DE69837935T2

DE69837935T2 - Nukleotid- und proteinsequenz von mammastatin und anwendungsmethoden

Info

Publication number: DE69837935T2
Application number: DE69837935T
Authority: DE
Inventors: Paul R. Ann Arbor ERVIN
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2018-12-19
Also published as: US20110003318A1; ATE364706T1; JP4441113B2; US20070082334A1; US6599495B1; EP1037989A2; DE69837935D1; EP1037989B1; US6500937B1; US7816097B2; AU1935399A; US20080207506A1; WO1999032625A3; US7256277B2; CA2315239A1; WO1999032625A2; JP2001526891A; CA2315239C

Description

Dies ist eine Teilfortführung der US-Patentanmeldung Nr. 08/943.828 , eingereicht am 3. Oktober 1997, die hiermit für jeden Fall durch Zitat erwähnt sei.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Brustkrebs. Die Erfindung betrifft insbesondere Nucleinsäuresequenzen, die für Mammastatin codieren – ein Protein, das bei der Diagnose und Behandlung von Brustkrebs brauchbar ist.
Hintergrund der Erfindung
Brustkrebs ist eine Krankheit, an der jährlich mehr als 45.000 Frauen alleine in den Vereinigten Staaten sterben. Jedes Jahr werden über 180.000 neue Fälle von Brustkrebs diagnostiziert, und man schätzt, dass es bei einer von acht Frauen zur Entwicklung von Brustkrebs kommt. Diese Zahlen zeigen, dass Brustkrebs eine der gefährlichsten Krankheiten ist, denen Frauen sich heute gegenübersehen. Der Krebsforschung ist es nicht gelungen, die Ursache von Brustkrebs zu bestimmen, und man hat kein geeignetes Verfahren zur Therapie oder Prävention gefunden.
Frauen mit diagnostiziertem Brustkrebs können mittels Chirurgie, Hormontherapie, Chemotherapie und Strahlung behandelt werden. Entwickeln die Patientinnen eine metastatische Erkrankung, so ist Strahlung und eine hoch dosierte Chemotherapie erforderlich, um den Krebs in abseits gelegenen Regionen wie z.B. Gehirn, Knochen und Leber zu abladieren.

Die zur Behandlung von Brustkrebs zur Verfügung stehenden aktuellen Therapien sind toxisch, gefährlich, kostspielig, und viele sind unwirksam, insbesondere bei der Behandlung metastatischer Erkrankungen. Die nachstehende Tabelle stammt aus Churchill Livingston, Clinical Oncology, 1995, und in ihr sind die zu den aktuel len Behandlungsmethoden verfügbaren Daten und die zu erwartenden Überlebensraten zusammengestellt.

Behandlung	Methode	Wirkung	Toxizität	Ergebnis	Überleben
Adriamycin	Bolus	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+14 Monate
Cyclophosphat	Bolus	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+16 Monate
Methotrexat	Infusion	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+16 Monate
5F-Uracil	Infusion	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+18 Monate
Mix der obigen	gemischt	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+22 Monate
Taxol	Bolus	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+12 Monate
Estrogen	oral	kann Wachstum aufhalten	gering	kann Remission induzieren	+6 Monate
Tamoxifen	oral	kann Wachstum aufhalten	gering	kann Fortschreiten aufhalten	+12 Monate
Mastektomie	operativer Eingriff	Tumorentfernung	gering	kann Krebs beseitigen	+5 Jahre*
Operative Tumorentfernung	operativer Eingriff	Tumorentfernung	gering	kann Krebs beseitigen	+5 Jahre*
Chirurgie und Tamoxifen	Kombination	Kombination	gering	kann Krebs beseitigen	+7-10 Jahre*
Strahlung	Mechanisch	Abtötung von Krebszellen	hoch	kann Remission induzieren	+14 Monate

* Unter der Annahme, dass keine Mikrometastasen vorliegen

Gegenwärtig gibt es keine Therapien, die für eine langfristige Behandlung von Brustkrebs wirksam sind, der zu den Lymphknoten oder an distale Stellen metastasiert ist. Eine lokale Erkrankung kann durch einen operativen Eingriff wirksam behandelt werden, falls der Krebs völlig entfernt werden kann. Es besteht dringender Bedarf an einer neuen Therapie zur wirksamen Behandlung von Brustkrebs, die das Wachstum von Brustkrebs und von Zellen aufhalten kann, die von metastatischem Krebs stammen. Eine solche Therapie wäre hilfreich bei der Behandlung von lokalem Brustkrebs, bei der langfristigen Behandlung von metastatischen Erkrankungen und als Nachsorgebehandlung nach der operativen Entfernung von Tumoren. Weitere Anwendungen umfassen einen Wachstumshemmer als Primärtherapie und zum präventiven Einsatz.
Durch die Nachweismethoden für Brustkrebs wie z.B. Mammogramm, Körperuntersuchung, CAT-Abtastung und Ultraschall hat sich die Früherkennung von Brustkrebs deutlich verbessert. Bei diesen Verfahren muss jedoch ein vermuteter Tumor nach wie vor zur pathologischen Untersuchung operativ entfernt werden, um zu bestimmen, ob der Tumor gutartig oder bösartig ist, und den Versuch zu unternehmen, den Gewebetyp und den Grad der Bösartigkeit zu bestimmen. Diese pathologische Diagnose ist hilfreich zur Bestimmung, welche Vorschriften zur nachfolgenden Behandlung verwendet werden können.
Bei Brustkrebs lassen diese Verfahren im Allgemeinen keine Schlüsse zu, da keine passenden Brustkrebs-Tumormarker zur Verfügung stehen. Verfügbare Marker wie etwa CA 15-3 und CA 27-29 werden als Indikatoren für Metastasen verwendet, sind jedoch nicht spezifisch. Es besteht ein großer Bedarf an diagnostischen Werkzeugen und Verfahren, mit denen Brustkrebs wirksam und zuverlässig diagnostiziert werden kann, z.B. unter Verwendung neuer und spezifischer Brustkrebs-Marker. Zudem besteht großer Bedarf an einem zuverlässigen und einfachen Verfahren zur Früherkennung und Diagnose von Brustkrebs. Vorzugsweise wird mit einem solchen Früherkennungsverfahren Brustkrebs im Frühstadium identifiziert, die Entwicklung des Brustkrebses über fortgeschrittene metastatische Erkrankungen verfolgt und die Neigung einer Patientin zur Entwicklung von Brustkrebs oder zur Entwicklung einer fortgeschrittenen Erkrankung diagnostiziert. In sehr bevorzugter Weise kann das diagnostische Verfahren ohne eine Gewebebiopsie eingesetzt werden, z.B. durch Analyse einer Körperflüssigkeit wie etwa Blut.
Menschliche Brustgewebe durchlaufen beim Einsetzen der Menarche und während jedes Menstruationszyklus einen Ausbruch proliferativer Aktivitäten. Untersuchungen zu den Wirkungen von Estrogen auf Brustgewebe und -tumoren zeigen, dass Estrogen ein primärer Wachstum initiierender Faktor für Brustgewebe ist. Estradiol-sensitive Wachstumsfaktoren wurden charakterisiert. Außerdem sind auch Brustzellen-Wachstumsfaktoren beschrieben, die nicht hormoneller Natur sind.
Zu den spezifischen Wachstumsfaktoren, von denen gezeigt wurde, dass sie stimulierende Wirkung auf das Wachstum von Brustgewebe haben, zählt der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF), der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (IGF-1) und der von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktor (TGF) α. Andererseits wurde gezeigt, dass TGF-β das Wachstum von Brustgewebe supprimiert.
Die Regulierung des Wachstums von Brustzellen ist von großer Bedeutung bei der Diagnose und Behandlung von Brustkrebs. Neoplastisches Wachstum von Brustgeweben kann – falls nichts dagegen unternommen wird – sich zu unkontrollierbar wuchernden, bösartigen Tumoren entwickeln, die jährlich zum Tode von tausenden Frauen führen. Ein wachstumshemmender Faktor, der das Wachstum von Brustzellen spezifisch supprimieren kann, erbrächte ein dynamisches Werkzeug zur Verwendung bei der Diagnose und Behandlung von Brustkrebs.
Von großem Nutzen wäre also die Isolierung und Charakterisierung eines spezifischen Brustzellen-Wachstumshemmers, die Identifizierung der Nucleinsäuresequenz und der Aminosäuresequenz und die rekombinante Expression des Hemmers als gereinigtes Protein. Diagnostische und therapeutische Verfahren unter Verwendung der Nucleinsäuresequenz und/oder des rekombinant hergestellten Hemmers wären von großem Nutzen bei der Diagnose und Behandlung von Brustkrebs.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Ein spezifischer Brustzellen-Wachstumshemmer, das Mammastatin, wurde aus normalen menschlichen Brustzellen isoliert und charakterisiert. Nun wurde gefunden, dass Mammastatin von normalen Brustzellen produziert wird, nicht aber von Brustkrebszellen. Auch wurde nun gefunden, dass eine Verringerung oder das Fehlen von Mammastatin im Blut mit dem Vorhandensein von Brustkrebs korreliert. Die Verabreichung von aktivem Mammastatin verhindert das Wachstum von Brustkrebszellen.
Die für Mammastatin codierende Nucleinsäuresequenz wurde nun kloniert, sequenziert und in Wirtszellen als aktiver Hemmer des Wachstums von Brustzellen rekombinant exprimiert. Die isolierte und charakterisierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO. 1) und die daraus folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) erbringen einzigartige und spezifische Werkzeuge zur Verwendung bei der Diagnose und Behandlung von Brustkrebs.
Die vorliegende Erfindung macht eine isolierte und gereinigte Nucleinsäuresequenz verfügbar, die für Mammastatin codiert, das ein spezifischer Proteinhemmer des Brustzellenwachstums und insbesondere des Wachstums von Brustkrebszellen ist. Die Erfindung umfasst auch Plasmide und Vektoren, die die Mammastatin-Nucleinsäuresequenz enthalten, die Aminosäuresequenz von Mammastatin sowie Verfahren, Kits und Zusammensetzungen, bei denen die Nucleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz von Mammastatin genutzt wird, um einen gereinigten Brustzellen-Wachstumshemmer herzustellen, sowie die Verwendung bei der Diagnose und Behandlung von Brustkrebs. Die erfinderischen Zusammensetzungen umfassen Sonden und Primer, die spezifisch an die Mammastatin-Nucleinsäuresequenz und deren RNA-Produkte hybridisieren.
Beschrieben wird auch ein Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs durch Verabreichung von Mammastatin.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Western-Blot, der die Expression von rekombinantem Mammastatin in eukaryontischen Cos-7-Zellen zeigt.
2 ist ein Immunoblot, der die Expression von Mammastatin in Insektenzellen zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die Hemmung des Brustzellenwachstums durch rekombinantes Mammastatin zeigt, das durch in vitro-Transkription und Translation erzeugt wurde.
4 ist ein Diagramm, das die Hemmung des Wachstums bei menschlichen Brustkrebszellen durch Behandlung mit einem konditionierten Medium von Cos-7-Zellen zeigt, die mit Mammastatin-cDNA transfiziert sind.
5 ist ein Western-Blot, der die relativen Mengen von 53, 49 und 44 kD-Mammastatin in normalen und kanzerösen menschlichen Brustzellen zeigt.
6 ist ein Immunoblot, der den Phosphatase-Verdau von Mammastatin zeigt.
7 ist ein Diagramm, das die Wirkung von Phosphatase auf die Aktivität von Mammastatin zeigt.
8 ist ein Western-Blot, der Mammastatin aus normalen und kanzerösen menschlichen Brustzellen sowie in gemischten Kulturen aus normalen und kanzerösen Zellen zeigt.
9 ist ein Diagramm, das Mammastatin in normalem menschlichen Serum wie mittels ELISA analysiert zeigt.
10 ist ein Diagramm, das eine Mammastatin-ELISA-Standardkurve zeigt.
11 ist ein Diagramm, das die Mammastatin-Spiegel in Brustkrebs-Patientinnen über den Verlauf der Behandlung zeigt.
12 ist ein Western-Blot, der die Retrovirus-induzierte Expression von Mammastatin zeigt.
Die 13A, 13B und 13C sind Diagramme, die die Wirkung der Mammastatin-Behandlung auf MCF7-Tumorzellen in Nacktmäusen zeigen.
14A, 14B und 14C sind Diagramme, die die Wirkung der Mammastatin-Behandlung auf Tumorzellen in Nacktmäusen zeigen.
15 ist ein Dotblot-Assay, der Mammastatin im Blut von normalen Frauen gegenüber der Abwesenheit von Mammastatin im Blut von Brustkrebs-Patientinnen zeigt.
16 ist ein Immunoblot von Säugerzellen, die rekombinantes Mammastatin exprimieren.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Mammastatin
Mammastatin ist ein Protein-Wachstumshemmer, der von normalen menschlichen Brustepithelzellen produziert und sezerniert wird. Beschrieben wurde zunächst ein Brustzellen-Wachstumshemmer in Form einer in Medien vorhandenen hemmenden Protein-Wirkung, welche durch das Wachstum normaler menschlicher Brustzellen konditioniert waren. Die hemmende Wirkung wurde in konditioniertem Medium aus normalen menschlichen Brustzellen identifiziert, jedoch nicht in Medien, die durch das Wachstum menschlicher Brustkrebszellen konditioniert waren. Es wurde mittels Bioassay und Antikörper-Entwicklung festgestellt, dass die hemmende Wirkung in drei Proteinen liegt, welche die ungefähren Molekulargewichte 53, 49 und 44 kDa aufweisen (Ervin, Paul R., Dissertation University of Michigan, 1995).
Nun wurde festgestellt, dass ein bestimmter Brustzellen-Wachstumshemmer, das Mammastatin, als 44 kD-Protein exprimiert wird, dessen Molekulargewicht durch Phosphorylierung auf 49 kD und 53 kD ansteigt. Die nicht phosphorylierte Form mit 44 kD ist kein wirksamer Hemmer, während die phosphorylierten Formen mit 49 kD und 53 kD das Wachstum von Brustkrebszellen hemmen. Das wirksame Phosphoprotein mit 53 und/oder 49 kD wird von normalen menschlichen Brustzellen exprimiert, wird jedoch im Allgemeinen nicht von menschlichen Brustkarzinomzellen produziert. Einige Karzinomzellen erzeugen das 44 kD-Protein, das die Phosphorylierung nicht aufweist und inaktiv ist.

Die nachstehende Tabelle ist eine Zusammenfassung von Daten, die die Expression und Aktivität von Mammastatin in normalen und kanzerösen Zellen und Geweben zeigen.

Zelltyp*	Anzahl	44 kDa**	53/49 kDa**	erzeugen Hemmer	werden gehemmt
Normale Primärkulturen	42	+/-	++++	42/42	2/2
Normales Brustgewebe	5	+	++
Brustzelllinie	16			0/16	12/12
Typ A	11	+	-	0/11	8/8
Typ B	5	-	-	0/5	4/4
Brusttumorlysat	25
Typ A	17	+	-
Typ B	8	-	-
Nichtmammäre Zelllinien	8			0/2	0/8
Typ A	3	+	-***	0/1	0/3
Typ B	5	-	-***	0/1	0/5

* Karzinomzellen, in denen Mammastatin mit 44 kDa nachgewiesen wurde (Typ A) oder nicht (Typ B)
** (-) Keine Expression (++++) starke Expression
*** Zwei Zelllinien, BxPc3 und A253, exprimierten Proteine, die als 53/49 kD identifiziert wurden, doch keine Zelllinie ergab eine hemmende Wirkung.

Dosis-Wirkungs-Studien mit menschlichen Brustkarzinomzellen zeigen, dass das Wachstum der Karzinomzellen mit 10 ng/ml Mammastatin zu 50-70% gehemmt und mit 25-50 ng/ml vollständig blockiert wird. Bei stark metastatischen Zellen wie etwa MDA-MB-435 und MDA-MB-231 waren 50 ng/ml erforderlich, um das Wachstum aufzuhalten. Klinische Daten von in vitro- und in vivo-Experimenten zeigen, dass die Wirkung reversibel ist, und dass wiederholte Verabreichung des Inhibitors nötig ist, um das Wachstum der Karzinomzellen bei den niedrigeren Konzentrationen zum Stillstand zu bringen. Bei Dosen von mehr als 50 ng/ml scheint Mammastatin jedoch Apoptose zu induzieren, wie sich anhand der Histologie zeigt, z.B. Zellnekrose.
Da Mammastatin ein natürlicher Wachstumshemmer ist, der das Wachstum von Brustkarzinomzellen blockiert, und da kein Tumor aktives Mammastatin erzeugt, ist die Mammastatin-Ersatztherapie ideal für die therapeutische Behandlung von Brustkrebs. Die in den nachstehenden Beispielen gelieferten klinischen Daten zeigen die Wirksamkeit der Mammastatin-Ersatztherapie.
Die für das Protein Mammastatin codierende Nucleinsäuresequenz wurde nun isoliert, charakterisiert, sequenziert (SEQ ID NO. 1), und es wurde festgestellt, dass sie für alle drei Proteine mit den Molekulargewichten 53, 49, und 44 kD codiert, denen der Name "Mammastatin" gegeben wurde. Es wurde festgestellt, dass die Unterschiede im Molekulargewicht der drei Formen vom Grad der Phosphorylierung des Proteins verursacht werden. Von normalen humanen mammären Zellen (NHMC) in Kultur erzeugtes Mammastatin und rekombinant exprimiertes Mammastatin hemmen das Wachstum menschlicher Brustkarzinomzellen und sind brauchbar als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Brustkrebs.
Die Analyse von Humanseren aus normalen Frauen und Brustkrebspatientinnen zeigt, dass verringerte Mammastatin-Blutspiegel mit fortschreitendem Brustkrebs korrelieren. Durch Screening und Überwachung des Blutserums auf die Anwesenheit dieses wirksamen Inhibitors – wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben – ergibt sich ein spezifisches und wirksames diagnostisches Werkzeug.
Nucleinsäuresequenz
Die für Mammastatin codierende Nucleinsäuresequenz (DNA SEQ ID NO. 1) und die daraus folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) sind in Tabelle 1 ge zeigt. Die Sequenz wurde durch Klonieren und Sequenzieren von Mammastatin-cDNA aus einer cDNA-Bibliothek normaler menschlicher Brustzellen identifiziert, wie in den nachstehenden Beispielen eingehender beschrieben ist. Ein chromatographisch gereinigter Hemmer wurde bislang nicht hinreichend isoliert, um eine Analyse seiner Aminosäuresequenz zu erlauben, und die ersten Versuche zur Sequenzierung des Protein-Inhibitors mit Hilfe der üblichen Techniken schlugen fehl. Bei den Versuchen zum Screening einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Antikörpern, die gegen das chromatographisch gereinigte Inhibitor-Protein geschaffen wurden, konnte kein aktiver Klon erzeugt werden. Zur Überwindung dieser Probleme wurde das für Mammastatin codierende Gen identifiziert durch Peptid-Sequenzierung und Screening einer cDNA-Bibliothek normaler menschlicher Brustzellen mit degeneriertem Oligonucleotid.
Das durch die normalen menschlichen Brustzellen produzierte konzentrierte Protein wurde affinitätsgereinigt unter Verwendung eines Antikörpers gegen Mammastatin, der gegen den chromatographisch gereinigten Inhibitor geschaffen wurde. Die gereinigten Protein-Fraktionen wurden mit einer kleinen Menge (10⁵ min^-1) ³²P-markierung Tracer ergänzt. Das markierte Tracer-Protein wurde aus konditionierten Medien von Zellen aufgereinigt, die in Gegenwart von ³²P vermehrt wurden, wie in den nachstehenden Beispielen eingehender beschrieben ist. Das Protein wurde mit Bromcyan gespalten, und die Spaltfragmente wurden durch autoradiographische Analyse des ³²P-markierten Proteins als Mammastatin identifiziert. Sequenziert wurden die häufigsten markierten Peptide, die durch die Spaltung erzeugt worden waren.
Zur Herstellung der degenerierten Oligonucleotide wurden zwei Peptide verwendet, die so ausgewählt wurden, dass sie einzigartige Aminosäuresequenzen haben (SEQ ID NO. 3 und 4). Die degenerierten Oligonucleotide wurden anschließend zum Screening einer cDNA-Bibliothek normaler menschlicher Brustzellen verwendet.
Ein Klon, bezeichnet als pMammA, hybridisierte an die Oligonucleotide von beiden ausgewählten Peptiden. Dieser Klon wurde näher charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass er ein Protein exprimiert, das von Antikörpern gegen Mammastatin erkannt wird. Durch Northern-Blot-Analyse, in vitro-Transkriptions- und Translationsassays und Wachstumshemmungsassays wurde bestätigt, dass der Klon für Mammastatin codiert. Ein pcDNA3-Klon, der das Mammastatin-cDNA-Insert enthält (pMammB), wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer 97451. Das aus pMammB exprimierte rekombinante Protein (SEQ ID NO. 2) wurde durch Immunoblot von transfizierten Säugerzelllinien nachgewiesen, und es wurde gezeigt, dass es wachstumshemmende Wirkung gegen Brustkrebszellen besitzt. Der cDNA-Klon wurde vollständig sequenziert (siehe Beispiel 3) und erwies sich als einzigartig in der BLAST-DNA-Datenbank.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO. 1) codiert für menschliches Mammastatin, das so wirkt, dass es das Wachstum von menschlichen Brustzellen – normalen und kanzerösen – hemmt. Der Begriff "menschlich" (bzw. human) soll die Herkunft des Proteins nicht einschränken, und auch die hemmenden Wirkungen sollen nicht nur auf menschliche Zellen und Gewebe beschränkt sein. Es sei klar, dass die Nucleinsäuresequenz und die Aminosäuresequenz von Mammastatin in Individuen etwas variieren können, ohne dass Struktur oder Funktion des Proteins sich ändern. Zudem wird dem Fachmann in Biochemie klar sein, dass Abwandlungen an der Nucleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz vorgenommen werden können, ohne die Struktur und/oder Funktion des Moleküls zu verändern. Zum Beispiel kann die Nucleinsäuresequenz so abgewandelt werden, dass optimale Expression der gewünschten Aminosäuresequenz ermöglicht wird, wobei bekannte optimale Codons für einen bestimmten zellulären Wirt verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz ist nützlich bei der Herstellung großer Mengen hochgereinigten Mammastatin-Proteins zur Verwendung bei therapeutischen und diagnostischen Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs.
Antikörper gegen Mammastatin
Etliche Anti-Mammastatin-Antikörper wurden hergestellt und charakterisiert. Siehe zum Beispiel PCT-Anmeldung WO 89/11491 , veröffentlicht am 30. November 1989. Diese Antikörper wurden geschaffen gegen chromatographisch gereinigtes Inhibitor-Protein, und es wurde gezeigt, dass sie die hemmende Wirkung des Mammastatin-Proteins auf das Wachstum von Brustzellen blockieren.
Zu den verfügbaren Antikörpern gegen Mammastatin zählen 7G6 und 3C6, die im Handel erhältlich sind von Neomarkers (Freemont, CA), und 6B8. Hybridom-Zellen, die 6B8-Antikörper produzieren, sind von der American Type Culture Collection zu beziehen (ATCC Nr. HB 10152). Jeder dieser Antikörper bindet an alle drei Molekulargewichtsformen von Mammastatin, und sie sind brauchbar bei immunologischen Assays, darunter Dot-Blots und Western-Blots. Der 7G6-Antikörper ist bevorzugt für die Western-Blot-Analyse oder für den ELISA von denaturierten Protein-Proben. Die Antikörper 3G6 und 6B8 können bei ELISAs verwendet werden, z.B. unter Bedingungen, die in den Beispielen angegeben sind.
Weitere Antikörper können hergestellt werden unter Verwendung üblicher Verfahren, die bekannt sind für die Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Das zur Herstellung der Antikörper verwendete Antigen kann aus NHMC-Kultur oder aus rekombinant exprimiertem Mammastatin stammen.
Diagnostisches Verfahren
Die Erfindung macht des Weiteren einen in vitro-Assay zum Nachweis von aktivem, hemmendem Mammastatin in Patientinnenproben verfügbar, darunter Gewebe, Zellen und Flüssigkeiten. Brustkrebs-Erkrankungen und fortschreitende metastatische Erkrankungen werden diagnostiziert durch Korrelieren der Anwesenheit und Art des Mammastatin-Proteins in einer Probe der Patientin mit der von normalen oder kanzerösen menschlichen Brustzellen. Eine Blut- oder Gewebeprobe einer Patientin wird auf das Mammastatin-Protein analysiert, z.B. auf die Häufigkeit des Mammastatin-Proteins und/oder auf die Molekulargewichtsformen von Mammastatin. Wie nachstehend erörtert, wird die Abwesenheit oder der Verlust von Mammastatin, insbesondere der höhermolekularen phosphorylierten Formen von Mammastatin, mit Brustkrebs korreliert und zeigt eine fortschreitende metastatische Erkrankung an.
Die Analyse von Mammastatin erfolgt vorzugsweise mittels Immunassay, darunter ELISA oder Western-Blot-Analyse von Blutproben einer Patientin unter Verwendung von Antikörpern gegen Mammastatin. Vorzugsweise werden Standards von rekombinantem Mammastatin verwendet, um eine Standardkurve für eine zuverlässige Quantifizierung der Inhibitor-Spiegel zu ergeben. Beispielhaft für solche Immunassays sind die Dotblot-Assays und Western-Blot-Assays, die in den nachstehenden Beispielen gezeigt sind. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Gewebeproben, etwa Tumor-Biopsien, mittels Immunhistochemie analysiert oder durch Kultivieren der Tumorzellen einer Patientin und Untersuchen der Kulturen auf Expression von Mammastatin.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Assay zur Diagnose von Brustkrebs wenigstens zwei spezifische Antikörper: einen Antikörper zur Identifizierung des Probenbrustgewebes als Epithel-Gewebe, wie z.B. einen Antikörper gegen Cytokeratin, und einen Anti-Mammastatin-Antikörper. Unter Verwendung eines Immunoblot-Formats wird zum Beispiel ein Gewebe, von dem vermutet wird, dass es Brustkrebszellen enthält, homogenisiert, auf einem SDS/PAGE-Gel getrennt, auf eine Membran überführt und mit Antikörpern sowohl gegen Kerstin als auch gegen Mammastatin geprüft. Zum Nachweis der gebundenen Antikörper werden isotypspezifische zweite Antikörper verwendet, die an ein geeignetes Markersystem wie etwa Peroxidase oder alkalische Phosphatase konjugiert sind. Membranen, die gebundene erste und zweite Antikörper enthalten, werden dann unter Verwendung bekannter kolorimetrischer oder fluorometrischer Techniken entwickelt und mit Hilfe bekannter Verfahren quantifiziert.
In der meist bevorzugten Ausführungsform wird die Probe etwa mittels Western-Blot unter Verwendung von Antikörpern gegen Mammastatin auf die phosphory lierten Formen von Mammastatin analysiert. Die Verringerung oder Abwesenheit von Mammastatin mit hohem Molekulargewicht (53/49 kD) korreliert mit fortschreitendem Brustkrebs.
Rekombinante Expressionsvektoren und transformierte Zellen
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren sind brauchbar zur Herstellung und Amplifikation von gereinigtem Mammastatin-Protein und Teilen desselben und zur einfachen Isolierung von Mammastatin-Protein und Teilen desselben, die bei diagnostischen und therapeutischen Verfahren eingesetzt werden sollen.
Eine Zielsequenz, etwa die gesamte oder ein Teil der Mammastatin-cDNA mit 2434 kb (SEQ ID NO. 1), wird mit Hilfe üblicher Verfahren in eine geeignete Nucleinsäuresequenz eines Expressionsvektors wie z.B. pUC18, pKC30, pBR322, pKK177-3, pET-3, pcDNA3 (Invitrogen) für COS- und CHO-Zellen und pAcG3X-Baculovirus-Expressionsvektor (PharMingin, San Diego, CA) für die Expression in Insektenzellen und dergleichen kloniert, die bekannte Expressionssysteme sind. Im Handel erhältliche Expressionsvektoren sorgen für die Klonierung einer Zielsequenz in eine Stelle des Vektors in einer Weise, dass die Zielsequenz wirksam mit den Transkriptions- und Translationskontrollregionen verknüpft ist.
Unter Anwendung bekannter Verfahren wie z.B. Calciumphosphat-Präzipitation, Liposomen-vermittelte Transformation, Protoplasten-Transformation, Elektroporation und dergleichen wird der Expressionsvektor anschließend in geeignete Wirtszellen eingeführt. Zu den geeigneten Wirtszellen gehören COS- und CHO-Zellen, High 5- und SF9-Insektenzellen, Baculovirus und Hefezellen. Weitere Wirtszellen umfassen E. coli-Stämme wie z.B. E. coli DH5α und avirulente isogene Salmonella spp. wie z.B. S. typhimurium-Deletionsmutanten, denen adenylierte Cyclase und das cAMP-Rezeptorprotein fehlt, Salmonella-Mutanten in aro-Genen, und andere Salmonella-Vakzinstämme wie beschrieben in Bio/Tech 6, 693 (1988).
Vorzugsweise ist der zelluläre Wirt eine eukaryontische Zelle, die das Protein mit der richtigen Faltung und Kinase-Aktivität exprimieren kann, um einen phosphorylierten, aktiven Inhibitor zu ergeben. Die Wirtszellen können gescreent werden durch Transfektion mit cDNA, die für Mammastatin codiert. Die Analyse des von den transformierten Zellen produzierten Proteins, z.B. mittels Immunoblot, und die Fähigkeit des Proteins zur Hemmung des Brustzellenwachstums, zum Beispiel des Wachstums von MCF7-Zellen, wie in den nachstehend angegebenen Beispielen beschrieben, können zum Screening potentieller Wirtszellensysteme herangezogen werden.
Die mit der Zielnucleinsäuresequenz transformierten Wirtszellen werden mit vielen verschiedenen Methoden gescreent, darunter Koloniehybridisierung oder Reaktivität mit Antikörpern, die für das Mammastatin-Protein spezifisch sind. Eine transformierte Zelle ist eine geeignete Wirtszelle, die pcDNA3 oder ein anderes Plasmid oder einen Vektor trägt, die eine für Mammastatin codierende Nucleinsäuresequenz enthalten. Eine solches Plasmid ist das pcDNA-Plasmid (pMammB), das das BamHI-XhoI-Insert mit 2,4 kb von pMammA trägt, das am 22. Februar 1996 bei der American Type Culture Collection in Rockville, MD, hinterlegt und mit der Zugangsnummer 97451 versehen wurde (siehe Beispiel 5.)
Ein Expressionsvektor, der die spezifische Ziel-DNA-Sequenz enthält, wird verwendet, um das gesamte Mammastatin-Protein oder einen Teil davon durch in vitro-Transkription und Translation durch Insertion in zelluläre Wirte für die Protein-Produktion zu erzeugen. Die vom Expressionsvektorsystem produzierten Proteine hemmen das Wachstum von normalen und kanzerösen Brustzellen (siehe Beispiel 7). Mit dem Vektor transfizierte eukaryontische Zellen, z.B. Cos7-Wirtszellen, exprimieren und sezernieren Mammastatin in das konditionierte Medium. Das konditionierte Medium hemmte das Wachstum von normalen und kanzerösen Brustzellen (siehe Beispiel 8).
Die Aminosäuresequenz
Das Mammastatin-Protein (SEQ ID NO. 2) ist ein Polypeptid aus etwa 2400 Aminosäureresten mit einer Sequenz, die aus der Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO. 1) folgt und die in Tabelle 1 gezeigt ist. Das von der klonierten Mammastatin-Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO. 1) exprimierte Protein hemmt das Wachstum von Brustkrebszellen (MCF-7).
Das rekombinante Mammastatin-Protein kann in gereinigter Form und in großen Mengen effizient hergestellt werden. Gereinigtes rekombinantes Mammastatin ist nützlich als zuverlässiger Standard für diagnostische Assays des Inhibitors in Patientinnenproben. Rekombinantes Mammastatin-Protein ist auch brauchbar als gereinigtes therapeutisches Mittel zur Hemmung oder Verhütung des Wachstums von Brustkrebszellen.
Therapeutische Anwendung
Das Mammastatin-Protein für die therapeutische Anwendung wird aus NHMC-Kulturen unter serumfreien Bedingungen oder rekombinant erzeugt. Das Mammastatin-Phosphoprotein wird therapeutisch eingesetzt zur Hemmung des Brustzellenwachstums, z.B. bei der Behandlung von Brustkrebs. Vorzugsweise wird das Mammastatin in höheren eukaryontischen Zellen produziert, um eine Phosphorylierung des Proteins zu erzielen. Rekombinantes Mammastatin-Protein wird in Wirtszellen oder synthetisch hergestellt.
Funktionsfähiges Mammastatin wird zur Verabreichung des Phosphoproteins mit Hilfe bekannter Methoden an Patientinnen verabreicht, vorzugsweise durch Injektion, um den Inhibitor-Spiegel im Blutkreislauf zu erhöhen und die Wechselwirkungen des Inhibitors mit den Brustzellen zu steigern.
Das Protein kann der Patientin mit Hilfe von Methoden gegeben werden, die auf dem Gebiet der Gabe von therapeutischen Mitteln aus phosphoryliertem Protein bekannt sind. Im Allgemeinen wird der Inhibitor mit einem Verabreichungsträger gemischt und mittels Injektion verabreicht.
Die Dosierung des zu verabreichenden Inhibitors kann durch den Fachmann bestimmt werden und wird je nach Art der Behandlungsmodalitäten und Ausmaß der Erkrankung variieren. Da Mammastatin in einer Konzentration von 10 ng/ml in vitro etwa 50% des Brustkrebszellenwachstums hemmt und bei etwa 20-25 ng/ml das Wachstum zum Stillstand bringt, beträgt der brauchbare therapeutische Dosierungsbereich etwa 2,5 μg bis etwa 250 μg täglich verabreichter Dosis. Bevorzugt sind etwa 125 μg täglich verabreichter Dosis. Ziel der Verabreichung ist es, eine Körperenddosis zu ergeben, die im physiologischen Bereich oder etwas höher liegt (50-75 ng/ml). Höhere Dosen des Inhibitors (> 50 ng/ml) scheinen Apoptose zu induzieren, wie in der Histologie behandelter Zellen sichtbar wird. Für die klinische Anwendung beträgt der bevorzugte Dosierungsbereich etwa 500 ng/ml für die Erstbehandlung einer metastatischen Erkrankung, gefolgt von einer Erhaltungsdosierung von etwa 50 ng/ml. Erste klinische Studien, die in den nachstehenden Beispielen ausgeführt sind, zeigen, dass eine verabreichte tägliche Dosis von etwa 50 ng/ml bis etwa 750 ng/ml ausreichend ist, um eine Remission bei Brustkrebs-Patientinnen in Stadium IV herbeizuführen.
Da aktives Mammastatin ein phosphoryliertes Protein ist, steht zu erwarten, dass Mehrfachdosen des Inhibitors erforderlich sein werden, um wachstumshemmende Mammastatin-Spiegel im Blut der Patientin aufrechtzuerhalten. Da Mammastatin im Allgemeinen eher zytostatisch als zytozid wirkt, steht zu erwarten, dass für eine maximale Wirkung des Inhibitors regelmäßige Erhaltung der Inhibitor-Spiegel bei Brustkrebs-Patientinnen erforderlich ist.
In der bevorzugten Anwendung wird Mammastatin in hohen Dosierungen (> 50 ng/ml, vorzugsweise etwa 50-500 ng/ml) verabreicht, um Tumorregression zu induzieren. Niedrigere Erhaltungsdosen (< 50 ng/ml, vorzugsweise 20 bis 50 ng/ml) werden angewandt, um Krebszellenwachstum zu verhindern.
Klinische Erfahrungen mit Mammastatin bei Brustkrebs-Patientinnen in Stadium IV zeigen, dass eine brauchbare Dosis eine solche ist, bei der physiologische Spiegel an Mammastatin im Blut aufrechterhalten werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise täglich, kann aber auch beispielsweise durch kontinuierliche Infusion, durch ein Depot mit langsamer Freisetzung oder durch einmalige Injektion alle 2-3 Tage erfolgen. Aus unveröffentlichten Anhaltspunkten geht hervor, dass kontinuierliche Verabreichung eine Feedback-Hemmung induzieren kann, und daher besteht ein bevorzugtes Verabreichungsschema in der täglichen Verabreichung einer Dosis Mammastatin über etwa 25-28 Tage, gefolgt von 2-5 Tagen ohne Verabreichung.
Diagnostische Anwendung
Die Assays der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen der Gegenwart des funktionsfähigen Inhibitors in menschlichem Gewebe und Serum sind brauchbar zum Screening von Patientinnen auf Brustkrebs, zum Screening der Bevölkerung auf diejenigen mit hohem Risiko der Entwicklung von Brustkrebs, zum Nachweisen eines frühen Ausbruchs von Brustkrebs und zur Überwachung des Inhibitor-Spiegels bei Patientinnen während der Behandlung. Zum Beispiel kann die Analyse des Blut-Mammastatins einer Patientin auf eine verringerte Menge des phosphorylierten Mammastatins mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu einer normalen Kontrolle oder einem früheren Mammastatin-Profil der Patientin hinweisen. Eine solche Änderung steht in Zusammenhang mit erhöhtem Brustkrebsrisiko, frühem Ausbruch von Brustkrebs und mit fortschreitendem metastatischen Brustkrebs. Die diagnostische Prüfung auf phosphoryliertes aktives 49/53 kD-Mammastatin erfolgt vorzugsweise durch Western-Blot-Immunassay, z.B. ELISA, oder unter Verwendung spezifischer Anti-Mammastatin-Antikörper. Das Screening, zum Beispiel in Serum, erfolgt vorzugsweise mittels Immunassay, z.B. Dotblot-Assay.
Um beste Ergebnisse zu erzielen, sollten die Patientinnen-Proben innerhalb kurzer Zeit (innerhalb einer Woche) geprüft, bei 4°C gelagert (weniger als ein Jahr) oder für langfristige Lagerung eingefroren werden. Ganz besonders bevorzugt werden die Proben bis zum Zeitpunkt der Prüfung eingefroren.
Analysenkit
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird ein Analysenkit zum Nachweis von Mammastatin in einer Flüssigkeit und/oder im Brustgewebe einer Patientin bereitgestellt. Der bevorzugte Screeningassay ist ein Immunassay wie z.B. ein Dotblot-Assay zum Nachweisen oder Quantifizieren von Mammastatin im Blutserum. Ein solches Screeningkit umfasst Anti-Mammastatin-Antikörper und gegebenenfalls einen Kontrollantikörper und/oder Mammastatin-Kontrollen oder Standards. Mit einem zweiten Screeningassay wird Mammastatin im Brustgewebe analysiert. Vorzugsweise enthält das Analysenkit die notwendigen Reagenzien und Hilfsmittel zum Reagierenlassen des Gewebes mit einem Antikörper zur spezifischen Bestimmung, dass das Gewebe Brustepithel ist, z.B. mit einem Anti-Cytokeratin-Antikörper und einem spezifischen Antikörper gegen Mammastatin. Die im Handel erhältliche Antikörpermischung Pankeratin (Sigma) ist ein bevorzugter Antikörper gegen Cytokeratin.
Eine negative Prüfung auf Mammastatin könnte entweder durch die Gegenwart eines Brustkrebstumors oder durch nichtepitheliales Brustgewebe verursacht werden. Die Verwendung des Anti-Cytokeratin-Antikörpers schützt gegen falsch positive Assays. Epithelzellen der Brust, die mit dem Antikörper gegen Mammastatin keine Färbung geben oder nur das 44 kD-Mammastatin exprimieren, sind transformierte Zellen. Somit lassen sich falsch positive Ergebnisse vermeiden, indem zunächst das Gewebe als Brustepithel identifiziert wird, das z.B. aus Brustgewebe isoliert wird und positiv gegenüber dem Anti-Cytokeratin-Antikörper ist, und anschließend eine zweite positive Reaktion mit Anti-Mammastatin-Antikörper identifiziert wird.
Da etwa 30% der bislang untersuchten Brustkrebszellen nichtphosphoryliertes inaktives 44 kD-Mammastatin exprimieren, besteht das bevorzugte Analysenverfahren in der Differenzierung zwischen den Formen mit 53/49 kD und 44 kD, z.B. mittels Western-Blot-Analyse.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher definiert.
Beispiel 1
cDNA-Bibliothek humaner Brustzellen
Eine cDNA-Bibliothek wurde aus menschlichen Brustzellen hergestellt, die erhalten wurden aus Brustverkleinerungsoperationen (UM Hospital). Die Gesamt-RNA wurde aus den Brustzellen mit Hilfe eines Cäsiumchlorid-Gradienten isoliert. Aus dem Gesamt-RNA-Präparat wurde die mRNA isoliert. Bei den angewandten Verfahren handelt es sich um diejenigen, die beschrieben sind bei Garner I., "Isolation of total and poly A+ RNA from animal cells", Methods Mol. Biol. (1994) 28, 41-7.
Durch reverse Transkriptase in Gegenwart der isolierten mRNA wurde die cDNA produziert, die anschließend an EcoRI-Linker ligiert wurde. Die cDNA wurde in EcoRI-geschnittenes, T4-DNA-Ligase-behandeltes Lambda Zap inseriert und in XL1-blue E. coli amplifiziert, wobei nach dem bei Short J.M. et al. (1988), Nucleic Acids Research 16, 7583, beschriebenen Verfahren vorgegangen wurde.
Beispiel 2
Herstellung von Mammastatin-Oligonucleotiden
Die in Beispiel 1 hergestellte cDNA-Bibliothek normaler menschlicher Brustzellen wurde unter Verwendung degenerierter Oligonucleotide auf das Vorhandensein von Nucleinsäuren gescreent, die für Mammastatin codieren. Die degenerierten Oligonucleotide wurde wie folgt abgeleitet:
Normale menschliche Brustzellen wurden vom Plastic Surgery Department des University of Michigan Hospital oder vom Cooperative Human Tissue Network bezogen. Das Gewebe wurde durch Collagenase-Behandlung reduziert, wobei im Wesentlichen nach dem bei Soule et al., In Vitro, 22, 6 (1986), beschriebenen Verfahren vorgegangen wurde.
Die Brustzellen wurden in 175 cm³-Kolben in DMEM/F12-Medien mit wenig Calcium, formuliert mit 40 μM CaCl₂ und ergänzt mit 5% CHELEX-behandeltem Pferdeserum (Sigma), 0,1 μg/ml Choleratoxin (Sigma), 0,5 μg/ml Hydrocortison (Sigma), 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, Collaborative Research, Redford MA), 10 μg/ml Insulin und 1 μg/ml Penicillin/Streptomycin, nach dem bei Soule et al., In Vitro 22, 6 (1986), beschriebenen Verfahren bis zur Konfluenz vermehrt. Zur Entfernung von Serum-Calcium wurde das Pferdeserum drei Stunden bei Raumtemperatur mit CHELEX-Harz behandelt.
Die Zelllysate wurden präpariert durch Spülen der Zellen mit TBS und Abkratzen vom Kolben mit einem Teflon-Spatel. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und mit 8 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5% β-Mercaptoethanol, 0,5% TRITON X-100 (Lysepuffer) und drei Minuten Beschallung auf Eis lysiert.
Die Zelllysate wurden an DEAE-Sephacel-Anionenaustauscherharz (Sigma) fraktioniert, das mit Lysepuffer äquilibriert war. Die Lysate wurden auf die harzgefüllten Säulen gegeben (50 ml, Einweg, BioRad) und mit zehn Säulenvolumina Lysepuffer gewaschen. Das Material durchfloss die Säulen lediglich mittels Schwerkraftförderung. Die Fraktionen wurden mit einem Salzgradienten eluiert, der erzeugt wurde durch kontinuierliche Schwerkraftförderung des 5 M NaCl enthaltenden Elutionspuffers in eine geschlossene Mischkammer, die zunächst Elutionspuffer (250 ml 8 M Harnstoff und 50 mM Tris, pH 7,5) in Abwesenheit von Salz enthielt.
Die eluierten Fraktionen (2 ml) wurden mit einem Gibson-Fraktionensammler aufgefangen und mittels Dot-Blot mit dem vorstehend beschriebenen Anti-Mammastatin-Antikörper 7G6 auf die Gegenwart von Brustzellen-Wachstumshemmer analysiert.
Positive Fraktionen wurden gepoolt und in Lysepuffer mit 50 mM NaCl dialysiert, erneut an einer identischen Ionenaustauschersäule getrennt und mit einem konti nuierlich abnehmenden pH-Gradienten (pH 8 bis pH3) in Elutionspuffer mit 50 mM NaCl eluiert. (Zur Erzeugung des pH-Gradienten wurde auf pH 3 gepufferter Harnstoff kontinuierlich mit dem anfänglichen pH 8-Puffer gemischt.) Die Fraktionen (2 ml) wurden aufgefangen und mit dem 7G6-Antikörper wie vorstehend beschrieben analysiert.
Die positiven Fraktionen wurden erneut gepoolt und durch Filterzentrifugation (Amicon Centriprep, 10 kD Cutoff) auf 1/10 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Der konzentrierte Pool wurde mittels präparativer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) zusammen mit vorgefärbten Molekulargewicht-Standards (Sigma) nach Größe fraktioniert.
Das im Molekulargewichtsbereich zwischen 40 und 60 kD enthaltene Protein wurde in Streifen oder Fraktionen von 0,5 cm aus dem Gel ausgeschnitten. Mit dem Protein aus jedem Gelstreifen wurde eine Elektroelution durchgeführt, indem der Gelstreifen in 1 ml Laufpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris, pH 8,3, 0,1% SDS) in einen Dialyseschlauch eingebracht wurde. Der Schlauch wurde in eine Unterwasser-Elektrophoreseapparatur gelegt und über Nacht bei 25 Volt elektroeluiert. Der Strom wurde 2 Minuten lang umgekehrt, und der Laufpuffer, der nun das elektroeluierte Protein enthielt, wurde entfernt. Die Reinheit des eluierten Proteins wurde durch analytische SDS-PAGE mit Silber-Anfärbung sowie mittels Immunoblot mit dem 7G6-Antikörper überprüft, wobei nach dem bei Towbin et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 27, 495-501 (1989), beschriebenen Verfahren vorgegangen wurde. Fraktionen, die wenigstens 70% rein waren, wie bestimmt mittels PAGE mit Silber-Anfärbung, wurden gepoolt, eingeengt und zu Pulverform lyophilisiert.
Das gepoolte Protein wurde mit Bromcyan gespalten, indem das lyophilisierte Pulver in 500 μl 70% Ameisensäure resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur (etwa 20 Stunden) mit 20 mg/ml Bromcyan (Sigma) inkubiert wurde. Die eingesetzten Methoden sind beschrieben bei Freemont et al., Arch. Biochem. Biophys. 228, 342-352 (1986). Die mit Bromcyan gespaltenen Protein-Proben wurden in doppelt destilliertem, deionisiertem Wasser dialysiert, erneut eingeengt und zu einem Pulver lyophilisiert.
Durch die Bromcyan-Spaltung wurden mehrere Peptide aus der ursprünglichen Protein-Probe erzeugt, die mittels präparativer 15% SDS-PAGE getrennt und durch Elektroelution auf eine PVDF-Membran übertragen wurden.
Neben dem Protein, das aus den Brustzelllysaten erhalten wurde, wurde auch aus dem konditionierten Medium der normalen menschlichen Brustzelle Protein isoliert. Die normalen Zellen wurden mit 8 ml DMEM inkubiert, das keine Phosphate enthielt und mit 200 μCi/ml ³²P-Orthophosphat und 1% dialysiertem fetalen Rinderserum ergänzt wurde. Die Zellen wurden 24 Stunden in Gegenwart von ³²P zur Vermehrung belassen, ehe das konditionierte Medium gewonnen wurde.
Das gewonnene konditionierte Medium wurde 5x durch Amicon-Filtration mit 10 kD-Ausschlussgrenze eingeengt. Das konzentrierte Medium wurde einmal mit PBS auf Filtrationsmembranen gewaschen, um überschüssiges, nicht aufgenommenes Phosphat zu entfernen, und wurde weiterhin mittels S-200 SEPHACRYL-Molekularsiebchromatographie (Pharmacia, Uppsala, Schweden; Säule: 100 cm × 0,75 cm) fraktioniert, wobei mit PBS eluiert wurde. Die Abtrennung von nicht aufgenommenem ³²P aus der Probe ist sowohl mit dem Filter als auch mit der Säule möglich. Fraktionen mit 1 ml wurden von der Säule aufgefangen und markierte Fraktionen durch Szintillationszählung identifiziert. Die radioaktiven Fraktionen wurden gepoolt und mittels SDS-PAGE mit Silber-Anfärbung und Autoradiographie analysiert. Das gepoolte Protein wurde eingeengt, zu Pulver lyophilisiert und vor der Bromcyan-Spaltung mit der größeren Masse des nichtmarkierten Proteins vereinigt, das wie vorstehend beschrieben gereinigt worden war. Die Zugabe von markiertem Protein ergibt ein probates Hilfsmittel zum Auffinden der Fragmente aus der Bromcyan-Spaltung, welche die phosphorylierten Mammastatin-Peptide enthalten. Die gespaltenen Peptide wurden wie vorstehend beschrieben mittels präparativer PAGE aufgetrennt.
Nachdem die radioaktiven Proteine mit Bromcyan gespalten, getrennt, auf PVDF-Membran überführt waren und mit ihnen ein Röntgenfilm belichtet worden war, wurden zwei markierte Banden von etwa 20 und 22 kD sichtbar. Diese beiden Peptide wurden aus den Membranen ausgeschnitten und mittels Edman-Abbauverfahren an der University of Michigan Biomedical Research Core Facility unter Anwendung der bei Ullah Alt et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 203, 182-189 (1994), beschriebenen Methoden sequenziert. Die Aminosäuresequenzen von jedem der beiden Peptide wurden mit Hilfe des NIH "BLAST"-Servers mit bekannten Datenbanksequenzen verglichen. Die beiden Peptide erwiesen sich als einmalig.
Ein besonders einmaliger Teil der jeweiligen Sequenz wurde verwendet, um degenerierte Oligonucleotide unter Verwendung der standardmäßigen Degeneration an der dritten Position gemäß dem bei Jerala, Biotechniques 13, 564-567 (1992), beschriebenen Verfahren herzustellen. Von dem 20 kD-Peptid wurde die Sequenz "gly-gln-leu-glu-tyr-gln-asp-leu-arg" (SEQ ID NO. 3) verwendet; von dem 22 kD-Peptid wurde die Sequenz "tyr-glu-arg-asp-leu-lys-gly-arg-asp-pro-val-ala-ala" (SEQ ID NO. 4) verwendet, um mehrere Oligonucleotid-Spezies zu erzeugen. Die degenerierten Oligonucleotide wurden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt.

SEQ ID NO. Peptid

3 gly gln leu glu tyr gln arg leu arg

4 tyr glu arg asp leu lys gly arg asp pro val ala ala
Die degenerierten Oligonucleotide wurden mit ³²P-γ-ATP und T4-DNA-Polynucleotidkinase (BRL, Bethesda, MD) endmarkiert und in T4-DNA-Kinase-Puffer (60 mM Tris, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 15 mM β-Mercaptoethanol) auf 1,5 mg/ml resuspendiert. Die Oligonucleotide (250 μM) wurden anschließend mit 0,33 μM ATP, 5 Einheiten Kinase in 25 μl Kinase-Puffer zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Der Einbau von ³²P-Phosphat wurde mittels TCA-Präzipitation bestimmt (15% TCA, 4° C, 15 Minuten). Ein typischer Einbau war 10⁹ min^-1/μg DNA.
Beispiel 3
Screening der Brustzellen-cDNA-Bibliothek mit degenerierten Oligonucleotiden
Bakterien, die mit dem für Beispiel 1 hergestellten Phagen infiziert waren, der ein cDNA-Insert normaler Brustzellen enthielt, wurden auf 15 cm NZCYM-Platten (10 g NZ-Amin (Boehringer Mannheim), 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 2 g MgSO₄, 1 g Caseinhydrolysat) in Deckagar plattiert (1/10-Verdünnung der infizierten Bakterien-Kulturen auf 6 ml 7% NZYM-Deckagar) und acht Stunden bei 37°C zum Inkubieren belassen. Die Plaques enthaltenden Platten wurden vor der Denaturierung des Phagen 15 Minuten mit Nitrocellulose überschichtet. Der Phage wurde mittels Bloffilter (DNA-Seite nach oben) auf Whatman-Papier, das mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl gesättigt war, 5 Minuten lang denaturiert. Die Filter wurden mit H₂O gewaschen, ehe 5 Minuten in 1 M Tris, pH 7,0, 1,5 M NaCl inkubiert wurde, gefolgt von 20 × SSC und 2 × SSC jeweils 5 Minuten. Die Filter wurden getrocknet und 1 Stunde lang auf 80°C erhitzt oder unter Ultraviolettlicht gelegt, um die DNA zu immobilisieren. Die wärmebehandelten Filter wurden 30 Minuten in 2 × SSC mit 1% SDS gewaschen und anschließend mit 50% deionisiertem Formamid, 5x Denhart-Lösung, 1% SDS, 5 × SSC und 100 μg/ml gescherter Lachsspermien-DNA über Nacht bei 37°C vorhybridisiert.
Die Filter wurden mit dem wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten markierten degenerierten Oligonucleotid in Vorhybridisierungspuffer hybridisiert, dem 10⁷ min^-1/ml wärmedenaturiertes (95°C, 5 Minuten) markiertes degeneriertes Oligonucleotid zugesetzt worden war. Die Hybridisierungen wurden 24 Stunden lang bei 37°C durchgeführt. Die Filter wurden dreißig Minuten bei 37°C mit 2 × SSC gewaschen, gefolgt von 3 dreißigminütigen Wäschen in 2 × SSC plus 1% SDS bei 50°C. Die Filter wurden kurz mit 2 × SSC gespült, getrocknet und zur Identifizierung der positiven Plaques 24-48 Stunden lang auf Kodak AR-5-Film aufbelichtet.
Die positiven Plaques wurden aus Agar-Pfropfen isoliert, die mit der Spitze einer umgedrehten 200 μl-Pipette ausgeschnitten worden waren, und über Nacht bei 4°C resuspendiert. Sekundäre und tertiäre Platten (10 cm) wurden hergestellt unter Verwendung von XL1-B, infiziert mit einer 1/10.000-Verdünnung von Phagen enthaltendem SM-Puffer zu Bakterien, in NZCYM (mit 1 mM MgSO₄). Die Plaques wurden erzeugt durch achtstündiges Inkubieren der infizierten Bakterien wie vorstehend beschrieben und wurden anschließend auf Nitrocellulose überführt, ehe das Screening mit den markierten degenerierten Oligonucleotiden erfolgte. Das Screening wurde im Wesentlichen durchgeführt wie beschrieben bei Kroczek R.A., J Chromatogr 618, 133-45 (1993), unter Verwendung von 10⁷ min^-1/ml markierter DNA für die Hybridisierungen und mit einer Stringenz der letzten Wäsche von dreißig Minuten 2 × SSC bei 50°C.
Der für die weitere Analyse ausgewählte Klon war ein solcher, der beide degenerierten Oligonucleotide erkannte. Dieser Klon erhielt den Namen "pMammA".
Beispiel 4
Sequenzierung der Mammastatin-cDNA
Der in Beispiel 3 erhaltene positive Klon pMammA wurde mit einem Sequenzierungsautomaten an der Biomedical Research Core Facility an der University of Michigan sequenziert sowie durch Didesoxy-DNA-Sequenzierung unter Verwendung von 15% DNA-Sequenzierungsgelen und Radiomarkierung der DNA-Fragmente mit ³⁵S-Nucleotiden. Die angewandten Methoden sind beschrieben bei Lasken RS et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1301-5 (1985).
Die erkannte Fehlerrate der Automatensequenzen beträgt etwa 5%. Daher wurde der hinterlegte Klon zur Bestätigung der Nucleotidsequenz erneut sequenziert, wobei – wie festgestellt – besonders auf die Regionen mit vermuteten möglichen Fehlern geachtet wurde.
Die ursprünglich erhaltenen Sequenzinformationen enthielten zahlreiche Stopcodons in allen Leserastern und auch offenkundige Fehler, insbesondere in den GC-reichen Regionen. Der ursprüngliche Klon (pMammA) wurde sorgfältig resequenziert. Die erhaltene Nucleinsäuresequenz war frei von internen Stopcodons und ist in Tabelle 1 gezeigt (SEQ ID NO. 1).
Beispiel 5
Subklonierung der Mammastatin-cDNA in einen Expressionsvektor
Das Mammastatin-cDNA-Insert pMammA wurde in den Expressionsvektor pcDNA 3 (Invitrogen) subkloniert. Die Mammastatin-cDNA wurde isoliert durch Verdau des wie in Beispiel 4 beschrieben erhaltenen pMammA-Plasmids mit BamHI- and XhoI-Restriktionsendonucleasen. Die Restriktionsenzyme schneiden das Plasmid an den Enden des Mammastatin-Klon-Inserts und erzeugen ein lineares Plasmid-Fragment und ein lineares Insert-Fragment. Die verdaute Probe wurde in die Vertiefungen eines 1,2% Agarose-Gels gegeben, das in ein Elektrophoresegerät eingebracht war, und es wurde ein Strom mit 50 V zwei Stunden lang angelegt. Durch die Elektrophorese werden DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt, wobei das größere Plasmid-DNA-Fragmente eine langsamere Wanderungsgeschwindigkeit auf dem Gel hat. Der das 2,4 kb enthaltende Teil des Agarose-Gels wurde sichtbar gemacht durch Ethidiumbromid-Anfärbung und Beobachten des Gels in einer Ultraviolettlicht-Box. Das 2,4 kb-Mammastatin-Fragment wurde aus dem Gel geschnitten und in einen Dialyseschlauch verbracht, und die DNA wurde in Tris-Borat-Puffer (TBE: 0,089 M Tris-Borat, 0,089 M Borsäure, 0,002 M EDTA) elektroeluiert, der aufgefangen und mit Ethanol gefällt wurde.
Die pcDNA3-Plasmid-DNA wurde modifiziert, so dass das Mammastatin-cDNA-Fragment bei der Ligation angenommen wird. Das pcDNA3-Plasmid wurde mit BamHI- und XhoI-Restriktionsendonucleasen verdaut, und nach vollständigem Verdau wurde die DNA eine Stunde lang in Gegenwart von Kalbsdarmphosphatase inkubiert, um die 5'-Phosphate zu entfernen. Die pcDNA3-Probe wurde anschließend mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
Das pcDNA3 und das 2,4 kb-Mammastatin-cDNA-Fragment wurden aneinander ligiert. Das 2,4 kb-Mammastatin-Fragment und das lineare pcDNA3-Plasmid wurden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase im Verhältnis 3:1 gemischt. Die Ligationsreaktion wurde eine Stunde lang zum Inkubieren belassen und anschließend bei 4°C über Nacht gelagert. Nachdem die Ligationsreaktion vollständig war, wurde die DNA zur Transformation von E. coli-kompetenten Zellen verwendet. Die Subklonierung wurde verifiziert durch Reinigen der Plasmid-DNA aus Ampicillinselektierten Kolonien. Die Plasmide wurden mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und XhoI verdaut. Die verdauten DNA-Proben wurden in Agarose-Gel verbracht und mittels Elektrophorese getrennt. Das Plasmid, welches das Mammastatin-DNA-Fragment mit der richtigen Größe enthielt, wurde als pMammB bezeichnet und am 22. Februar 1996 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und mit der Zugangsnummer ATCC 97451 versehen.
Beispiel 6
Transfektion und Protein-Expression aus der Mammastatin-cDNA-Sequenz Cos-7-Zellen exprimieren keine immunreaktiven Proteine, die zusammen mit den Mammastatin-Proteinen wandern. pMammB und pcDNA3 wurden zur Transfektion von Cos-7-Affen-Fibroblastzellen mit LIPOFECTIN^® (BRL, Life Technologies, Bethesda, MD) verwendet, wobei nach den Anweisungen des Herstellers vorgegangen wurde. Die transfizierten Zellen wurden vor dem Ernten zwei Tage lang vermehrt. Die transfizierten Zellen wurden durch Trypsinierung der Zellen unter Anwendung der üblichen Vorschriften von den Platten entfernt. (2,5 ml Trypsin (0,25% SIGMA) wurden in Kolben mit Zellen 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Ein 7,5 ml-Aliquot RPMI-Medium mit 10% FBS (fetales Rinderserum) wurde zugesetzt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen.) Die Zellen wurden mittels Hämozytometer gezählt und in SDS-PAGE-Probenbeschickungspuffer mit 10⁷ Zellen/ml lysiert. Die Zelllysate wurden auf Gelen mit 8-15% SDS-PAGE-Gradienten (Biorad) getrennt und auf eine Nylon-Membran überführt, wobei nach dem bei Towbin H. et al., J Clin Chem Clin Biochem (Aug. 1989) 27(8), 495-501, beschriebenen Verfahren vorgegangen wurde. Die Membran wurde mit dem monoklonalen Anti-Mammastatin-Antikörper 7G6 sondiert. Gebundener Antikörper wurde mit Peroxidase-konjugiertem GAM-IgM nachgewiesen und mittels ECL (Amersham) entwickelt.
Wie in 1 gezeigt, exprimierten die mit pMammB transfizierten Cos-7-Zellen (Bahnen C, D) immunreaktive Proteine, die zusammen mit dem Mammastatin-Protein wanderten (Bahn A). Die nur mit dem leeren Vektor pcDNA3 transfizierten Cos-7-Zellen exprimierten keine immunreaktiven Proteine bei der Durchführung von Immunoblot-Experimenten (Bahn B). DNA/AS-Sequenz

Bahn A NHMC (25 μg) – Kontrolle

Bahn B Cos-pcDNA3-Zelllysat (25 μg) – Kontrolle

Bahn C Cos-pMammB-Zelllysat (10 μg)

Bahn D Cos-pMammB-Zelllysat (20 μg)
Wie die Immunoblot-Experimente zeigen, enthält der pMammB-Klon ein cDNA-Insert, das ein Protein mit der Größe und den immunologischen Eigenschaften von Mammastatin synthetisieren kann. Zudem wurden die immunreaktiven Proteine mit 44, 49 und 53 kD in den mit pMammB transfizierten Cos-7-Zellen exprimiert. Diese Proteine wanderten beim gleichen Molekulargewicht wie die Mammastatin-Proteine, die zuvor in normalen menschlichen Brustzellen identifiziert worden waren. Diese Gruppe immunreaktiver Proteinen wurde nicht in Cos-7-Zellen identifiziert, die mit dem leeren Vektor pcDNA3 transfiziert worden waren.
Bei dem in 1 gezeigten speziellen Assay zeigt die NHMC-Kontrolle eine ungewöhnlich hohe Menge Mammastatin mit 44 kD. Hierbei handelt es sich um ein Artefakt, das durch lange Lagerung (> 1 Jahr) des NHMC-Standards bei 4°C gebildet wird, die mit der Zeit zum Abbau der Formen mit höherem Molekulargewicht führt. Werden frischere NHMC-Proben (< 1 Jahr alt) oder eingefrorene Proben verwendet, so ist das 44 kD-Protein stets weniger häufig als die Formen mit höherem Molekulargewicht.
Beispiel 7
GST Fusion
Der Mammastatin-Klon kann in ähnlicher Weise in ein Baculovirus-Expressionssystem subkloniert werden. Das pMammA-Insert wurde in einen pAcG3X-Vektor subkloniert, der von Pharmgen (San Diego, CA) im Handel bezogen wurde. Dieser Vektor ermöglich die Herstellung von Mammastatin als Fusionsprotein mit Glutathion S-Transferase (GST) und hat einen Teil des GST-Gens stromaufwärts von der codierenden Stelle.
Das pMammA-Insert wurde subkloniert durch Herstellung von PCR-Primersätzen, die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen für BamHI (5') und SmaI (3'), eine kleine, nichtspezifische Region und einen Teil der Mammastatin-Sequenz enthielten. Es wurden drei jeweils im Leseraster verschobene Primersätze hergestellt. Die Primer hybridisierten an die pMammA-Klone und amplifizierten in einer typischen PCR mit pMammA-Matrizen-DNA ein pMammA-PCR-Produkt, das in das Leseraster des GST-Gens in pAcG3X inseriert werden konnte. Der Vektor wurde dann zur Transfektion von High 5-Wirtsinsektenzellen (Invitrogen) verwendet und exprimierte ein GST-Mammastatin-Fusionsprotein, das mit Glutathion-Harz (Glutathion-Agarose, Qiagen, Chatsworth, CA) problemlos von Wirtsinsektenzellen zu reinigen war.
Zur Herstellung der DNA zum Inserieren in die BamHI, SmaI-Restriktionsstelle pAcG3X (PharMingen, San Diego, CA) wurden Primersätze in drei Leserastern hergestellt, so dass sie im Falle des 5'-Primers die BamHI-Erkennungsstelle (GGATCC), einen Teil der pMammA-Sequenz und etwas von der 5'-Sequenz des pBlueskript-Vektors enthielten. Die 3'-Primer waren identisch und enthielten die SmaI-Erkennungssequenz (GGG CCC), einen Teil der pMammA-Sequenz und etwas von der pBlueskript-Sequenz.

Die verwendeten Primersätze sind in der folgenden Tabelle gezeigt:

SEQ ID NO.:	5'-Primer (in drei Leserastern)*
5	5'-TGG GAT CCC TTC GCC ACG AGC ACG GTG-3'
6	5'-TGG GAT CCT TCG CCA CGA GCA CGG-3'
7	5'-TGG GAT CCC CTT CGC CAC GAG CAC-3'
	3'-Primer
8	5'-TTT TTT TTT TTT GGG CCC TTA AGT-3'**

* amHI-Stelle unterstrichen
** SmaI-Stelle unterstrichen

Nur ein Primersatz (SEQ ID NO. 6 und 8) erzeugte Klone, die für aktives hemmendes Mammastatin codieren können. Bei Verwendung zur Transformation von High 5-Zellen erzeugten die aktiven Klone Mammastatin, das in den transformierten Zellen immunologisch reaktiv war (siehe 2).
Andere bekannte eukaryontische Expressionssysteme können in ähnlicher Weise zur Produktion des Mammastatin-Proteins verwendet werden.
Beispiel 8
Hemmungstest mit Proteinen, die durch in vitro-Transkription und Translation erzeugt wurden
Die in vitro-Transkription von pMammB, Mammastatin-cDNA wurde mit einem Express-RNA-Transkriptionskit von Stratagene durchgeführt, um Mammastatin-RNA zu erzeugen. Die erzeugte RNA wurde mit dem In Vitro Express-Translationskit von Stratagene in das Protein translatiert. Bei dem durch Translation der Mammastatin-RNA erzeugten Mammastatin-Protein wurde gezeigt, dass es das Brustzellenwachstum in Kultur hemmt.
Kulturen von MCF-7-Zellen wurden mit Protein-Produkten behandelt, die bei der vorstehend beschriebenen Translation erzeugt worden waren. Die Protein-Produkte (5 Volumen-%, Kulturmedium) wurden den Zellen in Platten mit 12 Vertiefungen zugesetzt, die 1 ml Medium pro Vertiefung enthielten. Parallele Kulturen wurden sowohl mit dem Translationsprodukt als auch mit dem Anti-Mammastatin-Antikörper 3C6 in einer Endkonzentration von 30 μg/ml behandelt.
Als negative Kontrolle wurden Kulturen mit Protein-Produkten behandelt, die mit dem in Abwesenheit von Mammastatin-cDNA inkubierten In Vitro Express-Translationskit von Stratagene translatiert worden waren (d.h., Einsatz von Vektor). Diese Lysate verfügen nicht über die richtigen Mechanismen zur Erzeugung des Mammastatin-Proteins.
Alle Kulturen wurden nach Behandlung mit den Protein-Produkten sechs Tage lang zur Vermehrung belassen, und die Zellenzahl einer jeden Probe wurde mit einem Coulter-Zähler berechnet. Von jedem Kulturzustand lagen Dreifachproben vor, so dass die Zellenzahl einer jeden Probe gemittelt und die prozentuale Hemmung bestimmt wurde durch Vergleich mit den Kontrollzellen, die mit Retikulozytenlysat behandelt worden waren.
Wie in 3 gezeigt, wurde das Wachstum von MCF-7-Zellen durch das Protein-Translationsprodukt von pMammB gehemmt. In Gegenwart des Anti-Mammastatin-Antikörpers 3C6 war diese Hemmung stark verringert oder blockiert.
Beispiel 9
Hemmung von Brustzellen mit Proteinen, die in konditionierten Medien vorhanden sind, die aus der Vermehrung von pMammB-transfizierten Cos-7-Zellen erhalten werden
Die Experimente zur Hemmung des Wachstums von Brustzellen wurden unter Verwendung konditionierter Medien durchgeführt, die aus Cos-7-Zellen erhalten wurden, die wie in Beispiel 6 beschrieben mit pMammB transfiziert worden waren. Mammastatin ist ein sezerniertes Protein und wird in konditionierten Medien von Zellen angetroffen, die das Protein exprimieren. Die durch die konditionierten Medien verursachte Wachstumshemmung wurde durch Zugabe von Anti-Mammastatin-Antikörper blockiert.
MCF-7-Zellen wurden zu 10⁴ Zellen/ml in MEM plattiert, das mit 10% nichtessentiellen Aminosäuren und FBS (SIGMA) ergänzt worden war. Die Zellen wurden über Nacht zum Anhaften belassen und anschließend ergänzt mit 10 Volumen-% konditionierter Medien (3-Tage-Kultur) aus: (1) Cos-7-Zellen, transfiziert mit dem leeren Vektor pcDNA (negative Kontrolle), (2) Cos-7-Zellen, transfiziert mit pMammB (pMammB-Cos), (3) NHMC-konditionierten Medien, oder (4) nichtkonditionierten Medien. Parallele MCF-7-Kulturen wurden mit 30 μg/ml 3C6-Blockierantikörper ergänzt. Die behandelten MCF-7-Zellen wurden sechs Tage lang zur Vermehrung belassen und anschließend mit einem Hämozytometer gezählt.
Die Hemmung des Zellwachstums wurde bestimmt durch Vergleichen des Wachstums von MCF-7-Zellen, die in konditionierten Medien inkubiert worden waren, mit dem Wachstum von MCF-7-Zellen, die in nichtkonditionierten Kontrollmedien inkubiert worden waren. Die Daten sind in 4 gezeigt und belegen, dass konditionierte Medien von pMammB-transformierten Zellen das Wachstum von Brustkrebszellen genauso wirksam hemmen wie konditionierte Medien normaler menschlicher Brustzellen. Diese Hemmung wurde in Gegenwart von Antikörpern gegen Mammastatin blockiert.
Beispiel 10
Die drei immunologisch reaktiven Anti-Mammastatin-Proteine

Ganze normale menschliche Brustzellen (NHMC) und Brustkarzinomzellen in Gewebekulturzellen wurden lysiert, und die Zelllysat-Proteine wurden mittels SDS-PAGE getrennt wie oben und bei Ervin, Paul, 1995, Dissertation, University of Michigan, Kapitel 2, beschrieben. Die lysierten Zellproben wurden mittels 10% SDS-PAGE in einem Mini-Protean II-Gerät (25 μg/Probe) getrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose übertragen und mit dem monoklonalen Anti-Mammastatin-Antikörper 7G6 oder IgM-Kontrollantikörper, alkalischer Phosphatase-konjugiertem zweiten Antikörper sondiert, Ziege-Anti-Maus-IgM wurde mit einem NBT/BCIP-Substratsystem verwendet, um positive Antikörperreaktionen kolorimetrisch nachzuweisen. Die Daten sind in 5 gezeigt.

Karzinomzellen
Bahn 1	ZR-75-1
Bahn 2	MDA MB 435
Bahn 3	4MCF-7
Bahn 4	T47D
Bahn 5	NHMC-14 Positiv-Kontrolle
Bahn 6	NHMC-14 Positiv-Kontrolle mit dem 38C 13-Antikörper
Normale Zellen
Bahn 7	NHMC-17
Bahn 8	NHMC-16
Bahn 9	NHMC-15
Bahn 10	NHMC-14
Bahn 11	NHMC-6
Bahn 12	NHMC-14 Positiv-Kontrolle

Wie in 5 gezeigt, exprimierten normale menschliche Brustzellen ein Dublett von Proteinen, die bei 49 und 53 kD wanderten und von dem monoklonalen Anti-Mammastatin-Antikörper hochgradig erkannt wurden, sowie ein drittes, schwach immunreaktives 44 kD-Protein. Die getesteten vier Tumorzelllinien exprimierten entweder nur ein immunreaktives 44 kD-Protein (Bahnen 1, 4) oder überhaupt kein immunreaktives Protein (Bahnen 2, 3).
Die obigen Daten sind repräsentativ für Experimente, die mit normalen Zellen aus 42 Patientinnen mit Brustverkleinerungsoperationen über einen Zeitraum von mehreren Jahren durchgeführt wurden. Die Intensität der Expression des 44 kD-Proteins in normalen Zellen und Krebszelllinien variierte bei jeder Präparation.
Beispiel 11
Mammastatin ist ein Phosphoprotein
Zelluläre phosphorylierte Proteine von Brustzellen wurden mit ³²P markiert durch Ergänzen von Kulturen normaler Brustzellen mit ³²P-Orthophosphat (200 μCi/ml) über 24 Stunden. Die konditionierten Medien wurden 5× mittels Amicon-Zentrifugation mit einer Molekulargewichtsbegrenzung von 30 kD eingeengt. Die konzentrierten Medien wurden auf Filtrationsmembranen einmal mit PBS gewaschen, um überschüssiges, nicht aufgenommenes Phosphat zu entfernen, und mittels S-200 SEPHACRYL-Molekularsiebchromatographie (Pharmacia, Uppsala, Schweden; Säule: 100 cm × 0,75 cm) fraktioniert. Die Immunoblots wurden präpariert wie vorstehend beschrieben und mit dem 7G6-Antikörper sondiert.
Durch Immunpräzipitation wurde ein radiomarkiertes 53 kD-Mammastatin-Protein in den konditionierten Medien identifiziert. Diese Analyse zeigte, dass Mammastatin ein sezerniertes Phosphoprotein ist. Da sezernierte Phosphoproteine ungewöhnlich sind, wurde eine Brefeldin A-Behandlung von Zellen herangezogen, um zu bestimmen, ob Mammastatin aufgrund von Sekretion oder durch Aufbrechen oder Auslaufen von Zellen in konditionierten Medien vorhanden ist. Brefeldin A ist eine Pilzverbindung, die die Sekretion von Proteinen aus eukaryontischen Zellen blockiert. Brefeldin A hemmt das normale endoplasmatische Retikulum und die Golgi-Funktion und blockiert die Vesikel-Bildung (Ervin, Paul, 1995, Dissertation, Seite 25). Da die meisten sezernierten Proteine von der Zelle durch einen Prozess der Exozytose aus membrangebundenen Vesikeln freigesetzt werden, wird durch das Blockieren der Vesikel-Bildung die Sekretion vieler Proteine blockiert. Werden NHMC in Gegenwart von Brefeldin A vermehrt, so wird kein phosphoryliertes Mammastatin in den konditionierten Medien identifiziert.
Zur Bestimmung der phosphorylierten Aminosäurereste in dem Mammastatin-Protein wurde mit dem radiomarkierten 53 kD-Protein eine Phosphoaminosäure-Analyse durchgeführt. NHMC-Zellen wurden mit ³²P-Orthophosphat 24 Stunden inkubiert. Die Zelllysate wurden anschließend mit dem Anti-Mammastatin-Antikörper 7G6 immunpräzipitiert und wie folgt gereinigt. Das 53 kD-Protein wurde mit Trypsin verdaut und mit Säure hydrolysiert. Zur Analyse der phosphorylierten Aminosäuren von Mammastatin wurde eine zweidimensionale Dünnschichtchromatographie angewandt. Die ³²P-Aminosäuren wurden mit Phospho-ser/thr/tyr-Kontrollen gemischt und am Ursprung (0) einer 2D-DC-Platte (20 cm) aufgetragen. Die Proben wurden in zwei Dimensionen aufgetrennt: 1. Dimension: Puffer mit pH 1,9 (50 ml Ameisensäure, 156 ml Eisessig/2000 ml (1794 H₂O), 20 Minuten und 1,5 kV; Drehung im Uhrzeigersinn; 2. Dimension: Puffer mit pH 3,5 (10 ml Pyridin, 100 ml Eisessig, 1890 ml H₂O), 16 Minuten und 1,3 kV.
Die DC-Platten wurde mit Ninhydrin angefärbt und auf einen Film einwirken lassen. Die Phosphoaminosäure-Analyse zeigte durch Vergleichen von Autoradiographien mit Ninhydrin-angefärbten Phosphoaminosäure-Standards, dass das 53 kD-Mammastatin-Protein drei Arten phosphorylierter Aminosäurereste enthält.
Threonin (Th) war die häufigste phosphorylierte Aminosäure, gefolgt von Serin (S) und Tyrosin (Ty), der am wenigsten häufigen phosphorylierten Spezies. Es kann jedoch sein, dass die relative Häufigkeit der Phosphoaminosäurereste nicht repräsentativ für die im nativen Protein ist, da durch die saure Hydrolyse Phosphat aus den Phosphotyrosyl-Resten freigesetzt werden kann.
Beispiel 12
Ein einziges Mammastatin-Protein mit unterschiedlicher Phosphorylierung
Die zelluläre Phosphorylierung von Proteinen kann durch Phosphatasen und Kinasen moduliert sein. Aufgrund der unterschiedlichen Aktivitäten von Mammastatin-Phosphatasen wird Mammastatin in Lysaten von normalen und Tumorzellen unterschiedlich phosphoryliert. Die Wirkung von Phosphatase auf Mammastatin in NHMC-Lysaten wurde untersucht.
NHMC wurden in Medien mit wenig Calcium bis zur Konfluenz vermehrt und durch Abkratzen in TBS gewonnen. Die Zellen wurden mit TBS gewaschen und in Acetat-Puffer, pH 6,6, mit 0,5% Triton X-100 auf 2 mg/ml resuspendiert. Es wurden 5 μg/ml Yersiniaphosphatase (YOP) (Stuckey et al., Nature 370, 571-5 (1994)) oder einer Yersiniaphosphatase-Mutante (MYOP), die eine Mutation an einer aktiven Stelle enthält, dazu verwendet, die Zelllysate sechs Stunden bei 37°C zu verdauen (YOP und MYOP wurden überlassen von Dr. S. Jack Dixon, University of Michigan, Biochemistry Department). Wie in 6 gezeigt, führte der Verdau von Lysaten normaler menschlicher Brustzellen mit Yersiniaphosphatase (YOP) zu einer verringerten Menge des 53 kD-Mammastatin-Proteins, das mittels Anti-Mammastatin-Immunoblot identifiziert wurde (Bahn A). Dagegen wurde bei Verdau mit der Yersiniaphosphatase-Mutante (MYOP, Bahn B) die Identifikation des 53 kD-Mammastatin-Proteins nicht verändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Identifizierung des 53 kD-Mammastatin-Proteins mittels Immunoblot ein zweckmäßiges Maß für den Status der Phosphorylierung des Mammastatin-Proteins ist.
Es wurde ein konditioniertes Medium, inkubiert in Gegenwart von Yersiniaphosphatase (YOP) wie vorstehend beschrieben, zur Behandlung von MCF-7-Zellen verwendet. Wie schon früher beobachtet, hemmt konditioniertes Medium von NHMC das Wachstum von MCF-7-Zellen, und diese Hemmung wird durch Anti-Mammastatin-Antikörper blockiert. Wie in 7 gezeigt, wird diese hemmende Wirkung durch Behandlung von konditioniertem NHMC-Medium mit YOP aufgehoben. Als Kontrolle wurde die Behandlung von konditionierten NHMC-Medien mit einer YOP-Mutante (MYOP) getestet, der die Phosphatase-Aktivität fehlt. Diese Mutante hatte keine Auswirkung auf die hemmende Wirkung von konditionierten NHMC-Medien. Durch Immunpräzipitation der konditionierten Medien mit dem Anti-Mammastatin-Antikörper 7G6 wurde die hemmende Wirkung beseitigt.
Eine TCA-Präzipitation zeigte, dass durch das Inkubieren von konditionierten Medien mit YOP etwa 50% des enthaltenen Phosphats entfernt wurden. Wie oben gezeigt, wurde durch YOP auch die 53 kD-Spezies aus den NHMC-Lysaten entfernt (6).
Beispiel 13
Phosphoryliertes Mammastatin wird von normalen, aber nicht von kanzerösen Brustzellen produziert
Normale und transformierte Brustzellen wurden mit ³²P-Orthophosphat markiert. Die Karzinomzelllinien wurden in den Medien vermehrt, die von der ATCC vorgeschlagen werden, mit Ausnahme der MCF-7-Zellen, die in MEM (Celox), ergänzt mit 10% FBS, nichtessentiellen Aminosäuren und Insulin (10 mg/l), vermehrt wurden. Das Markieren der zellulären Proteine mit ³²P-Orthophosphat wurde durchgeführt in Phosphat-freiem DMEM (ICN), das 2% dialysiertes FBS enthielt. Die Zellen wurden 24 Stunden bei 37°C mit 200 μCi/ml ³²P-Phosphat inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die konditionierten Medien aus den Zellkulturen gewonnen und 5 x eingeengt. Die konditionierten Medien wurden mit TBS gewaschen und auf Amicon-Filtern mit einem Molekulargewicht-Cutoff von 10 kD konzentriert. Die Zellschicht wurde von den Zelllysaten und konditionierten Medien in den Lysepuffer weggekratzt (mit einem Teflon-Zellspatel), 1,5 ml/Kolben (0,5% Triton X-100, 2,01% SDS mit Desoxycholat).
Die Mammastatin-Proteine wurden immunpräzipitiert durch Zugabe von 5 μg des Anti-Mammastatin-Antikörpers 7G6 pro 500 μl der 5x konzentrierten Medien oder Zelllysate und 1,5 Stunden Inkubieren bei Raumtemperatur. Ziege-Anti-Maus-IgM als zweiter Antikörper (5 μg/0,5 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde eine weitere Stunde inkubiert. Protein G PLUS/A Agarose^®-Aufschlämmung (Oncogene Science) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um die Antikörperkomplexe zu immobilisieren.
Die Komplexe wurden 6x mit Lysepuffer gewaschen, und nach jeder Wäsche erfolgte eine Zentrifugation mit 3000 × g. Es wurde ein SDS-PAGE-Beschickungspuffer (50 μl) zugesetzt, ehe die Probe 3 Minuten lang auf 100°C erhitzt wurde. Die Überstände wurden durch SDS-PAGE gelöst, auf Nitrocellulose übertragen und auf einen Kodak X-AR-Film einwirken lassen.
Durch Phosphat-Markierung der NHMC-Proteine und nachfolgende Immunpräzipitation wurden die Phosphoproteine mit 49 und 53 kD in NHMC identifiziert. Die Phosphoproteine mit 49 und 53 kD waren bei den Karzinomzelllinien nicht festzustellen. Die Karzinomzelllinien MCF-7, T47D, ZR-75-1 und MDA-MB-435 exprimierten ein immunreaktives Protein mit 44 kD, doch dieses Protein konnte mit ³²P-Orthophosphat nicht markiert werden.
Diese Studie zeigt mehr eingebautes Phosphat mit zunehmendem Molekulargewicht des Mammastatins. Das Fehlen der Phosphorylierung von Mammastatin in transformierten Zelllinien korreliert mit den nicht vorhandenen Protein-Formen mit höherem Molekulargewicht und der fehlenden hemmenden Wirkung von Mammastatin.
Beispiel 14
Mammastatinkinase und -phosphatase
Normale oder Karzinomzellen wurden in Kolben bis auf 75% Konfluenz vermehrt. Die Zellkulturen wurden dreimal mit TBS gewaschen und anschließend mit einem Teflon-Spatel in TBS weggekratzt. Die Zellsuspensionen wurden durch Zentrifugation mit 1000 g pelletisiert und anschließend in einem kleinen Volumen TBS resuspendiert. Ein Aliquot eines jeden Zelltyps wurde zur Proteinquantifizierung entnommen. Die Protein-Konzentrationen wurden anschließend auf 2 mg/ml in Lysepuffer ausgeglichen (TBS mit 0,5% Triton X-100 und jeweils 5 μg/ml Aprotinin, Leupeptin und PMSF). Gleiche Massen von normalen und Tumorzellproteinen wurden gemischt und drei Stunden bei 37°C inkubiert. Parallele Mischungen von Normal- und Karzinomzelllysaten erfolgten in Gegenwart von 10 nM Orthovanadat (NaVO₄), einem Phosphatasehemmer. Die Mischung wurde dann mittels SDS/PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot unter Verwendung des 7G6-Antikörpers analysiert. Die Daten sind in 8 gezeigt.

Bahn A ZR-75-1-Lysat (30 μg)

Bahn B NHMC-Lysat (30 μg)

Bahn C NHMC (30 μg) + ZR 75 (30 μg) + 10 nM NaVO₄

Bahn D NHMC (30 μg) + ZR 75 (30 μg)
Wie in 8 gezeigt, produzierten Krebszellen (ZR-75-1; Bahn A) im Vergleich zu NHMC (Bahn B) kein Mammastatin mit 53/49 kD. Durch Mischen der Normal- und Krebszellenproteine in Gegenwart von Proteinasen verringert sich die Menge an aktivem 53 kD-Inhibitor (Bahn D). In Gegenwart des Tyrosinphosphatasehemmers NaVO₄ ist jedoch die 53 kD-Spezies in der Mischung nach wie vor vorhanden (Bahn C). Diese Ergebnisse zeigen, dass Karzinomzellen eine Phosphatase-Aktivität exprimieren, die die phosphorylierten Formen von Mammastatin eliminieren kann.
Die Expression von Mammastatin in normalen und transformierten Zelllinien kann durch Western-Blot-Analyse quantitativ gemessen werden. Mit monoklonalen Anti-Mammastatin-Antikörpern wurde gezeigt, dass es einen durchgängigen Unterschied in der Expression dieses Proteins zwischen Brustkarzinomzellen und den von normalem mammären Epithel stammenden Zellen gibt. Mammastatin wurde in normalem humanen weiblichen Brustgewebe durch Western-Blot-Analyse mit dem monoklonalen Anti-Mammastatin-Antikörper 7G6 als Spezies mit 44, 49 und 53 kD erkannt. Bei Brustkarzinomzellen gab es eine nicht durchgängige Erkennung einer 44 kD-Spezies, jedoch niemals der immunreaktiven Formen mit 49 oder 53 kD. Werden die Formen mit 49 und 53 kD in normalen Zellen identifiziert, so sind sie phosphoryliert. Die 44 kD-Spezies ist nicht phosphoryliert. Durch Beobachten der Expression der Mammastatin-Spezies mit 44, 49 und 53 kD ist es daher möglich, Immunoblot-Analysen zur Bestimmung heranzuziehen, ob Mammastatin phosphoryliert ist.
Beispiel 15
Identifikation von Mammastatin in Humaneren
Es wurde ein enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) erstellt, um Mammastatin nachzuweisen, wobei die gereinigten monoklonalen Anti-Mammastatin-Antikörper 6B8 und 3C6 verwendet wurden.
Der Antikörper 6B8 wurde dazu verwendet, Immulon 1-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Immulon Corp.) mit einer Konzentration von 10 μl/ml oder 100 μ/Vertiefung drei (3) Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C zu bedecken. Die Platten wurden 30 Minuten mit 2% BSA (Sigma) in TBS (150 mM NaCl, 100 mM Tris, pH 7,4) blockiert und anschließend entweder mit gereinigtem Mammastatin oder mit Probenseren, 50% verdünnt in 2% BSA-Lösung, 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden 5 Minuten lang gewaschen, dreimal mit 300 μ/Vertiefung TBS plus 0,1% Triton X-100, ehe der zweite Antikörper zugesetzt wurde.
Bei dem zweiten Antikörper handelte es sich um biotinylierten 3C6. Der Antikörper wurde biotinyliert durch zwei Stunden Inkubieren mit Biotin, N-Hydroxysuccinimidester (Sigma) in 0,1 M NaHCO₃ bei Raumtemperatur und 16 Stunden bei 4°C. Vor Gebrauch oder Lagerung wurde der Antikörper in 1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,02% Azid (NaN₃, Sigma) dialysiert.
Der biotinylierte Anti-Mammastatin-Antikörper wurde mit 1 μg/ml und 100 μl/Vertiefung in eine 2% BSA/TBS-Lösung gegeben und 1,5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden 5-mal je 5 Minuten mit TBS plus 0,1% Triton X-100 wie vorstehend beschrieben gewaschen. Der zweite Antikörper wurde mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Streptavidin (Southern Biotechnology) identifiziert und eine Stunde in einer Verdünnung von 1/1000 in 2% BSA/TBS mit 100 μl/Vertiefung für alle Proben inkubiert.
Die ELISAs wurden mit PNPP (p-Nitrophenylphosphat, Sigma), 1 mg/ml in alkalischem Phosphatase-Puffer (10 mM Diethanolamin, pH 9,5 (Sigma), 0,50 mM MgCl₂, (Sigma)) kolorimetrisch entwickelt. Die Mikrotiterplatten wurden auf einem ELISA-Lesegerät bei 405 nm in Intervallen von fünfzehn und dreißig Minuten abgelesen.
Mit dem aus Zelllysaten oder konditionierten Medien isolierten, chromatographisch gereinigten Mammastatin wurde eine Standardkurve für den ELISA erstellt, die zeigt, dass die Empfindlichkeit des Assays für Mammastatin im unteren Nanogrammbereich liegt (siehe 9). Die Quantifizierung der Mammastatin-Spiegel in normalen Humanseren von Freiwilligen wurde an Serumproben durchgeführt, die einen Monat lang in Intervallen von zwei Tagen von einer Freiwilligen genommen wurden. Die Mammastatin-Spiegel in normalen weiblichen Humanseren konnten mit diesem Assay erfasst werden und variierten zwischen etwa 10 und 50 ng/ml (10).
Die Mammastatin-Spiegel wurden auch in Seren gemessen, die von Brustkrebs-Patientinnen genommen worden waren. Patientinnen, bei denen am University of Michigan Breast Care Center knotennegativer Brustkrebs diagnostiziert worden war, wurden über den gesamten Verlauf ihrer Behandlung auf Mammastatin-Expression in den Seren getestet. Die Daten sind in 11 gezeigt und nachstehend zusammengefasst. Serumproben wurden von Brustkrebs-Patientinnen während des gesamten Verlaufs ihrer Behandlung im hormonellen Zyklus gemäß einer kombinierten Modalitätsvorschrift mit Cytoxin, Adriamycin, Methotrexat und 5FU genommen. Das Serum wurde nach der Gerinnung durch Zentrifugation vom Vollblut abgetrennt und bis zum Einsatz bei -20°C gelagert. ELISAs wurden mit 150 μl Serum zu 50% in 0,5% NFDM doppelt durchgeführt, wobei die Anti-Mammastatin-Antikörper 6B8 und 3C6 in einem enzymgekoppelten "Sandwich"-Assay eingesetzt wurden. Die Standardkurve wurde mit chromatographisch gereinigtem Mammastatin erstellt und war vergleichbar mit der in 9 gezeigten.
Die Expression von Mammastatin war unter den Patientinnen unterschiedlich und schwankte während des Verlaufs ihrer Behandlung. Es war stets zu beobachte, dass die Mammastatin-Spiegel mit dem Fortschreiten hin zu einer metastatischen Erkrankung nicht mehr nachweisbar waren.
Patientinnen mit diagnostiziertem Brustkrebs hatten im Vergleich zu den Spiegeln im Serum normaler Patientinnen zum Zeitpunkt der Diagnose niedrige Mammastatin-Serumspiegel. Die Mammastatin-Spiegel stiegen im Allgemeinen beim chemotherapeutischen Hilfsprotokoll im hormonellen Zyklus. Bei diesem Protokoll gab es Schwankungen bei den Mammastatin-Spiegeln. Die Mammastatin-Spiegel waren nicht nachweisbar bei Patientinnen mit fortgeschrittener Erkrankung vor dem Tode. Die Patientinnendaten wurden in vier Gruppen eingeteilt, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

I. Gruppe von Patientinnen, deren Serum-Mammastatinspiegel während der Therapie kontinuierlich anstiegen.
II. Gruppe von Patientinnen, deren Serum-Mammastatinspiegel während der Therapie zunächst anstiegen, dann aber nicht mehr nachweisbar waren.
III. Gruppe von Patientinnen, deren Serum-Mammastatinspiegel während der Therapie anstiegen, dann aber stark schwankten.
IV. Gruppe von Patientinnen, die niedrige Serum-Mammastatinspiegel hatten, die bei der Therapie dann nicht mehr nachweisbar waren.

Gruppe	Anzahl	Folgetage	Ergebnis
1.	4 p	280+/-100	Remission
II.	14 p	500+/-220	Verstorben
III.	10 p	380+/-280	Variabel
IV.	5 p	290+/-150	Verstorben

Beispiel 16
Wirksamkeit von Mammastatin in vivo
Homozygoten weiblichen, sechs Wochen alten CD-1 Nu/Nu-Mäusen (Charles River) wurde ergänzend Estrogen mittels Pellets mit langsamer Freisetzung mit 0,72 mg/Pellet gegeben, wobei 60 Tage lang 17-β-Estradiol freigesetzt wurde (Innovative Research #SE-121). Den mit Estrogen ergänzten Mäusen wurden 3 × 10⁶ MCF-7-Zellen, 100 μl pro Injektion, in 60% Matrigel injiziert. Zwei Injektionen wurden verabreicht, jeweils eine pro Flanke. Nach sieben Tagen Tumorzellenwachstum wurde Mammastatin verabreicht. Die Testmäuse erhielten 1, 2 oder 5 μg Mammastatin in Produktionsmedium in Abständen von 2 Tagen über einen Zeitraum von sechs Wochen. Den Kontrollmäusen wurde BSA injiziert oder sie erhielten keine Tumorinjektion, sondern den Inhibitor alleine.
Die Tumorgröße wurde am Punkt des größten Durchmessers in wöchentlichen Intervallen gemessen und auf die Behandlungsgruppe gemittelt. Die Ergebnisse sind in den 13A-13C gezeigt, wo die Tumorgröße als mittlerer Durchmesser ± Standardabweichung aufgetragen ist.
Diese Tierstudie wurde mit MDA-231-Tumorzellen wiederholt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2·10⁶ Zellen pro Injektion wie für die MCF-7-Zellen beschrieben injiziert.
Die Ergebnisse sind in den 14A-14C gezeigt.
Die gezeigten Ergebnisse waren nicht so gut wie erwartet. Die Tiere erhielten die Injektion über die Schwanzvene, was zu einer geringeren als der erforderlichen Blutdosis führt. Spätere Studien unter Anwendung intraperitonealer Injektion ergaben eine wirksamere Behandlung. Bei Dosen von 5 μg/Maus und höher wurde das Tumorwachstum zum Stillstand gebracht.
Beispiel 17
Retrovirus-Expression von Mammastatin
Die Mammastatin-cDNA (Insert mit 2,4 Kilobasen (kb)) wurde in einen retroviralen Expressionsvektor subkloniert. Der Vektor wurde zur Transfektion von 3T3-Fibroblastzellen verwendet. Die transfizierten Zellen wurden geerntet, lysiert und die Zelllysate mittels Western-Blot analysiert.
Wie in 12 gezeigt, exprimierten die mit dem Mammastatin tragenden Retrovirus transfizierten 3T3-Zellen phosphoryliertes Mammastatin.
Beispiel 18
Expression von Mammastatin in Baculovirus und Cos-7-Zellen

Nierenzellen von Affen, Cos-7-Zellen, wurden mit Mammastatin codierenden Nucleinsäuresequenzen transfiziert. Die getesteten Gruppen (n = 3) umfassen die folgenden:

Gruppe	Nucleinsäuresequenz
A	Kontrolle, Lysat normaler menschlicher Brustzellen 25 μg
B	Kontrolle, Cos-pcDNA3-Zelllysat – 25 μg
C	Cos-pMammB-Zelllysat – 10 μg
D	Cos-pMammB-Zelllysat – 10 μg

Wie in 16 gezeigt, wurde mit der Herbeiführung der Expression rekombinanten Mammastatins in Cos-7-Zellen belegt, dass das Mammastatin-Gen von pMammA und pMammB für authentisches Mammastatin codiert. Weiterhin wird durch die Beobachtung, dass Cos-7-Zellen die verschiedenen, mit der Phosphorylierung des Proteins in Zusammenhang stehenden Formen von Mammastatin exprimieren, nahegelegt, dass Mammastatin phosphoryliert und aktiv sein wird, wenn es in anderen eukaryontischen Zelllinien als menschlichen Brustzellen produziert wird. Es wurden stabile Transfektanten selektiert, um eine andauernde Synthese von rekombinantem Mammastatin zu ermöglichen.
Beispiel 19
Produktion von Mammastatin durch normale humane Brustepithelzellen in Kultur
Gesundes Brustgewebe wurde von Brustverkleinerungsoperationen steril und direkt aus dem Operationssaal erhalten. Das Gewebe wurde unter sterilen Bedingungen in einem Abzug mit laminarer Strömung in einer Lösung zerkleinert, die 4 Einheiten pro Gramm Collagenase Typ III enthielt (Life Sciences, Bethesda, MD).
Das zerkleinerte Gewebe wurde über Nacht in einem Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert, um den Collagenase-Verdau zu ermöglichen.
Das mit Collagenase verdaute Brustgewebe, eine viskose Flüssigkeit, die viele verschiedene Zellarten und aus den Fettzellen freigesetztes Lipid enthält, wurde zentrifugiert, um Lipid, wässrige Lösung und andere Zelltypen zu trennen. Das Collagenase-verdaute Material wurde mit 1000 U/min in einer Tischzentrifuge 5 Minuten bei Raumtemperatur geschleudert. Die Fettzellen und freies Lipid nahmen die obere Hälfte des Zentrifugenrohrs ein und wurden durch Absaugen abgezogen und verworfen. Der wässrige Überstand über dem Zellpellet wurde ebenfalls durch Absaugen abgezogen und verworfen. Das verbleibende Zellpellet wurde mit sterilen Lösungen von Säuger-Wachstumsmedien, DMEM, pH 7,4, gewaschen. Das Waschen wurde fortgesetzt, bis der Überstand aus den Wäschen nicht mehr trübe war (zum Beispiel etwa 4 Wäschen). Die gewaschenen Zellen wurden in Wachstumsmedium resuspendiert und 30 Minuten lang bei 40°C durch die Schwerkraft absetzen lassen. Da rote Blutzellen kernlos und weniger dicht sind als die Epithelzellen mit Kern, werden durch diese Prozedur die roten Blutzellen von den sedimentierten Epithelzellen entfernt, indem der die roten Blutzellen enthaltende Überstand abgezogen wird. Dieser Sedimentierungsvorgang wurde wiederholt, bis keine rote Farbe mehr im Zellpellet zurückblieb, z.B. etwa 2-mal. Das verbleibende Zellpellet wurde in einem nährstoffreichen DMEM/F12-Wachstumsmedium resuspendiert, das 5% Pferdeserum, 10 μg/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 100 ng/ml Choleratoxin, 500 ng/ml Hydrocortison, 10 μg/ml Insulin, 100 Einheiten/ml Penicillin und Streptomycin und eine 1 mM-Konzentration Calciumchlorid enthielt. Physiologische Konzentrationen an Calcium sind hilfreich, um das Anhaften und den Auswuchs der Zellen in der Zellkultur zu fördern. Die Zellsuspensionen wurden in sterilen Gewebekulturkolben bei 37°C mit einer 5% CO₂-Konzentration inkubiert.
Die Anfangskulturen von normalem Brustgewebe enthalten eine gemischte Zellpopulation. Die Adipozyten, Neuronen und vaskuläres Gewebe werden durch das vorstehend beschriebene differenzielle Zentrifugationsverfahren erheblich verringert. Bindegewebszellen sind in erheblichen Mengen vorhanden. Zur Entfernung nichtepithelialer Zellen wurde ein differenzielles Anhaftverfahren angewandt. Fibroblasten, Neuronen und andere Zellarten im Brustgewebe haften alle schneller am Gewebekultur-Kunststoffmaterial als Epithelzellen. Zudem werden all diese Zellarten durch Trypsin schneller als Epithelzellen vom Gewebekultur-Kunststoffmaterial entfernt. Zur Anreicherung der Kulturen mit Brustepithelzellen werden die Kulturen mit beginnender Bildung einer Monoschicht (5-7 Tage nach dem ersten Plattieren) mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (molares Verhältnis 250:1) behandelt. Die Mehrheit der Zellen wurde innerhalb 5-minütigen Inkubierens bei 37°C entfernt. Die verbleibenden anhaftenden Zellen waren zu mehr als 90% epitheliale Brustzellen. Diese Zellen wurden behalten und in das vorstehend beschriebene Wachstumsmedium mit 40 μM Calciumchlorid zurückgegeben. Die Fibroblastzellen wurden von den trypsinierten Kulturkolben entfernt, durch Zentrifugation gewonnen, in Wachstumsmedium resuspendiert und 30 Minuten bei 37°C auf Gewebekultur-Kunststoffmaterial plattiert. Die anhaftenden Zellen waren überwiegend Fibroblasten. Die nicht anhaftenden Zellen waren erheblich an Fibroblastzellen angereichert (50-80%). Die suspendierten Zellen wurden entfernt und in frischen Gewebekulturkolben absetzen lassen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, so dass Zellpopulationen erhalten wurden, die überwiegend epithelial waren. Da Choleratoxin das Wachstum von Epithelzellen fördert und das Fibroblasten-Wachstum hemmt, und da Fibroblasten bei verringertem Calcium nicht gut wachsen, waren die Kulturen in dem vorstehend beschriebenen Medium mit wenig Calcium innerhalb einer Woche zu etwa 100% epithelial. Diese Kulturen normaler menschlicher Brustzellen (NHMC) produzierten Mammastatin in das Kulturmedium.
Das zur Vermehrung der NHMC verwendete Nährstoffmedium enthält 5% Pferdeserum, was für die Injektion am Menschen nicht annehmbar ist. Das Mammastatin-Protein muss entweder von Pferdeserum-Proteinen gereinigt werden, oder die Zellen müssen in Medium ohne Serum gezogen werden. Normale Zellen können in Abwesenheit von Serum nur etwa sieben bis zehn Tage lang aufrechterhalten werden. Zur Produktion einer nennenswerten Menge serumfreien Mammastatins über einen längeren Zeitraum wurden die Zellen abwechselnd in serumfreiem und serumhaltigem Medium vermehrt.
Die NHMC wurden in Wachstumsmedium wie vorstehend beschrieben bis zur vollständigen Konfluenz vermehrt. Wenn die Zellen die verfügbare Oberfläche des Kolbens bedeckten, begannen die Zellen mit ihrer Vermehrung in Lösung zu knospen. Die knospenden Zellen wurden abgenommen und in neue Kolben überführt. Konfluente Kolben wurden dreimal mit steriler Salzlösung gespült, wobei zwischen den Wäschen fünf Minuten in Salzlösung inkubiert wurde, um Serumprotein zu entfernen. Die Zellen wurden dann mit einem serumfreien "Produktionsmedium" versehen, und dies war im Wesentlichen das Wachstumsmedium ohne Serum, Choleratoxin und Hydrocortison. Die Zellen wurden etwa 4 Tage lang (96 Stunden) auf dem Produktionsmedium gehalten, wobei das Medium abgenommen und die Zellen wenigstens vier Tage lang in das Wachstumsmedium zurück verbracht wurden. Eine typische Ansatzgröße für das in dieser Weise erzeugte Mammastatin war 1-2 Liter.
Mammastatin wurde auch in einem Bioreaktor erzeugt, nämlich dem Bioflow 3000, New Brunswick Scientific. In diesem Perfusionsreaktor wurden die Zellen an mit Gewebekultur behandelten Fibracell-Scheiben angelagert. Die Scheiben mit den anhaftenden Zellen wurden in einem Korb im Reaktionsgefäß gehalten und von Medium durchströmt. Bringt man die NHMC in den Reaktor ein, so besiedeln sie die Fibracell-Scheiben und werden durch die Perfusion des Mediums ernährt. Die konditionierten Medien wurden aus dem Reaktor geerntet und gekühlt.
Beispiel 20
Dotblot-Serumtest auf Mammastatin
Das Serum von einer 25 Jahre alten, gesunden Frau wurde erhalten und verglichen mit dem Serum einer Brustkrebspatientin (Stadium IV), eines nicht diagnosti zierten Geschwisters der Patientin und der Mutter der Patientin, deren Familie eine Krankengeschichte im Hinblick auf Brustkrebs aufweist. Die Serumproben wurden in einem Immunassay auf das Vorhandensein von Mammastatin hin verglichen. Blutproben von mehreren Brustkrebs-Patientinnen, die am Tag der Diagnose genommen worden waren, wurden ebenfalls im Immunassay analysiert. Als Standardkontrolle wurde konditioniertes Medium von normalen menschlichen Brustzellen (NHMC) verwendet. Standard-NHMC-Mammastatin enthielt etwa 50 ng/ml, wie bestimmt in einem Dotblot-Assay mit chromatographisch gereinigtem Mammastatin-Proteinstandard.
Die einzelnen Blutproben wurden in Vacutainer-Röhrchen aufgefangen, und das Serum wurde vom Vollblut abgetrennt. Die Serumproben (250 oder 500 μl Volumen) wurden ohne Verdünnung durch Absaugen unter Verwendung eines S&S Dot-Blot-Verteilers mit 96 Vertiefungen auf Nitrocellulose aufgebracht. Das konditionierte Medium wurde wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt. Die Proben auf den Nitrocellulose-Filtern wurden mit Triton X-100 in TBS gewaschen, mit fettfreier Trockenmilch (5% in TBS) blockiert und mit 1 μg/ml des ersten Anti-Mammastatin-Antikörpers (7G6-Maus-IgM) in 5% fettfreier Trockenmilch 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einstündigem Inkubieren mit 1 μg/ml des zweiten Antikörpers (Ziege-Anti-Maus-IgM, konjugiert an alkalische Phosphatase) in 5% fettfreier Trockenmilch bei Raumtemperatur. Die Farbreaktion der alkalischen Phosphatase wurde mit Nitroblau-tetrazolium und BCIP entwickelt.
Wie in 13 gezeigt, wurde die Mammastatin-Menge in der Probe gegen die Standardkurve quantifiziert, die mit dem konditionierten Medium der normalen Brustzellen erhalten wurde. Das von den gesunden Frauen erhaltene Serum enthielt problemlos nachweisbare Mengen an Mammastatin, wie sich anhand der dunkel gefärbten Flecke zeigt, wogegen das Serum von diagnostizierten Brustkrebs-Patientinnen und nicht diagnostizierten Familienmitgliedern wenig oder kein Mammastatin aufwies.
Weitere Proben wurden von Brustkrebs-Patientinnen am Tag der Diagnose, von gesunden Mitgliedern der Familie einer Brustkrebspatientin und von gesunden Frauen und Männern erhalten. Zur Analyse von Mammastatin wurde das Serum wie vorstehend beschrieben aufgearbeitet. Die Dot-Blots wurden als "negativ oder gering" oder "positiv oder hoch" bewertet, um die Intensität der entwickelten Farbreaktion anzugeben. Die Daten sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Probe Anzahl Negativ oder gering Positiv oder hoch

Brustkrebspatientin 89 83 (93%) 6 (7%)

Gesunde Frau 11 2 (18%) 9 (82%)

Gesundes Mitglied einer Hochrisikofamilie 4 4 (100%) 0

Mann 3 2 1
Beispiel 21
Behandlung von menschlichen Brustkrebs-Patientinnen

Neunundzwanzig (29) Brustkrebs-Patientinnen im Stadium IV mit wiederkehrendem Brustkrebs, die mit chemotherapeutischen Regimes scheiterten oder gescheitert waren, wurde der Zugang zu Mammastatin-Protein eröffnet. Das Protein wurde wie oben in Beispiel 19 beschrieben hergestellt und in Produktionsmedium bereitgestellt, mit der erforderlichen Dosis in einem Injektionsvolumen von 3 ml. Die Patientinnen verabreichten sich das Protein intravenös gemäß ihrem vorgeschriebenen Regime. Im Allgemeinen wurde eine tägliche Dosis injiziert. Die gewählte Dosis war eine solche, die physiologische Mengen Mammastatin im Blutkreislauf der Patientin ergab, z.B. 5-50 ng/ml bei gesunden Frauen. Die Dosierung und Häufigkeit bei der jeweiligen Patientin sind in nachstehender Tabelle gezeigt.

Patientin Nummer	Dosis (μg)	Zeitplan	Ergebnis
1.	125	täglich	vollständige Remission, danach Rückfall*
	125	täglich	vollständige Remission; Schmerzen bei Therapiepause
3.	75	täglich	spricht nicht an*
4.	75	täglich	partielle Remission; mögliche Immunreaktion*
5.	75	täglich	spricht nicht an*
6.	125	täglich	partielle Remission
7.	125	täglich	partielle Remission*
8.	75	täglich	spricht nicht an*
9.	125	jeden dritten Tag	vollständige Remission
10.	125	täglich	spricht nicht an
11.	125	täglich	partielle Remission
12.	125	täglich	spricht nicht an#
13.	150	täglich	spricht nicht an*
14.	75	täglich	spricht nicht an#
15.	125	täglich	partielle Remission
16.	125	täglich	partielle Remission
17.	75	täglich	spricht nicht an, Infektion**
18.	125	täglich	partielle Remission
19.	125	täglich	partielle Remission
20.	125	täglich	partielle Remission
21.	125	jeden zweiten Tag	spricht nicht an**; alternative Therapie
22.	125	jeden zweiten Tag	partielle Remission
23.	125	jeden zweiten Tag	spricht nicht an
24.	125	täglich	spricht nicht an
25.	125	täglich	spricht nicht an
26.	125	täglich	partielle Remission
27.	125	täglich	partielle Remission
28.	125	jeden zweiten Tag	partielle Remission
29.	125	täglich

Gesamt	Ansprechende	% Ansprechende	% ohne Leberbeteiligung	% ohne Lungen- oder Leberbeteiligung
29	17	59	81	89

* Patientin verstorben
** Patientin aus der Therapie genommen
# Hinweise auf Gelbsucht-Verbesserung vor dem Tode

Aus der Gruppe der 29 Patientinnen haben sechs, die eine Lebererkrankung im Spätstadium hatten, nicht überlebt. Diese sechs Patientinnen zeigten klinische Hinweise auf Leberversagen vor der Gabe von Mammastatin, und die Behandlungen halfen ihnen nicht. Eine Patientin zeigte Anzeichen nachlassender Gelbsucht, ehe ihre Leber versagte, doch starben alle sechs dieser Patientinnen offenbar an Stickstoff-Toxizität, die bei Patienten mit fortgeschrittenem Leberkrebs häufig auftritt.
Von den übrigen Patientinnen sind zwei an ihrer Krankheit gestorben. Eine schien nach zwei Monaten der Mammastatin-Therapie von der Krankheit befreit zu sein. Diese Patientin wurde aus der Therapie genommen und war innerhalb von zwei Monaten rückfällig. Die Krankheit der Patientin wurde niemals wieder unter Kontrolle gebracht, und sie starb aufgrund einer Leberbeteiligung. Die zweite Patientin starb nach 4 Monaten Behandlung und zeigte keinerlei Anzeichen eines Ansprechens auf die Therapie. Es gab keine Anzeichen einer Toxizität bei all diesen Patientinnen, obwohl die Mammastatin-Dosis bei den letzteren beiden Patientinnen zehnfach erhöht wurde.
Von den 19 Patientinnen, die gegenwärtig die Mammastatin-Therapie erhalten, zeigt die Mehrheit Anzeichen eines positiven Nutzens und keine Anzeichen ungünstiger Reaktionen. Es ist unklar, ob drei dieser Patientinnen in irgendeiner Weise von Mammastatin profitieren können. Die übrigen 16 Patientinnen zeigen klare klinische Anzeichen eines Nutzens, darunter eine Abnahme der Tumormarker (CA15-3 und CA27-29) auf normale Werte, Abnahme der Größe der fühlbaren Tumormassen, Nachlassen der Erkrankung, belegt in der MRI-Abtastung, und weniger Schmerzen. Mehrere dieser Patientinnen zeigen Verbesserungen in einem Umfang, dass sie krankheitsfrei betrachtet werden können. Wird jedoch diesen Patientinnen das Protein über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen vorenthalten, so ist stets zu beobachten, dass dies zu einem erneuten Aufflammen der Krankheitsaktivität führt, wie anhand der stärkeren Schmerzen festzustellen ist, und dies selbst bei Patientinnen, die keinerlei Anzeichen der Krankheit zeigen. Bei Wiederaufnahme der Protein-Behandlungen werden die Symptome stärkerer Schmerzen innerhalb von 2-4 Stunden verringert oder beseitigt.
Auch wurde beobachtet, dass die Mammastatin-Spiegel im Blut nach langer Behandlung abnehmen, was auf ein System mit negativer Rückkopplung schließen lässt. Dieser Abfall der konstanten Blutspiegel wird erfolgreich vermieden, wenn Mammastatin über einen Zeitraum von etwa 28 Tagen täglich gegeben wird, gefolgt von 2-3 Tagen ohne Protein.
Beispiel 22
Rekombinantes Mammastatin für die Humantherapie
Rekombinantes Mammastatin wurde in Cos-7-Affennierenzellen, Ovarialzellen chinesischer Hamster (CHO) und Sf9-Insektenzellen durch Transfektion der Zellen mit einem Plasmid erzeugt, das die Mammastatin-cDNA-Sequenz enthält. Die Mammastatin-cDNA wurde stabil in das Genom dieser produzierenden Zelllinien integriert, die immunreaktives Protein mit wachstumshemmender Wirkung sezernieren.
Zur Herstellung von Mammastatin aus diesen Zellen und zur Isolierung des Proteins für die Anwendung am Menschen werden die Zelllinien in serumfreiem Medium etwa 48 bis 72 Stunden vermehrt. Das Medium wird abgezogen und das Protein aus dem konditionierten Medium gereinigt, und zwar entweder durch Ionenaustauschchromatographie in Tris-Puffer, pH 7,5, unter Verwendung eines Natriumchlorid-Gradienten von etwa 0,1 M bis etwa 0,5 M, Auffangen der Mammastatin-Fraktion bei etwa 0,2 M. Die Protein-Fraktion wird anschließend gegen normale Salzlösung dialysiert, verdünnt – falls notwendig – und sterilfiltriert.
Bei einem alternativen Verfahren wird Mammastatin als Fusionsprotein in Cos-7- oder Sf9-Zellen produziert. Das Fusionsprotein enthält einen Histidin-Anhang (sechs Histidin-Reste) und eine Faktor X-Proteinase-Spaltstelle. Die Mammastatin exprimierenden Zellen werden kultiviert, vorzugsweise in 1% Serum enthaltenden Medien, die konditionierten Medien werden abgenommen und durch ein Nickelkomplexierendes Harz geleitet. Das His-Fusionsprotein haftet an der Säule, wird mit 50 mM Tris, pH 7,5, 0,1 M NaCl gewaschen und langsam mit Tris-NaCl eluiert, das 10 Einheiten/ml Faktor X-Proteinase enthält. Dadurch wird das Mammastatin aus der His-Fusion freigesetzt. Das Mammastatin wird durch Molekularsiebchromatographie oder mittels Ionenaustauschchromatographie wie vorstehend beschrieben abgetrennt.
Die obigen Ausführungen, Beispiele und Daten liefern eine vollständige Beschreibung der Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Da viele Ausführungsformen der Erfindung ausgeführt werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen, liegt die Erfindung in den beigefügten Patentansprüchen begründet.
Tabelle 1 – Mammastatin-DNA-Sequenz
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Im Wesentlichen gereinigte und isolierte Nucleinsäurezusammensetzung, die die codierende Sequenz von Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Im Wesentlichen gereinigtes und isoliertes Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Rekombinantes Protein, das aus der Nucleinsäuresequenz von Anspruch 1 hergestellt ist.
Plasmid oder Vektor, der die codierende Sequenz der Nucleinsäuresequenz von Anspruch 1 umfasst.
Diagnostischer Kit zum Nachweis von Mammastatin, der die Zusammensetzung von Anspruch 1 umfasst.
Diagnostischer Kit gemäß Anspruch 5, der weiterhin Anti-Mammastatin-Antikörper und Mammastatin umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Zusammensetzung von Anspruch 2 umfasst.
Zusammensetzung, die die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Verwendung der Mammastatin-Nucleinsäure von Anspruch 1 oder des Mammastatin-Proteins von Anspruch 2 oder von Antikörpern dagegen zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Diagnostizieren oder Überwachen eines Mammakarzinoms durch Analysieren des Bluts oder Gewebes eines Patienten auf die Anwesenheit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, wobei die Abwesenheit oder Reduktion von Mammastatin im Vergleich zu einer normalen Kontrolle mit Mammakarzinom korreliert ist.
Verwendung der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung des Wachstums von humanen Brustdrüsenzellen.