DE69737296T2 - Synthetische antisense oligodeoxynukleotide und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen - Google Patents

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Description

  • 1. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Das Gebiet dieser Erfindung sind Antisense-Oligodesoxynukleotide und auf diesen basierende Pharmazeutika.
  • 2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDES DER TECHNIK
  • Das ACHE-Gen, welches das Acetylcholin-hydrolysierende Enzym Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) codiert, wird in Muskel, Nerv, hämatopoetischen Zellen, Embryonalgewebe und Keimzellen exprimiert. ACHE kartiert auf Chromosom 7q22 und codiert das primäre Enzym Acetylcholinesterase (AChE, E.C. 3.1.1.7), das die Neurotransmission an Synapsen und neuromuskulären Verbindungsstellen beendet.
  • Der Text Human Cholinesterases and Anticholinesterases von Soreq und Zakut (Academic Press, Inc., 1993) liefert eine Zusammenfassung des biochemischen und biologischen Hintergrunds sowie der Molekularbiologie humaner Cholinesterase-Gene. Ferner liefert der Text Transgenic Xenopus von Seidman und Soreq (Humana Press, 1996) eine Zusammenfassung der Entwicklung des transgenen Xenopus-Tiermodells. Artikel von Beeri et al., 1995; Karpel et al., 1996 und die Übersichtsartikel von Lev-Lehman et al., 1997, und Grifman et al., 1995, 1997, liefern weitere Informationen über die Entwicklung von Antisense-ACHE-Oligomeren, die Parameter zur Auswahl von Sequenzen und das Testen der Wirksamkeit und sind hier durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Kurz gesagt, enthält AChE das Peptidmotiv S/T-P-X-Z, was es zu einem potenziellen Substrat für eine Phosphorylierung durch cdc2-Kinasen macht, die allgemeinen Regulatoren des Zellzyklus. Die meisten anderen Substrate von cdc2-Kinasen führen biologische Funktionen aus, die für Vorgänge notwendig sind, die mit dem Zellzyklus zusammenhängen. Somit kann erwartet werden, dass eine Störung entweder von CHE- oder cdc2-Transkriptionsvorgängen die Zellteilung ableitet und/oder anhält, und die Regulation dieser Vorgänge kann für mehrere medizinisch wichtige Verfahren nützlich sein.
  • Biochemische und histologische Analysen zeigen, dass AChE in hohen Spiegeln in verschiedenen Embryonalgeweben mehrerer eukaryotischer Spezies exprimiert wird, in denen Cholinesterasen (ChEs) im Hinblick auf Zellproliferation und -differenzierung koordiniert reguliert werden. Die spezifische Rolle, die ChEs bei der Embryonalentwicklung zugeschrieben werden muss, kann somit mit der Zellteilung zusammenhängen, so dass ihre biologische(n) Funktion(en) in diesen Geweben möglicherweise an der Steuerung der Organogenese beteiligt sind.
  • Zusätzlich zu ihrem Vorkommen in den Membranen reifer Erythrozyten wird AChE auch in sich entwickelnden Blutzellen in vivo und in vitro intensiv produziert, und ihre Aktivität dient als annehmbarer Marker für sich entwickelnde Maus-Megakaryozyten. Ferner hat man gezeigt, dass die Verabreichung von Acetylcholin-Analoga sowie von Cholinesterase-Inhibitoren die Megakaryozytopoese induziert und die Plättchenzahlen in der Maus erhöhte, was dieses Enzym bei der Festlegung und Entwicklung dieser hämatopoetischen Zellen impliziert.
  • Eine hauptsächliche hydrophile Form der AChE, die potenziell mit einem "Schwanz" nichtkatalytischer Untereinheiten versehen werden kann, wird im Zentralnervensystem und im Muskel exprimiert, wohingegen man eine hydrophobe, mit Phosphoinositid (PI) verknüpfte Form des Enzyms in Erythrozyten findet. Es wurde gezeigt, dass alternative Exons, die das C-terminale Peptid in der AChE codieren, die molekulare Ursache für die amphiphile, (PI)-verknüpfte und die hydrophile, mit einem "Schwanz versehene" Form der AChE im elektrischen Organ von Torpedo bereitstellen. Die Existenz entsprechender alternativer Exons und homologer Enzymformen bei Säugern legt nahe, dass ein ähnlicher Mechanismus den molekularen Polymorphismus von humaner AChE liefern kann. cDNAs aus Säugerhirn und -muskel, über die bis heute berichtet wurde, codieren die hydrophile AChE-Form.
  • Genauer gesagt, wurden drei alternative AChE-codierende mRNAs bei Säugern beschrieben (11). Die vorherrschende Zentralnervensystem- und Muskel-AChE (AChE-T), die man in der neuromuskulären Verbindung (neuromuscular junction, NMJ) findet, wird von einer mRNA codiert, die Exon E1 und die invarianten codierenden Exons E2, E3, und E4 trägt, die an das alternative Exon E6 gespleißt sind [Li et al., 1991; Ben Aziz-Aloya et al., 1993]. AChE-mRNA mit den Exons E1-4 und dem alternativen Exon E5 codiert die mit dem Glykolipid Phosphatidylinositol (GPT) verknüpfte Form der AChE, die für Vertebraten-Erythrozyten charakteristisch ist (AChE-H) [Li et al., 1993; Legay et al., 1993a]. Eine zusätzliche durchgelesene mRNA-Spezies, welche die Intronsequenz I4 beibehält, die sich unmittelbar 3' von Exon E4 befindet, wurde für Nager-Knochenmark und erythroleukämische Zellen [Li et al., 1993; Legay et al., 1993a] und in verschiedenen Tumorzelllinien menschlichen Ursprungs [Karpel et al., 1994] beschrieben.
  • AChE ist die hauptsächliche Cholinesterase (ChE) in Zellen des Nervensystems. Weil Acetylcholin hauptsächlich im ZNS produziert wird, sollten Veränderungen in der AChE mit dem mentalen Zustand gekoppelt sein.
  • Die cholinerge Theorie der Alzheimer-Krankheit [Coyle, et al., 1983; Slotkin et al., 1994] legt nahe, dass der selektive Verlust cholinerger Neuronen bei Alzheimer-Krankheit zu einem relativen Mangel an Acetylcholin in spezifischen Regionen des Gehirns führt, die Lern- und Gedächtnisfunktionen vermitteln und dafür Acetylcholin benötigen. Der hauptsächliche Ansatz zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit zielte deshalb darauf ab, das cholinerge System zu verbessern. Verringerte Spiegel an Acetylcholin in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten belassen einen relativen Überschuss an Acetylcholinesterase, dem Enzym, das für die Beendigung der Nervenimpulse während der normalen Hirnaktivität durch Entsorgung des verbrauchten Acetylcholins verantwortlich ist (Soreq und Zakut, 1993). Ein relativer Überschuss an Acetylcholinesterase verstärkt das wachsende cholinerge Defizit, indem er die Verfügbarkeit von Acetylcholin verringert. Die heutzutage erfolgreichste Strategie zur Verstärkung der cholinergen Neurotransmission bei Alzheimer-Patienten ist eine pharmakologische Hemmung der Acetylcholinesterase. Tatsächlich sind die einzigen zugelassenen Arzneimittel für Alzheimer-Krankheit starke Acetylcholinesterase-Inhibitoren (Winker, 1994), d.h. Arzneimittel, die die katalytische Aktivität des Acetylcholin-hydrolysierenden Enzyms Acetylcholinesterase (Acetylcholin-Acetylhydrolase, EC 3.1.1.7, AChE) unterdrücken [Knapp et al., 1994]. Dies liefert eine Erhöhung der cholinergen Neurotransmission, die in solchen Patienten aufgrund des selektiven Verlusts cholinerger Neuronen gestört ist. Solche Inhibitoren verringern jedoch nicht die Menge an AChE-Protein, und es gibt neuere Berichte über Wirkungen der AChE, die nicht mit ihrer Aktivität zusammenhängen, bei der Fortsatzverlängerung [Small et al., 1995, Layer et al.; 1995, Jones et al., 1995; Darboux et al., 1996; Sternfeld et al., 1997] und der Bildung von Amyloidfibrillen [Inestrosa et al., 1996].
  • Tacrin, der erste und am besten charakterisierte Acetylcholinesterase-Inhibitor, der zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendet wird, liefert eine begrenzte palliative Linderung für 30–50% der schwachmäßig betroffenen Alzheimer-Patienten für bis zu 6 Monate [Winker, 1994; Knapp et al., 1994]. Der positive, wenn auch partielle, Erfolg von Tacrin unterstützt die Nützlichkeit der cholinergen Theorie und den potenziellen Wert einer verbesserten Anti- Cholinesterase-Behandlung für Alzheimer-Krankheit. Von einem weiteren zugelassenen Arzneimittel, E-2020 (Aricept), wurde berichtet, dass es derselben Wirkungsweise folgt wie Tacrin, jedoch bei niedrigeren Dosen [Rogers et al., 1996]. Eine Reihe weiterer Verbindungen wird zurzeit zur Hemmung der Acetylcholinesterase entwickelt [Johansson und Nordberg, 1993]. Diese zielen sämtlich auf die Blockierung des Abbaus von Acetylcholin durch das vollständig gefaltete Protein ab.
  • Der positive, wenn auch partielle Erfolg von Tacrin unterstützt die Nützlichkeit der cholinergen Theorie und den potenziellen Wert einer verbesserten Anti-Cholinesterase-Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Anti-Acetylcholinesterase-Therapien für Alzheimer-Krankheit erfordern jedoch hohe Dosen an Arzneimittel und erzeugen Nebenwirkungen in Verbindung mit der systemischen cholinergen Toxizität. Tacrin wurde zum Beispiel mit Leberschädigung und Blutstörungen bei einigen Patienten in Zusammenhang gebracht [Johansson und Nordberg, 1993]. Ferner treten derzeitige ACHE-Inhibitoren unspezifisch mit dem zu AChE homologen Serumprotein Butyrylcholinesterase in Wechselwirkung und stimulieren regulatorische Rückkopplungswege, die zu einer verstärkten Expression von AchE führen.
  • Obwohl neuere Inhibitoren, wie E-2020, mit einer größeren Spezifität für Acetylcholinesterase niedrigere Dosen ermöglichen [Rogers et al., 1996], ist es aufgrund des hohen Grads an Ähnlichkeit zwischen den beiden Proteinen nicht wahrscheinlich, dass sie das Problem der Kreuzreaktivität mit Butyrylcholinesterase vollständig lösen [Loewenstein-Lichtenstein et al., 1996]. Außerdem bestimmen die Leberfunktion, die Anzahl an roten Blutzellen sowie natürliche Varianten in den Genen, die Acetylcholinesterase und Butyrylcholinesterase codieren, sowohl die Quantität als auch die Qualität des Arzneimittelabfangpotenzials in einzelnen Patienten. Es wurde bereits vorgeschlagen, dass mehrere Mutationen im Butyrylcholinesterase-Gen eine genetische Prädisposition für nachteilige Reaktionen auf Anti-Cholinesterasen hervorrufen [Loewenstein-Lichtenstein et al., 1995]. Dies legt nahe, dass sogar bei dem Szenario für den besten Fall von auf Acetylcholinesterase-Inhibitoren basierenden Therapien verschiedene Elemente bei der Gestaltung individualisierter Dosierungsschemata basierend auf jedem einzelnen Patienten in Betracht gezogen werden müssen.
  • Myasthenia gravis (MG) ist eine Autoimmunerkrankung, bei der gegen den nicotinischen Acetylcholin-Rezeptor (AChR) an der motorischen Endplatte der neuromuskulären Verbindung (NMJ) gerichtete Antikörper durch Bindung an den ACHR die neuromuskuläre Kommunikation entweder direkt oder über NMR-Abbau behindern. Die therapeutischen Strategien zur Behandlung von MG beinhalten inzwischen Anti-Cholinesterase-Arzneimittel, immunsuppressive Arzneimittel, Thymektomie und Plasmapherese [siehe Myasthenia Gravis and Related Disorders, Annals of the New York Academy of Sciences, Bände 681 (1993), 505 (1987), 377 (1981), 274 (1976) und 135 (1966) hinsichtlich einer Übersicht über den Fortschritt und die Entwicklung des Verständnisses der Ätiologie der MG-Erkrankung und therapeutischer Strategien sowie den Band von 1998 (im Druck)].
  • AChE wird an neuromuskulären Verbindungen akkumuliert (Salpeter 1967) und dient dort der lebenswichtigen Funktion der Modulation der cholinergen Neurotransmission (Übersicht von Soreq und Zakut, 1993). Die molekularen Mechanismen, durch die AChE und andere synaptische Proteine zur NMJ gelenkt werden, sind nicht gut verstanden. Eine kompartimentalisierte Transkription und Translation in und um die Kerne der Verbindung tragen wahrscheinlich zur NMJ-Lokalisierung der AChE bei (Jasmin et al., 1993). Daher wird eine Anti-Cholinesterase-Therapie mit fast allen Patienten dazu genutzt, AChE zu verringern und dadurch die Halbwertszeit von Acetylcholin zu erhöhen und die neuromuskuläre Transmission zu potenzieren. Diese Therapie wird oft zusammen mit einer immunsuppressiven Therapie (gewöhnlich Steroide) eingesetzt. Es ist das allgemeine Ziel, den Patienten aus der immunsuppressiven Therapie aufgrund von deren Nebenwirkungen zu entfernen.
  • Pyridostigmin (Mestinon®) bleibt aufgrund seiner Wirksamkeit und Verträglichkeit für die Patienten das Arzneimittel der Wahl bei der Behandlung von Myasthenien. Ambenonium (Mytelase®) wird für die Patienten verwendet, die Pyridostigmin nicht vertragen. Die Patienten müssen jedoch an der Bestimmung der Dosierung des Arzneimittels beteiligt werden, weil die Dosierung oft über jeden Vierundzwanzig-Stunden-Zeitraum eingestellt werden muss. Variablen, wie Menstruationszyklus, Infektionen und emotionaler Stress beeinflussen die Dosierung, und die Patienten müssen angeleitet werden, ihre Dosierung zu modifizieren, damit sie diese und anderen Faktoren berücksichtigen. Eine Überdosierung von Pyridostigmin kann zu einer cholinergen Krise führen, und sogar bei einer guten Patientenausbildung treten solche Überdosen auf. Wie hier vorstehend erläutert, müssen genetische Prädispositionen zu einer Prädisposition für nachteilige Reaktionen auf Anti-Cholinesterasen [Loewenstein-Lichtenstein et al., 1995] in Betracht gezogen werden.
  • Eine cholinerge Krise aufgrund einer Überdosis eines Anti-Cholinesterase-Arzneimittels ist durch zunehmende Muskelschwäche gekennzeichnet, die, wenn sie die Atemwegsmuskeln umfasst, zu einer myasthenischen Krise und zum Tod führen kann. Eine myasthenische Krise aufgrund einer Steigerung der Schwere der Erkrankung mit denselben Symptomen kann ebenfalls vorliegen. Eine Unterscheidung zwischen den beiden ist äußerst wichtig, da die Behandlung für eine cholinerge Krise in der Beendigung der Anti-Cholinesterase-Arzneimittel besteht, während die nicht mit dem Arzneimittel zusammenhängende myasthenische Krise eine Erhöhung der Dosierung des anti-cholinergen Arzneimittels anzeigt. Daher wäre es vorteilhaft, Alternativen zur Anti-Cholinesterase-Arzneimittel-Therapie bei MG zu finden.
  • Diese Überlegungen zeigen den Bedarf an der Entwicklung einer neuen Generation von Anti-Acetylcholinesterase-Arzneimitteln, die eine erhöhte Zielspezifität, verbesserte Wirksamkeit und verringerte Nebenwirkungen zeigen.
  • Durchbrüche in der Molekularbiologie und im Human-Genom-Projekt haben zuvor unvorhergesehene Möglichkeiten für einen gezielten Eingriff in die Säugergenexpression eröffnet. Dazu gehören bleibende Ansätze, wie eine transgene Überexpression oder rekombinante Disruption spezifischer Gene, sowie neue Ansätze einer transienten Unterdrückung der Genfunktion. Kurze synthetische Antisense-(AS-)Oligodesoxynukleotide (AS-ODN), die derart gestaltet sind, dass sie mit spezifischen Sequenzen innerhalb einer angesteuerten mRNA hybridisieren, gehören zur letzteren Klasse.
  • Viele ausgezeichnete Übersichtsartikel decken die Hauptaspekte der Antisense-Technologie und ihr enormes therapeutisches Potenzial ab. Die Literatur schritt natürlich von chemischen [Crooke, 1995] zu zellulären [Wagner, 1994] und therapeutischen [Hanania, et al., 1995; Scanlon, et al., 1995] Aspekten dieser sich schnell entwickelnden Technologie voran. In einer relativ kurzen Zeit hat sich genügend Information über die In-vitro-Verwendung von AS-ODN in kultivierten Primärzellen und Zelllinien sowie die In-vivo-Verabreichung dieser ODNs zur Unterdrückung spezifischer Vorgänge und zur vorübergehenden Veränderung von Körperfunktionen angehäuft. Dieser Reichtum an angehäufter Erfahrung bietet nun eine neue Weise, den Antisense-Ansatz zu analysieren, nämlich seine In-vitro-Verwendungen mit den In-vivo-Verwendungen zu vergleichen [Lev-Lehman et al., 1997]. Ferner ist jetzt, wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt wird, genügend Erfahrung in vitro sowie in vivo in Tiermodellen vorhanden, um die Wirksamkeit im Menschen vorherzusagen.
  • Eine AS-Intervention in die Expression spezifischer Gene kann durch Verwendung synthetischer AS-ODNs erzielt werden [neuere Berichte siehe in Lefebvre-d'Hellencourt et al., 1995; Agrawal, 1996; Lev-Lehman et al., 1997]. AS-ODNs sind kurze DNA-Sequenzen (durchschnittlich 15-25-mere), die derart gestaltet sind, dass sie zu der Ziel-mRNA von Interesse komplementär sind und einen RNA:ODN-Duplex bilden. Diese Duplexbildung kann Prozessierung, Splicing, Transport oder Translation der relevanten mRNA verhindern. Außerdem können bestimmte AS-ODNs eine zelluläre RNase-H-Aktivität zeigen, wenn sie mit ihrer Ziel-mRNA hybridisiert sind, was zum mRNA-Abbau führt [Calabretta et al., 1996]. In diesem Fall spaltet RNase H die RNA-Komponente des Duplexes und kann potenziell das AS-ODN freisetzen, das dann weiter mit zusätzlichen Molekülen der Ziel-RNA hybridisieren kann. Eine zusätzliche Wirkungsweise ergibt sich aus der Wechselwirkung von AS-ODNs mit genomischer DNA, wodurch eine Tripelhelix gebildet wird, die transkriptionsinaktiv sein kann. Siehe eine schematische Darstellung der Wirkungsweisen von AS-ODN in 1.
  • Phosphorthioat-Antisense-Oligonucleotide zeigen keine signifikante Toxizität und weisen ausreichende pharmakodynamische Halbwertszeiten in Tieren auf [Agarwal et al., 1991, 1996]. Antisense-induzierte Funktionsverlust-Phänotypen, die mit der Zellentwicklung zusammenhängen, wurden für das saure Gliafibrillenprotein (glial fibrillary acidic protein, GFAP), das beim Astrozytenwachstum in Astrozyten-Neuronen-Cokulturen impliziert wird [Winstein et al., 1991], für das Myelin-assoziierte Glykoprotein in Schwann-Zellen, das für die Bildung der kompakten Myelinscheidenbildung, die diese Zellen umgibt, verantwortlich ist [Owens und Bunge, 1991], für die Mikrotubuli-assoziierten tau-Proteine, die bei der Polarität der Hippocampusneuronen und ihrer Axonbildung impliziert werden [Caceres und Kosik, 1990], für β1-Integrin, das für die Neuronenwanderung entlang radialer Gliazellen und für die Festlegung der Tektumplattenbildung beim Huhn wichtig ist [Galileo et al., 1991], und für das N-myc-Protein gezeigt, das für die Aufrechterhaltung der zellulären Heterogenität in neuroektodermalen Kulturen (Ephithel- gegenüber Neuroblastenzellen, die sich hinsichtlich ihrer Koloniebildungsfähigkeiten, Tumorigenität und Adhärenz unterscheiden) verantwortlich ist [Rosolen et al., 1990; Whitesell et al., 1991]. Die Hemmung des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFgF) mit mitogenen und angiogenen Eigenschaften durch Antisense-Oligonukleotide unterdrückte 80% des Wachstums in Gliomzellen [Morrison, 1991] auf sättigbare und spezifische Weise. Die Antisense-Oligonukleotide waren gegen die Initiations- und Splice-Stellen in der bFgF-mRNA gerichtet, sie verringerten die Aktivität des erhaltenen Proteins, und Sense-Oligomere blieben inaktiv. In Weichagarkulturen verringerten Antisense-Oligonukleotide die Größe von Gliakolonien und induzierten das Auftreten größerer Zellen innerhalb dieser [Morrison, 1992]. Da sie hydrophob sind, interagieren Antisense-Oligonukleotide gut mit Phospholipidmembranen [Akhter et al., 1991]. Nach ihrer Wechselwirkung mit der zellulären Plasmamembran werden sie aktiv in lebende Zellen mit einem sättigbaren Mechanismus transportiert [Loke et al., 1989], von dem vorhergesagt wird, dass spezifische Rezeptoren daran beteiligt sind [Yakubov et al., 1989].
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In der vorliegenden Anmeldung werden synthetische Nuklease-resistente Antisense-Oligodesoxynukleotide, die fähig sind, die Produktion von humaner Acetylcholinesterase (AChE) selektiv zu modulieren, mit den folgenden Sequenzen beschrieben:
    5'ACGCTTTCTTGAGGC 3' SEQ ID No: 1,
    5'GGCACCCTGGGCAGC 3' SEQ ID No: 2,
    5'CCACGTCCTCCTGCACCGTC 3' SEQ ID No: 6 und
    5'ATGAACTCGATCTCGTAGCC 3' SEQ ID No: 7.
    5'GCCAGAGGAGGAGGAGAAGG 3' SEQ ID No: 4,
    5'TAGCGTCTACCACCCCTGAC 3' SEQ ID No: 5,
    5'TCTGTGTTATAGCCCAGCCC 3' SEQ ID No: 17 und
    5'GGCCTGTAACAGTTTATTT 3' SEQ ID No: 18.
  • Es ist ein Nukelase-resistentes Antisense offenbart, das gegen die Splice-Verbindung in dem AChE-mRNA-Boten nach dem Spleißen gerichtet ist. Es ist offenbart, dass die E4-E6-Verbindung in der E2-E3-E4-E6-Splice-Variante der AChE-mRNA hochspezifisch für die Muskel- und die Zentralnervensystem-Splice-Variante der AChE ist.
  • So ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid, das fähig ist, die Produktion der E1-E2-E3-E4-E6-Splice-Variante von humaner Acetylcholinesterase (AchE), die überwiegend im zentralen Nervensystem und/oder im Muskel exprimiert wird, selektiv zu modulieren.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden synthetische, Nuklease-resistente Antisense-Oligodesoxynukleotide, die fähig sind, die Produktion von humaner Acetylcholinesterase im zentralen Nervensystem selektiv zu modulieren, oder die fähig sind, die Ablagerung von humaner Acetylcholinesterase an der neuromuskulären Verbindung selektiv zu verringern, mit den folgenden Sequenzen bereitgestellt:
    5'TCTGTGTTATAGCCCAGCCC 3' SEQ ID No: 17 und
    5'GGCCTGTAACAGTTTATTT 3' SEQ ID No: 18.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch eine pharmazeutische oder medizinische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens eines dieser synthetischen, Nuklease-resistenten Antisense-Oligodesoxynukleotide in einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur Wiederherstellung einer ausgeglichenen cholinergen Signalübertragung im Gehirn bei Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, insbesondere in Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis sowie Stressstörungen und Parkinson. Das Verfahren beinhaltet die Schritte der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines erfindungsgemäßen synthetischen, Nuklease-resistenten AS-ODN an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur Verringerung der Produktion und damit der Ablagerung von Acetylcholinesterase in der neuromuskulären Verbindung bei Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, insbesondere Patienten mit Myasthenia gravis. Das Verfahren beinhaltet die Schritte der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen synthetischen, Nuklease-resistenten Antisense-Oligodesoxynukleotide an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
  • Diese Technologie hält speziell die Produktion, im Gegensatz zu biochemischen Aktivität, von Acetylcholinesterase in Hirnzellen auf und verhindert und/oder verringert die Ablagerung an der neuromuskulären Verbindung. Diese Technologie basiert auf einer Unterbrechung des Weges, der zur Acetylcholinesterase-Biosynthese führt, durch Verabreichung sehr niedriger Dosen an Antisense-Oligonukleotiden. Antisense-Oligonukleotide sind allein gegen das Gen gerichtet, das Acetylcholinesterase codiert, und nicht gegen das endgültige Genprodukt (d.h. das Protein). Daher interagiert das molekulare Ziel dieser Antisense-Oligonukleotide gegen Acetylcholinesterase weder mit dem verwandten Enzym Butyrylcholinesterase noch unterdrückt es die Butyrylcholinesterase-Genexpression. Somit wirkt dieses potenzielle Arzneimittel effektiv in sehr niedrigen Dosen und vermeidet gleichzeitig viele der Nebenwirkungen, die mit Tacrin und verwandten cholinergen Arzneimitteln für Alzheimer-Krankheit und Pyridostigmin und verwandten Arzneimitteln für Myasthenia gravis einhergehen.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden leicht erkannt, weil diese anhand der folgenden eingehenden Beschreibung besser verständlich wird, wenn diese in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet wird, in denen:
  • 1 ein schematisches Diagramm der Wirkungsweisen von Antisense-(AS-)Oligodesoxynukleotiden (ODN) ist, das ein Gen zeigt, das in mRNA transkribiert wird, und nach Aufnahme von AS-ODN können sowohl eine Hemmung der Transkription durch Tripelhelixbildung, durch Störung von RNA-Splicing oder -Translation auftreten, oder der RNA:ODN-Duplex kann RNase-H-Aktivität zeigen, was zu RNA-Abbau und zur Verhinderung der Proteinproduktion führen kann.
  • 2 ist eine Zusammenstellung von eingesetzten Fotografien von Gelen, die eine Verringerung der AChE-mRNA-Spiegel im Cortex von Mäusen zeigt, die mit Antisense-Oligodesoxynukleotiden behandelt wurden. Es wurden spezifische Primer eingesetzt, um die hACHE-, mACHE- oder Synaptophysin-(Syn-)mRNAs nachzuweisen; cDNA-Produkt wurde in jedem dritten Zyklus zwischen den Zyklen 21–36 entnommen, einer Gelelektrophorese unterzogen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Produkte aus den Zyklen 21–36 sind in der Figur von links nach rechts dargestellt. Die Spiegel der AChE-Aktivität im Cortex von Mäusen, denen Puffer oder AS-Oligodesoxynukleotide injiziert wurden, sind in nmol hydrolysiertes Substrat/min/μg Protein dargestellt.
  • 3 ist ein Graph, der zeigt, dass i.c.v. injizierte Antisense-Oligonukleotide eine Verringerung der katalytischen AChE-Aktivität in den subcortikalen Regionen ergeben. Jeder Kreis stellt die AChE-Aktivität dar, die in der subcortikalen Region einer einzelnen Maus, die eine Injektion erhielt, gemessen wurde. Die spalte der Mäuse, denen Puffer injiziert wurde, stellt Daten aus zwei unabhängigen Experimenten dar, die an im alter zusammenpassenden Mäusen durchgeführt wurden. Die für jede Gruppe berechnete durchschnittlichen Aktivität ist durch eine horizontale Linie angegeben.
  • 4A–B zeigt die In-vivo-Antisense-Unterdrückung der ACHE-mRNA, wobei 4A schematisch das Maus-ACHE-Gen mit seinem Promotor (P), 6 Exons (mit 1–6 nummeriert) und 4 Introns darstellt. Alternatives Splicing ergibt 3 mRNA-Transkriptvarianten, die Polypeptide codieren, die sich in ihren C-terminalen Peptidsequenzen unterscheiden. 4B ist eine Fotografie der Gelelektrophorese von PCR-Produkten in verschiedenen Zyklen und zeigt die Wirkung auf die Gesamt-ACHE-mRNA von Antisense-(AS-)Oligonukleotiden, die gegen das gemeinsame Exon E2 (mE2) oder das alternative Exon E5 (mE5) gerichtet sind, verglichen mit derjenigen von Sense-(S-)Oligos auf Basis der homologen humanen ACHE-Gensequenz oder von Scheininjektionen mit PBS. β-Aktin-mRNA diente als Kontrolle für unspezifische Wirkungen auf die Transkription. Man beachte, dass sowohl AS-mE2 als auch AS-mE5 eine spezifische Verringerung von E6-enthaltender ACHE-mRNA im Knochenmark, aber nicht im Muskel bei den verabreichten Dosen bewirken, während Aktin-mRNA durch jede Behandlung unbeeinflusst war. Die Gele zeigen Daten von einem einzigen repräsentativen Tier aus drei behandelten Individuen.
  • 5A–B zeigt Anti-ACHE-ODNs und die ACHE-mRNA-Sequenzen, gegen die sie gerichtet sind, wobei 5A eine Fotografie eines Gels der RT-PCR-Amplifikationsprodukte ist, die von Gesamt-RNA-Präparationen von adulten (2 Monate alten) Mäusehirnen, zerebralen primären Neuronen aus Mäuseembryonen (Embryonaltag 13), die 3 Tage in Kultur mit oder ohne 0,5 μg/ml Actinomycin D (Act. D) gezüchtet wurden, oder von undifferenzierten PC12-Zellen stammten. Gezeigt sind 10% der mittels Elektrophorese auf Agarose-Flachgelen aufgetrennten und mit Ethidiumbromid gefärbten Produkte einer RT-PCR-Amplifikation von 200 ng RNA, die mit selektiven Primern für die ACHE-mRNA-Transkripte, die 3' mit E5-, E6- oder I4/E5-Sequenzen endeten, inkubiert wurden [Einzelheiten siehe in Karpel et al., 1996]. Man beachte, dass das E6-ACHE-mRNA-Transkript in jeder dieser Quellen das ausgeprägteste von allen ist und das es nach 3 Tagen in Gegenwart von Actinomycin D in Abwesenheit neuer Transkripte größtenteils intakt bleibt. PC12-Zellen exprimieren wie murine Hirnneuronen 3 alternative ACHE-mRNAs. 5B ist ein schematisches Diagramm der Stellung und verschiedener Parameter der AS-ODNs. Die Stellung jedes der AS-ODNs ODNs (1–7) (fett unterstrichen) ist entlang des ACHE-Gens markiert, das schematisch dargestellt ist. Leere Kästen zeigen Introns (I) und ausgefüllte Kästen Exons (E) mit Ausnahme des Pseudointrons 4 (I4), das ebenfalls schattiert ist. Die gestrichelten Linien stehen für alternative Splicing-Möglichkeiten. Offene Leserahmen-(ORF-)Regionen sind durch eine durchgezogene Linie darüber markiert, die bei dem ersten AUG-Codon am 5'-Ende des Gens beginnt. ODN-Strukturen sind in solche ohne vorhergesagte Sekundärstruktur (N) und solche klassifiziert, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine Schleife bilden (gezeichnet). Die G,C-Gehalte sind ebenfalls angegeben. Vorhergesagte Schmelztemperaturen und freie Enthalpien der ODNs sind jeweils unterhalb ihrer Positionen dargestellt (PRIMER-Programm, University of Wisconsin GCG-Softwarepaket).
  • 6A–B zeigt die Neurotoxizität der AS-ODNs, wobei 6A ein Balkendiagramm der Überlebensrate undifferenzierter PC12-Zellen nach 24 Stunden in Gegenwart von jeweils entweder 1 μM (ausgefüllte Balken) oder 10 μM (offene Balken) der ODNs ist. Der Standardfehler des Mittelwerts für 3 Kulturen ist durch die Fehlerblaken angegeben. Man beachte die höhere Toxizität von AS2 sogar bei 1 μM, und die erhöhte Neurotoxizität bei 10 μM der meisten anderen ODNs. 6B ist ein Graph, der die lineare Beziehung zwischen der Zellzahl und freien Thiolgruppen zeigt. Die Anzahl in Mikrotitervertiefungen abgelagerter undifferenzierter PC12-Zellen wurde mittels Phasenmi kroskopie und manuelles Zählen in einem Hämozytometer gemessen. Dargestellt ist die durchschnittliche Absorption bei 405 nm pro 1000 Zellen für sechs Kulturen, die gepuffertem Triton X-100 und DTNB ausgesetzt wurden.
  • 7 ist ein Graph, der zeigt, dass die Wirksamkeit von AS-ODNs bei 1 μM von der NGF-Induktion, aber nicht von ihrer Zielposition entlang der codierenden Region in der ACHE-mRNA-Sequenz abhängt. Gezeigt ist die prozentuale Hemmung der AChE-Aktivität in unbehandelten Kulturen. Die Werte von AChE in NGF-behandelten Kulturen sind mit ausgefüllten Kreisen und diejenigen für undifferenzierte PC12-Zellen in leeren Kreisen dargestellt. Die Datenpunkte für jedes AS-ODN befinden sich unterhalb ihrer Positionen in der ACHE-cDNA-Sequenz, die schematisch über dem Graph dargestellt ist. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler des Mittelwerts von 3 Vertiefungen in jedem Test. Die AS5 entsprechenden Werte befinden sich in einem getrennten Kasten rechts unter dem alternativen E5-Exon. Man beachte, dass für die meisten AS-ODNs die Hemmwirksamkeiten in den NGF-behandelten Kulturen höher sind als in unbehandelten Kulturen.
  • 8A–B sind Graphen der semi-quantitativen Messung der AChE-mRNA durch kinetische Verfolgung von RT-PCR. RT-PCR-Analysen wurden für mRNAs für AChE (A) und Aktin (B) durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte von Gesamt-RNA, die von unbehandelten differenzierten PC12-Zellen (keine) oder mit ODNs (AS1, AS3, AS4, AS6 oder AS-B) behandelten Zellen extrahiert wurde, wurden einer Gelelektrophorese und CCD-Quantifizierung unterzogen. Gezeigt sind die Prozent der maximalen Fluoreszenzintensitäten von 12 μl der ethidiumbromidgefärbten Produkte, die in den Zyklen 18, 20, 22, 24, 26, 28 (für Aktin-mRNA) und 26, 28, 30, 32, 34, 36 (für AChE-mRNA) entnommen wurden. Einsatz: Lineare Regressionsanalysen der Akkumulationskinetiken wurden nur an den Zeitpunkten durchgeführt, an denen die Produktakkumulation mit konstanter Geschwindigkeit erfolgte (Zyklen 28, 30 und 32 für AChE-mRNA, Zyklen 20, 22, 24 für Aktin-mRNA). Man beachte die Rechtsverschiebung der Kurven, die für AS-ODN-behandelte Zellen abgeleitet wurden, verglichen mit den Kontrollzellen und das Fehlen einer solchen Verschiebung in den Aktin-mRNA-Kurven.
  • 9A–B sind Balkendiagramme der mangelhaften Leistung von AChE-transgenen Mäusen im sozialen Erkundungstest (A), die durch Tacrin korrigiert wird (B). 9A zeigt adulte transgene oder Kontroll-Mäuse, die einem unbekannten Jungtier ausgesetzt werden, und die aufgezeichnete Zeit, die in die olfaktorische Erkennung investiert wurde (t1). Nach den angegebenen Zeitabständen (in Minuten) wurde jede Maus mit dem gleichen oder einem anderen Jungtier zusammengebracht, und die Erkennungsdauer wurde notiert (t2). Dargestellt ist der Durchschnitt ±SD für t2/t1 für Gruppen von 5–8 Mäusen. Sternchen zeigen statistisch signifikante Unterschiede von t2 gegenüber t1. Man beachte, dass transgene Mäuse innerhalb von 10 Minuten die Fähigkeit verloren, die "gleiche" Maus zu erkennen, gegenüber 30 Minuten für die Kontrollen. Figur B zeigt die verbesserte Gedächtnisleistung, die bei transgenen Mäusen nach einer einzigen Verabreichung von Tacrin (1 mg/g Gew.) und einem 20-minütigen Intervall zwischen den Gegenüberstellungen beobachtet wurde.
  • 10 ist ein Balkendiagramm der mangelhaften Leistung AChE-transgener Mäuse im Geschmacksaversionstest, was zeigt, dass hAChE-transgene Mäuse lernen, aber kein Langzeitgedächtnis besitzen.
  • 11 ist ein schematisches Diagramm der drei Splice-Varianten der AChE.
  • 12 zeigt die Aminosäuresequenz humaner (H) AChE-Varianten vom Ende von E4 bis zum Ende des Proteins in den drei Varianten E1-4, 6 (SEQ ID No: 21), E1-5 (SEQ ID No: 22), E1-4-I4-E5 (durchgelesen; SEQ ID No: 23).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid (AS-ODN) bereit, das fähig ist, die Produktion von humaner Acetylcholinesterase (AChE) im zentralen Nervensystem (ZNS) und an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) selektiv zu modulieren. Der Begriff Modulieren, wie hier verwendet, betrifft eine selektive Hemmung und/oder Stimulation der Acetylcholinesterase-Produktion, d.h. eine Wechselwirkung, die fähig ist, die Rate der Produktion zu verändern oder die Produktion zu stoppen.
  • Eine solche selektive Modulation, d.h. Veränderungen in der Rate der Produktion, kann zum Beispiel zu (1) Veränderungen in der neuronalen Aktivität, (2) Veränderungen von Lernen und Gedächtnis oder (3) einer Verringerung der AChE in der NMJ, d.h. einer Verringerung der Ablagerung von AChE in der NMJ, führen.
  • Die spezifische Sequenz des AS-ACHE-ODN wird bestimmt und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit getestet, wie hier nachstehend beschrieben. Die Sequenz wird derart ausgewählt, dass sie zu einer Splice-Variante der AChE-mRNA gelenkt wird, die im zentralen Nervensystem und/oder im Muskel aktiv/überwiegend ist, wodurch die AS-ODN-Aktivität in anderen Geweben verringert oder beseitigt wird. Die Zielsequenz wird derart ausgewählt, dass sie für das AS-ODN zugänglich und für die Splice-Variante in dem Zielgewebe einzigartig ist. Es ist möglich, eine Sequenz auszuwählen, die zwar nicht einzigartig für die Splice-Variante, aber unzugänglich für das AS-ODN in anderen Geweben ist (siehe Beispiele). Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die AS-ODNs nicht-toxisch, hochselektiv für das ACHE-Gen sind, auf sequenzabhängige Weise wirken und zu einem spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen gelenkt werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-Oligodesoxynuk leotid bereit, das fähig ist, die Produktion der E1-E2-E3-E4-E6-Splice-Variante von humaner Acetylcholinesterase (AchE), die überwiegend im zentralen Nervensystem und/oder im Muskel exprimiert wird, selektiv zu modulieren.
  • Bei einer Ausführungsform wird das synthetische, Nuklease-resistente Antisense-Oligodesoxynukleotid aus einer der folgenden Sequenzen ausgewählt:
    5'TCTGTGTTATAGCCCAGCCC 3' (hAS-6) SEQ ID No: 17,
    5'GGCCTGTAACAGTTTATTT 3' (hAS-7) SEQ ID No: 18.
  • Antisense-Oligodesoxynukleotide mit einer der folgenden Sequenzen sind nachstehend charakterisiert:
    5'ACGCTTTCTTGAGGC 3' SEQ ID No: 1,
    5'GGCACCCTGGGCAGC 3' SEQ ID No: 2,
    5'GCCAGAGGAGGAGGAGAAGG 3' (hAS-1) SEQ ID No: 4,
    5'TAGCGTCTACCACCCCTGAC 3' (hAS-2) SEQ ID No: 5,
    5'CCACGTCCTCCTGCACCGTC 3' (hAS-3) SEQ ID No: 6,
    5'ATGAACTCGATCTCGTAGCC 3' (hAS-4) SEQ ID No: 7.
  • SEQ ID No: 1 ist gegen die humane ACHE-Sequenz gerichtet, die an Position 1119 beginnt (hinsichtlich der Nummerierung der Nukleotide siehe Soreq et al., 1990). SEQ ID No: 2 ist gegen die humane ACHE-Sequenz gerichtet, die an Position 1507 beginnt. Die SEQ ID No: 4–7 und 17–18 sind das humane Äquivalent der mAS-Sequenzen, die in den Beispielen 4–8 getestet werden, und entsprechen mAS-1-4,6-7 (SEQ ID No: 8, 10, 11, 12, 13 bzw. 14). Man beachte, dass aufgrund der fehlenden Homologie zwischen den beiden Sequenzen an dieser Position in der Sequenz wenig Homologie zwischen den mAS3- und hAS3-Antisense-Sequenzen besteht. Kontroll-hAS-Sequenzen waren inverses hAS-1 5'GGAAGAGGAGGAGGAGACCG3' (SEQ ID No: 19) und inverses hAS-6 5'CCCGACCCGATATTGTGTCT3' (SEQ ID No: 20).
  • Der Begriff "Oligonukleotid" betrifft ein Oligomer oder Polymer von Nukleotid- oder Nukleosidmonomeren, das aus natürlich vorkommenden Basen, Zuckern und Interzucker-(Rückgrat-)Bindungen besteht. Der Begriff beinhaltet auch modifizierte oder substituierte Monomere, die nicht natürlicherweise vorkommende Monomere oder Teile davon umfassen, die ähnlich wirken. Der Einbau substituierter Oligomere basiert auf Faktoren, einschließlich der erhöhten Aufnahme durch die Zellen oder einer erhöhten Nuklease-Resistenz, und sie werden ausgewählt, wie im Stand der Technik bekannt. Das gesamte Oligonukleotid oder nur Teile davon kann/können die substituierten Oligomere enthalten.
  • Eine Antisense-Intervention in die Expression spezifischer Gene kann durch Verwendung synthetischer Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen erzielt werden [für neuere Berichte siehe Lefebvre-d'Hellencourt et al., 1995; Agrawal, 1996; Lev-Lehman et al., 1997]. Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen können kurze DNA-Sequenzen, üblicherweise ein 15-30-mer, aber auch nur ein 7-mer sein [Wagner et al., 1996], die derart gestaltet sind, dass sie zu einer Ziel-mRNA von Interesse komplementär sind und einen RNA:AS-Duplex bilden. Diese Duplexbildung kann Prozessierung, Splicing, Transport oder Translation der relevanten mRNA verhindern. Außerdem können bestimmte AS-Nukleotidsequenzen zelluläre RNase-H-Aktivität zeigen, wenn sie mit ihrer Ziel-mRNA hybridisiert sind, was zum mRNA-Abbau führt [Calabretta et al., 1996]. In diesem Fall spaltet RNase H die RNA-Komponente des Duplexes und kann potenziell das AS freisetzen, das dann weiter mit zusätzlichen Molekülen der Ziel-RNA hybridisieren kann. Eine zusätzliche Wirkungsweise ergibt sich aus der Wechselwirkung von AS mit genomischer DNA, wodurch eine Tripelhelix gebildet wird, die transkriptionsinaktiv sein kann.
  • Antisense-induzierte Funktionsverlust-Phänotypen, die mit der Zellentwicklung zusammenhängen, wurden für das saure Gliafibrillenprotein (glial fibrillary acidic protein, GFAP), für die Festlegung der Tektumplattenbildung beim Huhn [Galileo et al., 1991] und für das N-myc-Protein gezeigt, das für die Aufrechterhaltung der zellulären Heterogenität in neuroektodermalen Kulturen (Ephithel- gegenüber Neuroblastenzellen, die sich hinsichtlich ihrer Koloniebildungsfähigkeiten, Tumorigenität und Adhärenz unterscheiden) verantwortlich ist [Rosolen et al., 1990; Whitesell et al., 1991]. Die Hemmung des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFgF) mit mitogenen und angiogenen Eigenschaften durch Antisense-Oligonukleotide unterdrückte 80% des Wachstums in Gliomzellen [Morrison, 1991] auf sättigbare und spezifische Weise.
  • Eine Nuklease-Resistenz, wenn benötigt, wird durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren bereitgestellt, das die biologische Aktivität der Antisense-Oligodesoxynukleotide, wie sie für das Verfahren zur Verwendung und Zuführung benötigt wird, nicht behindert [Iyer et al., 1990; Radhakrishnan, et al., 1990; Eckstein, 1985; Spitzer und Eckstein, 1988; Woolf et al., 1990; Shaw et al., 1991]. Modifikationen, die an den Antisense-Oligonukleotiden vorgenommen werden können, um die Nuklease-Resistenz zu verstärken, sind u.a. eine Modifikation des Phosphor- oder Sauerstoff-Heteroatoms im Phosphatrückgrat, kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Interzucker-Bindungen oder kurzkettige heteroaromatische oder heterocyclische Interzucker-Bindungen. Dazu gehören die Herstellung von 2'-fluorierten, O-methylierten, Methylphosphonaten, Phosphorthioaten, Phosphordithioaten und Morpholino-Oligomeren. Bei einer nicht-beschränkenden Ausführungsform wird es so bereitgestellt, dass es Phosphorthioat-Bindungen aufweist, die zwischen den vier bis sechs 3'-terminalen Nukleotidbasen Verknüpfungen bereitstellen. Alternativ verbinden Phosphorthioat-Bindungen alle Nukleotidbasen. Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotide zeigen normalerweise keine signifikante Toxizität bei Konzentrationen, die wirksam sind, und zeigen ausreichende pharmakodynamische Halbwertszeiten in Tieren [Agarwal et al., 1996] und sind Nuklease-resistent. Alternativ kann die Nuklease-Resistenz dadurch bereitgestellt wird, dass eine 9 Nukleotide lange, eine Schleife bildende Sequenz am 3'-Terminus mit der Nukleotidsequenz CGCGAAGCG (SEQ ID No: 3) vorhanden ist. Die Verwendung einer Avidin-Biotin-Konjugationsreaktion kann ebenfalls für einen verbesserten Schutz von AS-ODNs gegen Serum-Nukleaseabbau verwendet werden [Boado und Pardridge, 1992]. Diesem Konzept zufolge werden die AS-ODN-Mittel an ihrem 3'-Ende monobiotinyliert. Wenn sie mit Avidin umgesetzt werden, bilden sie dichte, Nuklease-resistente Komplexe mit 6-fach verbesserter Stabilität gegenüber nicht-konjugierten ODNs.
  • Studien von anderen haben eine In-vivo-Verlängerung von AS-Oligodesoxynukleotiden gezeigt [Agarwal et al., 1991]. Dieser Vorgang, der vermutlich als Abfangmechanismus, um fremde AS-Oligonukleotide aus dem Kreislauf zu entfernen, geeignet ist, hängt von dem Vorliegen freier 3'-Termini in den angefügten Oligonukleotiden an, an denen die Verlängerung erfolgt. Daher sollte partielles Phosphorthioat, Schleifen-Schutz oder Biotin-Avidin an dieser wichtigen Position ausreichend sein, um die Stabilität dieser AS-Oligodesoxynukleotide zu gewährleisten.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch alle Analoga von oder Modifikationen an einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid, die im Wesentlichen nicht die Funktion des Oligonukleotids beeinflussen. Solche Substitutionen können zum Beispiel gewählt werden, um die zelluläre Aufnahme zu erhöhen, oder für eine erhöhte Nuklease-Resistenz, wie im Stand der Technik bekannt. Der Begriff kann auch Oligonukleotide betreffen, die zwei oder mehrere getrennte Regionen enthalten, in denen Analoga substituiert wurden.
  • Die Nukleotide können aus natürlich vorkommenden oder synthetisch modifizierten Basen ausgewählt werden. Natürlich vorkommende Basen beinhalten Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil. Modifizierte Basen der Oligonukleotide umfassen Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl-, 2-Propyl- und andere Alkyladenine, 5-Halogenuracil, 5-Halogencytosin, 6-Azacytosin und 6-Azathymin, Pseudouracil, 4-Thiouracil, 8-Halogenadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioladenin, 8- Thiolalkyladenine, 8-Hydroxyladenin und andere 8-substituierte Adenine, 8-Halogenguanine, 8-Aminoguanin, 8-Thiolguanin, 8-Thioalkylguanine, 8-Hydroxylguanin und andere substituierte Guanine, andere Aza- und Deazaadenine, andere Aza- und Deazaguanin, 5-Trifluormethyluracil und 5-Trifluorcytosin.
  • Zusätzlich können Analoga von Nukleotiden hergestellt werden, wobei die Struktur des Nukleotids grundlegend verändert wird und die als therapeutische oder experimentelle Reagenzien besser geeignet sind. Ein Beispiel für ein Nukleotidanalogon ist eine Peptidnukleinsäure (PNA), worin das Desoxyribose-(oder Ribose-)Phosphat-Rückgrat in DNA (oder RNA) durch ein Polyamid-Rückgrat ersetzt ist, das ähnlich ist wie das, das man in Peptiden findet. Es wurde gezeigt, dass PNA-Analoga resistent gegen den Abbau durch Enzyme sind und verlängerte Lebensdauern in vivo und in vitro besitzen. Ferner wurde gezeigt, dass PNAs stärker als ein DNA-Molekül an eine komplementäre DNA-Sequenz binden. Diese Beobachtung wird der fehlenden Ladungsabstoßung zwischen dem PNA-Strang und dem DNA-Strang zugeschrieben. Andere Modifikationen, die an Oligonukleotiden durchgeführt werden können, sind u.a. Polymergrundgerüste, Morpholinopolymergrundgerüste [U.S.-Patent Nr. 5,034,506], cyclische Grundgerüste, oder acyclische Grundgerüste, Zuckermimetika oder jede andere Modifikation, einschließlich derjenigen, die die Pharmakodynamik-Eigenschaften des Oligonukleotids verbessern können.
  • Das erfindungsgemäße synthetische, Nuklease-resistente Antisense-Oligodesoxynukleotid kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein Applied-Biosystems-380B-DNA-Synthesegerät verwendet werden. Die endgültige Reinheit der Oligonukleotide wird bestimmt, wie im Stand der Technik bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch eine pharmazeutische oder medizinische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein synthetisches, Nuklease- resistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid, das fähig ist, die Produktion von humaner Acetylcholinesterase im zentralen Nervensystem oder an der neuromuskulären Verbindung selektiv zu modulieren, in einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die synthetischen, Nuklease-resistenten Antisense-Oligodesoxynukleotide die SEQ ID No: 17 und 18.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Wiederherstellung einer ausgeglichenen cholinergen Signalübertragung im zentralen Nervensystem bei Patienten bereit, die einer solchen Behandlung bedürfen, wie solchen mit Defiziten im Gedächtnis und Lernen oder bei Stressstörungen und Parkinson. Das Verfahren umfasst das Verabreichen an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines synthetischen, Nuklease-resistenten AS-ODN, das fähig ist, die Produktion von humaner Acetylcholinesterase im zentralen Nervensystem selektiv zu modulieren, in einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verringerung der Ablagerung von Acetylcholinesterase in der neuromuskulären Verbindung bei Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, bereit, umfassend das Verabreichen an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines synthetischen, Nuklease-resistenten AS-ODN, das fähig ist, die Produktion von humaner Acetylcholinesterase in der neuromuskulären Verbindung selektiv zu modulieren, in einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
  • Annehmbare Träger, Excipienten sind nichttoxisch für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen und beinhalten Puffer, wie physiologisch annehmbare Puffer, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, und allgemeiner alle geeigneten Träger, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Zusammensetzungen können ferner gegebenenfalls physiologisch annehmbare Zusatzstoffe enthalten, wie Antioxidantien, Mono- und Disaccharide, salzbildende Gegenionen, wie Natrium, und/oder nichtionische oberflächenaktive Mittel. Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung werden ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Anmeldung in Betracht gezogen. Diese können semipermeable polymere Matrices in Form von geformten Gegenständen, wie Filmen und Mikrokapseln, beinhalten. Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligodesoxynukleotide und Zusammensetzungen müssen steril sein. Die Antisense-Zufuhr wurde auch unter Verwendung von Liposomen gezeigt [Juliano und Akhtar, 1992].
  • Bei einer Ausführungsform sind die synthetischen, Nuklease-resistenten Antisense-Oligodesoxynukleotide die SEQ ID No: 17 und 18.
  • Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Nuklease-resistenten Antisense-Oligodesoxynukleotid-Erfindung ist, dass sie durch einfache subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder intraperitoneale Injektion verabreicht werden können und dass ihre Wirkungen mindestens mehrere Wochen lang anhalten. Die beschränkte Toxizität der erfindungsgemäßen AS-ODNs ist von besonderer Bedeutung für ihre therapeutischen Anwendungen.
  • Das AS-ODN wird gemäß der guten medizinischen Praxis verabreicht und dosiert, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle und das Verfahren der Verabreichung, das Protokoll der Verabreichung, das Patientenalter, -geschlecht, -körpergewicht und andere, dem medizinischen Fachpersonal bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Die pharmazeutisch "wirksame Menge" für die vorliegenden Zwecke wird somit durch Überlegungen bestimmt, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Menge muss wirksam sein, damit sie die Verbesserung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Veränderungen in den Spiegeln von AChE im ZNS oder in der neuromuskulären Verbindung, oder die Verbesserung oder Beseitigung von Symptomen und anderen Indikatoren erzielt, wie sie als geeignete Maße durch den Fachmann ausgewählt werden.
  • Für die spezifische Zufuhr innerhalb des ZNS kann intrathekale Zufuhr zum Beispiel mit einem Ommaya-Reservoir verwendet werden. Das United States Patent 5,455,044 stellt die Verwendung eines Dispersionssystems für die ZNS-Zufuhr bereit, oder siehe eine Erläuterung der ZNS-Zufuhr im United States Patent 5,558,852. Zusätzlich können pharmakologische Formulierungen verabreicht werden, die die Blut-Hirn-Schranke überqueren. [Betz et al., 1994; Brem et al., 1993]. Solche Formulierungen können jetzt verfügbare Verfahren zur Produktion chimärer Moleküle nutzen, worin die vorliegende Erfindung mit einem Hirntransportvektor gekoppelt ist, der den Transport über die Schranke gestattet [Pardridge, et al., 1992; Pardridge, 1992; Bickel, et al., 1993]. Ferner haben die Anmelder in einer gleichzeitig angemeldeten United States-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 08/975,084, eingereicht am 20. Nov. 1997, die an denselben Rechtsnachfolger abgetreten wurde, gezeigt, dass ein Stress nachahmendes Induktionsmittel oder eine Stress nachahmende Behandlung die Schranke öffnet, wie die ACHE-I4-Durchlese-Splice-Variante oder das I4-Peptid oder Adrenalin oder Atropin.
  • Zur Modulation der Produktion und daher der Ablagerung der AChE an der neuromuskulären Verbindung werden AS-ODNs verwendet, die die Muskelform ansteuern. Da sie hydrophob sind, wechselwirken Antisense-Oligonukleotide im Allgemeinen gut mit Phospholipidmembranen [Akhter et al., 1991]. Nach ihrer Wechselwirkung mit der zellulären Plasmamembran werden sie aktiv in lebende Zellen mit einem sättigbaren Mechanismus transportiert [Loke et al., 1989], von dem vorhergesagt wird, dass daran spezifische Rezeptoren beteiligt sind [Yakubov et al., 1989]. Daher sind AS-ODN für die Muskelzellen verfügbar, die AChE produzieren, die an der neuromuskulären Verbindung abgelagert (dorthin transportiert, dort freigesetzt) wird.
  • Wie bei jedem Arzneimittel, erfordert das Testen der potenziellen therapeutischen Nützlichkeit von Antisense-Oligonukleotiden, die gegen Acetylcholinesterase gerichtet sind, ein geeignetes Modell, entweder in vivo, ex vivo oder in vitro. Weil Mäuse natürlicherweise eine Erkrankung, die humaner Demenz ähnelt, nicht entwickeln, haben die Anmelder ein einzigartiges transgenes Mausmodell für Alzheimer-Krankheit entwickelt, das diesem Zweck dient [Beeri et al., 1995 und die gleichzeitig angemeldete United-States-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 08/370,156, die an den gleichen Rechtsnachfolger abgetreten wurde]. Diese gentechnisch veränderten Mäuse überproduzieren humane Acetylcholinesterase in cholinergen Hirnzellen. Überschüssige Acetylcholinesterase in Hirnzellen induziert Acetylcholin-Mängel ähnlich denjenigen, von denen man annimmt, dass sie die kognitive Dysfunktion in Verbindung mit Alzheimer-Krankheit fördern. Und tatsächlich zeigen die transgenen Mäuse der Anmelder eine altersabhängige Verschlechterung der kognitiven Leistung, wie anfänglich durch einen standardisierten Schwimmtest für räumliches Lernen und Gedächtnis, einen sozialen Erkennungstest, wie hier nachstehend im Beispiel 7 beschrieben, und einen Geschmacksaversionstest gemessen wurde. Weil die überschüssige Acetylcholinesterase in den Gehirnen dieser Mäuse von humaner DNA stammt, ist sie empfänglich für Antisense-Oligonukleotide, die gegen das humane Acetylcholinesterase-Gen gerichtet sind. Dieses Tiersystem und davon stammende Gehirnschnitte liefern daher die Fähigkeit, die Anti-Acetylcholinesterase-Antisense-Technologie durch In-vivo-, Ex-vivo- und In-vitro-Mittel zu testen, um eine ausgeglichene cholinerge Signalübertragung im Gehirn wiederherzustellen und dadurch einige der beeinträchtigten kognitiven Funktionen zu lindern, an denen Patienten mit Alzheimer-Krankheit leiden, und um die Wirksamkeit einer in präsymptomatischen Stadien begonnenen Behandlung zu testen. Im Allgemeinen erfolgt ein anfängliches Screening auf die Wirksamkeit ex vivo oder in vitro, vorzugsweise an Hirnschnitten. Nach diesem Screening wird das AS-ODN hinsichtlich seiner Wirksamkeit in transgenen hACHE-Mäusen getestet. Dadurch werden geeignete Kandidaten für einen Test an Menschen bestimmt. Diese Modellsystem reagiert auch auf Tacrin auf die gleiche Weise wie Menschen (siehe Beispiele), wodurch ebenfalls seine Verwendung als Modellsystem zum Testen von AS-ODNs unterstützt wird.
  • Zum Testen von AS-ODN an myasthenischen Tieren steht das experimentelle autoimmune Myasthenia-Gravis-Modell zur Verfügung. Ferner haben die Anmelder über In-vivo-Verhaltenstests (Seilgreifen) und In-situ-Histologie (Synapsen haben MG-ähnliche Struktur) ein MG-nachahmendes Modell in transgenen Mäusen gezeigt [Andres et al, 1997], die AChE überexprimieren, das beim Testen neuer AS-ODNs verwendet werden kann.
  • Die Anmelder haben Protokolle für die In-vivo-Verabreichung von Oligonukleotiden unter Verwendung intravenöser, intraperitonealer und direkter intracerebroventrikulärer (i.c.v.) Wege etabliert. Die Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit Nukelase-resistenter Antisense-Oligonukleotide bei der Verringerung der katalytischen Aktivität von AChE im Hirngewebe transgener Mäuse. Diese Studien liefern die Basis für das Testen und Definieren therapeutisch geeigneter Formen und Dosen der Oligonukleotide in vivo.
  • Wie in den Beispielen gezeigt, wurden AS-ACHE-ODNs produziert und injiziert, die sowohl gegen humane als auch Maus-AChE-mRNA gerichtet sind (siehe Tabellen I und II). Die AS-ODNs waren Nuklease-resistent, wie angegeben.
  • Keine akuten toxischen Wirkungen wurden bei einer AS-ODN-behandelten human-transgenen Maus beobachtet, und das Verhalten schien bei allen behandelten Tieren normal. Das gegen hAChE-mRNA gerichtete AS-ODN führte zu verringerten Spiegeln sowohl der hAChE- als auch der mAChE-mRNA (2) und verringerte drastisch die Proteinspiegel bei einem von zwei Tieren. Das AS-ODN gegen mAChE-mRNA führt zu einer Verzögerung von 3 Zyklen beim Auftreten des RT-PCR-Produkts bei einem Tier (etwa 8-fache Verringerung der mRNA). Wenn 100 pmol (etwa 1 μg) AS-ODN gegen hAChE- oder mAChE-mRNA i.c.v. 15 Tage alten Mäusen zugeführt wurden, zeigten 2 von 3 Mäusen in jeder Gruppe Gesamt-AChE-Aktivitäten von > 1 S.D. unterhalb der mittleren Aktivität, die in Tieren, denen Puffer injiziert worden war, 40 Stunden nach der Injektion gemessen wurde (3).
  • Bei der Gestaltung von AS-ODNs für ACHE-mRNA in Zielzellen muss definiert werden, welches der drei in Säugern exprimierten Transkripte in diesen Zellen vorliegt. Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die für jedes der Transkripte selektiv sind, bestimmt, welche vorhanden sind und in welcher Intensität. Gewöhnlich wird das Transkript mit der höchsten Intensität im Zielgewebe ausgewählt. Wie in den Beispielen gezeigt wird, gibt es Gewebeunterschiede (siehe 4 und 5). Wie zuvor erläutert, wird die überwiegende Zentralnervensystem- und Muskel-AChE (AChE-T), die man in der neuromuskulären Verbindung (NMJ) findet, von einer mRNA codiert, die Exon E1 und die invarianten codierenden Exons E2, E3, und E4, die an das alternative Exon E6 gespleißt sind, enthält [Li et al., 1991; Ben Aziz-Aloya et al., 1993]. Wie in den Beispielen gezeigt, ist es möglich, dass ein zu einem spezifischen Exon gelenktes AS sowohl Prä- als auch Post-Splice-AChE-mRNA ansteuert. Um spezifisch die Post-Splice-AChE-mRNA anzusteuern, kann die einzigartige Splice-Verbindung der drei Formen durch das Antisense angesteuert werden (11–12), nachdem das Splicing erfolgt ist. Ein 20-mer-AS-ODN ist bevorzugt, aber andere Längen werden verwendet, die zu der einzigartigen Sequenz an der Splice-Verbindung komplementär sind. Die Antisense-Sequenzen erstrecken sich in der Regel 10 Nukleotide auf beiden Seiten der Verbindung, aber andere Bereiche auf jeder Seite können verwendet werden, solange sie die einzigartige Sequenz der Splice-Verbindung definieren. Bei einer Ausführungsform ist ein gegen die E4-E6-Verbindungssequenz gerichtetes AS-ODN (12) im Allgemeinen spezifisch für die Form des zentralen Nervensystems und der neuromuskulären Verbindung (AChE-T), wie in den Beispielen gezeigt wird.
  • Wie hier beschrieben, waren die mAS-ODNs mit Ausnahme von mAS6 und mAS7 interessanterweise gegen translatierbare Sequenzen gerichtet, die im offenen Leserahmen der ACHE-mRNA enthalten sind. mAS7, das gegen die 3'-Region von Exon 6 gerichtet ist, war signifikant weniger wirksam als diejenigen, die gegen die Sequenz gestaltet wurden, die allen alternativ gespleißten ACHE-mRNA-Transkripten gemeinsam ist. Dies ist keine allgemeine Regel; im Gegenteil wurde gezeigt, dass AS-ODNs, die gegen 3'-Regionen in anderen mRNAs gerichtet waren, die Zerstörung der gesamten mRNA-Sequenz effizient induzieren [z.B. Bennet et al., 1994]. Jedoch ist Säuger-ACHE-mRNA besonders reich an G,C-Basenpaaren (67% in humaner ACHE, Soreq et al., 1990). Daher ist sie wahrscheinlich dicht gefaltet. Weil gefunden wurde, dass eine verkürzte humane ACHE-mRNA, die nur die Exons 2, 3 und 4 trägt, in Xenopus-Embryonen translatiert werden konnte [Seidman et al., 1997], ist es möglich, dass E6-ACHE-mRNA so dicht gefaltet ist, dass eine RNaseH-Einwirkung an ihrem 3'-Exon nicht zur Zerstörung der Exons 2, 3 und 4 führt, wodurch eine mRNA verbleibt, die ein katalytisch aktives, C-terminal verkürztes Protein codiert. Daher ist ein gegen die E4-E6-Verbindungssequenz gerichtetes AS wirksam, während ein gegen die 3'-Region gerichtetes unwirksam sein kann.
  • Die vorstehende Erläuterung liefert die Tatsachenbasis für die Verwendung von AS-ODN. Die mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Verfahren und ihre Nützlichkeit können durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele und die beigefügten Figuren gezeigt werden.
  • BEISPIELE
  • ALLGEMEINE VERFAHREN
  • Allgemeine Verfahren in der Molekularbiologie: Es wurde allgemein nach im Stand der Technik bekannten molekularbiologischen Techniken vorgegangen, die nicht speziell beschrieben werden, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley und Sons, Baltimore, Md. (1989). Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde allgemein wie in PCR Protocols: A Guide To Methods und Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990) durchgeführt.
  • Reaktionen und Manipulationen, an denen andere Nukleinsäuretechniken beteiligt sind, wurden, wenn nicht anders angegeben, wie allgemein in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, und der Methodologie, wie in den United-States-Patenten 4,666,828, 4,683,202, 4,801,531, 5,192,659 und 5,272,057 beschrieben, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, durchgeführt.
  • Synthese von Antisense-Oligodesoxynukleotiden
  • Oligodesoxynukleotide wurden an einem Applied-Biosystems-380B-DNA-Synthesegerät unter Verwendung von Phosphoramiditen von der gleichen Firma nach den Angaben des Herstellers synthetisiert. Sie wurden mittels Umkehrphasen-HPLC an einem Waters-Zweipumpen-6000A-System in Kombination mit einem automatischen Waters-Gradientenregler und einem Modell-481-UV-Spektralphotometer, das bei 260 nm betrieben wurde, gereinigt, wobei die 5'-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe noch an die Oligodesoxynukleotide gebunden war. Diese wurde mittels Standardbehandlung mit 80%iger wässriger Essigsäure entfernt. Die erhaltenen Oligodesoxynukleotide wurden wiederum mittels HPLC auf ihre Reinheit überprüft.
  • Für die Nuklease-Resistenz wurden Phosphorthioatgruppen eingebaut, der Oxidationsschritt, der Iod einsetzt, wurde durch eine Umsetzung mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid ersetzt [Iyer et al., 1990]. Diese Behandlung schützt die Oligodesoxynukleotide gegen Nuklease [Eckstein, 1985; Spitzer und Eckstein, 1988] und verlängert ihre Lebensdauer in vivo [Woolf et al., 1990; Shaw et al., 1991]. Wenn ein partieller Schutz erforderlich war, wurde eine Umsetzung mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid nur für die ersten drei Schritte durchgeführt, wonach die reguläre Synthese fortgesetzt wurde. Die erhalten, partiell geschützten Oligodesoxynukleotide waren daher nur an den letzten drei Internukleotidbindungen an ihrem 3'-Terminus mit Phosphorthioatgruppen geschützt.
  • Um die Schleife einzuführen, wurde die Synthese des Oligodesoxynukleotids am 3'-Ende verlängert, um SEQ ID No: 3 einzuführen.
  • Die Antisense-Oligodesoxynukleotide wurden in einer Konzentration von 4 mM bei –20°C aufbewahrt und vor ihrer Verabreichung an Mäuse in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt.
  • BEISPIEL 1
  • ZUSAMMENFASSUNG FRÜHRER ARBEITEN MIT AS-ACHE-ODN IM HÄMATOPOETISCHEN SYSTEM
  • Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften ist das hämatopoetische System für einen Antisense-Eingriff in mehrere zelluläre und molekulare Vorgänge besonders gut geeignet. Die schnelle Proliferation und die kurze Halbwertszeit hämatopoetischer Zellen sowie die effiziente Aufnahme und Verfügbarkeit von AS-ODNs darin gehören zu den Gründen für diese effizienten Wirkungen von AS-ODNs in hämatopoetischen Zellen [Calabretta et al., 1996; Gerwirz et al, 1993].
  • Um die Rolle von AChE bei der Regulation der hämatopoetischen Zusammensetzung im Allgemeinen und der Entwicklung von Megakaryozyten (MK) im Besonderen zu untersuchen, wurden reife weibliche Mäuse in vivo mit Phosphorthioat-AS-ACHE behandelt. Um die Wirkungen dieser Behandlung zu untersuchen, wurden die differentiellen Knochenmarkszellzahlen mit einer kinetischen Verfolgung der Polymerasekettenreaktionsprodukte (RNA-PCR) in verschiedenen Geweben kombiniert [Lev-Lehman et al., 1994]. Eine In-situ-Hybridisierung mit 35S-markierten ACHE- und BCHE-cRNA-Sonden, gefolgt von computergestützter Quantifizierung der Hybridisierungsdaten, wurde dazu verwendet, die mRNA-Spiegel mit spezifischen Zelltypen zusammenzubringen. Die RNA-PCR-Analyse zeigte eine anscheinend vollständige Abwesenheit der ACHE-mRNA 12 Tage nach der Behandlung, als die Lymphozyten- und Erythroidfraktionen im Knochenmark behandelter Mäuse drastisch verringert waren. Dies impliziert ACHE sowohl bei der Entwicklung von Lymphozyten als auch Erythrozyten, zwei Zelllinien, die dieses Enzym exprimieren, und zeigt auch die Wirksamkeit der AS-ODN-Behandlung.
  • Aufgrund ihrer kleinen Anzahl und ihrer Langlebigkeit wäre es informativ, Unterschiede in der MK-Fraktion am Tag 12 zu untersuchen, weil MK immer noch Zellen aus dem Vor-Behandlungszeitraum darstellen. Die sekundäre Abnahme der Aktin-mRNA im Knochenmark, in dem MK diese mRNA-Spezies reichlich enthalten, wurde jedoch ebenfalls als Hinweis auf die Abnahme von MK verwendet. Weil angenommen wird, dass MK und erythroide Zellen einen gemeinsamen Vorläufer haben, legen diese Befunde außerdem nahe, dass diese Vorläufer gleichermaßen durch die AS-ACHE-Behandlung beeinflusst werden.
  • Lymphknoten wurden als zusätzliches Gewebe für die RT-PCR-Experimente ausgewählt, weil dieses Gewebe ähnlich wie Knochenmarkszellen einem kontinuierlichen Umsatz unterliegt. Die drastische Abnahme der Lymphknoten-ACHE-mRNA-Spiegel 12 Tage nach Behandlung zeigte eine effiziente Gewebeverteilung des verabreichten AS-ACHE-Oligos.
  • Diese Befunde zeigen vorübergehende Veränderungen in der Zusammensetzung hämatopoetischer Zellen nach der AS-ACHE-Behandlung und insbesondere – eine erhöhte myeloide Fraktion [Patinkin et al., 1990, 1994; Lev-Lehman et al., 1994].
  • Die In-vivo-Wirkungen von AS-ACHE-Oligonukleotiden bei der Erhöhung der myeloiden Fraktion im Knochenmark, wie hier vorstehend erläutert, könnte eine Ausbreitung der Vorläufer widerspiegeln, die zuerst in einer Zunahme der sich schneller entwickelnden myeloiden Zellen ersichtlich sein könnte. Zusätzlich oder alternativ könnte sie auf eine verstärkte Myeloidogenese oder eine unterdrückte Erythropoese zurückzuführen sein. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden und die Funktion des ACHE-Gens bei der Hämatopoese genauer zu untersuchen, wurde AS-ACHE ex vivo an primäre hämatopoetische Zellen verabreicht. Seine Wirkungen auf die Genexpression, die Ausbreitung von Vorläufern und die differenzelle Zellzusammensetzung an Maus-CFU-MK- und -CFU-GEMM-Kolonien wurden untersucht [Soreq et al., 1994]. Auch diese Experimente führten zu einer Zunahme in der Fraktion der myeloiden Zellen, was sowohl die Ausbreitung von Vorläufern als auch eine Zunahme in der Entwicklung ihrer Zellabkömmlinge widerspiegelt [Soreq et al., 1994].
  • Die Ex-vivo-Experimente unter Verwendung primärer Maus-Knochenmarkskulturen liefern einen zusätzlichen Vorteil gegenüber In-vivo-Experimenten dahingehend, dass die Wirkungen von Wachstumsfaktoren einzeln untersucht werden können. Zum Beispiel induziert in solchen Primärkulturen Interleukin 3 (IL-3) die Ausbreitung einer Fraktion der existierenden pluripotenten Stammzellen in multipotente Vorläufer, die sich in megakaryozytenkoloniebildende Einheiten (CFU-MK) differenzieren können, die aus Granulozyten, Megakaryozyten und Makrophagen bestehen [Patinkin et al., 1990; Lapidot-Lifson et al., 1992]. Die Zugabe von Erythropoetin und Transferrin zu IL-3 und längere Inkubationszeiten induzieren CFU-GEMM-Kolonien, die Granulozyten, erythroide Zellen, Megakaryozyten und Makrophagen enthalten. Dies impliziert, dass die Koloniezahlen die Ausbreitung und das Überleben von Vorläufern widerspiegeln, die Abkömmlinge erzeugt haben, wohingegen die Zellzahlen die Proliferationsraten widerspiegeln, und differenzielle Zellzahlen zeigen, welche Zelllinien sich entwickelten und welche zum Absterben programmiert wurden. Es ist denkbar, dass eine Störung der Expression hämatopoetisch wichtiger Gene durch AS-ODN-Mittel [Stein und Cheng, 1993] jede oder alle Eigenschaften dieser Kulturen verändern kann, und da die Anmelder AS-ODNs demonstriert haben, die zu cdc-Kinasen [Lapidot-Lifson et al., 1992) und zu dem ACHE-verwandten Gen BCHE gelenkt werden [Lapidot-Lifson et al., 1989; Soreq und Zakut, 1993], die Megakaryozytopoese in CFU-MK-Kolonien stören [Lapidot-Lifson et al., 1992; Patinkin et al., 1994; Soreq et al., 1994].
  • BEISPIEL 2
  • ZUSAMMENFASSUNG FRÜHERER ARBEITEN MIT AS-BCHE-ODN IM HÄMATOPOETISCHEN SYSTEM
  • Die Rolle von BuChE bei der Hämatopoese wurde untersucht, indem die Wirkung von AS-BCHE-ODN, das an primäre Maus-Knochenmarkskulturen verabreicht wurde, mit den für AS-ACHE-ODNs beobachteten verglichen wurden. Die Befunde zeigten eine gewisse Verstärkung der myeloiden Zellfraktionen und eine entsprechende Unterdrückung der Megakaryozytenfraktionen sowohl in CFU-MK- als auch CFU-GEMM-Kulturen, denen AS-BCHE-ODNs verabreicht wurden. Diese Erythropoetin-unabhängige Wirkung war sequenzabhängig und hing nicht mit allgemeinen apoptotischen Veränderungen zusammen. Ergänzende In-vivo-Studien zeigten eine Fortsetzung der Antisense-induzierten Zerstörung der BCHE-mRNA für mehr als 2 Wochen, keine Wirkung auf das Megakaryozyten-Überleben und eine Ex-vivo-Unterdrückung der CFU-MK-Ausbreitungsfähigkeit nach der In-vivo-Behandlung. Somit kann erwartet werden, dass AS-ACHE- und AS-BCHE-Mittel ähnliche Wirkungen auf die Megakaryozytopoese haben, obwohl sie nicht mit dem jeweiligen Ziel des anderen kreuzreagieren.
  • Um eine unspezifische Zytotoxizität der Oligonukleotide zu vermeiden, wurden partiell Phosphorthioierte verwendet, um die relevanten Oligos zu schützen, wobei nur die drei 3'-terminalen Internukleotidbindungen durch Phosphorthioatgruppen ersetzt wurden [Ehrlich et al., 1994]. Eine Demonstration eines ungestörten apoptotischen Index in den experimentellen Zellkulturen, der durch unveränderte Leitern von fragmentierter DNA nachgewiesen wurde, zeigte, dass die untersuchten Wirkungen nicht von einer unspezifischen Induktion des programmierten Zelltods herrührten. Dies legt wiederum nahe, dass die Zunahme der myeloiden Zellfraktion hauptsächlich auf die selektive Zerstörung der BCHE-Ziel-mRNA und die AS-ODNs zurückzuführen war.
  • Andere Experimente in dieser Reihe zeigten nicht-sequenzabhängige Wirkungen von AS-ODE-Mitteln über die Hämatopoese ex vivo. Sowohl in CFU-MK- als auch CFU-GEMM-Kulturen verstärkte partiell geschütztes AS-BCHE, aber nicht die sense-orientierte Sequenz S-BCHE die myeloiden und die Granulozytenzahlen und verringerte gleichzeitig die Fraktion früher Megakaryozyten. In CFU-MK-Kulturen erhöhten jedoch sequenzunabhängige Wirkungen des eingesetzten S-BCHE-Oligos die Variabilität der Koloniezahlen. Dagegen wurde die Variabilität der CFU-GEMM-Koloniezahlen unter AS-BCHE-Behandlung zusammen mit einer Unterdrückung der Megakaryozyten verringert. Diese Beobachtungen bestätigten frühere Befunde der Anmelder und weiteten sie aus [Patinkin et al., 1990; Lapidot-Lifson et al., 1992; Lev-Lehman et al., 1994; Ehrlich et al., 1994] und zeigten gleichzeitig, dass das durch AS-BCHE induzierte Abweichen von den megakaryopoetischen zu den myeloidogenen Linien Erythropoetin-unabhängig ist, dass daran Zunahmen der myeloiden Proliferation beteiligt sind und dass es auch unter In-vivo-Bedingungen auftritt. Diese Befunde zeigen auch, dass CFU-GEMM-Vorläufer auf AS-BCHE auf weniger variable Weise reagieren als CFU-MK-Vorläufer. Es kann daher erwartet werden, dass einzelne Vorläuferzellen auf spezifische AS-ODN-Mittel mit unterschiedlichen Ausmaßen an Variabilität reagieren, die sowohl von dem Oligo als auch von dem in Frage kommenden Zelltyp abhängen.
  • Ähnlich den Wirkungen von AS-ACHE, erfolgt die Unterdrückung der Megakaryozytopoese durch AS-BCHE über die gesamte Dosis-Wirkungs-Kurve der CFU-GEMM.
  • Die lange In-vivo-ex-vivo-Dauer der AS-BCHE-Wirkungen ist von besonderem Interesse. Sie zeigt, dass die AS-BCHE-induzierte Zerstörung der BCHE-mRNA in jungen Promegakaryozyten fähig war, die Entwicklung dieser Zellen für mindestens zwei Wochen zu verringern, und zeigt, dass keine Rückkopplungsreaktionen auftraten, um die BCHE-Unterdrückung zu kompensieren und die normale Produktion von Megakaryozyten wiederherzustellen.
  • Im Allgemeinen waren die AS-BCHE-Wirkungen verglichen mit den deutlichen Wirkungen, die von einer Ex-vivo- und In-vivo-Behandlung mit den parallelen AS-ACHE-ODNs, die die ACHE-Expression blockieren, beschränkt. Wie AS-BCHE, unterdrückt auch AS-ACHE die Megakaryozytenbildung. Im Gegensatz zu AS-BCHE unterdrückt es jedoch auch die Erythropoese ex vivo und in vivo [Lev-Lehman et al., 1994; Soreq et al., 1994], was nahe legt, dass Acetylcholinesterase auch am Erythropoesevorgang beteiligt ist. Außerdem induziert AS-ACHE, aber nicht AS-BCHE, eine drastische Ex-vivo-Ausbreitung der CFU-GEMM-Kolonieproliferation und der Zellproliferation und verringert die Apoptose in primären CFU-GEMM-Knochenmarkskulturen [Soreq et al., 1994]. Diese Unterschiede enthüllen Unterschiede zwischen der (den) Rolle(n), die die zwei Cholinesterasen bei der Säuger-Hämatopoese spielen. Die Entwicklung sowohl neuer Anti-Cholinesterasen als auch AS-ODN-Mittel, die gegen diese mRNAs gerichtet sind, wie in der vorliegenden Anmeldung dargelegt, berücksichtigen diese Beteiligung der Proteinprodukte dieser mRNAs an der Hämatopoese sowie ihre ganz bestimmte Rolle beim Hämatopoesevorgang.
  • BEISPIEL 3
  • AS-ODN IN MÄUSEN AN DER NEUROMUSKULÄREN VERBINDUNG
  • Eine weitere vorherrschende Stelle der ChE-Aktivitäten ist die neuromuskuläre Verbindung, an der ChEs die cholinerge Innervierung der motorischen Funktionsfähigkeit regulieren. Daher wäre es wichtig zu gewährleisten, dass unter systemischer Verabreichung eines spezifischen AS-ODN nur das gewünschte Gewebe beeinflusst wird.
  • Die In-vivo-Verabreichung eines AS-ACHE-Oligos veränderte die Hämatopoese in Mäusen, denen es injiziert wurde [Lev-Lehman et al., 1994], wie hier vorstehend in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Um diese Technologie auf eine ausgeweitete In-vivo-Verwendung anzuwenden, fragten die Anmelder, ob eine Injektion bestimmter AS-ODNs immer die Ziel-mRNA auch in anderen Geweben beeinflusst (4).
  • Fünf Wochen alten weißen Sabra-Mäusen wurden 3 Tage lange einmal pro Tag 0,2 ml PBS oder PBS, das 3'-terminal phosphorthioierte Oligodesoxynukleotide (5 μg/g Körpergewicht), die gegen das Maus-ACHE-Gen gerichtet waren, injiziert (i.p.). Zwei Antisense-(AS)-Oligonukleotide, von denen eines gegen das gemeinsame Exon E2 (mE2; Maus-E2; SEQ ID No: 8) oder das alternative hämatopoetische Exon E5 (mE5; Maus-E5; SEQ ID No: 9) gerichtet war, wurden verwendet und mit denjenigen von Sense-(S-)Oligos auf Basis der homologen humanen ACHE-Gensequenz oder Scheininjektionen mit PBS verglichen. β-Aktin-mRNA diente als Kontrolle für unspezifische Wirkungen auf die Transkription. Die Mäuse wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion getötet, und Gesamt-RNA wurden aus Muskel und Knochenmark (BM) präpariert. Eine semi-quantitative RT-PCR wurden an 100-ng RNA-Proben unter Verwendung eines Primerpaars (+1361/–1844) durchgeführt, das in den Exons E4 (+) und E6 (–) des Maus-ACHE-Gens verankert war. Zwischen den Zyklen 24 und 33 wurden alle 3 Zyklen Proben für eine Analyse entnommen. Sowohl AS-mE2 als auch AS-mE5 zeigen eine spezifische Reduktion der E6-enthaltenden ACHE-mRNA im Knochenmark, aber nicht im Muskel, bei den verabreichten Dosen, während Aktin-mRNA durch jede Behandlung unbeeinflusst war.
  • Das AS-mE2-ODN hybridisiert potenziell mit den drei alternativen Splicing-Formen der ACHE-mRNA-Transkripte, die Polypeptide codieren, die sich in ihren C-terminalen Peptidsequenzen unterscheiden (4A): die "synaptische Form" mit den Exons E2-E3-E4-E6, die "durchgelesene Form" mit den Exons E2-E3-E4-I4-E5 und die "hämatopoetische Form" mit den Exons E2-E3-E4-E5. Es wurde daher erwartet, dass AS-mE2 (eine im E2-Exon ausgewählte Antisense-Sequenz) in allen Geweben hochwirksam ist, in denen AChE exprimiert wird. Dagegen sollte AS-mE5 (eine im E5-Exon ausgewählte Antisense-Sequenz, SEQ ID No: 9) nur fähig sein, an die letzten beiden Formen zu hybridisieren, was seine potenzielle Wirksamkeit im ZNS beschränkt.
  • Es wurde eine PCR-Amplifikation (RT-PCR) auf RNA-Basis an RNA, die aus Knochenmark (BM), Muskel und Gehirn der einer Injektion unterzogenen Tiere extrahiert worden war, mit verschiedenen PCR-Primern durchgeführt. Um zu testen, ob diese AS-ODNs unspezifische toxische Wirkungen auf den Gesamt-RNA-Abbau haben, wurden eine RT-PCR mit Primern für β-Aktin eingesetzt (hinsichtlich der Primersequenzen siehe Lev-Lehman et al., 1994). Eine effektive Abnahme im Spiegel der E6-ACHE erfolgt in BM, aber nicht in Gehirn, nach der AS-mE2-ODN-Injektion verglichen mit einer subtilen Abnahme im Muskel (4B). Eine begrenztere Abnahme der E6-ACHE-mRNA wurde in Muskel und Knochenmark, aber nicht im Gehirn, von Tieren beobachtet, die mit dem AS-mE5-ODN behandelt wurden. Dies könnte Beschränkungen beim Zugang zum Gehirn sowie Hybridisierung mit dem Primärtranskript der AChE-mRNA im Kern des Muskels und von Zellen des Knochenmarks widerspiegeln, was zu seinem Abbau oder einer Hemmung des Splice-Vorgangs und des Transports in das Cytoplasma führt. Diese Ergebnisse stimmen mit der bereits erläuterten höheren Empfänglichkeit des Knochenmarks für AS-ODN überein. Somit bewirkt eine In-vivo-Verabreichung von AS-ODN nicht notwendigerweise die gleiche Wirkung in verschiedenen Geweben, die die angesteuerten Proteine exprimieren. Dies gestattet die Gestaltung spezifischer AS-ACHE-ODNs, die zu spezifischen Geweben gelenkt werden können.
  • BEISPIEL 4
  • IN-VITRO-TEST VON AS-ODNS
  • Die von Ratten-Phaeochromozytom stammende PC12-Zelllinie ist ein gut etabliertes Modell zur Untersuchung cholinerger Neuronen von Vertebraten, in dem die Differenzierung durch Nervenwachstumsfaktor (NGF) induziert werden kann. Es wird gezeigt, dass die NGF-Behandlung die Proliferation von PC12-Zellen anhält, ihr Genexpressionsmuster verändert [Lee et al., 1995] und ihre Differenzierung zu einem cholinergen Phänotyp mit erhöhter AChE-Aktivität und Neuritenähnlichen Fortsätzen induziert [Greene und Tischler, 1976; Tao-Chang et al., 1995]. Daher unterscheiden sich NGF-vorbehandelte PC12-Zellen in ihren Membraneigenschaften, in der Zellarchitektur und den Spiegeln an ACHE-mRNA signifikant von unbehandelten.
  • Diese Zellen können als Modell für das Screening auf Neurotoxizität von AS-ODNs verwendet werden, die gegen nukleolytischen Abbau geschützt wurden, und um zu bestimmen, ob es Unterschiede in den Reaktionen je nach dem Stadium der Differenzierung der Zellen gibt. Die Reihe von AS-ACHE-ODNs wurde an PC12-Zellen vor, während und nach der Induktion der Differenzierung durch NGF getestet.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Zelllinien: Ratten-Phaeochromozytom-PC12-Zellen wurden von Dr. R. Stein, Universität Tel-Aviv, zur Verfügung gestellt. Die Zellen werden in Dulbeccos-modifiziertem-Eagles-Medium gezüchtet, das mit 8% fötalem Kälberserum, 8% Pferdeserum, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin angereichert ist. Die Zellen werden bei 37°C in einer vollständig feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre bei 5% Kohlendioxid gehalten. Für die Differenzierung werden 50 ng/ml NGF (Alomone Laboratories, Jerusalem, Israel) zugegeben. Alle Gewebekulturreagenzien sind von Biological Industries (Beit Haemek, Israel).
  • Primärkulturen: Primäre Mäuseneuronenkulturen werden von embryonalen (e14) (Balb/C-) Mäuse-Gesamthirnen hergestellt. Die Gehirne werden entnommen, und die Zellen werden mittels Durchziehen durch eine Pasteurpipette mechanisch dissoziiert. Die Zellen werden in serumfreiem Medium (2,5 × 106 Zellen/ml) in Costar- (Cambridge, MA) Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (1 ml pro Vertiefung), die nacheinander mit Poly-L-Ornithin und Kulturmedium, das 10% fötales Kälberserum enthält, beschichtet werden [Weiss et al., 1986], ausplattiert. Wenn erwähnt, wird 0,5 μg/ml Actinomycin D für 72 Stunden hinzugefügt.
  • Oligonukleotide: Die AS-ODNS wurden von Microsynth (Balgach, Schweiz) synthetisiert. Die ODNs waren 20 Nukleotide lang, wobei die letzten drei 3'-Internukleotidbindungen phosphorthioiert waren. Die sieben getesteten ODNs wurden an verschiedene Stellen entlang der Maus-ACHE-mRNA-Kette gelenkt, wobei Exon-Splice-Variablen berücksichtigt wurden (SEQ ID No: 8–14). Das überwiegende Transkript im Gehirn ist dasjenige, bei dem Exon 4 an Exon 6 gespleißt ist. Die mAS-ODNs hatten die folgenden Sequenzen:
  • Experimentelle Sequenzen:
    • mAS1 (ASmE2) 5'-GGGAGAGGAGGAGGAAGAGG-3' SEQ ID No: 8
    • mAS2 5'-TAGCATCCAACACTCCTGAC-3' SEQ ID No: 10
    • mAS3 5'-CTGCAATATTTTCTTGCACC-3' SEQ ID No: 11
    • mAS4 5'-ATGAACTCGATTTCATAGCC-3' SEQ ID No: 12
    • mAS5 (ASmE5) 5'-AGAGGAGGGACAGGGCTAAG-3' SEQ ID No: 9
    • mAS6 5'-GTCGTATTATATCCCAGCCC-3' SEQ ID No: 13
    • mAS7 5'-GTGGCTGTAACAGTTTATTG-3' SEQ ID No: 14
  • Kontrollsequenzen:
    • mASB 5'-GACTTTGCTATGCAT-3' SEQ ID No: 15
    • mI-AS5 5'-GAATCGGGACAGGGAGGAGA-3' SEQ ID No: 16
  • mAS1 (Position in neuronalem Maus-Transkript 70) und mAS2 (880) befinden sich sehr nahe bei der Translationsinitiationsstelle im Exon 2. mAS3 (658) und mAS4 (1454) befinden sich in den Exons 2 und 3, die allen Splice-Variablen gemeinsam sind. mAS5 (234) ist gegen Exon 5 gerichtet; dieses besondere ODN sollte mit der alternativen E5-ACHE-mRNA, aber nicht mit reifem E6-Transkript hybridisieren. mAS6 (1932; SEQ ID No: 13) und mAS7 (2068; SEQ ID No: 14) wurden so gestaltet, dass sie mit Exon 6 hybridisieren. Kein mAS-ODN wurde für I4 gestaltet, da dessen Sequenz bei Säugern am stärksten variabel ist [Karpel et al., 1994]. Alle mAS-ODNs, ausgenommen mAS6 und mAS7, waren gegen translatierbare Sequenzen gerichtet, die im offenen Leserahmen der ACHE-mRNA enthalten sind. (siehe die schematische Position des AS-ODN im Gen in 5B).
  • Antisense-Behandlung: PC12-Zellen werden bis zu 50%iger Konfluenz (etwa 105 Zellen pro Vertiefung) in NunclonTM-(Nunc, Roskilde, Dänemark) Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Nach 24-stündiger Kultur wurden das fötale Kälberserum und das Pferdeserum jeweils auf 2% reduziert, und entweder 1 oder 10 μM ODN wurden für weitere 24 Stunden zum Kulturmedium gegeben. Bei bestimmten Experimenten wurde LipofectamineTM zusammen mit den ODN im Wesentlichen wie vom Hersteller (Gico BRL, Gaithersburg, MD) angegeben zugegeben, ausgenommen dass 1 μM ODN zusammen mit 2,5 μl LipofectamineTM pro Vertiefung verwendet wird. Kolorimetrische Messungen:
    Nach der ODN-Behandlung werden die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 1% Triton X-100 in 200 μl 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, der 0,5 mM Dithiobisnitrobenzoesäure (DTNB) enthielt, für 20 Minuten lysiert. Waschen entfernt tote Zellen, die nicht an der Oberfläche der Vertiefung haften. Um das Zellüberleben nach der AS-ODN-Behandlung zu untersuchen, wird der Gehalt an freien Thiolgruppen in diesen Zellen gemessen. Solche Gruppen reagieren mit DTNB und ergeben das gelbe Anion 5-Thio-2-nitrobenzoat, das in den gleichen Mikrotitervertiefungen anhand der Absorption bei 405 nm quantifiziert werden kann (ε405 = 13600 M-1 cm-1). Es wurde gefunden, dass diese Extinktion proportional zu der Konzentration an Zellen in jeder Vertiefung war, und sie diente als Maß für die Zellzahl (6A). Die AChE-Aktivität wurde anschließend nach Zugabe von 1 mM Acetylthiocholin zu der DTNB-Lösung in die gleichen Vertiefungen unter Verwendung einer Adaption des Ellman-Tests [Ellman et al., 1961] für die Verwendung mit Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemessen [Seidman et al., 1994]. Zum Testen von AS-ODN-AChE-Wechselwirkungen wurden ähnliche Tests mit hochreiner rekombinanter humaner AChE (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) durchgeführt, die mit den angegebenen Mengen an ODNs inkubiert wurde. RNA-Extraktion und PCR: Gesamt-RNA wurde aus Gesamthirn, embryonalen Hirnneuronen und PC12-Zellen unter Verwendung von RNazolTM (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX) extrahiert, wie andernorts ausgeführt [Karpel et al., 1994]. Eine reverse Transkription, gefolgt von PCR-Amplifikation wurde durchgeführt, wie von Karpel et al., 1994, beschrieben.
  • Die Kinetik der Akkumulation von RT-PCR-Produkten wurde durch Entnahme von 12-μl-Aliquoten in 6 abwechselnden Zyklen bei dem PCR-Verfahren untersucht. Die gesammelte DNA wird auf ethidiumbromidgefärbten Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. UV-Bilder dieser Gele werden unter Verwendung einer Charge-Coupled-Device-(CCD-)Kamera digitalisiert. Die Intensität der Fluoreszenz wird unter Verwendung des Programms IpLab Spectrum (Signal Analytics, Vienna, VA, USA) für vierfache PCR-Reaktionen quantifiziert. Die Ergebniswerte werden als Prozent der maximalen Intensität dargestellt, die zu dem Zeitpunkt erhalten wird, wenn der Kontrollsatz von PCR-Reaktionen ein Plateau erreicht. Unter idealen Bedingungen sollte die Fluoreszenzintensität über diese kinetische Verfolgung exponentiell ansteigen, mit einer vertikalen Trennung zwischen einzelnen Kurven, die von der Anfangsqualität der untersuchten mRNA abhängt. Eine lineare Regressionsanalyse relativer Fluoreszenzeinheiten gegen die Zykluszahl sollte daher ein Maß für die Menge der ursprünglich vorhandenen Matrize liefern. Wenn eine selektive mRNA-Zerstörung stattfand, sollten die Spiegel der Ziel-mRNA, aber nicht einer irrelevanten Kontroll-mRNA, vertikale Verschiebungen in den kinetischen Akkumulationskurven zeigen, die sich in unterschiedlichen Schnittpunkten mit der y-Achse äußern.
  • ERGEBNISSE
  • Die drei alternativen ACHE-mRNA-Splice-Varianten liegen in P12-Zellen mit E6 > I4 > E5 (5A) vor, einem ähnlichen Muster, wie man es sowohl in embryonalen Mäusehirnneuronen als auch adultem Mäusehirn findet.
  • Bei den hier beschriebenen Experimenten wurden die AS-ODNs mittels 3'-Phosphorthioierung geschützt. Weil das ursprüngliche ACHE-Transkript unter Bildung drei verschiedener mRNAs alternativ gespleißt werden kann, wurde bei dieser Studie die Wirksamkeit von gegen die verschiedenen reifen mRNA-Isoformen gerichteten AS-ODNs bei der Unterdrückung der Produktion der AChE in differenzierten (NGF-behandelten) und undifferenzierten Zellen untersucht.
  • Drei verschiedene Verabreichungsprotokolle wurden verwendet: undifferenzierte PC12-Zellen wurden mit 1 μM AS-ODN allein oder mit NGF für 24 Stunden behandelt, oder man ließ die NGF-induzierte Differenzierung für 24 Stunden ablaufen, bevor sie weitere 24 Stunden dem AS-ODN ausgesetzt wurden.
  • Um die Neurotoxizität zu untersuchen, wurde die Anzahl an lebenden Zellen anhand des Gehalts an freien Thiolgruppen in in situ lysierten Zellen bestimmt. Die Rate der Acetylthiocholinhydrolyse war das Maß für die AChE-Aktivität. Die Wirkungen jedes ODN auf das Zellüberleben wurden untersucht, indem die reaktiven freien Thiolgruppen in Triton-X-100-lysierten Zellen als Maß für die Zellzahl quantifiziert wurden. Diese Messung war schnell, angenehm und leicht durchzuführen; es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl der in einzelne Vertiefungen plattierten Zellen und dem Gehalt an freien Thiolgruppen in der Kultur gefunden (6A). Eine ähnliche Beziehung wurde für NGF-behandelte Zellen gefunden. Eine Verringerung der freien Thiolgruppen von > 20% wurde als Hinweis auf Toxizität angesehen. Bei einer Konzentration von 1 μM verringerte mit Ausnahme von mAS2 keines der ODNs den Gehalt an freien Thiolgruppen in den Kulturen um mehr als 5%. Es wurde jedoch eine leichte Toxizität bei einer Konzentration von 10 μM beobachtet, bei der 5 der 9 ODNs (Nr. 1, 3, 5, 6 und 7) den Gehalt an freien Thiolgruppen um 20–40% verringerten (6B).
  • Um die Aufnahme der ODNs in PC12-Zellen zu erleichtern, testeten wir reaktive Liposomen (LipofectamineTM). Unter diesen experimentellen Bedingungen schien LipofectamineTM extrem toxisch für die Zellen, insbesondere nach der Differenzierung, zu sein und verringerte ihre Anzahl auf bis zu 10% innerhalb von 24 Stunden. Daher wurde seine Verwendung ausgesetzt.
  • Die Fähigkeit dieser ODNs, die AChE-Aktivität zu unterdrücken, wurde getrennt in drei Sätzen von Wachstumsbedingungen getestet; (1) für Zellen in Abwesenheit von NGF, (2) für eine gleichzeitige Verabreichung von AS-ODNs und NGF und (3) nach 24-stündiger Differenzierung mit NGF. Tabelle III zeigt die Wirksamkeit der getesteten ODNs bei der Unterdrückung der AChE-Aktivität in verschiedenen PC12-Kulturen.
  • Die AChE-Aktivitäten in Kontroll-ODN-behandelten undifferenzierten Zellen waren um 9 und 10% niedriger als diejenigen in unbehandelten Zellen. Eines der 7 AS- ODNs, mAS3, unterdrückt die AChE-Aktivität in undifferenzierten PC12-Zellen um mehr als 20% (Ps 0,01, Student-T-Test) (Tabelle III, Spalte A). Wie erwartet, wurde eine Zunahme der spezifischen AChE-Aktivität von etwa 13% 24 Stunden nach der Zugabe von NGF beobachtet, so dass die Acetylthiocholinhydrolyse-Spiegel unter diesen Bedingungen von 7,8 auf 9,0 nmol/min/103 Zellen anstiegen. Eine gleichzeitige Verabreichung von AS-ODNs mit NGF führte zu einer variablen und doch anscheinend wirksamen (12–28%) Unterdrückung; jedoch wurde eine 16%ige Hemmung auch in den mit den Kontroll-ODNs behandelten Zellen beobachtet. Dies und die große Variabilität zwischen den Hemmwerten in verschiedenen Kulturen zeigten, dass unter diesen Bedingungen Vieles der Wirkung von AS-ODNs hauptsächlich sequenzunabhängig war.
  • Nur ein AS-ODN, mAS5, zeigte eine signifikante (28%, p ≤ 0,01), mehr als zweifache Hemmung der Kontrolle unter Bedingungen einer gleichzeitigen Behandlung (Tabelle III, Spalte B). Vierundzwanzig Stunden später stieg die AChE-Aktivität weiter auf 11,7 nmol/min/103 Zellen. Unter der Annahme von 106 Zellen pro mg Feuchtgewicht und 10% Protein entspricht dies 1,2 μmol/min/mg Protein, was erheblich höher ist als die spezifische Aktivität von 0,22 μmol/min/mg Protein für Homogenate von Mäusehirncortex, die von Berri et al. [1995] gefunden wurden. Interessanterweise wurde ein signifikanter Teil dieser Zunahme verhindert, wenn die AS-ODNs zu Zellen gegeben wurden, die 24 Stunden mit NGF vorbehandelt worden waren. In diesen Zellen unterdrückten zwei weitere AS-ODNs, mAS1 und mAS4, die AChE-Aktivitäten um mehr als 25% bzw. 36% verglichen mit einer beschränkten Unterdrückung (bis zu 11%) durch Kontroll-ODNs (p ≤ 0,01).
  • mAS3, das in undifferenzierten PC12-Zellen wirksam ist, und mAS5, das bei gleichzeitiger Verabreichung von NGF und AS-ODN wirksam ist, hemmten 21 bzw. 20% der AChE-Aktivität in NGF-vorbehandelten Zellen (Tabelle III, Spalte C). Davon war mAS3 signifikanter wirksam als mAS5 (p ≤ 0,01 gegenüber s 0,05).
  • 7 zeigt die Wirksamkeit jedes AS-ODNs als Funktion der Position seiner Zielsequenz entlang der ACHE-mRNA-Kette. Kein Muster in Bezug auf die Sequenzposition, gegen die das AS-ODN gerichtet war, und seine Wirksamkeit bei der Unterdrückung der AChE-Aktivität entweder in undifferenzierten oder in NGF-vorbehandelten Zellen innerhalb der ACHE-mRNA-Kette wurde ermittelt. Zu den inaktiven ODNs gehörten das anscheinend toxische mAS2-ODN, das die AChE-Aktivität überhaupt nicht unterdrückte, und das gegen E6 gerichtete 3'-terminale AS-ODN (mAS-7), das unter allen drei dieser Wachstumsbedingungen relativ unwirksam war. Interessanterweise war mAS5, das in gleichzeitig behandelten Zellen (Tabelle III, Spalte B) und in primären kultivierten sich differenzierenden Mäuseneuronen [Grifman et al., 1997] wirksam war, in undifferenzierten PC12-Zellen relativ unwirksam. mAS4, das die AChE-Aktivität in NGF-vorbehandelten Zellen um 36% unterdrückte, war sowohl in undifferenzierten Zellen als auch unter Bedingungen gleichzeitiger Verabreichung recht unwirksam.
  • Um die Möglichkeit zu testen, dass die Hemmung der AChE-Aktivität in AS-ODN-behandelten Zellen auf Aptamer-Wirkungen der getesteten Oligos auf die katalytische Aktivität des Enzyms zurückzuführen war, wurde die gereinigte rekombinante humane AChE für 24 Stunden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1% Rinderserumalbumin und 1 μM der entsprechenden AS-ODNs enthielt, inkubiert. Eine anschließende Messung der katalytischen Aktivitäten im Vergleich zu denjenigen von AChE-Präparationen, die nur in PBS inkubiert worden waren, zeigten, dass mAS1, mAS3, mAS4, mAS5 und mAS6 die katalytische Aktivität nicht um mehr als 3% veränderten.
  • Um ein unabhängiges Maß für die Hemmung der AChE-Expression zu erhalten, wurde Gesamt-RNA aus PC12-Zellen extrahiert, die für 24 Stunden mit NGF und dann für 24 Stunden entweder mit mAS1, mAS3, mAS4, mAS6, einem Kontroll-ODN (AS-B) oder ohne ODN vorinkubiert worden waren. Die Spiegel der AChE-mRNA in diesen Zellen wurden mittels kinetischer Verfolgung von reverser Transkription, gekoppelt an PCR-Amplifikation, untersucht (8). Diese semi-quantitative Analyse zeigte deutlich ähnliche Kinetiken (parallele Geraden in den Akkumulationsgraphen) sowie eine Abnahme in den AChE-mRNA-Spiegeln in AS-ODNs-behandelten Zellen, aber nicht in Kontrollzellen oder in mit dem Kontroll-ODN behandelten Zellen (was durch eine Rechtsverschiebung in der Akkumulationskurve widergespiegelt wird). Außerdem blieben die Aktin-mRNA-Spiegel, wenn sie der gleichen Analyse unterzogen wurden, in diesen sämtlichen Zellkulturen unverändert, was die Selektivität der ACHE-mRNA-Verringerung unter den wirksamen AS-ACHE ODNs zeigt.
  • Zusammengefasst lässt sich sagen, dass zwei von sieben AS-ODNs, die derart gestaltet waren, dass die mit Ratten-ACHE-mRNA hybridisierten, (mAS1 und mAS4) die AChE-Aktivität in PC12-Zellen, die mit NGF vorbehandelt worden waren, um mehr als 25% unterdrückten, während sie die Zellzahlen unbeeinflusst ließen. Keines davon war in undifferenzierten PC12-Zellen oder in gleichzeitig mit NGF behandelten Zellen wirksam, in denen sie die AChE-Aktivität nicht signifikant stärker als die Kontroll-ODNs unterdrückten. Diese zwei ODNs zielen auf Exons, die allen alternativ gespleißten Formen der ACHE-mRNA gemeinsam sind, ein Positionierungsfaktor, der für ihre hohen Wirksamkeiten relevant sein kann. Dagegen scheinen die beschränkte Sekundärstruktur, die für mAS3 und mAS4 durch theoretische Überlegungen vorhergesagt wird, (ΔG: = –4,7 bzw. –2,6 Kcal/mol) oder ihr niedriger G,C-Gehalt (40%) von keiner Signifikanz für ihre Antisense-Wirksamkeit zu sein, da andere AS-ODN-Mittel mit ähnlichen Eigenschaften (z.B. AS7) erheblich weniger wirksam waren. Das FOLDRNA-Programm (GCG-Softwarepaket der University of Wisconsin) zeigt, dass mAS4 eine Region mit einer relativ losen vorhergesagten Stem-Loop-Zusammensetzung ansteuert (nicht gezeigt). mAS1, das auch in NGF-vorbehandelten Zellen wirksam ist, steuert jedoch eine dicht gefaltete Stem-Region an. Zusätzlich ist nicht ersichtlich, dass die für diese 2,3 Kb und mRNA gezeichnete Struktur biologisch signifikant ist. Somit erklärt keiner der zur Charakterisierung der AS-ODNs verwendeten physikalischen Standardparameter die scheinbare Überlegenheit von mAS1 und mAS4 verglichen mit den anderen AS-ODNs.
  • Eine interessante Implikation des Beispiels ist, dass Neuronen erheblich empfänglicher für eine AS-ODN-Hemmung sind als ihre undifferenzierten Vorläufer. Diese Eigenschaft kann eine relativ effiziente Aufnahme von ODNs, eine erhöhte Aktivität von neuronaler RNaseH, eine weiter entwickelte Empfindlichkeit gegenüber (einem) bona-fide-AS-Mechanism(us/en) oder eine Kombination aller drei widerspiegeln. Die beiden ersten Möglichkeiten sind weniger wahrscheinlich, weil das Kontroll-ODN in PC12-Zellen, die mit NGF vorbehandelt worden waren oder nicht, gleichermaßen inaktiv war. Dies deutete auf keinen Unterschied in der ODN-Aufnahme oder der unspezifischen RNaseH-Aktivität. Die dritte Möglichkeit deutet wiederum auf getrennte Mechanismen für spezifische AS-ODNs, die in Neuronen in verschiedenen Differenzierungsstadien wirken. Diese Möglichkeit wird durch den Befund unterstützt, dass mAS4 in NGF-behandelten PC12-Zellen am wirksamsten war, wohingegen mAS3 in undifferenzierten PC12-Zellen am wirksamsten war. Die Wahrscheinlichkeit eines (von) AS-Mechanism(us/en) wird durch die wirksame AS-ODN-Unterdrückung in NGF-stimulierten PC12-Zellen trotz der Tatsache, dass die AChE-Spiegel in diesen Zellen signifikant anstiegen, unterstrichen. Dies kann auf verstärkte Translation zurückzuführen sein, die die Empfänglichkeit der AChE-mRNA für eine AS-ODN-vermittelte Zerstörung erhöhen kann. Ein erhöhte Stabilität der ACHE-mRNA in differenzierten Neuronen verglichen mit ihren Vorläufern sollte ebenfalls in Betracht gezogen werden, weil dies in der embryonalen P19-Neuronzelllinie gezeigt [Coleman und Taylor, 1996] und bekräftigt wurde. Verglichen mit der weniger aktiven ACHE-mRNA in undifferenzierten Neuronen kann ACHE-mRNA jedoch in differenzierten Neuronen weniger durch (ein) zelluläre(s) Protein(e) gegen einen RNAse-H-angriff geschützt sein. Schließlich kann die scheinbare Hemmung der AChE-Akkumulation in NGF-vorbehandelten Neuronen einen schnelleren Umsatz des aktiven Enzyms in diesen Zellen widerspiegeln. Daher kann AS-ODN in NGF-behandelten Neuronen aufgrund von (einem) Antisense-Mechanism(us/en), was durch eine potenziell erhöhte AChE-Produktion und einen schnelleren Umsatz in diesen Zellen unterstützt wird, und trotz des langsameren Umsatzes der ACHE-mRNA in differenzierten Neuronen wirksamer sein.
  • mAS7, das gegen die 3'-Region von Exon 6 gerichtet ist, war signifikant weniger wirksam als diejenigen, die gegen die Sequenz gestaltet wurden, die allen alternativ gespleißten ACHE-mRNA-Transkripten gemeinsam ist. Dies war der Fall in Abwesenheit von NGF, unter Bedingungen einer gleichzeitigen Behandlung und nach einer 24-stündigen Behandlung mit diesem die Differenzierung induzierenden Mittel. Dies ist keine allgemeine Regel; im Gegenteil wurde gezeigt, dass AS-ODNs gegen 3'-Regionen in anderen mRNAs effizient die Zerstörung der gesamten mRNA-Sequenz induzieren [z.B. Bennet et al., 1994]. Tatsächlich zeigte eine methodische Studie von Falkler et al. [1994] eine Wirksamkeit von ODNs, die nicht im Zusammenhang mit der Stellung ihrer Zielsequenz in der mRNA stand. Jedoch ist Säuger-ACHE-mRNA besonders reich an G,C-Basenpaaren (67% in humanem ACHE, Soreq et al., 1990). Daher ist sie wahrscheinlich dicht gefaltet. Weil gefunden wurde, dass eine verkürzte humane ACHE-mRNA, die nur die Exons 2, 3 und 4 trägt, in Xenopus-Embryonen translatiert werden konnte [Seidman et al., 1997], ist es möglich, dass E6-ACHE-mRNA so dicht gefaltet ist, dass eine RNaseH-Einwirkung an ihrem 3'-Exon nicht zur Zerstörung der Exons 2, 3 und 4 führt, wodurch eine mRNA verbleibt, die ein katalytisch aktives, C-terminal verkürztes Protein codiert.
  • Diese Befunde zeigen eine Spezifität mehrerer AS-ODNs sowohl für differenzierte Neuronen als Zielzellen als auch für ACHE-Expression, was zeigt, dass spezifische AS-ODNs dazu verwendet werden können, bei der Behandlung von Erkrankungen, die mit einer cholinergen Malfunktion einhergehen, oder bei Erkrankungen, die eine Regulation der cholinergen Expression erfordern, die AChE-Spiegel zu unterdrücken.
  • BEISPIEL 5
  • TEST VON AS-ODNS IN TRANSGENEN MÄUSEN
  • AS-ACHE-ODNs wurden produziert und injiziert, die sowohl gegen humane als auch Maus-AChE-mRNA gerichtet waren (siehe Tabellen I und II). Die AS-ODNs wurden durch eine von zwei Modifikationen geschützt: a) Phosphorthioat-Modifikation der letzten drei Nukleotide (3'-phosphorthioiert) oder b) 3'-Addition einer 9 Basen langen palindromischen Sequenz (SEQ ID No: 3), die derart gestaltet war, dass sie eine Nuklease-resistente Schleife bildete (mit 3'-Schleife versehen). Die wissenschaftliche Basis für diese Modifikationen wird von Ehrlich et al. [1994] dargelegt.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Enzymaktivitätsassays: Die Gehirnhemisphären wurden in die cortikalen und subcortikalen Regionen geteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –70°C eingefroren. Für die AChE-Aktivitätsmessungen wurden Extrakte in 10 Vol. (w/v) 10 mM Phosphatpuffer, der 1% Triton-X 100 enthielt, unter Verwendung eines Glas-Glas-Homogenisators hergestellt, für 1 Stunde auf Eis inkubiert und im Kalten für 30 Minuten in der Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die geklärten Homogenate wurden 1:10 verdünnt, und 10 μl wurden in 200 μl Endvolumen 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4), 0,5 mM Dithiobisnitrobenzoesäure, 0,1 mM Acetylthiocholin getestet. Die Proteinbestimmungen erfolgten unter Verwendung eines kommerziellen Assaykits (Promega). Ein Enzym-Antigen-Immunassay wurde unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAb 101-1) durchgeführt, um AChE humanen Ursprungs in den Homogenaten zu identifizieren.
  • RNA-Extraktion: Die Isolation von RNA erfolgte mit dem RNA-CleanTM-Verfahren (Angewandte Gentechnologic Systeme GmbH, Heidelberg, Deutschland). Proben wurden in 0,8 ml RNA-Clean homogenisiert und in Eppendorf-Röhrchen überführt. 80 μl Chloroform wurden zu den Homogenaten hinzu gegeben, und sie wurden für 5 Minuten bei 4°C aufbewahrt. Die Proben wurden dann für 15 Minuten zentrifugiert, und die wässrige Phase wurde in neue Eppendorf-Gefäße überführt. 0,4 ml Isopropanol wurden für 45 Minuten bei 4°C zugegeben. Die RNA-Niederschläge wurden später für 15 Minuten zentrifugiert und einmal mit 0,8 ml 70%igem Ethanol gewaschen.
  • RT-PCR-Amplifikation: Die RT-PCR erfolgte im Wesentlichen, wie beschrieben [Beeri et al., 1995], unter Verwendung spezifischer Primer für humane AChE und Maus-AChE, CHAT, Aktin und Synaptophysin. Die Zyklusreaktionen erfolgten bei 69°C. Die RT-PCR wurde in einem Thermocycler (GeneAmp PCR System 9600, Perkin-Elmer Cetus Corp., South San Francisco, CA) durchgeführt. Jedes Röhrchen enthielt ein Endvolumen von 10 μl, das aus 2 μl RNA-Probe, 3 μl DDW, 1 μl dNTPs (4 mM), 0, 5 μl Hexameren (2, 5 μM), 2 μl 5 × PCR-Puffer, 0,25 μl HPRI, 1 μl DDT (100 mM) und 0,25 μl RT-Enzym bestand. Nach 40 Minuten bei 37°C wurden 40 μl PCR-Reagenzien zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in den Röhrchen 50 μl betrug. Die PCR-Reagenzien bestanden aus 4 μl 10 × PCR-Puffer, 30,75 μl DDW, 2,5 μl Primer (+, 10 μM), 2,5 μl Primer (-, 10 μM) und 0,25 μl Taq-DNA-Polymerase. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden auf 1,5%igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt und nach Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Belichtung sichtbar gemacht.
  • In-vivo-Injektionen: Es wurden Protokolle für die Zufuhr von Antisense-Oligonukleotiden an transgene Mäuse in vivo auf intravenösem (i.v.; Schwanzvene), intraperitonealem (i.p.) und intracerebroventrikulärem (i.c.v) Weg entwickelt. Um die Validität dieser verschiedenen Verabreichungswege zu testen, wurden 12–15 Tage alte Mäuse verwendet, die später zum Testen früher Präventionsprotokolle verwendet werden können.
  • i.v.: 12 Wochen alte ACHE-transgene Mäuse wurden kurz unter eine Wärmelampe gesetzt, dann wurden ihnen in die Schwanzvene 5 μg/g Körpergew. Oligonukleotid in einem Volumen von 0, 1 ml in PBS injiziert, und sie wurden 18 Stunden später mittels Dekapitierung getötet. i.p.: Den Mäusen wurden 5 μg/g Körpergew. Oligonukleotid (0,5 mg/ml) intraperitoneal injiziert. Es wurden sowohl Einzelinjektions- als auch Mehrfachinjektionsprotokolle untersucht. Für mehrfache Injektionen erhielten die Tiere Injektionen in 24-stündigen Abständen für 3 Tage. Die Mäuse wurden 18 Stunden nach der letzten Injektion getötet.
  • i.c.v.: In 10–12 Tage alte ACHE-transgene Mäuse wurden in den linken Ventrikel 0,2–0,4 μl Oligonukleotid (50–200 μM) in PBS, das Evans-Blau als Marker zur Überwachung der Genauigkeit der Injektionen enthielt, i.c.v. injiziert. Für die Operation wurden die Tiere mit Ether anästhetisiert, und ein kleiner Einschnitt wurde in die Kopfhaut gemacht. Ein kleines Loch wurde mit einer hypodermalen Nadel Nr. 25 gemacht, und die Injektionen wurden unter Verwendung einer 10-μl-Hamilton-Spritze durchgeführt. Nach einem 1-2-stündigen Erholungszeitraum wurden die Mäuse wieder zur Mutter gesetzt und 18–40 Stunden nach der Injektion mittels Dekapitierung getötet. Die Gehirne wurden entnommen und das Cerebellum verworfen.
  • ERGEBNISSE: Sechs Experimente, die In-vivo-Injektionen beinhalteten, wie in Tabelle II beschrieben, wurden durchgeführt.
  • RNA (200 ng) vom Cortex von Mäusen, denen i.v. Puffer oder AS-Oligodesoxynukleotide, die gegen hACHE (AS1120, SEQ ID No: 1; AS1500, SEQ ID No: 2) oder mACHE (ASmE2, SEQ ID No: 8) gerichtet waren, injiziert worden waren, wurde einer semi-quantitativen kinetischen Verfolgung der RT-PCR-Amplifikationsprodukte, wie hier vorstehend beschrieben, unterzogen. Spezifische Primer wurden zum Nachweis der hACHE-, mACHE- oder Synaptophysin-(Syn)mRNAs eingesetzt. Das cDNA-Produkt wurde in jedem dritten Zyklus zwischen den Zyklen 21–36 entnommen, einer Gelelektrophorese unterworfen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Produkte der Zyklen 21–36 sind in 2 von links nach rechts dargestellt. Das erste Auftreten des cDNA-Produkts und/oder die Intensität von Banden wurden als Maß für die ursprüngliche mRNA-Konzentration verwendet. Man beachte bei hACHE die geringere Intensität der beiden ersten Banden (Zyklen 27, 30) in allen mit Antisense-Oligodesoxynukleotid behandelten Mäusen verglichen mit den Kontrollen, denen Puffer injiziert worden war. Man beachte bei mACHE, dass das erste Auftreten von Produkt in der ASmE2-behandelten Maus sowohl verglichen mit Mäusen, denen Puffer injiziert worden war, als auch Mäusen, denen hAS injiziert worden war, um drei Zyklen verzögert ist. Die Kontroll-Synaptophysin-mRNA-Spiegel waren in allen Proben identisch, was zeigt, dass eine annähernd gleiche Menge an RNA in jede PCR-Reaktion eingebracht worden war und dass AS-ODNs keine sequenzabhängige zelluläre Toxizität verursachten.
  • Die Spiegel der AChE-Aktivität im Cortex von Mäusen, denen Puffer oder AS-Oligodesoxynukleotide injiziert wurden, sind in der Zusammenstellung in 2 in nmol hydrolysiertes Substrat/min/μg Protein angegeben. Es gibt eine Abnahme der AChE-Aktivität im Cortex der zwei Mäuse, denen AS1500 injiziert wurde.
  • Wie in 3 gezeigt, ergaben i.c.v. injizierte Antisense-Oligonukleotide eine Verringerung der katalytische AChE-Aktivität in subcortikalen Regionen.
  • Keine akuten toxischen Wirkungen wurden in einer AS-ODN-behandelten humanen transgenen Maus beobachtet, und das Verhalten schien bei allen behandelten Tieren normal zu sein. In-vivo-Experimente wurden nur an Geschwistern durchgeführt. Gegen hAChE-mRNA gerichtetes AS-ODN führt zu verringerten Spiegeln sowohl der hAChE- als auch der mAChE-mRNAs (2) und verringerte drastisch die Proteinspiegel in einem von zwei Tieren. Das AS-ODN gegen mAChE-mRNA führte zu einer Verzögerung von 3 Zyklen beim Auftreten des RT-PCR-Produkts bei einem Tier (etwa 8-fache Verringerung der mRNA). Wenn 100 pmol (etwa 1 μg) AS-ODN gegen hAChE- oder mAChE-mRNA i.c.v. 15 Tage alten Mäusen zugeführt wurden, zeigten 2 von 3 Mäusen in jeder Gruppe Gesamt-AChE-Aktivitäten von > 1 S.D. unterhalb der mittleren Aktivität, die in Tieren, denen Puffer injiziert worden war, 40 Stunden nach der Injektion gemessen wurde (3).
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen in Kombination mit den hier nachstehenden Beispielen 7 und 8, dass das human-transgene Mausmodell ein Modell zum Testen humaner AS-ACHE-ODNs hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bereitstellt.
  • BEISPIEL 6
  • CORTICO-HIPPOCAMPALE GEHIRNSCHNITTE EIGNEN SICH ALS EX-VIVO-SYSTEM ZUR UNTERSUCHUNG DER EFFIZIENZ VON ANTI-ACHE-ODNS IN SÄUGERHIRN
  • Für das erste Stadium bei der Entwicklung von Antisense-(AS-)Oligodesoxynukleotid-(ODN-)-Therapien, die gegen das humane ACHE-Gen im Gehirn gerichtet sind, ist es wesentlich, dass man über ein schnelles und einfaches Modell für das Screening von Kandidaten-ODNs in einer heterogenen Population von Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) von Säugern verfügt. Zu diesem Zweck etablierten die Anmelder ein Assaysystem unter Verwendung von cortico-hippocampalen Gehirnschnitten von Mäusen, einschließlich transgenen Mäusen, die das humane ACHE-Gen tragen, zusammen mit elektrophysiologischen, biochemischen und molekularen Analysen.
  • Bei diesem Assay können 400 μM Mäusehirnschnitte in vitro mindestens 11 Stunden gehalten werden, wonach intakte, PCR-amplifizierbare RNA und katalytisch aktives AChE-Protein präpariert werden können. Außerdem sind die Gehirnschnitte zugänglich für cytohistochemische Analysen, einschließlich In-situ-Hybridisierung, cytochemischer Aktivität und immunhistochemischer Färbung, um die genaue Lokalisierung der AChE-mRNA- und Proteinexpression in verschiedenen Hirnregionen zu bestimmen. Unter Verwendung dieses Systems haben die Anmelder gezeigt, dass die Applikation verschiedener Acetylcholinesterase-(AChE-)Inhibitoren, einschließlich Tacrin (THA, Tetrahydroaminoacridin, Cognex®) – dem ersten von der FDA zugelassenen Arzneimittel gegen Alzheimer-Krankheit (AD) – eine 2-fache Erhöhung der AChE-Aktivität induziert, der erhöhte Spiegel einer spezifischen, AChE-codierenden Boten-RNA vorausgehen. Diese Erhöhung der AChE-Aktivität ging mit erhöhter neuronaler Erregbarkeit einher und ist von Veränderungen in der Expression zusätzlicher Gene begleitet, die bei der neuronalen Aktivität wichtig sind.
  • Somit bietet im Vergleich zu Zellkultursystemen das cortico-hippocampale Hirnschnittsystem ein geeignetes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Wirksamkeit und Wirkungsweise von Antisense-Oligonukleotiden, die gegen AChE-mRNA gerichtet sind, an primären ZNS-Neuronen im Kontext ihrer natürlichen umgebenden Gewebe, wobei viele native cholinerge Signalübertragungswege zumindest teilweise intakt gehalten werden. Der hauptsächliche Vorteil dieses Ansatzes gegenüber In-vivo-Studien ist, dass er die technischen Beschränkungen überwindet, die durch die Blut-Hirn-Schranke auferlegt werden, indem er einen direkten Zugang zum Hirngewebe für die Verabreichung von Arzneimitteln erleichtert. Außerdem gestattet er die Durchführung mehrfacher experimenteller Analysen an Geweben, die aus einer einzigen Maus extrahiert wurden, was die Anzahl an Tieren, die für diese Forschung getötet werden, drastisch verringert.
  • Verfahren: Für die Herstellung von Hirnschnitten wurden Mäuse mit Nembutal (60 mg/kg) anästhesiert und dekapitiert. Die Gehirne wurden in eiskalten NSR-Puffer (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl2; pH 7,4) entnommen, der kontinuierlich mit 95% O2/5% CO2 belüftet wurde. Vibrotomschnitte (400 μm) wurden hergestellt und in belüftetem NSR-Puffer bei Raumtemperatur aufbewahrt. Man ließ die Schnitte mindestens 1 Stunde lang ungestört liegen, bevor weitere Manipulationen durchgeführt wurden. Die Schnitte wurden in einzeln belüftete Flaschen überführt, wobei mindestens 2,5 ml Puffer pro 2 Schnitten belassen wurden und die Konzentration an KCl auf 8 mM erhöht wurde, um die Zellen vor der Zugabe der Inhibitoren zu hyperpolarisieren.
  • Ergebnisse: Transkriptionsregulierte Abschaltung der cholinergen Neurotransmission nach cholinerger Hyperaktivierung: Während einer akuten Stressreaktion sind die zentralen cholinergen Übertragungswege vollständig aktiviert. Um die molekularen Folgen von cholinerger Hyperaktivierung zu untersuchen, unterzogen wir normale FVB/N-Mäuse einem erzwungenen Schwimmstress-Protokoll oder setzten cortico-hippocampale Hirnschnitte Cholinesterase-Inhibitoren aus und suchten nach damit einhergehenden Veränderungen in der Genexpression im Hirn. Sowohl der Stress in vivo als auch die AChE-Hemmung in vitro stimulierten schnelle und spezifische Zunahmen der "durchgelesenen" AChE-mRNA, die eine lösliche hydrophile AChE mit potentiell größerer interzellulärer Zugänglichkeit als die herkömmliche synaptische Form des Enzyms codiert.
  • In-situ-Hybridisierung enthüllte "durchgelesene" AChE-mRNA-Transkripte in Zellkörpern und apikalen Fortsätzen pyramidaler Neuronen in den corticalen Schichten 2, 3, 4 und 5 in Gehirnschnitten von Mäusen, denen das Anti-AChE Pyridostigmin injiziert worden war, verglichen mit der schwächeren, beschränkteren Markierung in Zellkörpern, die in Neuronen der Schicht 2 und Schicht 5 der Kontrollen lokalisiert waren. Erhöhte AChE-mRNA-Spiegel induzierten bis zu 3-fach verstärkte Spiegel des katalytisch aktiven Enzyms im Hippocampus und im Cortex, aber nicht im Cerebellum, innerhalb von 5 Stunden. Die durch Stress verstärkte AChE-Aktivität war durch eine erhöhte Heterogenität und eine insgesamt schnellere Wanderung bei der nicht-denaturierenden Gelelektrophorese gekennzeichnet. Dagegen stimulierten sowohl Stress als auch Hemmung der AChE ausgeprägte Verringerungen der ChAT-mRNA-Spiegel, was nahe legt, dass ein bimodaler Mechanismus, der eine unterdrückte Acetylcholin-Synthese und ein verstärkte Acetylcholin-Hydrolyse umfasst, die Abschaltung der cholinergen Neurotransmission nach akuter Hyperaktivierung bewirkt. Obwohl beide Behandlungen zu erhöhten c-fos-mRNA-Spiegeln führten, die neuronale Erregbarkeit anzeigen, wurden keine Veränderungen in den Synaptophysin-mRNA-Spiegeln beobachtet, was die Selektivität dieser "cholinergen" Rückkopplungsantwort zeigt. In mit AChE-Inhibitoren behandelten Gehirnschnitten wurden erhöhte neuronale Erregbarkeit, Paar-Impuls-Erleichterung und mRNA-Veränderungen sowohl durch BAPTA-AM als auch Tetrodotoxin blockiert, was zeigt, dass diese Vorgänge durch Erhöhungen des intrazellulären Ca++- und/oder Na+-Einstroms vermittelt werden.
  • Diese Experimente zeigen die Eignung des Hirnschnittsystems zur Überwachung von Veränderungen in der ACHE-Genexpression und die Nützlichkeit der ACHE- transgenen Mäuse als neues Modell zur Untersuchung der Wirksamkeit von AS-ACHE-ODNs.
  • Tacrin-induzierte Erhöhung der AChE-Expression: Tacrin ist ein starker reversibler AChE-Inhibitor, der die kognitiven Symptome bei 30–50% der schwach bis mäßig betroffenen Patienten lindert. Die Beobachtung, dass irreversible Inhibitoren, wie DFP oder Pyridostigmin, dauernde Veränderungen in der Expression von Genen, die mit cholinergen Übertragungswegen zusammenhängen, einschließlich Rückkopplungswegen, die die AChE-Spiegel erhöhen, induzieren, legte nahe, dass Tacrin ähnliche Reaktionen induzieren kann. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde Tacrin in einer Konzentration von 5 × 10-7 M 75–90 Minuten lang auf Hirnschnitte angewendet, und die AChE-Aktivität wurde in Detergenzextrakten untersucht. Unter diesen Bedingungen wurden AChE-Aktivitäten beobachtet, die 26–186% höher waren als die in unbehandelten Kontrollschnitten gemessenen.
  • Diese Beobachtungen untersteichen die Nützlichkeit cortico-hippocampaler Hirnschnitte bei der Untersuchung der AChE-Genexpression und stellen die Verwendung von Tacrin in Studien der Wirksamkeit von gegen AChE-mRNA gerichteten Antisense-Oligonukleotiden bei der Unterdrückung der AChE-Biosynthese in einem empfindlichen Modell mit kurzem Zeitrahmen bereit. Außerdem unterstreichen sie die Wichtigkeit, Alternativen zum derzeitigen Cholinesterase-Inhibitor-Ansatz zur Behandlung von AD zu finden.
  • BEISPIEL 7
  • MANGELHAFTE LEISTUNG HACHE-TRANSGENER MÄUSE IN GEDÄCHTNISTESTS AUF DER BASIS VON SOZIALER ERKUNDUNG ODER GESCHMACK
  • Soziale Erkundung:
  • Die Anmelder haben zuvor eine gestörte Leistung transgener FVB/N-Mäuse, die humane Acetylcholinesterase (AChE) in cholinergen Hirnneuronen exprimieren, im Morris-Wasserlabyrinthtest für räumliches Lernen und Gedächtnis gezeigt [Beeri et al., 1995]. Obwohl einen Monat alte transgene Mäuse eine ähnliche Leistung zeigen wie Kontrollmäuse, wird eine fortschreitende Verschlechterung der Leistung transgener Mäuse bis zum Alter von 6–8 Monaten beobachtet, einem Zeitpunkt, an dem sie Schwierigkeiten haben, die Aufgabe überhaupt zu lösen. Zusammen mit neuropathologischen Analysen [Beeri et al., eingereicht] scheinen diese Befunde ein chronisches cholinerges Ungleichgewicht darzustellen, das zu spät einsetzenden, fortschreitenden kognitiven Defizienzen führt – ein neues Modell für die cholinergen Störungen in Verbindung mit Alzheimer-Krankheit. Neuere Studien enthüllten jedoch schwerwiegende visuelle Störungen bei AChE-transgenen Mäusen ab einem Alter von etwa zwei Wochen. Weil die Leistung im Morris-Wasserlabyrinth wahrscheinlich hauptsächlich auf visuellen Gründen beruht, war es wichtig, zusätzliche Studien unter Verwendung eines Lernen/Gedächtnis-Paradigmas durchzuführen, das keine intakten visuellen Netzwerke zur Validierung des Modells erfordert.
  • Der experimentelle Ansatz: Zur Untersuchung der fortschreitenden kognitiven Defizite, die bei AChE-transgenen Mäusen beobachtet wurden, durch einen Ansatz, der von der visuellen Funktion unabhängig ist, wurde das Verhalten dieser Mäuse in einem Test der sozialen Erkundung beobachtet. Der Test beinhaltet das Aussetzen einer adulten, entweder transgenen oder Kontroll-, Maus einem unbekannten Jungtier. Dies leitet eine olfaktorische Schnüffelreaktion ein, die etwa 240 Sekunden lang dauert. Wenn die junge Maus entfernt und dann unmittelbar wieder präsentiert wird (zweite Präsentation), verkürzt sich der Schnüffelzeitraum auf etwa 80 Sekunden. Dies ist ein Test des Arbeitsgedächtnisses, der bei Transgenen und Kontrollen ähnlich erfolgt. Wenn bei der zweiten Präsentation eine andere junge Maus eingesetzt wird, wird sie etwa 200 Sekunden lang beschnüffelt, was eine klare Unterscheidung zwischen der Erkundung von "gleich" und "anders" zeigt.
  • Zehn Minuten später benötigt eine adulte Kontrollmaus 150 Sekunden, um die Erkennung zu bestätigen. Nach 20 Minuten benötigt sie 200 Sekunden, und nach 30 Minuten wiederholt sie das gesamte Ritual, als ob sie diese gleiche Maus überhaupt nicht kennen würde. Bei den transgenen Mäusen wird "gleich" sogar nach einer verstrichenen Zeit von nur 10 Minuten als "anders" behandelt, was eine klare Störung bei diesem Verhalten zeigt (9A).
  • Wirkung von Tacrin
  • Von diesem Kurzzeitverhalten ist in der Literatur beschrieben, dass es von cholinergen Übertragungswegen abhängt, und es unterstreicht, dass Cholinesterase-Inhibitoren das Erkundungsgedächtnis verlängern. Wie im Beispiel 6 gezeigt, induzierte Tacrin eine Erhöhung der AChE-Expression, und unter Verwendung dieses Tests wurde die Wirkung von Tacrin auf hAChE-transgene Mäuse getestet. Wie in 9B gezeigt, dehnte eine i.p.-Injektion von 1 mg/ml Tacrin das Kurzzeitgedächtnis bei jungen (6 Wochen alten) transgenen Mäusen auf 20 Minuten aus.
  • Dieses Beispiel liefert zusätzliche Daten, dass hAChE-transgene Mäuse tatsächlich an fortschreitenden kognitiven Defiziten leiden, die zu (einer) cholinergen Malfunktion(en) zurückverfolgt werden können, die zumindest teilweise für eine gewisse Zeit auf eine Anti-Cholinesterase-Therapie anspricht (ansprechen). Weiterhin liefert der soziale Erkundungstest einen relativ einfachen schnellen Test, um die Wirksamkeit von Anti-Cholinesterase-Therapien, einschließlich gegen humane AChE-mRNA gerichteter Antisense-Oligonukleotide, zu untersuchen.
  • Geschmacksaversionsgedächtnis
  • Im Gegensatz zum sozialen Erkundungstest ist der Geschmacksaversionstest so gestaltet, dass er zwischen Mängeln beim Lernen und Langzeitgedächtnis unterscheiden kann. Gruppen von nicht-transgenen und transgenen Mäusen (10 Mäuse pro Gruppe), den Kontrollen wurde Kochsalzlösung injiziert, wurden erstellt. Man ließ die Mäuse 20 Stunden lang dürsten, und dann wurde ihnen erlaubt, mit Saccharin gesüßtes Wasser zu trinken. Die Maus trank ein Volumen von 2 ml (etwa 10% ihres Körpergewichts). Dreißig Minuten später wird ihnen eine Übelkeit hervorrufende Lithiumchloridlösung injiziert. Nach 3 Tagen wurden sie hinsichtlich Lernen und Kurzzeitgedächtnis mit Aussetzen gegenüber Saccharin getestet. Gewöhnlich tranken die Mäuse nur 1,2 ml, d.h. sie lernten und erinnerten sich, dass der süße Geschmack Übelkeit hervorruft. Die Mäuse erhielten dann eine zweite Konditionierung mit Lithiumchlorid. Bis zu diesem Punkt reagierten sowohl die Kontroll- als auch die transgenen Mäuse gleich (10).
  • Um das Langzeitgedächtnis zu testen, erhielten die Mäuse einmal wöchentlich für mehrere Wochen nach dem anfänglichen Aussetzen und der anfänglichen Konditionierung Saccharin-Wasser (aber kein Lithium). Die Kontrollmäuse tranken weiter wochenlang weniger, was ein Langzeitgedächtnis anzeigte. Die Transgenen vergaßen jedoch allmählich und kehrten in weniger als einem Monat zum Trinken des gesamten Volumens zurück (10).
  • Die Bezugsgedächtnisfunktion, die erforderlich ist, um die Geschmacksaversionserfahrung zu stabilisieren, hängt von der cholinergen Funktion ab, die bei transgenen Mäusen gestört ist.
  • BEISPIEL 8
  • WIRKUNG VON AS-ODN AUF TRANSGENE MÄUSE IM SOZIALEN ERKUNDUNGSTEST
  • Eine Untersuchung von gegen AChE-mRNA gerichteten 2-O-Methyl-AS-ODNs zur Förderung einer verbesserten Leistung der ACHE-transgenen Mäuse im Lern- und Gedächtnistest der sozialen Erkundung und zur Korrelation von Veränderungen im Verhalten mit Modulationen in den AChE-Protein- und/oder -RNA-Spiegeln. Das Experiment wurde zweimal mit den gleichen Ergebnissen wiederholt. Es folgen die Ergebnisse von einem repräsentativen Experiment.
  • VERFAHREN:
  • Kanülierung: Kanülen wurden 5 Monate alten HpACHE-Mäusen stereotaktisch in einen Ventrikel etwa 2 Wochen vor dem Experiment implantiert, und sie wurden während des Erholungszeitraums einzeln gehalten.
  • Oligonukleotide und In-Vivo-Verabreichung: 5 mM 2-O-Methyl- (die letzten drei 3'-Nukleotide) Oligonukleotide, die gegen murine AChE (ASmACHE3-Me; mAS3; SEQ ID No: 11) oder BuChE (ASmBCHE-Me; mASB) gerichtet waren, wurden mit 13 mM des lipophilen Transfektionsmittels DOTAP (Boehringer Mannheim) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vereinigt und vor der ersten Injektion 15 Minuten bei 37°C inkubiert. 1 μl (25 ng) ODN wurde icv über einen Zeitraum von 1–2 Minuten 2 Mal in Abständen von 24 Stunden infundiert. Die Mäuse wurden dem sozialen Erkundungstest unterzogen und 24 Stunden nach der letzten ODN-Verabreichung getötet.
  • Sequenzen:
    • mAS3: 5'-CTGCAATATTTTCTTGCACC-3' (20 mer; SEQ ID No: 11)
    • mASB: 5'-GACTTTGCTATGCAT-3' (15 mer; SEQ ID No: 15)
  • Sozialer Erkundungstest: Die Mäuse wurden 4 Minuten lang zusammen mit einem unbekannten Jungtier in einen Käfig mit einer Glasvorderplatte gesetzt, und die Zeiten, die von der adulten Maus in den Erkundungskontakt mit dem Jungtier investiert wurden, wurden von einem Beobachter notiert. Am Ende des "Grundlinien"-Tests wurde das Jungtier aus dem Käfig genommen. Zehn Minuten später wurde das gleiche Jungtier wieder in den Käfig gesetzt, und die Erkundungszeit wurde aufgezeichnet ("Test"). Das Verhältnis von Test-:Basiszeit wurde durch das "Leistungsverhältnis" (performance ratio, PR) bestimmt. PR < 1 steht für "Lernen und Gedächtnis".
  • Kanülierte Mäuse wurden 24 Stunden vor der ersten Verabreichung von ODN (PR1) und 24 Stunden nach der letzten Verabreichung (PR2) in der sozialen Erkundung untersucht. PR2:PR1 wurde als Maß für Oligonukleotid-induzierte Verbesserungen bei Lernen und/oder Gedächtnis verwendet.
  • Biochemie: Die Tiere wurden mittels Zervixdislokation getötet, die Gehirne wurden entfernt; Hippocampus und Cortex wurden von jeder Hemisphäre abgeschnitten, auf Trockeneis eingefroren und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt. Niedrigsalz-Detergenzextrakte wurden in kaltem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4), der 1% Triton X-100 (1:9 w/v) enthielt, hergestellt und unter Verwendung eines kolorimetrischen Assays auf Basis der Hydrolyse von Acetylthiocholin (1 mM) auf die AChE-Aktivität getestet (siehe hier vorstehend, Ellman et al, 1961). Die Proteinbestimmung erfolgte unter Verwendung des detergenzkompatiblen (DC) Kits von Biorad, das auf dem Lowry-Test basiert.
  • ERGEBNISSE:
  • Die Tabellen 4 (experimentell) und 5 (Kontrolle) zeigen die Ergebnisse. Die AChE-transgenen Mäuse, die an fortschreitenden kognitiven Defiziten leiden (siehe Beispiel 7), die zu (einer) cholinergen Malfunktion(en) zurückverfolgt werden können, die zumindest teilweise auf eine Anti-Cholinesterase-Therapie anspricht (ansprechen). Wie ersichtlich ist, verbesserte das AS-ODN der SEQ ID No: 3 die Leistungen bei den transgenen Mäusen. Ein Anti-AChE-ASODN kann nach 48 Stunden Verabreichung ein verbessertes Lernen fördern. ODN-vermittelte Modulationen der AChE-Proteinspiegel sind innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung reversibel.
  • In dieser gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen, einschließlich United-States-Patenten, durch Zitate oder Nummer Bezug genommen. Die vollständigen Zitate für die Veröffentlichungen sind nachstehend aufgelistet. Die vollinhaltlichen Offenbarungen dieser Veröffentlichungen und Patente beschreiben vollständiger den Stand der Technik, zu dem diese Erfindung gehört.
  • Die Erfindung wurde auf veranschaulichende Weise beschrieben, und es sollte selbstverständlich sein, dass die Terminologie, die verwendet wurde, die Art von Worten der Beschreibung und nicht der Beschränkung haben soll.
  • Offensichtlich sind im Hinblick auf die vorstehenden Lehren viele Modifikationen und Varianten der vorliegenden Erfindung möglich. Es sollte daher selbstverständlich sein, dass innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders ausgeführt werden kann, als spezifisch beschrieben.
  • Figure 00660001
  • TABELLE 2
    Figure 00670001
  • TABELLE III
    Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
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Claims (10)

  1. Synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid, weiches fähig ist, die Produktion der E1-E2-E3-E4-E6 Splice-Variante von humaner Acetyicholinesterase (AchE), weiche überwiegend im zentralen Nervensystem und/oder im Muskel exprimiert wird, selektiv zu modulieren.
  2. Synthetisches, Nukleaseresistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Oligodesoxynukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5' TCTGTGTTATAGCCCAGCCC 3' SEQ ID No: 17, und 5' GGCCTGTAACAGTTTATTT 3' SEQ ID No: 18.
  3. Synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-OHgodesoxynukleotid nach einem der Ansprüche I und 2, welches Phosphorothioat-Bindungen, die die vier 3'-terminalen Nukleotidbasen verbinden, aufweist, urn Nuklease-Resistenz zu bewirken.
  4. Synthetisches, Nuklease-resistentes Antrsense-Oligodesoxynukleotid nach einem der Ansprüche 1 und 2, welches am 3'-Terminus eine eine Schielfe bildende Sequenz von 9 Nukleotiden mit der Nukleotidsequenz CGCGAAGCG (SEQ ID No: 3) aufweist, urn Nuklease-Resistenz zu bewirken.
  5. Synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid nach einem der Anspruche 1 und 2, worm das Nukleotid, für eine Resistenz gegenüber Nuklease, O-rnethyhert ist.
  6. Synthetisches, Nuklease-resistentes Antisense-Oligodesoxynukleotid nach einem der Ansprüche I und 2, worm das Nukleotid, für eine Resistenz gegenüber Nuklease, fluoriert ist. 2
  7. Pharmazeutisohe oder medizinische Zusammensetzung, die ats Wirkstoff mindestens em synthetisohes, Nuklease-resistentes AntisenseOligodesoxynukleotid nach den Ansprüchen I bis 6 in einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
  8. Verwendung eines synthetischen, Nuktease-resistenten AntisenseQhgodesoxynukleotids nach den Anspruchen 1 bis 6, zur Herstellung eines Medikaments zur selektiven Modulierung der Produktion von humaner Acetyicholinesterase im zentraten Nervensystem.
  9. Verwendung mindestens eines synthetischen, Nukiease-resistenten AntisenseOtigodesoxynukleotids nach den AnsprOchen I bis 6, zur Herstellung eines Medikaments zur Wiederherstellung einer ausgeglichenen cholinergen Signalübertragung im Gehirn,
  10. Verwendung mindestens eines synthetischen, Nuklease-resistenten AntisenseOligodesoxynukleotids nach den Anspruchen I bis 6, zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Abtagerung von Acetyicholinesterase in den neuromuskulären Verbindungen.
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