, Springer-Verlag, Berlin), könnte dieses Flip-Flop das wechselweise Auslösen von Replikationskomplexen in entgegengesetzten Richtungen steuern.
• Geringfügig beabstandete Stellen werden oft zusammenwirkend gebunden, wie im klassischen Beispiel der T4-Gen-32-Autogenregulierunq (Miller et al. (1994) in Molecular Biology of Bacteriophage T4, Karam et al., ed. pp 193-205, American Soc. Microbiol., Washington, D. C.). Fis steht dagegen für die ungewöhnliche Situation, in der ein Protein sich selbst Konkurrenz macht, indem es sich an überlappende Positionen bindet. Ein selbsttätiges Verschließen wurde in künstlichen Konstrukten beobachtet, in denen ein Ribosom offenbar durch die Anwesenheit eines anderen, in der Nähe gebundenen Ribosoms blockiert wird (Barrick et al. (1994) Nucl. Acids. Res., 22: 1287–1295). Auf ähnliche Weise kann in ColE1 und ColE7 ein Paar von LexA-Stellen zum Binden von LexA in Konkurrenz zueinander stehen (Ebina et al. (1983) J. Biol. Chem., 258: 13258-13261) ; Lu & Chak (1996) Mol. Gen. Genet., 251 : 407–411).
• Das gleiche Paar von LexA-Stellen in ColE7 kann auch mit einer unmittelbar vorgeschalteten 9,1 Bit-Fis-Stelle in Konkurrenz sein, sowie mit allen drei an den beiden sich überlappenden unmittelbar nachgeschalteten IHF-Stellen anliegenden Stellen. Diese Wechselwirkung kann für komplexere Flip-Flop- Mechanismen charakteristisch sein. Zum Beispiel können sich bis zu fünf Fis-Stellen in λ att befinden. Zwei dieser Stellen sind um 11 Basenpaare beabstandet, wovon eine sich mit einer Xis-Stelle überlappt (Schneider (1997) Nucl. Acids. Res., 25 : 4408-4415).
• Die Positionierung von Fis-Bindungsstellen zueinander und in Bezug auf Bindungsstellen anderer Proteine scheint also die Erklärung zu sein für die Fähigkeit von Fis, zahlreiche diverse Funktionen zu übernehmen. Fis hat einen transkriptionellen Aktivierungsmodus entwickelt, bei dem Stellen auf der gleichen DNA-Seite und ausreichend voneinander entfernt sind, um gleichzeitig gebunden zu werden. Fis kann sich auch spezifisch weiter entwickelt haben, um zwei kompetitive Bindungsarten zu ermöglichen. Wenn sich die Stellen auf der gleichen DNA-Seite befinden (um 11 bp getrennt), könnte sich ein einzelnes Fis-Molekül freisetzen und sich erneut binden, um die Krümmungsstelle zwischen zwei möglichen Orten zu verschieben, ohne die globale Richtung der DNA zu ändern. Wenn sich Stellen an praktisch entgegengesetzten Seiten (urn 7 bp getrennt) befinden, würde Fis eine Änderung der Krümmungsrichtung um 122° hervorrufen. Wie sich diese COGS in einen größeren Rahmen von pleiotropen Fis-Funktionen einfügen, bleibt noch zu definieren.
• Dieses Beispiel zeigt, dass anliegende Fis-Stellen zwei unterschiedliche Bindungsarten haben können, in denen Fis sich selbst Konkurrenz macht, um sich zu binden und daher wie ein molekulares Flip-Flop wirkt.
• Material und Methoden Sequenzanalyseprogramme
• Zur Handhabung der Sequenzen und der Informationsberechnungen wurden Delila-Systemprogramme verwendet (Schneider et al. (1982) Nucl. Acids Res., 10: 3013–3024 ; Schneider et al. (1984) Nucl. Acids Res., 12: 129–140 ; Schneider et al. (1986) J. Mol. Biol., 188: 415–431 ; Schneider & Stephens (1990) Nucl. Acids Res., 18: 6097–6100 ; Stephens & Schneider (1992) J. Mol. Biol., 228: 1124–1136 ; Schneider (1997) J. Theoret. Biol., 189(4): 427–441 ; Schneider (1997) Nucl. Acids Res., 25 : 4408-4415). Die Zahlen wurden ausgehend von den rohen GenBank-Daten unter Anwendung der Delila und UNIX-Skriptprogramme automatisch ermittelt.
• Entwurf von Fis-Bindungsexperimenten
• Es wurden künstliche DNAs mit um 11 und 7 Basenpaaren getrennten, starken Fis-Stellen durch Auswahl aus den häufigsten Basen an jeder Position im Fis-Sequenzlogo hergestellt (Hengen et al. (1997) supra). Diese wurden anschließend mit der selben, um 11 oder 7 Basenpaare versetzten Sequenz fusioniert und die R_iw(b,l) Werte der einzelnen Auswahlen verglichen. (Hinweis Die Konsensus-Sequenz des frühen von uns angewendeten Modells war TTTG(G/C)TCA AAATTTGA(G/C)C AAA (SEQ ID N°4); diese unterscheidet sich von der des Logos). Basierend auf den natürlichen Sequenzen an den proximalen und medianen hin-Stellen für das Überlappungsoligonucleotid 11 wurden an den Enden fünf zusätzliche Basen hinzugefügt und die Sequenzen um den externen und proximalen cin-Stellen für das Überlappungsoligonucleotid 7 verwendet (Hengen et al. (1997) supra). Die DNAs wurden eigenkomplementär angelegt (8a, 8b). Es wurden um 23 Basen getrennte Stellen geschaffen, wobei man mit der um 11 Basen getrennten DNA begonnen und die mittlere Überlappungsregion dupliziert hat. Es wurde auch eine BamHI Stelle eingefügt und die DNA mit EcoRI Stellen flankiert (10c). Am 5' Ende wurden mit Biotin Oligonucleotide synthetisiert und mit Gel gereinigt (Oligos Etc., Wilsonville, OR, USA). Um ein vollständiges Anelieren zu gewährleisten, wurden sie 10 Minuten auf 90°C erhitzt und langsam wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Die gepaarten Produkte wurden in einem 8%igen (G/V) Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, und die Bänder, die der linearen Doppelstrang-DNA der richtigen Größe entsprachen, wurden aus dem Gel entnommen. Die DNA wurde durch Elektroelution wiedergewonnen und mit Isoamylalkohol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Aus den beiden 66 bp hinFI Fragmenten des Bakteriophagen ϕX174 (Life Technologies, Inc.) wurde eine unspezifische Kontroll-DNA gebildet. Wie vorausgehend beschrieben wurden Gel-Shift-Experimente durchgeführt (Hengen et al. (1997) supra).
• Beispiel 2 : Ablesen eines Fis/DNA-Flip-Flops
• Es wird eine einzelne sehr lange Nucleinsäure mit einer Sequenz in der Mitte synthetisiert, die eine schnelle Haarnadelschleifenbildung verursacht (siehe
• 11). Die gesamte DNA kann dann in einem erwärmten und gekühlten Puffer aufgelöst werden und dabei eine Doppelstrang-DNA bilden. Dies gewährleistet, dass die komplementären Stränge die gleichen Molwerte haben und dass keine einsträngige DNA in dem Gemisch vorhanden ist.
• Die Nucleinsäure wird so angelegt, dass sie die oriC-Stelle in der Haarnadelform bildet und dass ein Biotin (über einen 19-Atom-Linker) am T's an der Position 77 oder 78 fixiert wird.
• Fis wird mit der Haarnadelschleifen-DNA zusammengebracht. Man geht davon aus, dass Fis sich an beide Positionen bindet (18 und 29 in 11; es wird darauf hingewiesen, dass die Fis-Stellen an 87 und 98 die gleichen am anderen DNA-Strang sind). Dann wird Streptavidin hinzugefügt.
• Wenn in Position 18 ein Fis-Molekül gebunden ist, kann sich auch Streptavidin binden und es muss eine starke Bandmigration mit DNA, Fis und Streptavidin zu sehen sein. Wenn in Position 29 ein Fis-Molekül gebunden ist, wird es das Streptavidin blockieren, so dass nur DNA und Fis vorhanden sein werden und das Band auf dem Gel tiefer liegt. Die Sichtbarkeit der beiden Bänder zeigt an, dass sich die zwei Bindungsstellen in der Lösung bilden.
• Geeignete Kontrollen umfassen das individuelle Ausschalten jeder Bindungsstelle sowie beider Stellen. Die Versuche umfassen nur DNA, DNA+Fis, DNA+Fis+Streptavidin und DNA+Streptavidin+Fis, um sich zu vergewissern, dass die Reihenfolge des Hinzufügens eine Wirkung auf die Ergebnisse hat. Der einzige Fall, in dem es zwei Bänder geben dürfte, bezieht sich auf die Zugabereihenfolge DNA+Fis+Streptavidin, wenn beide Fis-Stellen existieren.
• Es versteht sich, dass die hier aufgeführten Beispiele und Ausführungsarten nur zur Darstellung dienen und dass der Fachmann anhand dieser diverse Änderungen oder Modifizierungen ableiten wird können. Alle hier zitierten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden zweckdienlich als Referenz integriert.
• 2
• MARKER
• 3

  GATTER A (NICHT-ODER)
  	GEN BP3
  GATTER B (NICHT)

• 4

  GATTER A (NICHT-ODER)
  	GEN BP4
  GATTER B (NICHT-ODER)
  	GATTER C

• 6

  ZUSTAND A	STABIL a2 GEBUNDEN
  ZUSTAND B	STABIL b GEBUNDEN
  	REINITIALISIERUNG

• 7
• + 11 Verschiebung
• Keine Verschiebung
• + 7 Verschiebung
• 8/9
• a) Überlappung um 11
• b) Überlappung um 7
• c) Trennung um 23
• 10
• DNase I Abdruck (Messer et al., 1991)
• DNase I Abdruck (Lille et al., 1991)
• DNase I Abdruck (Filutowicz et al., 1992)
• MPE Abdruck (Messer et al., 1992)
• DNase I Abdruck (Roth et al., 1994)
• 11
• Teil 1, T1, Teil 1, Konfig.: linear, Richtung : +, Start : 1, Ende : 113
• Haarnadelschleife

Claims (65)

1. System logischer Elemente zur molekularen Berechnung und Informationsbearbeitung mit einer isolierten Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 5 Basenpaaren und einer Nucleotidsequenz, die für eine erste Proteinbindungsstelle und eine zweite Proteinbindungsstelle codiert, wobei die besagte erste und zweite Proteinbindungsstelle jeweils eine Bindungskraft von mindestens 0 Bit hat und die in Nähe zueinander angeordnet sind, sodass: wenn die besagte erste Proteinbindungsstelle an ein für die erste Bindungsstelle kognatbindendes Protein spezifisch bindet, die besagte zweite Bindungsstelle nicht an ein Protein binden kann, das ansonsten die besagte zweite Bindungsstelle spezifisch erkennt und daran bindet; und wenn die besagte zweite Bindungsstelle an ein für die zweite Stelle kognatbindendes Protein spezifisch bindet, die besagte erste Bindungsstelle nicht an ein Protein binden kann, das ansonsten die besagte erste Bindungsstelle spezifisch erkennt und daran bindet; und ein kognatbindendes Protein, das spezifisch an die besagte erste Proteinbindungsstelle oder an die besagte zweite Proteinbindungsstelle bindet.
2. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte Nucleinsäure eine doppelsträngige Nucleinsäure ist.
3. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) ist.
4. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte erste Bindungsstelle und die besagte zweite Bindungsstelle dieselbe Nucleotidsequenz haben.
5. System nach Patentanspruch 4, in dem die besagte erste Bindungsstelle und die besagte zweite Bindungsstelle die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:1 besitzen.
6. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte erste Bindungstelle oder die besagte zweite Bindungsstelle spezifisch erkannt wird und von einem aus der aus Fis und Tus bestehenden Gruppe ausgewählten Protein gebunden wird.
7. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte erste Bindungsstelle oder die besagte zweite Bindungsstelle von EF-tu gebunden wird.
8. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte erste Bindungstelle innerhalb von 20 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle liegt.
9. System nach Patentanspruch 1, in dem die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 11 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle liegt.
10. System nach Patentanspruch 8, in dem die besagte erste Bindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Kraft von mindestens 2,4 Bits hat.
11. System nach Patentanspruch 1, in dem der Kraftunterschied zwischen der besagten ersten Proteinbindungsstelle und der besagten zweiten Proteinbindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, mindestens 0 Bit beträgt.
12. System nach Patentanspruch 1, das zudem eine dritte Proteinbindungsstelle umfasst und in dem die besagte dritte Stelle in der Nähe der besagten ersten Proteinbindungsstelle oder der besagten zweiten Proteinbindungsstelle liegt, sodass die spezifische Bindung der besagten dritten Bindungsstelle mit einem Protein die spezifische Proteinbindung der besagten ersten oder besagten zweiten Proteinbindungsstelle verhindert.
13. System nach Patentanspruch 1, in dem: die besagte erste Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist; die besagte zweite Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist und die besagten Bindungsstellen weniger als 12 Nucleotidbasenpaare voneinander entfernt sind.
14. System nach Patentanspruch 13, in dem die besagte Nucleinsäure; eine Desoxyribonucleinsäure ist, die die Sequenz SEQ ID N°2 oder SEQ ID N°3 enthält.
15. Zusammensetzung logischer Elemente, die eine isolierte Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 5 Basenpaaren umfasst und eine Nucleotidsecquenz besitzt, die für eine erste Proteinbindungsstelle, eine zweite Proteinbindungsstelle und eine dritte Proteinbindungsstelle codiert, wobei jede Bindungsstelle eine Bindungskraft von mindestens 0 Bit hat und die besagten Proteinbindungsstellen in Nähe zueinander angeordnet sind, sodass wenn die besagte erste Proteinbindungsstelle oder die besagte dritte Proteinbindungsstelle spezifisch durch ein spezifisch mit dieser Stelle bindendes nucleinsäurebindendes Protein gebunden ist, die besagte zweite Bindungsstelle nicht durch ein nucleinsäurebindendes Protein, das ansonsten die besagte zweite Bindungsstelle spezifisch erkennt und bindet, gebunden werden kann und die besagte erste Proteinbindungsstelle und die besagte dritte Proteinbindungsstelle gleichzeitig von einem nucleinsäurebindenden Protein spezifisch gebunden werden können.
16. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte erste Proteinbindungsstelle oder die besagte dritte Proteinbindungsstelle von einem nucleinsäurebindenden Protein gebunden wird.
17. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte dritte Proteinbindungsstelle von einem nucleinsäurebindenen Protein gebunden wird.
18. Zusammensetzung nach Patentanspruch 17, in der das besagte Bindungsprotein an einen Gentransaktivator angehängt ist.
19. Zusammensetzung nach Patentanspruch 18, in der der besagte Transaktivator ein Gal4-Transaktivator ist.
20. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, die zudem ein Gen oder eine cDNA unter der Kontrolle des besagten Transaktivators enthält.
21. Zusammensetzung nach Patentanspruch 20, die zudem ein Gen oder eine cDNA unter der Kontrolle des besagten Transaktivators enthält.
22. Zusammensetzung nach Patentanspruch 21, in der das besagte Gen ein Reporter-Gen ist.
23. Zusammensetzung nach Patentanspruch 21, in der das besagte Gen für ein nucleinsäurebindendes Protein codiert.
24. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte Nucleinsäure eine doppelsträngige Nucleinsäure ist.
25. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) ist.
26. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte erste Bindungsstelle und die besagte dritte Bindungsstelle dieselbe Nucleotidsequenz haben.
27. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte erste Bindungsstelle oder die besagte zweite Bindungsstelle von einem Protein, das aus der aus Fis und Tus bestehenden Gruppe ausgewählt wird, spezifisch erkannt und gebunden wird.
28. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte erste Bindungsstelle oder die besagte zweite Bindungsstelle von EF-tu gebunden wird.
29. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 20 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle liegt.
30. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 11 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungstelle liegt.
31. Zusammensetzung nach Patentanspruch 30, in der die besagte erste Bindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Kraft von mindestens 2,4 Bit hat.
32. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der der Kraftunterschied zwischen der besagten ersten Proteinbindungsstelle und der besagten zweiten Proteinbindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, mindestens 0 Bit beträgt.
33. Zusammensetzung nach Patentanspruch 15, in der: die besagte erste Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist, die besagte dritte Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist.
34. Zusammensetzung für die Speicherung binärer Informationen, wobei die besagte Zusammensetzung eine isolierte Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 5 Basenpaaren enthält und eine Nucleotidsequenz hat, die für eine erste Proteinbindungsstelle und für eine zweite Proteinbindungsstelle codiert, wobei jede Bindungsstelle eine Bindungskraft von mindestens 0 Bit hat und die besagte erste und zweite Proteinbindungsstelle in Nähe zueinander angeordnet sind, sodass: wenn die besagte erste Proteinbindungsstelle durch ein für die erste Stelle kognatbindendes Protein spezifisch gebunden wird, die besagte zweite Bindungsstelle nicht von einem Protein gebunden werden kann, das ansonsten die besagte zweite Bindungsstelle spezifsch erkennt und bindet und wenn die besagte zweite Bindungsstelle durch ein für die zweite Stelle kognatbindendes Protein spezifisch gebunden wird, die besagte erste Bindungsstelle nicht von einem Protein gebunden werden kann, das ansonsten die besagte erste Bindungsstelle spezifisch erkennt und bindet und zudem ein kognatbindendes Protein, das an der besagten ersten Proteinbindungsstelle oder an der besagten zweiten Proteinbindungsstelle gebunden ist, enthält.
35. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der die besagte Nucleinsäure eine doppelsträngige Nucleinsäure ist.
36. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der die besagte Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) ist.
37. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der die besagte erste Bindungsstelle und die besagte zweite Bindungsstelle dieselbe Nucleotidsequenz haben.
38. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der die besagte erste Bindungsstelle oder die besagte zweite Bindungsstelle von einem Protein, das aus der aus Fis und Tus bestehenden Gruppe ausgewählt wird, spezifisch erkannt und gebunden wird.
39. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 20 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle (legt.
40. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 11 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle liegt.
41. Zusammensetzung nach Patentanspruch 40, in der die besagte erste Bindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Kraft von mindestens 2,4 Bit hat.
42. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der der Kraftunterschied zwischen der besagten ersten Proteinbindungsstelle und der besagten zweiten Proteinbindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, mindestens 0 Bit beträgt.
43. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, die zudem eine dritte Proteinbindungsstelle enthält und in der die besagte dritte Stelle in der Nähe der besagten ersten Proteinbindungsstelle oder der besagten zweiten Proteinbindungsstelle liegt, sodass die spezifische Bindung der besagten dritten Bindungsstelle mit einem Protein die spezifische Proteinbindung der besagten ersten oder der besagten zweiten Proteinbindungsstelle verhindert.
44. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der: die besagte erste Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist, die besagte zweite Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist und die besagten Bindungsstellen weniger als 12 Nucleotidbasenpaare voneinander entfernt sind.
45. Zusammensetzung nach Patentanspruch 44, in der die besagte Nucleinsäure eine die Sequenz SEQ ID N°2 oder SEQ ID N°3 enthaltende Desoxyribonucleinsäure ist.
46. Zusammensetzung nach Patentanspruch 34, in der das besagte Bindungsprotein an einen Gentransaktivator angehängt ist.
47. Zusammensetzung nach Patentanspruch 46, in der der besiegte Transaktivator ein Gal4-Transaktivator ist.
48. Zusammensetzung nach Patentanspruch 46, die zudem ein Gen oder eine cDNA unter der Kontrolle des besagten Transaktivators enthält.
49. Zusammensetzung nach Patentanspruch 48, in der das besagte Gen ein Reporter-Gen ist.
50. Zusammensetzung nach Patentanspruch 48, in der das besagte Gen für ein nucleinsäurebindendes Protein codiert.
51. Methode zur Informationsspeicherung, wobei die besagte Methode folgenden Schritt umfasst: Binden eines nucleinsäurebindenden Proteins an eine erste Proteinbindungsstelle an einer Nucleinsäure, wobei die besagte Nucleinsäure eine Länge von mindestens 5 Basenpaaren hat und die besagte Nucleinsäure für die besagte erste Proteinbindungsstelle und für eine zweite Proteinbindungsstelle codiert, wobei jede Bindungsstelle eine Bindungskraft von mindestens 0 Bit hat und die besagte erste und die zweite Proteinbindungsstelle in Nähe zueinander angeordnet sind, sodass: wenn die besagte erste Proteinbindungsstelle durch ein für die erste Stelle kognatbindendes Protein spezifisch gebunden ist, die besagte zweite Bindungsstelle nicht von einem Protein gebunden werden kann, das ansonsten die besagte zweite Bindungssteile spezifisch erkennt und bindet und wenn die besagte zweite Bindungsstelle durch ein für die zweite Stelle kognatbindendes Protein spezifisch gebunden ist, die besagte erste Bindungsstelle nicht von einem Protein gebunden werden kann, das ansonsten die besagte erste Bindungsstelle spezifisch erkennt und bindet.
52. Methode nach Patentanspruch 51, die zudem den Schritt der Bestimmung umfasst, welche Bindungsstelle an der besagten Nucleinsäure durch das besagte Bindungsprotein gebunden wird.
53. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte Nucleinsäure eine doppelsträngige Nucleinsäure ist.
54. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte Nucleinsäure; eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) ist.
55. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte erste Bindungstelle und die besagte zweite Bindungsstelle dieselbe Nucleotidsequenz haben.
56. Methode nach Patentanspruch 55, in der die besagte erste Bindungstelle und die besagte zweite Bindungsstelle die Nucleotidsequenz SEQ ID N°1 haben.
57. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte erste Bindungstelle oder die besagte zweite Bindungsstelle von einem Protein, das aus der aus Fis, EF tu und Tus bestehenden Gruppe ausgewählt wird, spezifisch erkannt und gebunden wird.
58. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 20 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle liegt.
59. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte erste Bindungsstelle innerhalb von 11 Nucleotiden der besagten zweiten Bindungsstelle liegt.
60. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte erste Bindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, eine Kraft von mindestens 2,4 Bit hat.
61. Methode nach Patentanspruch 51, in der der Kraftunterschied zwischen der besagten ersten Proteinbindungsstelle und der besagten zweiten Proteinbindungsstelle, wie durch die individuelle Informationstheorie bestimmt, mindestens 0 Bit beträgt.
62. Methode nach Patentanspruch 51, in der: die besagte erste Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist die besagte zweite Proteinbindungsstelle eine Fis-Bindungsstelle ist und die besagten Bindungsstellen durch weniger als 12 Nucleotidbasenpaare voneinander getrennt sind.
63. Methode nach Patentanspruch 51, in der die besagte Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure ist, die die Sequenz SEQ ID N°2 oder SEQ ID N°3 umfasst.
64. Methode zur Umwandlung binärer Informationen, wobei die besagte Methode folgende Schritte umfasst: (i) Binden eines nucleinsäurebindenden Proteins an eine Eingangsproteinbindungsstelle an einer ersten Nucleinsäure und (ii) Bestimmen, ob ein nucleinsäurebindendes Protein an eine Ausgangsproteinbindungsstelle an einer zweiten Nucleinsäure binden kann oder nicht; wobei die besagte erste Nucleinsäure eine isolierte Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 5 Basenpaaren ist und eine Nucleotidsequenz hat, die für eine erste Proteinbindungsstelle, eine zweite Proteinbindungsstelle und eine dritte Proteinbindungsstelle codiert, wobei die besagten Proteinbindungsstellen in Nähe zueinander angeordnet sind, sodass: wenn die besagte erste Proteinbindungsstelle oder die besagte dritte Proteinbindungsstelle spezifisch an ein nucleinsäurebindendes Protein gebunden ist, die besagte zweite Bindungsstelle nicht durch ein nucleinsäurebindendes Protein, das ansonsten die besagte zweite Bindungsstelle spezifisch erkennt und bindet, gebunden werden kann und die besagte erste Proteinbindungsstelle und die besagte dritte Proteinbindungsstelle gleichzeitig von einem nucleinsäurebindenden Protein spezifisch gebunden werden können.
65. Methode nach Patentanspruch 64, in der die besagte erste Nucleinsäure und die besagte zweite Nucleinsäure dieselbe Nucleinsäure sind.