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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung eines silanisierten kolloidalen Kieselsäurepräparats,
das, zum Beispiel, als ein Dichtegradientenmedium zur Trennung von
Zellen verwendbar ist.
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Literaturangaben
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F. M. Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc., Media PA (1988).
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Hintergrund der Erfindung
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Silanisierte kolloidale Kieselsäurepräparate werden
in einer Reihe von industriellen Anwendungen, einschließlich, zum
Beispiel, zur Herstellung von abriebbeständigen Beschichtungen, xerographischen
Tonermaterialien und zur Dichtegradiententrennung von biologischen
Materialien verwendet.
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Die Herstellung von silanisierter
kolloidaler Kieselsäure
kann schwierig sein, da kolloidale Kieselsäure an sich unter Bedingungen
instabil ist, die zur Silanisierung, z. B. bei saurem pH, optimal
oder sogar notwendig sind. Unter solchen sauren Bedingungen "geliert"
die Kieselsäure
oft, oder sie verliert ihre Eigenschaften als Suspension, wobei
ein halbfestes geleeartiges Material gebildet wird. Unter neutralen
oder alkalischen pH-Bedingungen verläuft die Silanisierung, möglicherweise
wegen der Selbstkondensation des Silans, nicht effizient. Während es
für einige
Anwendungen (z. B. für
abriebbeständige
Beschichtungen) nicht entscheidend ist, die Kieselsäurepartikel
in einem suspendierten Zustand zu halten, ist es für andere
Anwendungen (z. B. für
Dichtegradientmaterialien) wichtig, die kolloidalen Eigenschaften
der Suspension zu erhalten.
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Es wurden verschiedene Verfahren
entwickelt, die erkannten Probleme der Silanisierung zu überwinden.
Gemäß einem
Verfahren wird die Silanisierung in Gegenwart von organischen Lö sungsmitteln
in Abwesenheit von Wasser durchgeführt; diese organischen Lösungsmittel
sind jedoch schwer aus dem Präparat
zu entfernen und sie sind in vielen Anwendungen, wie in Dichtegradientenmaterialien,
nicht erwünscht,
da sie toxisch oder aus einem anderen Grund für die Anwendung nachteilig
sind.
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Ein anderes bekanntes Verfahren zur
Silanisierung von Kieselsäurepartikeln
verwendet einen Katalysator. Das bringt wieder das Problem der Zugabe
ungewünschter,
potentiell toxischer Materialien zu dem Präparat mit sich. Außerdem erzeugt
die Zugabe von organischen Lösungsmitteln
und/oder Katalaysatoren zu dem Präparat potentiell größere Mengen
von toxischem Abfall, der in den zunehmend eingeschränkten Gebieten
des Landes beseitigt werden muss. Deshalb würde es nützlich sein, andere Herstellungsverfahren
verfügbar
zu haben, die in Wasser lösliche,
für die
Umwelt sichere Reagenzien und Zwischenprodukte verwenden.
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Das U.S. Patent 4,927,750 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung einer organosilanisierten kolloidalen
Kieselsäure,
das für
Zellen relativ nicht toxisch ist; jedoch schließt das Herstellungsverfahren
die Zugabe von Silan zu der kolloidalen Kieselsäure in einer "tropfenweisen"
oder langsamen Weise über
mehrere Stunden ein, während
der das Gemisch bei einer relativ hohen Temperatur (75°C) gehalten
wird. Das Verfahren ist zeitaufwändig
und es eignet sich nicht ohne weiteres für die Massenfertigung. Während das
Verfahren unter alkalischen Bedingungen durchgeführt werden kann, wird betont,
dass die Zugabe von Silan zu der Kieselsäure langsam erfolgen muss.
Außerdem
können
leichte Abweichungen von dem vorgeschriebenen Verfahren zur Gelbildung
der Suspension führen,
womit es für
bestimmte Anwendungen, wie vorstehend beschrieben, nicht verwendbar
ist.
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Die vorliegende Erfindung löst viele
der Probleme, die Präparaten
eigen sind, die unter Verwendung der Verfahren des Standes der Technik
hergestellt sind, wie die Instabilibät der Präparate, die Gegenwart von organischen
Lösungsmitteln
und anderer toxischer Zwischenprodukte und die Erzeugung von toxischen
Nebenprodukten und Abfall. Das bedeutet, nach den Verfahren des
Standes der Technik konnten wässrige
Formulierungen nur durch sorgfältiges
langsames Mischen des Organosilans mit der kolloidalen Kieselsäure hergestellt
werden; andernfalls erfolgte ein Ausfallen der Suspension. In einer
anderen Ausführungsform
konnte das Präparat
unter Verwendung organischer Lösungsmittel
hergestellt werden; die Verwendung solcher Reagenzien ist jedoch
für kolloidale
Kieselsäurezusammensetzungen
für bestimmte
Anwendungen, wie bei der Herstellung von biologischen Materialien,
nicht erwünscht.
Auch ist die Verwendung solcher Reagenzien vom Standpunkt der Minimierung
der Erzeugung von gefährlichen
Abfällen
besonders erwünscht.
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Die vorliegende Erfindung überwindet
deshalb die den Verfahren des Standes der Technik inherenten Probleme
durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung organosilanisierter
kolloidaler Kieselsäurepartikel,
das die Silanisierung der Kieselsäure unter wässrigen Bedingungen ermöglicht,
das leicht für
Massenfertigungsverfahren in größerem Maßstab eingesetzt
werden kann. Das erhaltene silanisierte kolloidale Kieselsäurepräparat ist
sehr stabil und bleibt auch nach mehrfachen Arbeitsgängen im
Autoklaven und/oder nach Bestrahlung mit Gammastrahlen in der löslichen
Phase, wie es zur Sterilisierung des Mediums nötig ist. Die Formulierung ist
besonders gut geeignet zur Verwendung bei Tierzellenpräparaten,
da sie in einer physiologischen Salzlösung ohne Gelbildung oder ohne
Bildung eines Niederschlags suspendiert werden kann. Außerdem ist
sie für
solche Zellen relativ nicht toxisch, was durch die Beobachtung gezeigt
wurde, dass sie zur Verarbeitung menschlicher Zellen zur Transplantation
ohne nachteilige Wirkungen für
Empfänger
verwendet werden kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein neues,
für die
Umwelt sicheres Verfahren zur Herstellung einer stabilen, organosilanisierten
kolloidalen Kieselsäuresuspension
unter wässrigen
Bedingungen. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Massenfertigung
von organosilanisierten kolloidalen Kieselsäurepartikeln.
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Es ist die Feststellung der Erfindung,
dass die hauptsächlichen
Reagenzien zur Herstellung der organosilanisierten kolloidalen Kieselsäuresuspension
auf verhältnismäßig schnelle
Weise miteinander gemischt werden können, ohne auf die langsame
Beimischung oder tropfenweise Zugabe zurückzugreifen, die bei den Verfahren
des Standes der Technik nötig
sind. Das ist möglich,
wenn der pH-Wert des Organosilanreagenzes auf einen Bereich von
etwa 2–3
eingestellt wird und das Reagenz weiter etwa 1 Stunde auf etwa 80°C erwärmt wird.
Zu diesem behandelten Organosilan wird dann eine kolloidale Kieselsäuresuspension
zugegeben, wobei ein Gemisch aus Organosilan/kolloidale Kieselsäure-Gemisch
mit einer Endkonzentration zwischen etwa 5 bis etwa 10 Prozent Vol/Vol
erzeugt wird. Der pH-Wert des Organosilan/kolloidale Kieselsäure-Gemisches wird auf
einen pH-Wert von höher
als etwa 6,0, in bevorzugten Ausführungsformen in dem Bereich
von 6–7
oder besonders von pH 6,2–6,5,
eingestellt. Die Suspension wird dann in einem Zeitraum, der wirksam
ist, eine stabile kolloidale Suspension herzustellen, "gehärtet".
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Gemäß den bevorzugten Ausführüngsformen
wird das Härten
zum Beispiel durch Erwärmen
auf mindestens etwa 80°C
oder durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung erreicht. Eine
solche stabile Suspension wird durch das Ausbleiben der Bildung
eines Niederschlags in Gegenwart eines physiologischen Salzes oder Säure angezeigt.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
hat das Organosilan die allgemeine Formel:
(X)3-Si-(CH2)3-Y , wobei
Y
aus
ausgewahlt ist. Gemäß dieser
Ausführungsform
ist X aus H
3CO, Cl und H
5C
2O ausgewählt.
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Bei noch einer weiteren Ausführungsform
ist das Organosilan γ-Glycidoxypopyltrimethoxysilan.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
liegt der pH-Wert der Reaktion im Bereich von etwa 6,0 bis etwa
7,0, und vorzugsweise im Bereich von 6,2 bis 6,5.
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Die Kieselsäurepartikel, die die kolloidale
Kieselsäuresuspension
bilden, können
in jedem Größenbereich
vorliegen, der mit dem Aufrechterhalten der kolloidalen Suspension
vereinbar ist; bevorzugte Größenbereiche
schließen
Durchmesser von etwa 3 bis etwa 12 nm, stärker bevorzugt Durchmesser
von etwa 7 bis 12 nm ein.
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Gemäß einem wichtigen Merkmal der
Erfindung wird die Stabilität
der Kieselsäuresuspension
durch die Beständigkeit
gegenüber
wiederholtem Behandeln im Autoklaven und der Beständigkeit
gegenüber
einer Bestrahlung mit Gammastrahlen und der Stabilität in Gegenwart
von physiologischen Konzentrationen von Salzen, wie 0,9% Natriumchlorid
(Salzlösung),
bewiesen. Das vorstehende Herstellungsverfahren ist auch relativ
nicht toxisch für
die Umwelt, da die Reagenzien und Komponenten wässrig sind. Die erhaltene Zusammensetzung
ist auch relativ untoxisch für
Zellen, die in der silanisierten kolloidalen Kieselsäure suspendiert sind.
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Diese und andere Aufgaben und Merkmale
der Erfindung werden vollständiger
ersichtlich, wenn die nachstehende ausführliche Beschreibung der Erfindung
in Verbindung mit den zugehörenden
Zeichnungen gelesen wird.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
den Reaktionsablauf der Silanisierung von Silanolgruppen auf der
Oberfläche
eines kolloidalen Kieselsäurepartikels
(Beispiel 1);
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2A und 2B zeigen die Wirkung einer
wiederholten Behandlung im Autoklaven auf die gemessene Dichte von
kolloidaler Kieselsäure,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde in Abwesenheit (2A) und in Gegenwart
(2B) von Salzen;
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3A und 3B zeigen die Wirkung von
wiederholter Behandlung im Autoklauen auf die gemessene Osmolalität der kolloidalen
Kieselsäure,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde in Abwesenheit (3A) und in Gegenwart
(3B) von Salzen;
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4A und 4B zeigen die Wirkung von
wiederholten Behandlungen im Autoklauen auf den gemessenen pH-Wert
von kolloidaler Kieselsäure,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde in Abwesenheit (4A) und in Gegenwart
(4B) von Salzen;
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5 zeigt
die prozentuale Wiedergewinnung von verschiedenen Zelltypen, die
an der Grenzfläche der
Probe nach dem Verarbeiten in kolloidaler Kieselsäure vorliegen,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde;
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6 zeigt
die Lebensfähigkeit
von Zellen in Prozent, die in Gegenwart oder Abwesenheit von kolloidaler
Kieselsäure,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
(Beispiel 3) hergestellt wurde, inkubiert wurden; und
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7 zeigt
die Wiedergewinnung von Zellen (Kolonien bildende Einheiten; CFU)
in Prozent, die unter verschiedenen Bedingungen (Beispiel 3) präpariert
wurden.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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I. Definitionen
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"Kolloidale Kieselsäure" bezieht
sich auf eine wässrige
Suspension von kolloidalen Kieselsäurepartikeln, die gewöhnlich durch
Polymerisation von Orthokieselsäure
aus in Wasser gelöstem
SiO2 erzeugt werden.
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"Organosilanisierte kolloidale Kieselsäure (OCS)-Partikel"
bezieht sich auf eine kolloidale Kieselsäurezusammensetzung, an die
eine Organosilanbeschichtung kovalent gebunden ist. Das U.S. Patent
4,927,749 ist hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme im Hinblick
auf seine Beschreibung einer Herstellung einer organosilanisierten
kolloidalen Kieselsäure
aufgenommen.
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Der Ausdruck "stabile silanisierte
kolloidale Kieselsäuresuspension",
wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf kolloidale Kieselsäurepartikel,
die gemäß der vorstehenden
Beschreibung organosilanisiert wurden, die ferner dadurch gekennzeichnet
sind, dass sie in Bezug auf den pH-Wert, die Osmolalität und die Dichte oder nach
einer oder mehreren Behandlungen im Autoklauen oder Bestrahlung
mit Gammastrahlen eine Stabilität
der Zusammensetzung von mehreren Tagen aufweisen. Eine stabile kolloidale
Kieselsäuresuspension
wird durch das Ausbleiben der Bildung eines Niederschlags oder das
Ausbleiben der "Gelbildung" nach solchen Behandlungen angezeigt.
Solche stabilen Suspensionen bleiben auch in Gegenwart von oder
nach der Zugabe von physiologischen Salzkonzentrationen, wie 0,9%
(Gew/Vol) Natriumchlorid, stabil und sie sind gegenüber der
Zugabe von Säure
stabil, wobei ein pH-Wert von etwa 5–6 erzeugt wird. Im Gegensatz
dazu tritt, wenn ein physiologisches Salz oder genügend Säure zu einer
instabilen Lösung
zugegeben werden, eine Gelbildung oder die Bildung eines Niederschlags
auf, was durch die Veränderung
der vorher klaren Suspension in eine weiße oder undurchsichtige Substanz
angezeigt wird.
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Der Ausdruck "Sol", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein flüssiges
Kolloid, eine Suspension oder ein Gemisch, in dem feste Partikel
in einer flüssigen
Phase stabil dispergiert sind.
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Der Ausdruck "Gel", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine kolloidale Suspension einer Flüssigkeit
in einem Feststoff, wobei ein geleeartiges Material, eine festere
Form als ein Sol, gebildet wird.
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Der Ausdruck "nicht toxisch" für Zellen
bedeutet, dass eine Substanz in engen Kontakt mit einer Suspension
von biologischen Zellen während
mindestens 30 Minuten ohne Verminderung der Zahl der lebensfähigen Zellen
um mehr als etwa 20% gebracht werden kann. Vorzugsweise sind solche
lebensfähigen
Zellen auch funktional, wie durch eine geeignete Funktionsprüfung beurteilt
wird. Beispiele für
Verfahren zum Messen der Zelltoxizität und der Funktionalität werden
hier in den Beispielen 3–5
bereitgestellt.
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II. Verfahren zur Herstellung
einer stabilen silanisierten kolloidalen Kieselsäuresuspension
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Wie vorstehend zusammengefasst, haben
die Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung von silanisierten
Kieselsäurepartikeln
eine von zwei Hauptgruppen von Reaktionsbedingungen verwendet: entweder
(1) in einer wässrigen
Umgebung, wobei die Umsetzung bei einem sauren pH-Wert (etwa pH
5,5) durchgeführt
wird, wobei das Silan zu dem wässrigen
kolloidalen Kieselsäure-"Sol"
in tropfenweiser Form oder durch eine sehr langsame Zugabe zugegeben
wird, um die Gelbildung des Sols zu verhindern, oder (2) die Reaktion wird
in einem organischen Lösungsmittel
durchgeführt.
Das Reaktionsprodukt wird in beiden allgemeinen Verfahren während der
chemischen Synthese "gehärtet"
oder stabilisiert.
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Wie vorstehend erörtert, wird die Verwendung
von organischen Lösungsmitteln
im allgemeinen bei einer Anzahl von Anwendungen wegen der Toxizität und der
Bedenken hinsichtlich des toxischen Abfalls, als nicht erwünscht angesehen.
Besonders im Zusammenhang mit der Herstellung von Materialien zur
Trennung von biologischen Fraktionen auf Basis der Dichte führt der
Einschluss von organischen Lösungsmitteln
im allgemeinen zur Zelltoxizität.
Die bekannten Verfahren zur Silanisierung von kolloidaler Kieselsäure unter
wässrigen
Bedingungen sind im allgemeinen zu beschwerlich und zu zeitaufwändig für Verfahren
mit hoher Kapazität,
die zur industriellen Herstellung des Materials nötig sind;
außerdem
kann auch bei der Verwendung dieser Verfahren die Gelbildung des
Produkts eintreten.
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Das Verfahren, das der Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist, macht die mühsame, langsame (tropfenweise)
Zugabe des Reagenz unnötig
und stellt ein silanisiertes Produkt her, das stabil und für biologische
Materialien, wie Zellen, nicht toxisch ist, wie in dem nachstehenden
Abschnitt N gezeigt wird. Da der Stand der Technik nahe legt, dass
organosilanisierte Zusammensetzungen unter wässrigen Bedingungen instabil
sind, stellt das erfindungsgemäße Verfahren
durch das Bereitstellen eines für
die Umwelt sicheren Verfahrens zur Herstellung einer stabilen, wässrigen
Zusammensetzung eine bedeutende Verbesserung bereit.
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Ohne sich auf eine besondere Theorie
festzulegen, wird angenommen, dass das erfindungsgemäße Verfahren
zunächst
zu einer Bildung einer Siloxanbindung zwischen den Silanolgruppen
auf der Oberfläche der
Kieselsäurepartikel
und der reaktiven Einheit des Silanrests führt und dass die Bindung des
Organosilans an die Kieselsäurepartikel
durch ein Härtungsverfahren,
das das Aussetzen des Reaktionsprodukts gegenüber einer relativ hohen Reaktionstemperatur
(höher
als etwa 80°C)
für etwa
eine bis mehrere Stunden einschließt, weiter verstärkt wird.
Die Reaktion ist in 1 veranschaulicht,
wobei das Organosilan γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan
als Beispiel verwendet wird.
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Beispiel 1 stellt Einzelheiten des
erfindungsgemäßen Verfahrens
bereit, wie es unter Verwendung von γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan
(GPMS) als Silanisierungsmittel durchgeführt werden kann. Es ist verständlich,
dass dieses Verfahren leicht an beliebige oder alle Organosilane mit
einer genügenden
Reaktivität
zur Bildung von Siloxanin Lösung
angepaßt
werden kann. Tabelle 1 stellt eine Liste von Organosilanen als Beispiele bereit,
die verwendet werden können,
um erfindungsgemäße Zusammensetzungen
zu erzeugen. Während das
erfindungsgemäße Verfahren
unter Verwendung von GPMS als Organosilanreagenz als Beispiel angegeben
wird, ist es verständlich,
dass Reaktionszeiten und die Optimierung von Bedingungen von dem
speziell ausgewählten
Reagenz abhängen
werden; es liegt im Bereich der Fachkenntnis des Praktikers, die
optimierten Bedingungen zu bestimmen.
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Beispiel 1 gibt die Verwendung von
GPMS zur Organosilanisierung von kolloidalen Kieselsäurepartikeln
als Beispiel, die zur Herstellung eines biologischen Trennungsmediums
geeignet sind. Das GPMS wird hier zuerst zu Wasser zugegeben, wobei
eine Lösung
mit einer Endkonzentration von etwa 10 Prozent VoUVoI erzeugt wird.
Gemäß eines
wichtigen Merkmals der Erfindung wird die Lösung durch Zugabe einer Säure angesäuert (pH-Wert
etwa 2,5) und dann 60 Minuten auf 80°C erwärmt. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur
abgekühlt.
Zu der wässrigen
Silanlösung
wird unter kontinuierlichem Rühren
kolloidale Kieselsäure
zugegeben bis die gesamte Silankonzentration in dem Bereich von
5–10%,
vorzugsweise etwa 6–8%
Vol/Vol, liegt. Der pH-Wert des Silan-/Kieselsäure-Gemisches wird auf 6,2
bis 6,5 eingestellt und die Lösung
bei Raumtemperatur etwa 15–30
Minuten gerührt.
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Das für die vorstehenden präparativen
Schritte verwendete Silan kann jedes Silan aus einer Anzahl von
Silanverbindungen sein. Das entscheidende Merkmal der Silanauswahl
besteht darin, dass die Verbindung unter wässrigen Bedingungen löslich ist.
Demgemäß schließen, rieben
GPMS, geeignete Organosilane die in dem U.S. Patent 4,927,749 (Dorn),
das hier mit Bezugnahme aufgenommen ist, angegebenen Verbindungen
ein, sie sind aber nicht darauf eingeschränkt. Tabelle 1 stellt Beispiele
für verschiedene
Silane bereit, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können;
die Erfindung ist jedoch nicht auf die Aufzählung in Tabelle 1 eingeschränkt.
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Tabelle
1
Organosilane, die verwendet werden können, um eine reagenzmodifizierte
kolloidale Kieselsäure
herzustellen
Bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren
werden vorzugsweise Trialkoxysilane mit der Formel RSi(OR
1)
3 verwendet,
wobei der Rest R
1 ein aliphatischer oder
organischer Arylrest, typischerweise mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen,
wie eine n-Butyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl, n-Octyl-, t-Butyl-, 3-Butenyl-,
Phenylgruppe oder dergleichen, bedeutet. Diese hier durch GPMS als
Beispiel gegebenen Verbindungen sind wegen ihrer hohen Reaktivitäten, verglichen
zum Beispiel mit Dialkoxysilanen und Monoalkoxysilanen, die auch
verwendet werden können,
bevorzugt. Als Beispiele dienende Trialkoxysilane sind in dem U.S.
Patent 4,644,077 (Gupta) aufgeführt,
das hier unter Bezugnahme aufgenommen ist.
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Die kolloidale Kieselsäure als
Ausgangsmaterial ist vorzugsweise eine Zusammensetzung kolloidaler Kieselsäurepartikel,
umfassend eine wässrige
Suspension von Kieselsäurepartikeln
in einem Größenbereich von
etwa 1 bis etwa 5000 nm; für
die Zwecke der Herstellung eines Zelltrennmaterials sind Partikel
im Größenbereich
von 5–22
nm und besonders von 7–10
nm erwünscht.
Ein Beispiel für
ein Ausgangsmmterial ist "LUDOX HS-40", hergestellt von W. R. Grace & Co., wie hier
in Beispiel 1 beschrieben.
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Wie vorstehend erwähnt, ohne
sich auf einen zugrundeliegenden Mechanismus der Erfindung festzulegen,
wird angenommen, dass die Bildung einer Bindung zwischen den Partikeln
und dem zugegebenen Silanreagenz entweder durch Bildung von mehreren
Siloxanbindungen, intramolekularen Bindungen oder dergleichen durch
ein nachfolgendes "Härtungs"-Verfahren
verstärkt
wird. Typischerweise wird ein solches Härten durch Wärmebehandlung
bewirkt; zum Beispiel durch Erwärmen
der Suspension über
60 Minuten auf 80°C und
anschließend
3 Stunden auf 95°C,
wie es hier in Beispiel 1 ausführlich
beschrieben wird. Als Alternative oder zusätzlich kann das Härten jedoch
durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen, zum Beispiel wie
in dem U.S. Patent 4,822,828 beschrieben, das hier unter Bezugnahme
aufgenommen ist, bewirkt werden. Um zum Beispiel die Vollständigkeit
des Härtungsverfahrens
sicherzustellen, folgt nach einer Wärmebehandlung eine Bestrahlung
mit ultravioletten Strahlen. Andere geeignete oder äquivalente
Härtungsverfahren
werden den Fachleuten ersichtlich sein.
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III. Stabilität der silanisierten
Partikel
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Gemäß einer wichtigen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die silanisierten Teilchen, die
nach dem beanspruchten Herstellungsverfahren hergestellt werden,
sowohl besonders stabil gegenüber hohen
Temperaturen, wie sie bei Standardbedingungen im Autoklaven (121°C, 2,1 bar,
30 Minuten) vorliegen, als auch gegenüber einer ionisierenden Strahlung,
wie Gamma strahlung, in einer Dosis zwischen etwa 2,5 und 4,0 Megarad.
Die Stabilität
wird typischerweise durch den Vergleich von physikalischen Parametern,
wie des pH-Werts, der Osmolalität
und der Dichte des Präparats
vor und nach der Behandlung, wie nachstehend beschrieben, gemessen.
Die Stabilität
wird auch durch Zugabe eines Salzes oder einer Säure zu der Suspension bewertet,
wobei eine physiologische Salzkonzentration (0,9% Gew./Vol
Natriumchlorid) beziehungsweise ein pH-Wert von etwa 5–6 erzeugt
wird. Wenn diese Zugaben durchgeführt werden, wird bei einer
stabilen Suspension die Bildung eines Niederschlags ausbleiben oder
kein "Gel" auftreten, während
eine instabile Suspension wegen der Bildung des Niederschlags oder
der Gelbildung weiß oder
undurchsichtig wird.
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Die 2A und 2B zeigen die Wirkung von
wiederholten Autoklavenbehandlungen (2–4 Zyklen, jeweils 121°C, 30 Minuten)
auf die gemessene Dichte der organosilanisierten kolloidalen Kieselsäure. Wie
gezeigt, blieb die Dichte der Suspension in Abwesenheit oder Anwesenheit
von physiologischen Salzen konstant.
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Ebenfalls blieb die Osmolalität und der
pH-Wert der Suspension in Abwesenheit oder Anwesenheit von Salzen
nach 2–4
Zyklen der Autoklavenbehandlung (3A, 3B, 4A, 4B)
konstant. Bei diesen Versuchen waren die Anfangs- und Endzustände der
Suspension wie folgt: Dichte 1,0605 g/ml, pH 7,4, Osmolalität 280 mOsm
(+ Salze). Diese physikalisch-chemischen Parameter wurden verwendet,
um bestimmte Typen von nützlichen
Zellen, wie hämatopoetische
Vorläuferzellen,
Lymphozyten, dendritische Zellen, Mesenchymzellen und dergleichen
zu isolieren.
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In weiteren Versuchen, die zur Untermauerung
der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde festgestellt,
dass silanisierte kolloidale Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde, auch gegenüber
Bestrahlung, besonders in dem Bereich von 2,5–4,0 Megarad, stabil ist. Das
entspricht den Dosisbereichen, die üblicherweise zur definitiven
Sterilisierung von Lösungen,
zum Beispiel zur Isolierung von biologischen Zellen, verwendet werden.
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IV. Biologische Kompatibilität von silanisierter
kolloidaler Kieselsäure
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Die Trennung von Zellen durch eine
Dichtegradientzentrifugierung ist eine in der Biotechnologie beliebtes
Verfahren. Dieses Verfahren nutzt die Tatsache aus, dass sich Zellen
in einem definierten Dichtemedium gemäß des Auftriebs durch ihre
steigenden Dichten trennen. Für solche
Trennungen werden verschiedene Dichtegradientmaterialien, einschließlich der
auf kolloidaler Kieselsäure
basierenden Medien, verwendet.
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Ein Beispiel für ein auf kolloidaler Kieselsäure basierendes
Dichtemedium, das überlicherweise
bei der Dichtegradienttrennung verwendet wird, ist "PERCOLL" (eine
eingetragene Marke von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ).
PERCOLL ist eine stabile Suspension von kolloidalen Kieselsäurepartikeln
mit Polyvinylpyrrolidon-Beschichtungen. Während PERCOLL bei physiologischem
pH-Wert verhältnismäßig stabil
ist, ist es gegenüber
einer Sterilisierung unter Verwendung von Wärme oder ionisierender Bestrahlung
unter physiologischen Bedingungen (z. B. wenn es in einer physiologischen
Salzlösung
verdünnt
ist) instabil. Diese Eigenschaften schränken die Verwendbarkeit des
Produkts, besonders im Zusammenhang mit klinischen Anwendungen,
die die Wiedereinführung
von abgetrennten Zellen in Menschen oder irgendwo anders einschließen, wo
ein definitiv sterilisiertes Material nötig ist, ein.
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Das U.S. Patent 4,927,749 stellt
ein organosilanisiertes kolloidales Kieselsäure (OCS)-Partikel (OCSP)-Präparat zur
Dichtegradienttrennung bereit, das einige vorstehend besprochene
Probleme überwindet.
Dieses Medium hat hinsichtlich PERCOLL den Vorteil, dass es für Zellen,
besonders "seltene" Zellen, wie hämatopoetische Vorläuferzellen,
Stammzellen, Antigen-spezifische Lymphotypen, Mesenchymzellen und dergleichen,
besonders nach dem Sterilisieren des Mediums, viel weniger toxisch
ist. Jedoch schließt,
wie vorstehend erwähnt,
das in dem U.S. Patent 4,927,749 beschriebene Herstellungsverfahren
eine langsame Zugabe von Silan zu dem Präparat ein, was nicht praktisch
und für
Verfahren der Massenfertigung teuer ist.
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Es ist die Feststellung der vorliegenden
Erfindung, dass ein silanisiertes kolloidiles Kieselsäurepartikelpräparat unter
Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt werden
kann und dass dieses Präparat
in ähnlicher
Weise nicht toxisch für
biologische, Präparate,
besonders isolierte Blutzellenfraktionen, ist, wie nachstehend beschrieben
wird. Im Gegensatz dazu sind, wie vorstehend diskutiert, Produkte des
Standes der Technik häufig
schlecht herzustellen, gegenüber
Sterilisierung instabil und/oder für Zellen toxisch.
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5 zeigt
die prozentuale Wiedergewinnung von verschiedenen Typen von Zellen,
die an der Grenzfläche
einer Blutprobe nach dem Verarbeiten auf kolloidaler Kieselsäure, die
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde, vorhanden sind. Kurz gesagt wurde PBMC in ein
Zentrifugenröhrchen über organosilanisierte
kolloidale Kieselsäure
mit einer Dichte von 1,0605, pH 7,4, 280 mOsm eingebracht und, wie
in Beispiel 2 beschrieben, zentrifugiert. Von der Grenzfläche zwischen
dem eingebrachten Material und dem Dichtegradientmaterial wurden
Zellen wiedergewonnen und auf den Zelltyp unter Verwendung von Färbungs- und
FACS-Analyseverfahren, wie in Beispiel 4 ausführlich dargestellt,
analysiert. Wie in 5 gezeigt waren CD34+-Zellen und CD14+-Zellen,
wie unter den verwendeten Bedingungen erwartet, die überwiegend
isolierten Zellformen.
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Weitere Versuche zeigten, dass hämatopoetische
Vorläuferzellen
lebensfähig
waren, auch wenn sie 24 Stunden mit organosilanisierter kolloidaler
Kieselsäure
inkubiert wurden. 6 zeigt
die Ergebnisse von Versuchen, bei denen CD34+-Zellen
30 Minuten und 24 Stunden mit Puffer (PBS), kolloidaler Kieselsäure (CS) oder
fötalem
Kälberserum
(FCS) inkubiert und dann auf die Lebensfähigkeit geprüft wurden.
Wie gezeigt, waren die mit kolloidaler Kieselsäure inkubierten Zellen so lebensfähig wie
die Zellen, die mit Puffer oder fötalem Kälberserum inkubiert wurden.
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In weiteren Studien, die in Beispiel 3 ausführlich beschrieben
sind, wurde die funktionale Lebensfähigkeit von verschiedenen Zelltypen
gemessen, nachdem sie 30 Minuten lang PBS oder kolloidaler Kieselsäure ausgesetzt
wurden, 30 Minuten PBS oder kolloidaler Kieselsäure, gefolgt von 24 Stunden
einem Zellenwachstumsmedium (Iscove Puffer + Serum) ausgesetzt wurden
oder 24 Stunden PBS oder kolloidaler Kieselsäure in Gegenwart von Serum
ausgesetzt wurden. Wie in 7 gezeigt,
wurde die funktionale Lebensfähigkeit
(biologisches, proliferatives und Differenzierungspotential), wie
in Beispiel 5 beschrieben, durch eine Koloniebildungsprüfung beurteilt.
Die Werte zeigen, dass auch unter den strengsten Inkubationsbedingungen
die koloniebildenden Eigenschaften für die CD34+-Zellen
unverändert
waren.
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Toxikologische in vivo-Versuche,
die zur Untermauerung der vorliegenden Erfindung bei Säugern durchgeführt wurden,
zeigten auch, dass das Produkt offenbar nicht toxisch ist, wenn
es intravenös
oder intrakutan verabreicht wird. Das Produkt hat als solches den
zusätzlichen
Vorteil, dass es zur Verwendung bei der Trennung und Herstellung
von Zellen zur Einführung
bei Säugern,
wie bei der Stammzellentransplantation, geeignet sein kann.
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Die Erfindung stellt auch ein für die Umwelt
sicheres Verfahren zur Herstellung von kolloidalem Kieselsäurematerial
bereit, da es unter Verwendung von wässrigen, relativ nicht toxischen
Herstellungsmaterialien durchgeführt
wird.
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Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen
die vorliegende Erfindung, sie sollen sie aber in keiner Weise einschränken.
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Materialien
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A. Präparation von peripheren Blutvorläuferzellen
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Periphere einkernige Blutzellen (PBMC),
die durch Apherese von non-Hodgkins Lymphom(NHL), Hodgkins Lymphom-
(HL) und Brustkrebspatienten gesammelt wurden, wurden von dem Bone
Marrow Transplantation Laboratory der Stanford University School
of Medicine, Palo Alto, CA, U.S.A. erhalten. PBMC wurden in NHL-Patienten
durch Behandlung mit Cyclophosphamid (4 g/m2,
intravenös),
gefolgt von G-CSF (10 μg/kg,
intravenös,
täglich)
mobilisiert. PBMC wurden in Brustkrebspatientinnen durch Behandlung
mit VP-12 (2 g/m2, intravenös), gefolgt
von G-CSF (10 μg/kg,
intravenös,
täglich)
mobilisiert. PBMC wurden in HL-Patienten nur durch Behandlung mit
G-CSF mobilisiert.
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B. Antikörper
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Monoklonale Antikörper (mAb), die gegen Oberflächenantigene
gerichtet waren, die spezifisch für hämatopoetische Vorläuferzellen
(CD34, anti-HPCA-2) und Leukozyten (CD45, anti-HLe-1) sind, wurden
von Becton-Dickinson, Inc. (San Jose, CA) erhalten. Die verschiedenen
mAb wurden direkt mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin
(PE) gemäß Standardmethoden
gekennzeichnet (Ausubel et al., 1993). Die PE gekennzeichneten Isotyp
Kontroll-IgG1 polyklonalen Antikörper
wurden von Becton-Dickinson, Inc. (San Jose, CA) erhalten.
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Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen
die vorliegende Erfindung, aber sie sollen sie in keiner Weise einschränken.
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Beispiel 1
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Herstellung von silanisierter
kolloidaler Kieselsäure
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γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan
(GPMS; United Chemicals, Bristol, PA) wurde zu Wasser zugegeben,
wobei eine Lösung
mit einer Endkonzentration von 10% Vol/Vol erzeugt wurde. Der pH-Wert
wurde mit 1 N HCl unter kontinuierlichem Rühren auf 2,5 gesenkt. Die Lösung wurde
60 Minuten auf 80°C
erwärmt
und dann auf Raumtemperatur gekühlt.
Kolloidale Kieselsäure
(Ludox HS-40, W. R. Grace & Co.,
Columbia, MD) wurde zu der wässrigen
Silanlösung
langsam zugegeben, wobei kontinuierlich gerührt wurde, bis die Gesamtkonzentration
von Silan 7% Vol/Vol betrug. Der pH-Wert des Silan/Kieselsäure-Gemisches
wurde auf 6,2 bis 6,5 eingestellt und die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt.
Die Lösung
wurde dann 60 Minuten auf 80°C
und anschließend
3 Stunden auf 95° erwärmt. Die
Lösung
wurde auf Raumtemperatur gekühlt
und der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 9–10 erhöht. Das silanisierte kolloidale
Kieselsäurepräparat wurde
durch eine Säule
mit Aktivkohle geleitet, wobei Nebenprodukte der Reaktion entfernt
wurden.
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Beispiel 2
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Dichtegradientzentrifugierung
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PBMC wurden auf eine Dichtegradientenlösung unter
Verwendung einer Pipette geschichtet. Das Schichten wurde langsam
durchgeführt,
um ein Mischen der Probe mit der Lösung zu vermeiden. Ein Maximum
von 2 × 109 Zellen wurde pro Röhrchen aufgeschichtet. Das
Zentrifugieren wurde 30 Minuten mit 850 g bei Raumtemperatur durchgeführt. Um
das Vermischen der Zellen und der Dichtegradientlösung zu
verhindern, wurde die Zentrifuge ohne Bremskraft angehalten. Die
Zellen wurden in eine Fraktion niederer Dichte, die sich an der
Grenzfläche
befand, und eine Fraktion hoher Dichte getrennt, die das Pellet
bildet. Beide Zellfraktionen wurden unter Verwendung einer Pipette
aufgenommen und in eine anderes 50 ml Zentrifugenröhrchen aus
Polypropylen gegossen. Die Zellen wurden einmal gewaschen und in
Ca++- und Mg++-freiem
Dulbecco D-PBS bei Raumtemperatur bis zur weiteren Bearbeitung gelagert.
Die Zahl und die Funktionalität
der hämatopoetischen
Vorläuferzellen
(CD34+-Zellen) wurde in beiden Zellfraktionen
durch FACS-Analyse und klonogene Prüfungen, wie in den 5 beziehungsweise 7 gezeigt, bestimmt.
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Beispiel 3
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In vitro-Toxikologie
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Der Zweck dieser Versuche bestand
in der Beurteilung der Wirkung des Mischens und der nachfolgenden
Inkubierung von menschlichem peripheren Blut in die Dichtegradientenlösung. Die
Aufgabe der Untersuchung bestand darin, festzustellen, ob die Dichtegradientenlösung eine
Wirkung auf die Lebensfähigkeit
und die Funktionalität
von menschlichen hämatopoetischen
Stammzellen ausübt.
Es wurden in diesen Versuchen sechs verschiedene Misch- und Inkubierungsmusterbeispiele
verwendet, wie nachstehend dargestellt wird.
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Genauer wurden 3 × 107 Zellen
in 5 m1 Testpuffer oder eine Dichtegradientenlösung in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen aus
Polypropylen suspendiert. Die Probe wurde dann für eine bestimmte Zeit bei Raumtemperatur
inkubiert, wie nachstehend in Tabelle 2 angegeben ist. Die Zellen
wur den 30 Minuten, 30 Minuten, gefolgt von 24 Stunden in ein Zellkulturmedium
(Iscove Puffer + 10% fötales
Kälberserum)
oder 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aufgenommen und auf
ihre Fähigkeit überprüft, hämatopoetische
Kolonien (CFU-E, BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM) zu bilden. Außerdem wurde eine Beurteilung
durch Messen des Volumens der PBMC-Probe durchgeführt und die Hälfte des
Volumens in jedes von zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen eingebracht. Die Zellproben
wurden dann in insgesamt 50 ml Volumen unter Verwendung von 1 × D-PBS
(Ca++, Mg++ frei)
resuspendiert. Ein Röhrchen
wurde 10 Minuten bei 550 g zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit
abgetrennt. Das Pellet wurde auf das ursprüngliche Volumen ml unter Verwendung
einer CD34-Anreicherungslösung
resuspendiert. Die Zellen in jedem Aliquot wurden dann gezählt.
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Beispiel 4
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Färbungsverfahren und Quantifizierung
von CD34+-Zellen durch die FACS-Analyse
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Die Quantifizierung von CD34+-Zellen wurde durch FACS-Analyse durchgeführt. Die
Zellen wurden mit einem Kernfarbstoff und auf CD34 und CD45 gerichtetes
mAbs gekennzeichnet. Der Prozentsatz an CD34-Zellen wurde im Gate
mit Zellen bestimmt, die Kerne aufwiesen. Diese Methode wurde gewählt, um
die Überlagerung
von Festteilchenmaterial ohne Kerne mit der Genauigkeit der CD34-Zellanalyse
in der FACS zu vermeiden.
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In Ca++-
und Mg++-freiem D-PBS wurde eine Zellsuspension
von 2 × 107 Zellen/ml hergestellt. 50 μl dieser
Zellsuspension wurden in Vertiefungen von 96 Well-Mikrotiterplatten
bei einer Konzentration von 1 × 106 Zellen pro Vertiefung verteilt. 50 μl einer 20%-igen, wärmeinaktivierten
Kaninchenserum-/D-PBS-Lösung
wurden dann zu jeder Vertiefung zugegeben, anschließend 10 μ1 einer 10 μg/m1 LDS-Lösung und
75 μ1/D-PBS-Lösung zu
jeder Vertiefung. Die Inhalte jeder Vertiefung wurden gemischt.
Die Mikrotiterplatte wurde mit einer Folie bedeckt und 30 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Zu jeder Kontrollvertiefung wurden
20 μl IgGl-Phycoerythrin
(IgG1-PE) und 20 μg
CD34-PE zugegeben und dann wurde gemischt. Die Platte wurde wieder
mit einer Folie bedeckt und 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden
dann 2 Minuten bei 850 g bei 4°C
zentrifugiert. Die Platten wurden gekippt, um überstehende Flüssigkeit
zu entfernen, anschließend wurde
jedes Zellpellet in 200 μl
kaltem (4°C)
1 × D-PBS
(Ca++- und Mg++-frei)
resuspendiert. Die Platten wurden 5 Minuten bei 850 g bei 4°C zentrifugiert,
dann schnell gekippt, um überstehende
Flüssigkeit
zu entfernen. Jedes Zellpellet wurde in 50 μl 20%-iger wärmeinaktivierter Kaninchenserumlösung resuspendiert.
Zu jeder Kontrolle und jedem Testbehälter wurde 20 μ1 CD45-FITC
zugegeben und anschließend
wurde gemischt. Die Platten wurden mit einer Folie bedeckt und 30
Minuten bei 4°C
inkubiert. Ein 100 μl
Aliquot von kaltem (4°C)
1 × D-PBS
(Ca++- und Mg++-frei)
wurde zu allen Kontrollund Testbehältern zugegeben. Jede Platte
wurde 5 Minuten bei 850 g bei 4°C
zentrifugiert und anschließend
schnell gekippt, um überstehende
Flüssigkeit
zu entfernen. Die Zellpellets wurden in 100 μl kaltem (4°C) 1 × D-PBS (Ca++-
und Mg++-frei) resuspendiert und anschließend 5 Minuten
bei 850 g bei 4°C
zentrifugiert. Die Platten wurden dann schnell gekippt, um überstehende
Flüssigkeit
zu entfernen, und jedes Zellpellet wurde in 200 μl 1%-igem Paraformaldehyd (4°C) resuspendiert.
Die Platten wurden mit einer Folie bedeckt und verblieben bei 4°C bis zur
FACS-Analyse.
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Die FACS-Analyse wurde an 104-Fließfolgen
unter Verwendung eines FACS Star Plus-Systems, ausgerüstet mit
einem LYSIS II-Programm (Becton-Dickinson Inc.), durchgeführt. Ein
Gate (Region 1) wurde um die Zellen mit Kernen gelegt,
die durch LDS751-Färbung
in FL3 bestimmt wurden, um die roten Zellen, Plättchen und Ausschuß auszuschließen. FL1
und FL2 wurden als eine Punktgrafik unter Verwendung der Region 1 wiedergegeben.
Ein Gate (Region 2) wurde um die Zellpopulation gelegt,
die sowohl mit dem anti-CD45 als auch anti-CD34 mAb gefärbt ist.
Der prozentuale Anteil von Zellen, die mit dem anti-CD34 (FL2) und
anti-CD45 (FL1) mAb gefärbt
sind, wurde in Region 2 bestimmt. Das stellt den prozentualen
Anteil der CD34 positiven Coils an der Gesamtzahl von Zellen mit
Kernen dar. Die Gesamtzahl von CD34 positiven Zellen wurde in der nicht
verarbeiteten Probe und in der Zellfraktion bestimmt, die aus der
Grenzfläche
und dem Pellet nach dem Verarbeiten der PBMC-Proben auf der Dichtegradientenlösung erhalten
wurde.
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Beispiel 5
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Beurteilung der Kolonienbildung
(CFU)
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Die Zellen wurden mit 105 Zellen
in 1 ml halbfester Methylcellulose gemischt, die verschiedene koloniestimulierende
Faktoren und Erythropoietin (MethoCult® H4433
medium, Terry Fox Laboratories, Vancouver) enthalten. Nach 14 Tagen
Züchtung
bei 37°C
wurden das Erythroid (CFU-E, BFU-E), Granulozyten/Makrophagen (CFU-GM)
und gemischte (CFU-GEMM) Kolonien unter einem umgekehrten Mikroskop
(40 ×)
gezählt.
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Beispiel 6
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Statistische Analyse
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Die Zellenwiedergewinnung in Prozent
wurde durch die Formel bestimmt:
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Die CD34 Zellenwiedergewinnung in
Prozent wurde durch die Formel bestimmt:
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Die Wiedergewinnung von klonogenen
Zellen in Prozent wurde durch die Formel bestimmt:
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Während
die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Verfahren und Ausführungsformen
beschrieben wurde, ist es ersichtlich, dass verschiedene Modifikationen
und Veränderungen
durchgeführt
werden können,
ohne von der Erfindung abzuweichen.