DE69906930T2

DE69906930T2 - Verfahren zur herstellung von silanisierter kolloidaler kieselsäure

Info

Publication number: DE69906930T2
Application number: DE69906930T
Authority: DE
Inventors: Peter Van Vlasselaer; W. Shirin HASAN
Original assignee: Dendreon Corp
Current assignee: Dendreon Corp
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1999-01-07
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2019-01-08
Also published as: CA2317488C; WO1999036359A1; US6015843A; HK1028390A1; ATE237556T1; DK1047635T3; AU2217099A; CA2317488A1; ES2197604T3; BR9906965A; DE69906930D1; EP1047635B1; JP4576046B2; AU742446B2; NZ506157A; PT1047635E; EP1047635A1; JP2002509070A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines silanisierten kolloidalen Kieselsäurepräparats, das, zum Beispiel, als ein Dichtegradientenmedium zur Trennung von Zellen verwendbar ist.
Literaturangaben
F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc., Media PA (1988).
Hintergrund der Erfindung
Silanisierte kolloidale Kieselsäurepräparate werden in einer Reihe von industriellen Anwendungen, einschließlich, zum Beispiel, zur Herstellung von abriebbeständigen Beschichtungen, xerographischen Tonermaterialien und zur Dichtegradiententrennung von biologischen Materialien verwendet.
Die Herstellung von silanisierter kolloidaler Kieselsäure kann schwierig sein, da kolloidale Kieselsäure an sich unter Bedingungen instabil ist, die zur Silanisierung, z. B. bei saurem pH, optimal oder sogar notwendig sind. Unter solchen sauren Bedingungen "geliert" die Kieselsäure oft, oder sie verliert ihre Eigenschaften als Suspension, wobei ein halbfestes geleeartiges Material gebildet wird. Unter neutralen oder alkalischen pH-Bedingungen verläuft die Silanisierung, möglicherweise wegen der Selbstkondensation des Silans, nicht effizient. Während es für einige Anwendungen (z. B. für abriebbeständige Beschichtungen) nicht entscheidend ist, die Kieselsäurepartikel in einem suspendierten Zustand zu halten, ist es für andere Anwendungen (z. B. für Dichtegradientmaterialien) wichtig, die kolloidalen Eigenschaften der Suspension zu erhalten.
Es wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die erkannten Probleme der Silanisierung zu überwinden. Gemäß einem Verfahren wird die Silanisierung in Gegenwart von organischen Lö sungsmitteln in Abwesenheit von Wasser durchgeführt; diese organischen Lösungsmittel sind jedoch schwer aus dem Präparat zu entfernen und sie sind in vielen Anwendungen, wie in Dichtegradientenmaterialien, nicht erwünscht, da sie toxisch oder aus einem anderen Grund für die Anwendung nachteilig sind.
Ein anderes bekanntes Verfahren zur Silanisierung von Kieselsäurepartikeln verwendet einen Katalysator. Das bringt wieder das Problem der Zugabe ungewünschter, potentiell toxischer Materialien zu dem Präparat mit sich. Außerdem erzeugt die Zugabe von organischen Lösungsmitteln und/oder Katalaysatoren zu dem Präparat potentiell größere Mengen von toxischem Abfall, der in den zunehmend eingeschränkten Gebieten des Landes beseitigt werden muss. Deshalb würde es nützlich sein, andere Herstellungsverfahren verfügbar zu haben, die in Wasser lösliche, für die Umwelt sichere Reagenzien und Zwischenprodukte verwenden.
Das U.S. Patent 4,927,750 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer organosilanisierten kolloidalen Kieselsäure, das für Zellen relativ nicht toxisch ist; jedoch schließt das Herstellungsverfahren die Zugabe von Silan zu der kolloidalen Kieselsäure in einer "tropfenweisen" oder langsamen Weise über mehrere Stunden ein, während der das Gemisch bei einer relativ hohen Temperatur (75°C) gehalten wird. Das Verfahren ist zeitaufwändig und es eignet sich nicht ohne weiteres für die Massenfertigung. Während das Verfahren unter alkalischen Bedingungen durchgeführt werden kann, wird betont, dass die Zugabe von Silan zu der Kieselsäure langsam erfolgen muss. Außerdem können leichte Abweichungen von dem vorgeschriebenen Verfahren zur Gelbildung der Suspension führen, womit es für bestimmte Anwendungen, wie vorstehend beschrieben, nicht verwendbar ist.
Die vorliegende Erfindung löst viele der Probleme, die Präparaten eigen sind, die unter Verwendung der Verfahren des Standes der Technik hergestellt sind, wie die Instabilibät der Präparate, die Gegenwart von organischen Lösungsmitteln und anderer toxischer Zwischenprodukte und die Erzeugung von toxischen Nebenprodukten und Abfall. Das bedeutet, nach den Verfahren des Standes der Technik konnten wässrige Formulierungen nur durch sorgfältiges langsames Mischen des Organosilans mit der kolloidalen Kieselsäure hergestellt werden; andernfalls erfolgte ein Ausfallen der Suspension. In einer anderen Ausführungsform konnte das Präparat unter Verwendung organischer Lösungsmittel hergestellt werden; die Verwendung solcher Reagenzien ist jedoch für kolloidale Kieselsäurezusammensetzungen für bestimmte Anwendungen, wie bei der Herstellung von biologischen Materialien, nicht erwünscht. Auch ist die Verwendung solcher Reagenzien vom Standpunkt der Minimierung der Erzeugung von gefährlichen Abfällen besonders erwünscht.
Die vorliegende Erfindung überwindet deshalb die den Verfahren des Standes der Technik inherenten Probleme durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung organosilanisierter kolloidaler Kieselsäurepartikel, das die Silanisierung der Kieselsäure unter wässrigen Bedingungen ermöglicht, das leicht für Massenfertigungsverfahren in größerem Maßstab eingesetzt werden kann. Das erhaltene silanisierte kolloidale Kieselsäurepräparat ist sehr stabil und bleibt auch nach mehrfachen Arbeitsgängen im Autoklaven und/oder nach Bestrahlung mit Gammastrahlen in der löslichen Phase, wie es zur Sterilisierung des Mediums nötig ist. Die Formulierung ist besonders gut geeignet zur Verwendung bei Tierzellenpräparaten, da sie in einer physiologischen Salzlösung ohne Gelbildung oder ohne Bildung eines Niederschlags suspendiert werden kann. Außerdem ist sie für solche Zellen relativ nicht toxisch, was durch die Beobachtung gezeigt wurde, dass sie zur Verarbeitung menschlicher Zellen zur Transplantation ohne nachteilige Wirkungen für Empfänger verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein neues, für die Umwelt sicheres Verfahren zur Herstellung einer stabilen, organosilanisierten kolloidalen Kieselsäuresuspension unter wässrigen Bedingungen. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Massenfertigung von organosilanisierten kolloidalen Kieselsäurepartikeln.
Es ist die Feststellung der Erfindung, dass die hauptsächlichen Reagenzien zur Herstellung der organosilanisierten kolloidalen Kieselsäuresuspension auf verhältnismäßig schnelle Weise miteinander gemischt werden können, ohne auf die langsame Beimischung oder tropfenweise Zugabe zurückzugreifen, die bei den Verfahren des Standes der Technik nötig sind. Das ist möglich, wenn der pH-Wert des Organosilanreagenzes auf einen Bereich von etwa 2–3 eingestellt wird und das Reagenz weiter etwa 1 Stunde auf etwa 80°C erwärmt wird. Zu diesem behandelten Organosilan wird dann eine kolloidale Kieselsäuresuspension zugegeben, wobei ein Gemisch aus Organosilan/kolloidale Kieselsäure-Gemisch mit einer Endkonzentration zwischen etwa 5 bis etwa 10 Prozent Vol/Vol erzeugt wird. Der pH-Wert des Organosilan/kolloidale Kieselsäure-Gemisches wird auf einen pH-Wert von höher als etwa 6,0, in bevorzugten Ausführungsformen in dem Bereich von 6–7 oder besonders von pH 6,2–6,5, eingestellt. Die Suspension wird dann in einem Zeitraum, der wirksam ist, eine stabile kolloidale Suspension herzustellen, "gehärtet".
Gemäß den bevorzugten Ausführüngsformen wird das Härten zum Beispiel durch Erwärmen auf mindestens etwa 80°C oder durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung erreicht. Eine solche stabile Suspension wird durch das Ausbleiben der Bildung eines Niederschlags in Gegenwart eines physiologischen Salzes oder Säure angezeigt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat das Organosilan die allgemeine Formel:
(X)3-Si-(CH2)3-Y , wobei
Y aus
ausgewahlt ist. Gemäß dieser Ausführungsform ist X aus H₃CO, Cl und H₅C₂O ausgewählt.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform ist das Organosilan γ-Glycidoxypopyltrimethoxysilan.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert der Reaktion im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 7,0, und vorzugsweise im Bereich von 6,2 bis 6,5.
Die Kieselsäurepartikel, die die kolloidale Kieselsäuresuspension bilden, können in jedem Größenbereich vorliegen, der mit dem Aufrechterhalten der kolloidalen Suspension vereinbar ist; bevorzugte Größenbereiche schließen Durchmesser von etwa 3 bis etwa 12 nm, stärker bevorzugt Durchmesser von etwa 7 bis 12 nm ein.
Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung wird die Stabilität der Kieselsäuresuspension durch die Beständigkeit gegenüber wiederholtem Behandeln im Autoklaven und der Beständigkeit gegenüber einer Bestrahlung mit Gammastrahlen und der Stabilität in Gegenwart von physiologischen Konzentrationen von Salzen, wie 0,9% Natriumchlorid (Salzlösung), bewiesen. Das vorstehende Herstellungsverfahren ist auch relativ nicht toxisch für die Umwelt, da die Reagenzien und Komponenten wässrig sind. Die erhaltene Zusammensetzung ist auch relativ untoxisch für Zellen, die in der silanisierten kolloidalen Kieselsäure suspendiert sind.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden vollständiger ersichtlich, wenn die nachstehende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den zugehörenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt den Reaktionsablauf der Silanisierung von Silanolgruppen auf der Oberfläche eines kolloidalen Kieselsäurepartikels (Beispiel 1);
2A und 2B zeigen die Wirkung einer wiederholten Behandlung im Autoklaven auf die gemessene Dichte von kolloidaler Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde in Abwesenheit (2A) und in Gegenwart (2B) von Salzen;
3A und 3B zeigen die Wirkung von wiederholter Behandlung im Autoklauen auf die gemessene Osmolalität der kolloidalen Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde in Abwesenheit (3A) und in Gegenwart (3B) von Salzen;
4A und 4B zeigen die Wirkung von wiederholten Behandlungen im Autoklauen auf den gemessenen pH-Wert von kolloidaler Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde in Abwesenheit (4A) und in Gegenwart (4B) von Salzen;
5 zeigt die prozentuale Wiedergewinnung von verschiedenen Zelltypen, die an der Grenzfläche der Probe nach dem Verarbeiten in kolloidaler Kieselsäure vorliegen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde;
6 zeigt die Lebensfähigkeit von Zellen in Prozent, die in Gegenwart oder Abwesenheit von kolloidaler Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (Beispiel 3) hergestellt wurde, inkubiert wurden; und
7 zeigt die Wiedergewinnung von Zellen (Kolonien bildende Einheiten; CFU) in Prozent, die unter verschiedenen Bedingungen (Beispiel 3) präpariert wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
"Kolloidale Kieselsäure" bezieht sich auf eine wässrige Suspension von kolloidalen Kieselsäurepartikeln, die gewöhnlich durch Polymerisation von Orthokieselsäure aus in Wasser gelöstem SiO₂ erzeugt werden.
"Organosilanisierte kolloidale Kieselsäure (OCS)-Partikel" bezieht sich auf eine kolloidale Kieselsäurezusammensetzung, an die eine Organosilanbeschichtung kovalent gebunden ist. Das U.S. Patent 4,927,749 ist hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme im Hinblick auf seine Beschreibung einer Herstellung einer organosilanisierten kolloidalen Kieselsäure aufgenommen.
Der Ausdruck "stabile silanisierte kolloidale Kieselsäuresuspension", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf kolloidale Kieselsäurepartikel, die gemäß der vorstehenden Beschreibung organosilanisiert wurden, die ferner dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in Bezug auf den pH-Wert, die Osmolalität und die Dichte oder nach einer oder mehreren Behandlungen im Autoklauen oder Bestrahlung mit Gammastrahlen eine Stabilität der Zusammensetzung von mehreren Tagen aufweisen. Eine stabile kolloidale Kieselsäuresuspension wird durch das Ausbleiben der Bildung eines Niederschlags oder das Ausbleiben der "Gelbildung" nach solchen Behandlungen angezeigt. Solche stabilen Suspensionen bleiben auch in Gegenwart von oder nach der Zugabe von physiologischen Salzkonzentrationen, wie 0,9% (Gew/Vol) Natriumchlorid, stabil und sie sind gegenüber der Zugabe von Säure stabil, wobei ein pH-Wert von etwa 5–6 erzeugt wird. Im Gegensatz dazu tritt, wenn ein physiologisches Salz oder genügend Säure zu einer instabilen Lösung zugegeben werden, eine Gelbildung oder die Bildung eines Niederschlags auf, was durch die Veränderung der vorher klaren Suspension in eine weiße oder undurchsichtige Substanz angezeigt wird.
Der Ausdruck "Sol", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein flüssiges Kolloid, eine Suspension oder ein Gemisch, in dem feste Partikel in einer flüssigen Phase stabil dispergiert sind.
Der Ausdruck "Gel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine kolloidale Suspension einer Flüssigkeit in einem Feststoff, wobei ein geleeartiges Material, eine festere Form als ein Sol, gebildet wird.
Der Ausdruck "nicht toxisch" für Zellen bedeutet, dass eine Substanz in engen Kontakt mit einer Suspension von biologischen Zellen während mindestens 30 Minuten ohne Verminderung der Zahl der lebensfähigen Zellen um mehr als etwa 20% gebracht werden kann. Vorzugsweise sind solche lebensfähigen Zellen auch funktional, wie durch eine geeignete Funktionsprüfung beurteilt wird. Beispiele für Verfahren zum Messen der Zelltoxizität und der Funktionalität werden hier in den Beispielen 3–5 bereitgestellt.
II. Verfahren zur Herstellung einer stabilen silanisierten kolloidalen Kieselsäuresuspension
Wie vorstehend zusammengefasst, haben die Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung von silanisierten Kieselsäurepartikeln eine von zwei Hauptgruppen von Reaktionsbedingungen verwendet: entweder (1) in einer wässrigen Umgebung, wobei die Umsetzung bei einem sauren pH-Wert (etwa pH 5,5) durchgeführt wird, wobei das Silan zu dem wässrigen kolloidalen Kieselsäure-"Sol" in tropfenweiser Form oder durch eine sehr langsame Zugabe zugegeben wird, um die Gelbildung des Sols zu verhindern, oder (2) die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wird in beiden allgemeinen Verfahren während der chemischen Synthese "gehärtet" oder stabilisiert.
Wie vorstehend erörtert, wird die Verwendung von organischen Lösungsmitteln im allgemeinen bei einer Anzahl von Anwendungen wegen der Toxizität und der Bedenken hinsichtlich des toxischen Abfalls, als nicht erwünscht angesehen. Besonders im Zusammenhang mit der Herstellung von Materialien zur Trennung von biologischen Fraktionen auf Basis der Dichte führt der Einschluss von organischen Lösungsmitteln im allgemeinen zur Zelltoxizität. Die bekannten Verfahren zur Silanisierung von kolloidaler Kieselsäure unter wässrigen Bedingungen sind im allgemeinen zu beschwerlich und zu zeitaufwändig für Verfahren mit hoher Kapazität, die zur industriellen Herstellung des Materials nötig sind; außerdem kann auch bei der Verwendung dieser Verfahren die Gelbildung des Produkts eintreten.
Das Verfahren, das der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, macht die mühsame, langsame (tropfenweise) Zugabe des Reagenz unnötig und stellt ein silanisiertes Produkt her, das stabil und für biologische Materialien, wie Zellen, nicht toxisch ist, wie in dem nachstehenden Abschnitt N gezeigt wird. Da der Stand der Technik nahe legt, dass organosilanisierte Zusammensetzungen unter wässrigen Bedingungen instabil sind, stellt das erfindungsgemäße Verfahren durch das Bereitstellen eines für die Umwelt sicheren Verfahrens zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Zusammensetzung eine bedeutende Verbesserung bereit.
Ohne sich auf eine besondere Theorie festzulegen, wird angenommen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zunächst zu einer Bildung einer Siloxanbindung zwischen den Silanolgruppen auf der Oberfläche der Kieselsäurepartikel und der reaktiven Einheit des Silanrests führt und dass die Bindung des Organosilans an die Kieselsäurepartikel durch ein Härtungsverfahren, das das Aussetzen des Reaktionsprodukts gegenüber einer relativ hohen Reaktionstemperatur (höher als etwa 80°C) für etwa eine bis mehrere Stunden einschließt, weiter verstärkt wird. Die Reaktion ist in 1 veranschaulicht, wobei das Organosilan γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan als Beispiel verwendet wird.
Beispiel 1 stellt Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens bereit, wie es unter Verwendung von γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPMS) als Silanisierungsmittel durchgeführt werden kann. Es ist verständlich, dass dieses Verfahren leicht an beliebige oder alle Organosilane mit einer genügenden Reaktivität zur Bildung von Siloxanin Lösung angepaßt werden kann. Tabelle 1 stellt eine Liste von Organosilanen als Beispiele bereit, die verwendet werden können, um erfindungsgemäße Zusammensetzungen zu erzeugen. Während das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von GPMS als Organosilanreagenz als Beispiel angegeben wird, ist es verständlich, dass Reaktionszeiten und die Optimierung von Bedingungen von dem speziell ausgewählten Reagenz abhängen werden; es liegt im Bereich der Fachkenntnis des Praktikers, die optimierten Bedingungen zu bestimmen.
Beispiel 1 gibt die Verwendung von GPMS zur Organosilanisierung von kolloidalen Kieselsäurepartikeln als Beispiel, die zur Herstellung eines biologischen Trennungsmediums geeignet sind. Das GPMS wird hier zuerst zu Wasser zugegeben, wobei eine Lösung mit einer Endkonzentration von etwa 10 Prozent VoUVoI erzeugt wird. Gemäß eines wichtigen Merkmals der Erfindung wird die Lösung durch Zugabe einer Säure angesäuert (pH-Wert etwa 2,5) und dann 60 Minuten auf 80°C erwärmt. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu der wässrigen Silanlösung wird unter kontinuierlichem Rühren kolloidale Kieselsäure zugegeben bis die gesamte Silankonzentration in dem Bereich von 5–10%, vorzugsweise etwa 6–8% Vol/Vol, liegt. Der pH-Wert des Silan-/Kieselsäure-Gemisches wird auf 6,2 bis 6,5 eingestellt und die Lösung bei Raumtemperatur etwa 15–30 Minuten gerührt.
Das für die vorstehenden präparativen Schritte verwendete Silan kann jedes Silan aus einer Anzahl von Silanverbindungen sein. Das entscheidende Merkmal der Silanauswahl besteht darin, dass die Verbindung unter wässrigen Bedingungen löslich ist. Demgemäß schließen, rieben GPMS, geeignete Organosilane die in dem U.S. Patent 4,927,749 (Dorn), das hier mit Bezugnahme aufgenommen ist, angegebenen Verbindungen ein, sie sind aber nicht darauf eingeschränkt. Tabelle 1 stellt Beispiele für verschiedene Silane bereit, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können; die Erfindung ist jedoch nicht auf die Aufzählung in Tabelle 1 eingeschränkt.
Tabelle 1 Organosilane, die verwendet werden können, um eine reagenzmodifizierte kolloidale Kieselsäure herzustellen

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Trialkoxysilane mit der Formel RSi(OR₁) ₃ verwendet, wobei der Rest R₁ ein aliphatischer oder organischer Arylrest, typischerweise mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, wie eine n-Butyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl, n-Octyl-, t-Butyl-, 3-Butenyl-, Phenylgruppe oder dergleichen, bedeutet. Diese hier durch GPMS als Beispiel gegebenen Verbindungen sind wegen ihrer hohen Reaktivitäten, verglichen zum Beispiel mit Dialkoxysilanen und Monoalkoxysilanen, die auch verwendet werden können, bevorzugt. Als Beispiele dienende Trialkoxysilane sind in dem U.S. Patent 4,644,077 (Gupta) aufgeführt, das hier unter Bezugnahme aufgenommen ist.
Die kolloidale Kieselsäure als Ausgangsmaterial ist vorzugsweise eine Zusammensetzung kolloidaler Kieselsäurepartikel, umfassend eine wässrige Suspension von Kieselsäurepartikeln in einem Größenbereich von etwa 1 bis etwa 5000 nm; für die Zwecke der Herstellung eines Zelltrennmaterials sind Partikel im Größenbereich von 5–22 nm und besonders von 7–10 nm erwünscht. Ein Beispiel für ein Ausgangsmmterial ist "LUDOX HS-40", hergestellt von W. R. Grace & Co., wie hier in Beispiel 1 beschrieben.
Wie vorstehend erwähnt, ohne sich auf einen zugrundeliegenden Mechanismus der Erfindung festzulegen, wird angenommen, dass die Bildung einer Bindung zwischen den Partikeln und dem zugegebenen Silanreagenz entweder durch Bildung von mehreren Siloxanbindungen, intramolekularen Bindungen oder dergleichen durch ein nachfolgendes "Härtungs"-Verfahren verstärkt wird. Typischerweise wird ein solches Härten durch Wärmebehandlung bewirkt; zum Beispiel durch Erwärmen der Suspension über 60 Minuten auf 80°C und anschließend 3 Stunden auf 95°C, wie es hier in Beispiel 1 ausführlich beschrieben wird. Als Alternative oder zusätzlich kann das Härten jedoch durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen, zum Beispiel wie in dem U.S. Patent 4,822,828 beschrieben, das hier unter Bezugnahme aufgenommen ist, bewirkt werden. Um zum Beispiel die Vollständigkeit des Härtungsverfahrens sicherzustellen, folgt nach einer Wärmebehandlung eine Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen. Andere geeignete oder äquivalente Härtungsverfahren werden den Fachleuten ersichtlich sein.
III. Stabilität der silanisierten Partikel
Gemäß einer wichtigen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die silanisierten Teilchen, die nach dem beanspruchten Herstellungsverfahren hergestellt werden, sowohl besonders stabil gegenüber hohen Temperaturen, wie sie bei Standardbedingungen im Autoklaven (121°C, 2,1 bar, 30 Minuten) vorliegen, als auch gegenüber einer ionisierenden Strahlung, wie Gamma strahlung, in einer Dosis zwischen etwa 2,5 und 4,0 Megarad. Die Stabilität wird typischerweise durch den Vergleich von physikalischen Parametern, wie des pH-Werts, der Osmolalität und der Dichte des Präparats vor und nach der Behandlung, wie nachstehend beschrieben, gemessen. Die Stabilität wird auch durch Zugabe eines Salzes oder einer Säure zu der Suspension bewertet, wobei eine physiologische Salzkonzentration (0,9% Gew./Vol Natriumchlorid) beziehungsweise ein pH-Wert von etwa 5–6 erzeugt wird. Wenn diese Zugaben durchgeführt werden, wird bei einer stabilen Suspension die Bildung eines Niederschlags ausbleiben oder kein "Gel" auftreten, während eine instabile Suspension wegen der Bildung des Niederschlags oder der Gelbildung weiß oder undurchsichtig wird.
Die 2A und 2B zeigen die Wirkung von wiederholten Autoklavenbehandlungen (2–4 Zyklen, jeweils 121°C, 30 Minuten) auf die gemessene Dichte der organosilanisierten kolloidalen Kieselsäure. Wie gezeigt, blieb die Dichte der Suspension in Abwesenheit oder Anwesenheit von physiologischen Salzen konstant.
Ebenfalls blieb die Osmolalität und der pH-Wert der Suspension in Abwesenheit oder Anwesenheit von Salzen nach 2–4 Zyklen der Autoklavenbehandlung (3A, 3B, 4A, 4B) konstant. Bei diesen Versuchen waren die Anfangs- und Endzustände der Suspension wie folgt: Dichte 1,0605 g/ml, pH 7,4, Osmolalität 280 mOsm (+ Salze). Diese physikalisch-chemischen Parameter wurden verwendet, um bestimmte Typen von nützlichen Zellen, wie hämatopoetische Vorläuferzellen, Lymphozyten, dendritische Zellen, Mesenchymzellen und dergleichen zu isolieren.
In weiteren Versuchen, die zur Untermauerung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde festgestellt, dass silanisierte kolloidale Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, auch gegenüber Bestrahlung, besonders in dem Bereich von 2,5–4,0 Megarad, stabil ist. Das entspricht den Dosisbereichen, die üblicherweise zur definitiven Sterilisierung von Lösungen, zum Beispiel zur Isolierung von biologischen Zellen, verwendet werden.
IV. Biologische Kompatibilität von silanisierter kolloidaler Kieselsäure
Die Trennung von Zellen durch eine Dichtegradientzentrifugierung ist eine in der Biotechnologie beliebtes Verfahren. Dieses Verfahren nutzt die Tatsache aus, dass sich Zellen in einem definierten Dichtemedium gemäß des Auftriebs durch ihre steigenden Dichten trennen. Für solche Trennungen werden verschiedene Dichtegradientmaterialien, einschließlich der auf kolloidaler Kieselsäure basierenden Medien, verwendet.
Ein Beispiel für ein auf kolloidaler Kieselsäure basierendes Dichtemedium, das überlicherweise bei der Dichtegradienttrennung verwendet wird, ist "PERCOLL" (eine eingetragene Marke von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). PERCOLL ist eine stabile Suspension von kolloidalen Kieselsäurepartikeln mit Polyvinylpyrrolidon-Beschichtungen. Während PERCOLL bei physiologischem pH-Wert verhältnismäßig stabil ist, ist es gegenüber einer Sterilisierung unter Verwendung von Wärme oder ionisierender Bestrahlung unter physiologischen Bedingungen (z. B. wenn es in einer physiologischen Salzlösung verdünnt ist) instabil. Diese Eigenschaften schränken die Verwendbarkeit des Produkts, besonders im Zusammenhang mit klinischen Anwendungen, die die Wiedereinführung von abgetrennten Zellen in Menschen oder irgendwo anders einschließen, wo ein definitiv sterilisiertes Material nötig ist, ein.
Das U.S. Patent 4,927,749 stellt ein organosilanisiertes kolloidales Kieselsäure (OCS)-Partikel (OCSP)-Präparat zur Dichtegradienttrennung bereit, das einige vorstehend besprochene Probleme überwindet. Dieses Medium hat hinsichtlich PERCOLL den Vorteil, dass es für Zellen, besonders "seltene" Zellen, wie hämatopoetische Vorläuferzellen, Stammzellen, Antigen-spezifische Lymphotypen, Mesenchymzellen und dergleichen, besonders nach dem Sterilisieren des Mediums, viel weniger toxisch ist. Jedoch schließt, wie vorstehend erwähnt, das in dem U.S. Patent 4,927,749 beschriebene Herstellungsverfahren eine langsame Zugabe von Silan zu dem Präparat ein, was nicht praktisch und für Verfahren der Massenfertigung teuer ist.
Es ist die Feststellung der vorliegenden Erfindung, dass ein silanisiertes kolloidiles Kieselsäurepartikelpräparat unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt werden kann und dass dieses Präparat in ähnlicher Weise nicht toxisch für biologische, Präparate, besonders isolierte Blutzellenfraktionen, ist, wie nachstehend beschrieben wird. Im Gegensatz dazu sind, wie vorstehend diskutiert, Produkte des Standes der Technik häufig schlecht herzustellen, gegenüber Sterilisierung instabil und/oder für Zellen toxisch.
5 zeigt die prozentuale Wiedergewinnung von verschiedenen Typen von Zellen, die an der Grenzfläche einer Blutprobe nach dem Verarbeiten auf kolloidaler Kieselsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, vorhanden sind. Kurz gesagt wurde PBMC in ein Zentrifugenröhrchen über organosilanisierte kolloidale Kieselsäure mit einer Dichte von 1,0605, pH 7,4, 280 mOsm eingebracht und, wie in Beispiel 2 beschrieben, zentrifugiert. Von der Grenzfläche zwischen dem eingebrachten Material und dem Dichtegradientmaterial wurden Zellen wiedergewonnen und auf den Zelltyp unter Verwendung von Färbungs- und FACS-Analyseverfahren, wie in Beispiel 4 ausführlich dargestellt, analysiert. Wie in 5 gezeigt waren CD34⁺-Zellen und CD14⁺-Zellen, wie unter den verwendeten Bedingungen erwartet, die überwiegend isolierten Zellformen.
Weitere Versuche zeigten, dass hämatopoetische Vorläuferzellen lebensfähig waren, auch wenn sie 24 Stunden mit organosilanisierter kolloidaler Kieselsäure inkubiert wurden. 6 zeigt die Ergebnisse von Versuchen, bei denen CD34⁺-Zellen 30 Minuten und 24 Stunden mit Puffer (PBS), kolloidaler Kieselsäure (CS) oder fötalem Kälberserum (FCS) inkubiert und dann auf die Lebensfähigkeit geprüft wurden. Wie gezeigt, waren die mit kolloidaler Kieselsäure inkubierten Zellen so lebensfähig wie die Zellen, die mit Puffer oder fötalem Kälberserum inkubiert wurden.
In weiteren Studien, die in Beispiel 3 ausführlich beschrieben sind, wurde die funktionale Lebensfähigkeit von verschiedenen Zelltypen gemessen, nachdem sie 30 Minuten lang PBS oder kolloidaler Kieselsäure ausgesetzt wurden, 30 Minuten PBS oder kolloidaler Kieselsäure, gefolgt von 24 Stunden einem Zellenwachstumsmedium (Iscove Puffer + Serum) ausgesetzt wurden oder 24 Stunden PBS oder kolloidaler Kieselsäure in Gegenwart von Serum ausgesetzt wurden. Wie in 7 gezeigt, wurde die funktionale Lebensfähigkeit (biologisches, proliferatives und Differenzierungspotential), wie in Beispiel 5 beschrieben, durch eine Koloniebildungsprüfung beurteilt. Die Werte zeigen, dass auch unter den strengsten Inkubationsbedingungen die koloniebildenden Eigenschaften für die CD34⁺-Zellen unverändert waren.
Toxikologische in vivo-Versuche, die zur Untermauerung der vorliegenden Erfindung bei Säugern durchgeführt wurden, zeigten auch, dass das Produkt offenbar nicht toxisch ist, wenn es intravenös oder intrakutan verabreicht wird. Das Produkt hat als solches den zusätzlichen Vorteil, dass es zur Verwendung bei der Trennung und Herstellung von Zellen zur Einführung bei Säugern, wie bei der Stammzellentransplantation, geeignet sein kann.
Die Erfindung stellt auch ein für die Umwelt sicheres Verfahren zur Herstellung von kolloidalem Kieselsäurematerial bereit, da es unter Verwendung von wässrigen, relativ nicht toxischen Herstellungsmaterialien durchgeführt wird.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sie sollen sie aber in keiner Weise einschränken.
Materialien
A. Präparation von peripheren Blutvorläuferzellen
Periphere einkernige Blutzellen (PBMC), die durch Apherese von non-Hodgkins Lymphom(NHL), Hodgkins Lymphom- (HL) und Brustkrebspatienten gesammelt wurden, wurden von dem Bone Marrow Transplantation Laboratory der Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, U.S.A. erhalten. PBMC wurden in NHL-Patienten durch Behandlung mit Cyclophosphamid (4 g/m², intravenös), gefolgt von G-CSF (10 μg/kg, intravenös, täglich) mobilisiert. PBMC wurden in Brustkrebspatientinnen durch Behandlung mit VP-12 (2 g/m², intravenös), gefolgt von G-CSF (10 μg/kg, intravenös, täglich) mobilisiert. PBMC wurden in HL-Patienten nur durch Behandlung mit G-CSF mobilisiert.
B. Antikörper
Monoklonale Antikörper (mAb), die gegen Oberflächenantigene gerichtet waren, die spezifisch für hämatopoetische Vorläuferzellen (CD34, anti-HPCA-2) und Leukozyten (CD45, anti-HLe-1) sind, wurden von Becton-Dickinson, Inc. (San Jose, CA) erhalten. Die verschiedenen mAb wurden direkt mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) gemäß Standardmethoden gekennzeichnet (Ausubel et al., 1993). Die PE gekennzeichneten Isotyp Kontroll-IgG1 polyklonalen Antikörper wurden von Becton-Dickinson, Inc. (San Jose, CA) erhalten.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, aber sie sollen sie in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1
Herstellung von silanisierter kolloidaler Kieselsäure
γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPMS; United Chemicals, Bristol, PA) wurde zu Wasser zugegeben, wobei eine Lösung mit einer Endkonzentration von 10% Vol/Vol erzeugt wurde. Der pH-Wert wurde mit 1 N HCl unter kontinuierlichem Rühren auf 2,5 gesenkt. Die Lösung wurde 60 Minuten auf 80°C erwärmt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Kolloidale Kieselsäure (Ludox HS-40, W. R. Grace & Co., Columbia, MD) wurde zu der wässrigen Silanlösung langsam zugegeben, wobei kontinuierlich gerührt wurde, bis die Gesamtkonzentration von Silan 7% Vol/Vol betrug. Der pH-Wert des Silan/Kieselsäure-Gemisches wurde auf 6,2 bis 6,5 eingestellt und die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann 60 Minuten auf 80°C und anschließend 3 Stunden auf 95° erwärmt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der pH-Wert mit 1 N NaOH auf 9–10 erhöht. Das silanisierte kolloidale Kieselsäurepräparat wurde durch eine Säule mit Aktivkohle geleitet, wobei Nebenprodukte der Reaktion entfernt wurden.
Beispiel 2
Dichtegradientzentrifugierung
PBMC wurden auf eine Dichtegradientenlösung unter Verwendung einer Pipette geschichtet. Das Schichten wurde langsam durchgeführt, um ein Mischen der Probe mit der Lösung zu vermeiden. Ein Maximum von 2 × 10⁹ Zellen wurde pro Röhrchen aufgeschichtet. Das Zentrifugieren wurde 30 Minuten mit 850 g bei Raumtemperatur durchgeführt. Um das Vermischen der Zellen und der Dichtegradientlösung zu verhindern, wurde die Zentrifuge ohne Bremskraft angehalten. Die Zellen wurden in eine Fraktion niederer Dichte, die sich an der Grenzfläche befand, und eine Fraktion hoher Dichte getrennt, die das Pellet bildet. Beide Zellfraktionen wurden unter Verwendung einer Pipette aufgenommen und in eine anderes 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen gegossen. Die Zellen wurden einmal gewaschen und in Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freiem Dulbecco D-PBS bei Raumtemperatur bis zur weiteren Bearbeitung gelagert. Die Zahl und die Funktionalität der hämatopoetischen Vorläuferzellen (CD34⁺-Zellen) wurde in beiden Zellfraktionen durch FACS-Analyse und klonogene Prüfungen, wie in den 5 beziehungsweise 7 gezeigt, bestimmt.
Beispiel 3
In vitro-Toxikologie
Der Zweck dieser Versuche bestand in der Beurteilung der Wirkung des Mischens und der nachfolgenden Inkubierung von menschlichem peripheren Blut in die Dichtegradientenlösung. Die Aufgabe der Untersuchung bestand darin, festzustellen, ob die Dichtegradientenlösung eine Wirkung auf die Lebensfähigkeit und die Funktionalität von menschlichen hämatopoetischen Stammzellen ausübt. Es wurden in diesen Versuchen sechs verschiedene Misch- und Inkubierungsmusterbeispiele verwendet, wie nachstehend dargestellt wird.
Genauer wurden 3 × 10⁷ Zellen in 5 m1 Testpuffer oder eine Dichtegradientenlösung in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen suspendiert. Die Probe wurde dann für eine bestimmte Zeit bei Raumtemperatur inkubiert, wie nachstehend in Tabelle 2 angegeben ist. Die Zellen wur den 30 Minuten, 30 Minuten, gefolgt von 24 Stunden in ein Zellkulturmedium (Iscove Puffer + 10% fötales Kälberserum) oder 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aufgenommen und auf ihre Fähigkeit überprüft, hämatopoetische Kolonien (CFU-E, BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM) zu bilden. Außerdem wurde eine Beurteilung durch Messen des Volumens der PBMC-Probe durchgeführt und die Hälfte des Volumens in jedes von zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen eingebracht. Die Zellproben wurden dann in insgesamt 50 ml Volumen unter Verwendung von 1 × D-PBS (Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ frei) resuspendiert. Ein Röhrchen wurde 10 Minuten bei 550 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgetrennt. Das Pellet wurde auf das ursprüngliche Volumen ml unter Verwendung einer CD34-Anreicherungslösung resuspendiert. Die Zellen in jedem Aliquot wurden dann gezählt.
Tabelle 2
Beispiel 4
Färbungsverfahren und Quantifizierung von CD34⁺-Zellen durch die FACS-Analyse
Die Quantifizierung von CD34⁺-Zellen wurde durch FACS-Analyse durchgeführt. Die Zellen wurden mit einem Kernfarbstoff und auf CD34 und CD45 gerichtetes mAbs gekennzeichnet. Der Prozentsatz an CD34-Zellen wurde im Gate mit Zellen bestimmt, die Kerne aufwiesen. Diese Methode wurde gewählt, um die Überlagerung von Festteilchenmaterial ohne Kerne mit der Genauigkeit der CD34-Zellanalyse in der FACS zu vermeiden.
In Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freiem D-PBS wurde eine Zellsuspension von 2 × 10⁷ Zellen/ml hergestellt. 50 μl dieser Zellsuspension wurden in Vertiefungen von 96 Well-Mikrotiterplatten bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung verteilt. 50 μl einer 20%-igen, wärmeinaktivierten Kaninchenserum-/D-PBS-Lösung wurden dann zu jeder Vertiefung zugegeben, anschließend 10 μ1 einer 10 μg/m1 LDS-Lösung und 75 μ1/D-PBS-Lösung zu jeder Vertiefung. Die Inhalte jeder Vertiefung wurden gemischt. Die Mikrotiterplatte wurde mit einer Folie bedeckt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zu jeder Kontrollvertiefung wurden 20 μl IgGl-Phycoerythrin (IgG1-PE) und 20 μg CD34-PE zugegeben und dann wurde gemischt. Die Platte wurde wieder mit einer Folie bedeckt und 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dann 2 Minuten bei 850 g bei 4°C zentrifugiert. Die Platten wurden gekippt, um überstehende Flüssigkeit zu entfernen, anschließend wurde jedes Zellpellet in 200 μl kaltem (4°C) 1 × D-PBS (Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-frei) resuspendiert. Die Platten wurden 5 Minuten bei 850 g bei 4°C zentrifugiert, dann schnell gekippt, um überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Jedes Zellpellet wurde in 50 μl 20%-iger wärmeinaktivierter Kaninchenserumlösung resuspendiert. Zu jeder Kontrolle und jedem Testbehälter wurde 20 μ1 CD45-FITC zugegeben und anschließend wurde gemischt. Die Platten wurden mit einer Folie bedeckt und 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Ein 100 μl Aliquot von kaltem (4°C) 1 × D-PBS (Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-frei) wurde zu allen Kontrollund Testbehältern zugegeben. Jede Platte wurde 5 Minuten bei 850 g bei 4°C zentrifugiert und anschließend schnell gekippt, um überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Die Zellpellets wurden in 100 μl kaltem (4°C) 1 × D-PBS (Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-frei) resuspendiert und anschließend 5 Minuten bei 850 g bei 4°C zentrifugiert. Die Platten wurden dann schnell gekippt, um überstehende Flüssigkeit zu entfernen, und jedes Zellpellet wurde in 200 μl 1%-igem Paraformaldehyd (4°C) resuspendiert. Die Platten wurden mit einer Folie bedeckt und verblieben bei 4°C bis zur FACS-Analyse.
Die FACS-Analyse wurde an 10⁴-Fließfolgen unter Verwendung eines FACS Star Plus-Systems, ausgerüstet mit einem LYSIS II-Programm (Becton-Dickinson Inc.), durchgeführt. Ein Gate (Region 1) wurde um die Zellen mit Kernen gelegt, die durch LDS751-Färbung in FL3 bestimmt wurden, um die roten Zellen, Plättchen und Ausschuß auszuschließen. FL1 und FL2 wurden als eine Punktgrafik unter Verwendung der Region 1 wiedergegeben. Ein Gate (Region 2) wurde um die Zellpopulation gelegt, die sowohl mit dem anti-CD45 als auch anti-CD34 mAb gefärbt ist. Der prozentuale Anteil von Zellen, die mit dem anti-CD34 (FL2) und anti-CD45 (FL1) mAb gefärbt sind, wurde in Region 2 bestimmt. Das stellt den prozentualen Anteil der CD34 positiven Coils an der Gesamtzahl von Zellen mit Kernen dar. Die Gesamtzahl von CD34 positiven Zellen wurde in der nicht verarbeiteten Probe und in der Zellfraktion bestimmt, die aus der Grenzfläche und dem Pellet nach dem Verarbeiten der PBMC-Proben auf der Dichtegradientenlösung erhalten wurde.
Beispiel 5
Beurteilung der Kolonienbildung (CFU)
Die Zellen wurden mit 10⁵ Zellen in 1 ml halbfester Methylcellulose gemischt, die verschiedene koloniestimulierende Faktoren und Erythropoietin (MethoCult^® H4433 medium, Terry Fox Laboratories, Vancouver) enthalten. Nach 14 Tagen Züchtung bei 37°C wurden das Erythroid (CFU-E, BFU-E), Granulozyten/Makrophagen (CFU-GM) und gemischte (CFU-GEMM) Kolonien unter einem umgekehrten Mikroskop (40 ×) gezählt.
Beispiel 6
Statistische Analyse
Die Zellenwiedergewinnung in Prozent wurde durch die Formel bestimmt:
Die CD34 Zellenwiedergewinnung in Prozent wurde durch die Formel bestimmt:
Die Wiedergewinnung von klonogenen Zellen in Prozent wurde durch die Formel bestimmt:
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Verfahren und Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es ersichtlich, dass verschiedene Modifikationen und Veränderungen durchgeführt werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verfahren zur großtechnischen Herstellung einer stabilen, organosilanisierten kolloidalen Kieselsäuresuspension in einer wässrigen Umgebung, umfassend Bereitstellen einer wässrigen Organosilanlösung mit einem pH-Wert in Bereich von etwa 2 bis 3 und Erhitzen auf etwa 80°C für etwa 1 Stunde; Hinzufügen einer kolloidalen Kieselsäuresuspension zu der Organosilanlösung, um ein Organosilanlkolloidale Kieselsäure-Gemisch zu bilden, wobei das Gemisch eine Organosilan-Endkonzentration zwischen etwa 5 und etwa 10 Prozent VoUVoI aufweist; Einstellen des pH-Wertes des Organosilan/kolloidale Kieselsäure-Gemisches auf einen pH-Wert größer als etwa 6,0; Härten der Suspension für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine stabile kolloidale Suspension herzustellen, was durch das Ausbleiben der Bildung eines Niederschlags in Gegenwart eines physiologischen Salzes oder Säure angezeigt wird, wobei die resultierende stabile kolloidale Kieselsäuresuspension wässrig ist und nicht toxisch auf Zellen wirkt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Organosilan die Formel: (X)₃-Si-(CH₂)₃-Y aufweist, in der Y aus
ausgewählt ist und in der X aus H₃CO, Cl und H₅C₂O ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Organosilan γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Härten durch Erhitzen der Suspension auf mindestens etwa 80°C für mindestens 1 Stunde erreicht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Härten durch Bestrahlen der Suspension mit ultravioletter Strahlung erreicht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der pH-Wert des Organosilan/kolloidale Kieselsäure-Gemisches auf einen pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 7,0 eingestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der pH-Wert in dem Bereich von 6,2 bis 6,5 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Kieselsäurepartikel, welche in der kolloidalen Kieselsäuresuspension enthalten sind, durch einen Größenbereich von etwa 3 bis etwa 12 nm als Durchmesser gekennzeichnet sind.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Kieselsäurepartikel durch einen Größenbereich von etwa 7 bis etwa 12 nm als Durchmesser gekennzeichnet sind.