DE69733944T2 - Vmp-ähnliche sequenzen von pathogener borrelia - Google Patents

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Description

  • 1.0 HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1.1 Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie; insbesondere immunogene Zusammensetzungen und rekombinante VMP-ähnliche Gene, bedeutsam für die Behandlung und Diagnose der Lyme-Krankheit. Auch eingeschlossen sind Verfahren zur Bestimmung von Viruleszenzfaktoren der Lyme-Krankheit.
  • 1.2 Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Lyme-Krankheit ist eine bakterielle Infektion, welche durch pathogene Spirochäten des Genus Borrelia verursacht wird. Die Infektion kann in Menschen, Hunden, Rotwild, Mäusen und anderen Tieren auftreten und wird durch Gliederfüßler-Vektoren übertragen, in erster Linie durch Zecken vom Genus Ixodes. Borellia burgdorferi, der am meisten übliche Verursacher der Lyme-Krankheit in Nordamerika wurde zuerst 1982 kultiviert. B. garinii und B. afzelii sind die am meisten üblichen infektiösen Überträger der Lyme-Krankheit in Europa und eine weitere Spezies, B. japonicum, wurde in Japan beschrieben. Diese Organismen sind stark verwandt und verursachen ähnliche Manifestationen mit multiplen Stadien: einen expandierenden Ausschlag an der Stelle des Zeckenbisses (Erythema migrans); Fieber, Lymphadenopathie, Ermüdung und Unpässlichkeit; Effekte verbreiteter Infektion, einschließend Carditis, Meningoradiculitis und Polyarthritis; sowie chronische Manifestationen einschließend Arthritis und neurologische Erkrankungen. Die Lyme-Krankheit ist oft schwierig zu diagnostizieren, da sie Manifestationen mit anderen Erkrankungen teilt und sie kann refraktär gegenüber Behandlung während den Spätstadien der Erkrankung sein. Sie ist am häufigsten üblich in Gegenden wie z.B. suburbanen Regionen des Hinterlandes von New York und Connecticut, wo große Populationen von Rotwild und weißfüßigen Mäusen als prinzipielle Säugetier-Wirte und Reservoire der Infektion dienen. Etwa 10.000 Fälle der Lyme-Krankheit im Menschen werden in den Vereinigten Staaten pro Jahr verzeichnet, und sie stellt auch aufgrund der hohen Infektionsrate von Hunden und anderen domestizierten Tieren in endemischen Regionen ein signifikantes veterinäres Problem dar.
  • B. burgdorferi, der ethologische Erreger der Lyme-Krankheit ist in der Lage, für Jahre in Patienten oder Tieren zu überleben, trotz des Vorliegens einer aktiven Immunantwort (Steer, 1989; Schutzer, 1992). Antigene Variation wurde bereits früher als ein Mechanismus postuliert, wobei B. burgdorferi die Immunantwort in dem Säugetier-Wirt umgeht (Schwan et al., 1991; Wilske et al., 1992). Antigene Variation wurde definiert als Veränderungen in der Struktur oder der Expression von antigenen Proteinen, welche während der Infektion in einer Häufigkeit auftritt, welche größer ist als die übliche Mutationsrate (Bost und Geaves, 1987; Robertson und Meyer, 1992; Seifert und So, 1988).
  • Rezidivierendes Fieber ist eine weitere Erkrankung, welche durch pathogene Borrelia verursacht wird. Sie hat sowohl epidemische als auch endemische Formen. Die epidemische Form wird verursacht durch B. recurrentis und wird übertragen zwischen Menschen über Läuse. Sie war eine hauptsächliche Ursache der Morbidität und Mortalität während des ersten Weltkriegs, ist seither jedoch selten aufgetreten, hauptsächlich aufgrund der öffentlichen Gesundheits-Maßnahmen. Endemisches rezidivierendes Fieber ist eine epizotische Infektion, welche durch verschiedene Borrelia-Spezies verursacht wird, einschließend B. hermesii. Es tritt sporadisch auf unter Jägern, Höhlenforschern und anderen, die in Kontakt mit infizierten weichkörperartigen Gliederfüßlern des Genus Ornithidorus kommen. Rezidivierendes Fieber wird charakterisiert durch zwei oder mehrere Episoden oder "Rückfälle" von hoher Bakteremie (bis zu 108/ml). Die erste Welle der Infektion wird verursacht durch Borreliae, welche ein bestimmtes variables hauptsächliches Protein (VMP, Variable Major Protein) auf ihrer Oberfläche exprimieren (beispielsweise Vmp21). Das Gen, welches dieses VMP kodiert, ist an der Promotorstelle in dem Expressionsplasmid lokalisiert, wohingegen über 24 nicht-exprimierte Kopien verschiedener VMP-Gene im sogenannten ruhenden Plasmid vorliegen. Wenn der Wirt Antikörper gegen das exprimierte VMP entwickelt, werden die Organismen dieses Stereotyps zerstört, und es geht dem Patienten besser. Jedoch, ein kleiner Anteil der Organismen hat eine antigene Veränderung in Richtung eines anderen Stereotyps vorgenommen. Nicht reziprokale Rekombination tritt zwischen dem Expressionsplasmid und dem ruhenden Plasmid auf, was in einer Insertion eines anderen VMP-Gens an der Expressionsstelle resultiert (beispielsweise Vmp7). Die Organismen, welche Vmp7 exprimieren, werden nicht durch die Anti-Vmp21-Antikörper beeinträchtigt und vermehren sich Wirt und verursachen eine zweite Episode der Erkrankung. Bis zu fünf von diesen 3–5-tätigen Episoden können auftreten, getrennt von 1–2-wöchigen Intervallen.
  • Solche gut abgegrenzten Episoden der Infektion treten nicht während der Lyme-Krankheit auf und wenige Organismen liegen im Blut und den Geweben zu jeglichem Stadium vor.
  • Jedoch gibt es Gründe anzunehmen, dass ähnliche Mechanismen der antigenen Variation bei B. burgdorferi und anderen Lyme-Krankheits-Borrelias auftreten. Die Infektion, falls sie nicht behandelt wird, dauert im Allgemeinen über Monate bis Jahre an, trotz des Auftretens von Wirts-Antikörpern und zellulären Antworten; diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Immunantwort effektiv umgangen wird. Lyme-Krankheit kann zu Lähmungen führen (insbesondere in ihrer chronischen Form), folglich besteht ein Bedürfnis für eine effektive therapeutische und prophylaktische Behandlung.
  • Bestimmte B. burgdorferi-Gene und -Proteine wurden patentiert, einschließend dem äußeren Oberflächenprotein D (Outer Surface Protein D, OspD) (US-Patent Nr. 5,246,844; veröffentlicht 21. September 1993). OspD konnte bislang nicht als bedeutsames Protein für Diagnose oder Immunoprotektion gezeigt werden. Andere Proteine, einschließend OspA und OspC wurden als Vakzinkandidaten für die Lyme-Krankheit in Erwägung gezogen, einschließend ein rekombinantes OspA-Vakzin, das sich derzeit in menschlichen klinischen Phasen befindet. Andere Vakzine sind in Gebrauch oder werden Tests in veterinärmedizinischen Anwendungen unterzogen, einschließend der Impfung von Hunden. Jedoch zeigen Tieruntersuchungen, dass OspA-Impfungen nicht effektiv gegen alle Stämme der Lyme-Krankheit erzeugenden Borreliae sind. OspA ist nicht bedeutsam für die Immunodiagnose aufgrund der schwachen Antikörperantwort auf OspA in Patienten, welche an Lyme-Krankheit leiden.
  • Frühere Studien haben im Allgemeinen keinen Beweis erbringen können für das Auftreten einer antigenen Variation bei der Lyme-Krankheit Borrelia. Genetische Heterogenität in den Genen, welche die Membranlipoproteine OspA, OspB, OspC und OspD kodieren, wurden gut dokumentiert unter den Stämmen der Lyme-Krankheit-Borreliae (Marconi et al., 1993; Marconi et al., 1994; Livey et al., 1995). Darüber hinaus wurden Mutationen in OspA und OspB als in vitro auftretend gezeigt (Roa et al., 1992; Sadziene et al., 1992). Jedoch wurde keine signifikante antigene Veränderung (Barthold 1993) oder brutto-genetische Veränderung (Persing et al., 1994; Stevenson et al., 1994) in B. burgdorferi N40-Isolaten von chronisch infizierten BALB/c- und C3H-Mäusen nachgewiesen, im Gegensatz zum Verlust des 38 Kilobasen (kb) Plasmids, welches OspD kodiert. Folglich scheint die Heterogenität in den Osp-Proteinen beobachtet unter B. burgdorferi sensu lato Isolaten eine evolutionäre Divergenz ("antigene drift") darzustellen, anstelle einer antigenen Variation.
  • Es besteht ein kommerzieller Bedarf für Vakzine und diagnostische Kits für die Lyme-Krankheit, sowohl für menschliche als auch tiermedizinische Anwendungen. Verschiede ne Firmen betreiben aktive Forschung sowie Entwicklungsprogramme auf diesen Gebieten.
  • 2.0 ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Partielle und vollständige DNA-Sequenzen wurden bestimmt für mehrere rekombinante Klone, enthaltend DNA, kodierend VMP-artige Sequenzen. Die Identifikation und Charakterisierung dieser Sequenzen erlaubt nun Folgendes: (1) die Identifikation des exprimierten Gens (der exprimierten Gene) in B. burgdorferi; (2) die Expression dieses Gens (dieser Gene) durch einen rekombinanten Vektor in einem Wirtsorganismus wie z.B. E. coli; (3) die Immunisierung von Labor-Tieren mit dem resultierenden Polypeptid sowie die Bestimmung der schützenden Aktivitäten gegen B. burgdorferi Infektion; (4) die Verwendung der Antikörper gegen das exprimierte Protein, um das reaktive Polypeptid (die reaktiven Polypeptide) in B. burgdorferi Zellen zu identifizieren; (5) die Verwendung des exprimierten Proteins (der exprimierten Proteine), um Antikörperantworten in infizierten Menschen und Tieren nachzuweisen; (6) die Bestimmung des Vorliegens von Sequenzunterschieden sowie der Expression der VMP-artigen DNA-Sequenzen in anderen Lyme-Krankheit-Borreliae.
  • Diese Erfindung wird als bedeutsam in der Immunoprophylaxe, der Diagnose oder der Behandlung von Lyme-Krankheit, rezidivierendem Fieber oder verwandten Krankheiten in Menschen oder Tieren betrachtet. Es steht zu erwarten, dass rekombinante oder native Proteine, exprimiert durch die VMP-artigen Gene (oder Teile davon) bedeutsam für (a) die Immunoprophylaxe gegen Lyme-Krankheit, rezidivierendes Fieber oder verwandte Erkrankungen in Menschen und Tieren sein werden; (b) für die Immunotherapie der existierenden Lyme-Krankheit, rezidivierendes Fieber oder verwandte Erkrankungen mit Hilfe der Immunisierung durch Injektion von Antikörpern, gerichtet gegen VMP-artige Proteine; und (c) für die Immunodiagnose der Lyme-Krankheit, rezidivierendes Fieber oder verwandte Erkrankungen, einschließend ihre Verwendung in Kits, in welchen die VMP-artigen Proteine das einzige Antigen oder eines von multiplen Antigenen darstellen. Die DNA kann eingesetzt werden in: (a) der Produktion von rekombinanten DNA-Plasmiden oder anderer Vektoren, welche in der Lage sind, rekombinante Polypeptide zu exprimieren; und (b) dem Design und der Implementation von Nukleinsäuresonden oder Oligonukleotiden zum Nachweis und/oder zur Amplifikation von VMP-artigen Sequenzen. Von letztgenannten erwartet man, dass sie Anwendung in der Diagnose der Infektion mit Borrelia-Organismen zeigen.
  • Ähnliche Sequenzen in B. burgdorferi und anderen Lyme-Krankheits-Borrelias wurden bislang nicht berichtet, wie durch BLAST-Suchen der derzeitigen Nukleotid- und Aminosäure-Datenbanken bestimmt wurde, einschließend Genbank, der EMBL DNA Database und der Swiss Protein Database. Obwohl eine gewisse Ähnlichkeit zwischen den deduzierten B. burgdorferi-Aminosäuresequenzen mit früher publizierten B. hermsii VMP-deduzierten Aminosäure-Sequenzen auftritt, ist der Grad der Identität bzw. Ähnlichkeit nur ungefähr 30% bzw. ungefähr 50%. Vom äußeren Oberflächen-Protein C (OspC) der Lyme-Krankheits-Organismen wurde bereits berichtet, dass sie Sequenz-Ähnlichkeiten mit VMPs aufweisen, jedoch die höchste Ähnlichkeit besteht mit einer anderen Subgruppe von VMPs und nicht den hier berichteten Sequenzen (Carter et al., 1994). VMP-artige Sequenzen wie z.B. diejenigen enthalten in pJRZ53-31 zeigen einen geringen Grad der Homologie mit OspC von einigen Lyme-Krankheits-Organsimen (beispielsweise B. burgdorferi 2591), wie durch den BLAST Homologie-Score von 60 und einer Wahrscheinlichkeit von 0,0013 angezeigt wird. Folglich sind die B. burgdorferi VMP-artigen DNA-Sequenzen einzigartig, obwohl sie eine offensichtliche evolutionäre Beziehung mit anderen Borrelia-Genen aufweisen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist das Verfahren zum Identifizieren von möglichen Viruleszenz-Faktoren. Dieser Ansatz bringt die subtraktive Hybridisierung von Target-DNA von hochinfizierten Organismen mit Driver-DNA von weniger infektiösen Stämmen oder Klonen mit sich. Diese Prozedur liefert in starkem Maße Bereicherungen für Sequenzen, welche zwischen hoch- und niedrig-infektiven Stämmen unterschiedlich sind und folglich Proteine kodieren können, welche wichtig in der Viruleszenz sind. Von besonderer Bedeutung ist die Verwendung von nahe verwandten isogenen Klonen, welche in ihrer Infektivität unterschiedlich sind; in diesem Fall sollen die DNA-Unterschiede stringenter auf diejenigen begrenzt werden, die mit Infektivität in Beziehung stehen.
  • Offene Leserahmen in einem B. burgdorferi Plasmid, welche hypothetische Proteine kodieren, welche dem VMP-Protein der rezidivierenden Fieber-Organismen ähneln, wurden nun identifiziert. Die Erfinder haben herausgefunden, dass das Vorliegen des Plasmids, welches diese VMP-artigen Sequenzen in B. burgdorferi Klonen, enthält, stark mit der Infektivität korreliert. Es ist folglich wahrscheinlich, dass die Proteine, welche durch diese VMP-artigen Sequenzen kodiert werden, bedeutsam in der Immunoprotektion sowie der Pathogenese sind. Proteine, kodiert durch die VMP-artigen Sequenzen von B. burgdorferi können Protektion verleihen, wenn sie entweder allein oder in Kombination mit anderen Antigenen verwendet werden. Sie können auch bedeutsam in der Immunodiagnose sein.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid kodiert durch eine Nukleinsäure resultierend aus der genetischen Rekombination eines Borrelia-Gen-Segments vls2–vls16, wobei besagtes Segment weiterhin definiert ist, so dass es eine Sequenz von Position 712 bis 1293, Position 1294 bis 1869, Position 1870 bis 2439, Position 2440 bis 3009, Position 3010 bis 3483, Position 3484 bis 3990, Position 3991 bis 4548, Position 4549 bis 5058, Position 5059 bis 5652, Position 4653 bis 6219, Position 6220 bis 6789, Position 6846 bis 7373, Position 7274 bis 7946, oder Position 7947 bis 8000 von SEQ ID Nr. 3 oder eine Wiederholungs(Repeat-)-Gen-Sequenz von Position 1293 bis 1309, Position 1869 bis 1885, Position 2439 bis 2456, Position 3009 bis 3025, Position 3483 bis 3499, Position 3990 bis 4006, Position 4548 bis 4557, Position 5058 bis 5074, Position 5652 bis 5668, Position 6219 bis 6253, Position 6789 bis 6805, Position 7373 bis 7389 oder Position 7946 bis 7962 von SEQ ID Nr. 3 umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid ein Polypeptid kodiert durch irgendeines der Borrelia-Gen-Segmente vls2–vls16, wobei besagtes Polypeptid kodiert wird durch eine Nukleinsäure umfassend eine Sequenz von Position 712 bis 1293, Position 1294 bis 1869, Position 1870 bis 2439, Position 2440 bis 3009, Position 3010 bis 3483, Position 3484 bis 3990, Position 3991 bis 4548, Position 4549 bis 5058, Position 5059 bis 5652, Position 4653 bis 6219, Position 6220 bis 6789, Position 6846 bis 7373, Position 7274 bis 7946, oder Position 7947 bis 8000 von SEQ ID Nr. 3, oder wobei besagtes Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, welche eine Wiederholungs(Repeat-)-Gen-Sequenz von Position 1293 bis 1309, Position 1869 bis 1885, Position 2439 bis 2456, Position 3009 bis 3025, Position 3483 bis 3499, Position 3990 bis 4006, Position 4548 bis 4557, Position 5058 bis 5074, Position 5652 bis 5668, Position 6219 bis 6253, Position 6789 bis 6805, Position 7373 bis 7389 oder Position 7946 bis 7962 von SEQ ID Nr. 3 umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte Nukleinsäure, umfassend
    • (a) die Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder
    • (b) das Komplement von (a) oder
    • (c) 20 zusammenhängende Basen von SEQ ID Nr. 1, welche in der Lage sind, mit dem Komplement der Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren, oder
    • (d) das Komplement von (c), welches in der Lage ist, mit einer Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren.
  • Bevorzugte Ausführungsform davon schließen Nukleinsäure-Segmente, vorzugsweise DNA- oder RNA-Segmente ein, welche 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID Nr. 1 oder ein Komplement davon umfassen, Nukleinsäure-Segmente einschließlich des gesamten offenen Leserahmens von VMP-artigen Sequenzen; Nukleinsäure-Segmente, wobei besagte Segmente 500, 1000, 2000, 5000 oder 8000 Basen lang sind; Nukleinsäure-Segmente, welche für immunogene Peptidsequenzen kodieren, welche zwischen 70 und 80% oder mehr bevorzugt zwischen 85% und 90%; oder noch mehr bevorzugt zwischen 90 und 95 und 99% aller Aminosäuren aufweisen, welche identisch mit SEQ ID Nr. 2 sind; DNA-Segmente, welche immunogenes Peptid von 8 bis 20, 20 bis 80 oder von ungefähr 50 bis ungefähr 150 Aminosäuren an Länge, von ungefähr 100 bis ungefähr 200 Aminosäuren an Länge oder von ungefähr 100 bis 400 Aminosäuren an Länge kodieren; eine rekombinante B. burgdorferi- oder E. coli-Zelle enthaltend die DNA kodierend die VMP-artigen Sequenzen; Verfahren zum Herstellen von transformierten bakteriellen Wirtszellen unter Verwendung der DNA, kodierend die immunogenen Polypeptide; Verfahren, welche das Plasmid oder den Vektor verwenden, um die bakteriellen Wirtszellen zu transformieren, um B. burgdorferi-Polypeptide kodiert durch die DNA-Sequenzen zu exprimieren; Zusammensetzungen zur Anwendung in der Immunisierung von Menschen und Tieren mit nativen B. burgdorferi-Polypeptiden oder Polypeptiden exprimiert durch rekombinante Zellen, welche DNA einschließen, die immunogene Polypeptide kodiert. Verfahren zum Identifizieren von potenziellen Viruleszenzfaktoren unter Verwendung subtraktiver Hybridisierung zwischen Target-DNA von hochinfektiösen Zellen und Driver-DNA von niedriginfektiösen Zellen werden demonstriert.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein isoliertes immunogenes Polypeptid mit zumindest 85% Homologie zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, welche spezifisch mit Antikörpern bindet, welche gegen ein Polypeptid erzeugt wurden mit zumindest der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.
  • Noch eine weitere Ausführungsform ist ein Antikörper, welcher spezifisch an ein immunogenes Polypeptid bindet, das durch eine Nukleinsäure der Erfindung kodiert wird, welches in der Lage ist, spezifisch an Antikörper zu binden, welche gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das zumindest die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist.
  • Noch eine weitere Ausführungsform ist ein Vakzin zum Schutz gegen Borrelia-Infektion umfassend eines der Polypeptide der Erfindung.
  • Auch ein Verfahren zum Assaying auf Borrelia-Infektion unter Verwendung der Antikörper der Erfindung zur Identifizierung der Borrelia-Infektion durch immunogenes Binden an ein Polypeptid erhalten aus einer Probe eines Subjekts sowie ein Verfahren zur Diagnose der Lyme-Krankheit, umfassend das Identifizieren einer Nukleinsäure, eines Polypeptids oder eines Antikörpers der Erfindung in einer klinischen Probe sind Ausführungsformen der Erfindung und gleiches gilt für einen korrespondierenden Kit wie beansprucht.
  • 2.1 Zusammensetzungen zur Behandlung
  • Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Erkenntnis, dass Borellia VMP-ähnliche Sequenzen an der vls-Stelle rekombinieren, mit dem Ergebnis, dass antigene Variation virtuell unbegrenzt ist. Multiklonale Populationen können folglich in einem infizierten Patienten existieren, so dass immunologische Abwehrmechanismen stark auf die Probe gestellt werden, falls sie nicht total überwältigt werden. Folglich besteht nun die Möglichkeit, effizientere Kombinationen von Immunogenen zu entwickeln zum Schutz gegen Borellia-Infektionen oder als präventive Inokulationen wie z.B. in der Form von Cocktails von multiplen antigenen Varianten, basierend auf einer Basis-Serie von kombinatorischen VMP-ähnlichen Antigenen.
  • VMP-ähnliche Proteinpräparationen können in verschiedenen Arten verabreicht werden, entweder lokal oder systemisch in pharmazeutisch akzeptablen Formulierungen. Mengen geeignet zur Verabreichung werden auf individueller Basis bestimmt, abhängend von solchen Faktoren wie Alter und Geschlecht des Subjekts, wie auch physischer Zustand und Gewicht. Solche Bestimmungen liegen gut innerhalb den Fähigkeiten von praktizierenden Ärzten auf dem medizinischen Gebiet.
  • Andere Arten der Verabreichungen können Injektion von Borellia VMP-ähnlichen DNAs in Vakzinempfänger (Mensch oder Tier), gesteuert durch einen geeigneten Promotor wie z.B. CMV (sog. DNA-Vakzine) einschließen. Solche Präparationen sind zur Injektion direkt in Läsionen oder werden im Patienten zur systemischen Immunisierung transplantiert. DNA Impfungs-Techniken sind derzeit weit über das ursprüngliche anfängliche Entwicklungsstadium hinaus und haben sich vielversprechend als Form von Impf-Strategien gezeigt.
  • 2.2 VMP-ähnliche Gene
  • Rekombinante Proteine und Polypeptide, kodiert durch isolierte DNA-Segmente und Gene werden oft mit dem Präfix "r" für rekombinant bezeichnet. Als solches werden DNA- Segmente, welche rVMPs oder rVMP-verwandte Gene kodieren, als besonders bedeutsam in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung betrachtet. Irgendein rekombinantes vls, welches mit irgendeiner der vlsE Expressionsstellen-Loki und/oder ruhenden vls Kassetten (vls2–vls16) Genen kombiniert, würde ebenfalls sehr bedeutsam für die Verfahren der vorliegenden Erfindung sein.
  • Die Isolation der DNA, welche VMP-Polypeptide kodiert, ermöglicht es einem, Verfahren, welche dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind und wie sie hier beschrieben werden, einzusetzen, um Veränderungen in den Kodons für spezifische Aminosäuren durchzuführen, so dass die Kodons "bevorzugt Verwendung findende"-Kodons für eine gegebene Spezies darstellen. Folglich werden bevorzugte Kodons signifikant für bakterielle Spezies im Vergleich mit Säuger-Spezies variieren; jedoch gibt es selbst unter verwandten Spezies Präferenzen. Unten dargestellt ist eine bevorzugte menschliche Kodonverwendungstabelle. Die Isolierung von Spirochät-DNA kodierend VMP wird die Substitutionen an Stelle von bevorzugten menschlichen Kodons ermöglichen, obwohl das exprimierte Polypeptid-Produkt von menschlicher DNA homolog mit bakteriellem VMP sein dürfte und man folglich erwarten würde, das es strukturell und funktionell äquivalent zu VMP, isoliert von einem Spirochäten ist. Jedoch können Substitutionen von bevorzugten menschlichen Kodons die Expression in einem menschlichen Wirt verbessern, und dadurch die Effizienz von potenziellen DNA-Vakzinen steigern. Tabelle 1 Homo sapiens
    Figure 00100001
    kodierend GC 52.96%; 1. Buchstabe GC 55.98%; 2. Buchstabe GC 42.29%; 3. Buchstabe GC 60.60%
    • a Total 4489120
    • υb = Frequenz pro 1000
  • Die Definition eines "VMP-artigen Gens", "VMP-verwandten Gens", wie hier verwendet, bezeichnet ein Gen, welches unter relativ stringenten (d.h. hoch stringenten Bedingungen) Hybridisierungsbedingungen (siehe beispielsweise Maniatis et al., 1982) mit DNA-Sequenzen hybridisiert, von denen derzeit bekannt ist, dass sie verwandte Gensequenzen einschließen. Nukleinsäure-Segment-Ausführungsformen der Erfindung werden oben definiert.
  • Um ein VMP-artiges Gen-Segment oder eine cDNA herzustellen, kann man den Lehren wie hier offenbart folgen und auch den Lehren von irgendwelchen Patenten oder wissenschaftlichen Dokumenten, auf welche hier verwiesen wird. Mann kann ein rVMP- oder andere verwandte kodierende DNA-Segmente unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken erhalten, wie z.B. der Polymerasekettenreaktion (PCRTM) oder des Screenens einer cDNA- oder genomischen Bibliothek unter Verwendung von Primern oder Proben mit Sequenzen basierend auf der oben genannten Nukleotidsequenz. Solche Fragmente können fertig hergestellt werden, beispielsweise durch direkte Synthese des Fragments mit chemischen Mitteln, durch Anwendung einer Nukleinsäure-Reproduktions-Technologie wie z.B. der PCRTM-Technologie der US-Patente 4,683,195 und 4,683,202. Die Realisierung dieser Techniken ist eine Angelegenheit reiner Routine für die Fachleute auf dem Gebiet, wie dies von verschiedenen wissenschaftlichen Texten gelehrt wird (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989), hier eingeschlossen per Verweis. Bestimmte Dokumente beschreiben des Weiteren speziell geeignete Säugetier-Expressions-Vektoren (beispielsweise US-Patent 5,168,050, hier per Verweis eingeschlossen). Die VMP-Gene und DNA-Segmente, welche insbesondere bevorzugt sind zur Anwendung in bestimmten Aspekten der vorliegenden Verfahren, sind diejenigen, welche VMP- und VMP-verwandte Polypeptide kodieren.
  • Es ist auch beabsichtigt, dass man andere zusätzliche Gene oder cDNAs klonieren kann, welche ein VMP- oder VMP-verwandtes Peptid, Protein oder (immunogenes) Polypeptid kodieren. Techniken zum Klonieren von DNA-Molekülen, d.h. zum Erhalten einer spezifisch kodierenden Sequenz aus einer DNA-Bibliothek, welche verschieden von anderen Teilen an DNA ist, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch Screenen einer geeigneten DNA-Bibliothek, welche sich auf das Klonieren eines vls-Gens wie z.B. von der variablen Region dieses Genes bezieht. Die Screen-Prozedur kann auf der Hybridisierung von Oligonukleotid-Sonden basieren, welche nach Betrachtung von Teilen der Aminosäuresequenz von bekannten DNA-Sequenzen, welche verwandte Borellia-Proteine kodieren, konzipiert worden sind. Die Durchführung solcher Screening-Protokolle sind Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt und sie werden im Detail beschrieben in der wissenschaftlichen Literatur, beispielsweise siehe Sambrook et al., 1989.
  • Techniken zum Einbringen von Veränderungen in Nukleotidsequenzen, welche konzipiert sind, funktionelle Eigenschaften der kodierten Proteine oder Polypeptide zu verändern, sind im Stand der Technik wohl bekannt, beispielsweise in US-Patent 4,518,584, wobei die Techniken auch im weiteren Detail hier beschrieben werden. Solche Modifikationen schließen ein Deletion, Insertion oder Substitution von Basen und folglich Veränderungen in der Aminosäuresequenz. Veränderungen können durchgeführt werden, um die VMP-Aktivitäten eines Proteins zu verbessern, die biologische Stabilität oder Halbwertszeit zu verbessern, das Glykosylierungsmuster zu verändern und dergleichen. Alle solchen Modifikationen für Nukleotidsequenzen sind von dieser Erfindung eingeschlossen.
  • 2.3 VMP-kodierende DNA-Segmente
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in einem allgemeinen und übergreifenden Sinn auch die Isolation und Charakterisierung von neuen vls-Gensegmenten, welche kombinatorische Mosaike von exprimierten und ruhenden Regionen des vls-Gens kodieren. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein aufgereinigtes Nukleinsäure-Segment, welches ein Protein kodiert, das zumindest eine partielle Aminosäure-Sequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr. 2 aufweist. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein aufgereinigtes Nukleinsäure-Segment, des Weiteren definiert als eines, welches Nukleinsäure-Sequenzen in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 enthält.
  • In einer noch bevorzugteren Ausführungsform besteht das aufgereinigte Nukleinsäure-Segment essentiell aus der Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 ihrem Komplement oder degenerierten Varianten davon. Wie hier verwendet, werden der Begriff "Nukleinsäure-Segment" und "DNA-Segment" austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein DNA-Molekül, welches frei aus totaler genomischen DNA einer speziellen Spezies isoliert worden ist. Folglich bezieht sich ein "aufgereinigte" DNA- oder Nukleinsäure-Segment, wie hier verwendet, auf ein DNA-Segment, welches eine VMP-kodierende Sequenz enthält, die bereits isoliert worden ist von oder aufgereinigt ist und frei ist von der gesamten genomischen DNA, beispielsweise von der gesamten cDNA oder Borellia-genomischen DNA. Enthalten innerhalb der Bezeichnung "DNA-Segment" sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente, wie z.B. Segmente und auch rekombinante Vektoren, einschließend beispielsweise Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren und dergleichen.
  • In ähnlicher Art und Weise bezieht sich ein DNA-Segment umfassend ein isoliertes oder aufgereinigtes vls-Gen auf ein DNA-Segment, welches VMP-verwandte kodierende Sequenzen enthält, welche substantiell isoliert worden sind aus anderen natürlich vorkommenden Genen oder Protein kodierenden Sequenzen. In dieser Hinsicht wird der Begriff "Gen" verwendet, aus Gründen der Einfachheit, um sich auf ein funktionelles Protein, Polypeptid oder eine Peptid kodierende Einheit zu beziehen. Wie die Fachleute auf dem Gebiet verstehen werden, schließt dieser funktionelle Begriff sowohl genomische Sequenzen, cDNA-Sequenzen oder Kombinationen davon ein. "Isoliert substantiell aus anderen kodierenden Sequenzen" bedeutet, dass das Gen von Interesse, in diesem Fall vls, den signifikanten Teil der kodierenden Region des DNA-Segments ausbildet und, dass das DNA-Segment keine großen Teile von natürlich-vorkommender kodierender DNA enthält, wie z.B. große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder DNA kodierend Regionen. Selbstverständlich bezieht sich dies auf das DNA-Segment, wie ursprünglich isoliert, und schließt nicht Gene oder kodierende Regionen aus, die später zum Segment durch Menschenhand hinzugefügt wurden, noch sind andere Abschnitte oder benachbarte Sequenzen von den natürlich vorkommender DNA ausgeschlossen.
  • In besonderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche DNA-Sequenzen einbringen, welche ein VMP-artiges Protein kodieren, das innerhalb seiner Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr. 2 enthält.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein aufgereinigtes Nukleinsäure-Fragment, welches ein Protein in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr. 2 kodiert und des Weiteren definiert ist als ein rekombinanter Vektor. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "rekombinanter Vektor" auf einen Vektor, welcher so modifiziert worden ist, dass er ein Nukleinsäure-Segment enthält, welches ein VMP-Protein kodiert oder ein Fragment davon. Der rekombinante Vektor kann des Weiteren als ein Expressionsvektor definiert sein, welcher einen Promotor umfasst, der operativ an besagtes VMP-kodierendes Nukleinsäure-Segment geknüpft ist.
  • Eine des Weiteren bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, rekombinant erzeugt mit einem rekombinanten Vektor umfassend ein vls-Gen. Die rekombinante Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "erzeugte" oder "rekombinante" Zelle intentional auf eine Zelle, in welche ein rekombinantes Gen, wie z.B. ein Gen, das VMP kodiert, eingebracht worden ist. Folg lich sind erzeugte Zellen unterscheidbar von natürlich vorkommenden Zellen, welche kein rekombinant eingebrachtes Gen enthalten. Erzeugte Zellen sind folglich Zellen, welche ein Gen enthalten oder Gene, welche durch Menschenhand eingebracht worden sind. Rekombinant erzeugte Gene werden entweder in der Form einer Kopie eines genomischen Gens oder eines cDNA-Gens vorliegen oder werden Gene enthalten, welche benachbart zu einem Promotor positioniert sind, der nicht natürlicherweise mit dem speziell eingebrachten Gen assoziiert ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche ein Protein oder Peptid kodieren, das in seiner Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz essentiell wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt, enthält. Natürlicherweise sind dort, wo das DNA-Segment oder der Vektor ein immunogenes Volllängen-Polypeptid kodieren oder für die Anwendung beim Exprimieren des immunogenen Polypeptids gedacht sind, die am meisten bevorzugten Sequenzen diejenigen, welche essentiell wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt sind. Es wird festgehalten, dass SEQ ID Nr. 2 das Volllängen-Protein, kodiert durch das vls-Gen, repräsentiert und dass beabsichtigte Ausführungsformen Sequenzen bis hin zu der Volllängen-Sequenz wie auch funktionelle Varianten davon einschließen.
  • Die Bezeichnung "Sequenz essentiell wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt" bedeutet, dass die Sequenz substantiell mit einem Teil von SEQ ID Nr. 2 korrespondiert und relativ wenig Aminosäuren aufweist, die nicht identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder kein biologisch funktionelles Äquivalent der Aminosäure von SEQ ID Nr. 2 sind. Der Begriff "biologisch funktionelles Äquivalent" wird auf dem Fachgebiet gut verstanden und des Weiteren im Detail hier definiert als ein Gen, welches essentiell die selbe Sequenz wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, aufweist, und das assoziiert ist mit einem vls-Gen in der Borellia-Familie. Dementsprechend werden Sequenzen, welche zwischen ungefähr 70% und ungefähr 80% oder mehr bevorzugt zwischen ungefähr 85% und ungefähr 90% oder noch mehr bevorzugt zwischen ungefähr 90 und 95% und ungefähr 99% der Aminosäuren aufweisen, die identisch oder funktionell äquivalent mit den Aminosäuren von SEQ ID Nr. 2 sind, Sequenzen sein, welche "essentiell wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt" sind.
  • In bestimmten anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche innerhalb ihrer Sequenz eine Nukleinsäure-Sequenz einschließen, welche essentiell wie in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist. Der Begriff "essentiell wie in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 dargestellt" wird verwendet im gleichen Sinne wie oben beschrieben und bedeutet, dass die Nukleinsäure-Sequenz sub stantiell mit einem Teil von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 korrespondiert und relativ wenige Kodons aufweist, die nicht identisch sind oder funktionell äquivalent mit den Kodons von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3. Der Begriff "funktionell äquivalentes Kodon" wird hier verwendet, so dass es sich auf Kodons bezieht, welche die gleiche Aminosäure kodieren, wie z.B. die sechs Kodons für Arginin oder Serin, wie in Tabelle 4 dargestellt und bezieht sich auch auf Kodons, welche biologisch äquivalente Aminosäuren kodieren.
  • Es wird auch verstanden werden, dass Aminosäure- und Nukleinsäure-Sequenzen weitere Reste einschließen können, wie z.B. weitere N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5'- oder 3'-Sequenzen und immer noch essentiell wie eine der hier offenbarten Sequenzen dargestellt sein können, solange als die Sequenz die Kriterien, wie oben dargestellt, erfüllt, einschließend die Aufrechterhaltung der biologischen Proteinaktivität, wo die Proteinexpression betroffen ist. Die Zugabe von terminalen Sequenzen trifft insbesondere auf Nukleinsäure-Sequenzen zu, welche beispielsweise verschiedene nicht kodierende Sequenzen enthalten, die entweder die 5'- oder die 3'-Abschnitte der kodierenden Region flankieren oder verschiedene internale Sequenzen enthalten können, d.h. Introns, von denen man weiß, dass sie innerhalb von Genen vorkommen.
  • Wenn man Intron- oder flankierende Regionen ausschließt und die Entartung des genetischen Codes zulässt, werden Sequenzen, welche zwischen ungefähr 70% und ungefähr 80%; oder mehr bevorzugt zwischen ungefähr 80%, 85% und ungefähr 90% oder noch mehr bevorzugt zwischen ungefähr 90%, 95% und ungefähr 99% an Nucleotiden, die identisch mit den Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 sind, aufweisen, Sequenzen sein, welche "essentiell wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt und SEQ ID Nr. 3 dargestellt" sind. Sequenzen, welche essentiell die gleichen sind wie diejenigen dargestellt in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3, können auch funktionell definiert werden als Sequenzen umfassend 20 zusammenhängende Basen von SEQ ID Nr. 1, welche in der Lage sind, an ein Nukleinsäure-Segment zu hybridisieren, welches das Komplement von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 umfasst, und zwar unter Bedingungen hoher Stringenz. Geeignete Bedingungen hoher Stringenz werden dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sein und sind hier klar dargestellt, beispielsweise Bedingungen zur Anwendung mit Southern- und Northern-Blot-Analyse und wie in den hier dargestellten Beispielen beschrieben.
  • Natürlicherweise umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Segmente, welche komplementär oder essentiell komplementär mit der Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 dargestellt, sind. Nukleinsäure-Sequenzen, welche komplementär sind, sind diejenigen, welche in der Lage sind, Basen-Paarung gemäß den üblichen Watson-Crick- Komplimentaritäts-Regeln einzugehen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "komplementäre Sequenzen" auf Nukleinsäure-Sequenzen, welche substantiell komplementär sind, wie durch den gleichen Nukleotid-Vergleich wie oben dargestellt, ausgewertet werden kann oder sind definiert als solche, die in der Lage sind, mit Nukleinsäure-Segmenten von SEQ ID Nr. 1 und 3 unter relativ stringenten Bedingungen, d.h. Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren.
  • Die Nukleinsäure-Segmente der vorliegenden Erfindung, unabhängig von der Länge der kodierenden Sequenz selbst, können mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, so wie z.B. Promotoren, Polyadenylierungs-Signal, weiteren Restriktionsenzymstellen, multiplen Klonierungsstellen, anderen kodierenden Segmenten und dergleichen, so dass ihre Gesamtlänge merklich variieren kann. Es ist folglich angedacht, dass ein Nukleinsäurefragment von beinahe einer jeden Länge eingesetzt werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise limitiert ist durch die Einfachheit der Herstellung und die Verwendung des beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokolls. Beispielsweise können Nukleinsäurefragmente hergestellt werden, welche ein kurzes Stück komplementär mit SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3, wie z.B. von 20, 30, 40 oder ähnlicher Anzahl von Nukleotiden darstellen und welche bis zu 2000 oder vergleichbaren Anzahlen an Basenpaaren an Länge sind. DNA-Segmente mit einer Gesamtlänge von ungefähr 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 1000, 500, 200, 100 und ungefähr 50 Basenpaaren an Länge werden auch als bedeutsam betrachtet.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäure-Segment, welches zumindest ein 20 Nukleotide langes Stück umfasst, welches zur Nachrichtensystemsequenz von SEQ ID Nr. 1 und 3 korrespondiert oder dazu komplementär ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure des Weiteren definiert als umfassend zumindest ein 30 oder 40 Nukleotide langes Stück, 50 Nukleotide langes Stück, 100 Nukleotide langes Stück oder zumindest ein 2000 Nukleotide langes Stück, welches mit der Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 und 3 korrespondiert oder dazu komplementär ist. Das Nukleinsäure-Segment kann des Weiteren definiert werden als eines, welches die Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 aufweist.
  • Eine verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäure-Segment, welches ein zumindest 20 Nukleotide langes Stück umfasst, welches zur Nukleinsäure von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 korrespondiert oder dazu komplementär ist, und des Weiteren definiert ist als umfassend ein Nukleinsäurefragment von bis zu 10.000 Basenpaaren an Länge. Eine bevorzugtere Ausführungsform ist ein Nukleinsäurefragment, umfassend zwischen 20 Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 bis hin zu 5000 Basenpaaren an Längen, 3000 Basenpaaren an Längen, 2000 Basenpaaren an Längen, 1000 Basenpaaren an Längen, 500 Basenpaaren an Längen oder 100 Basenpaaren an Länge.
  • Es wird sich natürlicherweise verstehen, dass die Erfindung nicht begrenzt ist auf spezielle Nukleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können folglich die VMP-artigen Protein kodierenden Regionen selbst, kodierende Regionen, welche ausgewählte Veränderungen und Modifikationen in der kodierenden Basisregion aufweisen, enthalten, oder können größere Polypeptide kodieren, welche nichtsdestoweniger VMP-kodierende Regionen enthalten und biologisch funktionelle äquivalente Proteine oder Peptide kodieren, welche Varianten-Aminosäure-Sequenzen aufweisen.
  • Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung schließen biologisch funktionelle äquivalente VMP-artige Proteine und Peptide ein. Solche Sequenzen können also eine Konsequenz der Kodon-Redundanz und funktionellen Äquivalenz auftreten, von denen man weiß, dass sie natürlicherweise innerhalb von Nukleinsäure-Sequenzen und der dadurch kodierten Proteine auftreten. Alternativ können funktionelle äquivalente Proteine oder Peptide erzeugt werden, über die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie, in welcher Veränderungen der Proteinstruktur technologisch erzeugt werden können, basierend auf Betrachtungen der Eigenschaften der ausgetauschten Aminosäuren. Veränderungen, technisch erzeugt von Menschenhand, können eingebracht werden durch die Anwendung ortsgerichteter Mutagenesetechniken, beispielsweise, um Verbesserungen mit Blick auf die Antigenität des VMP-artigen Proteins einzubringen, oder um VMP-artige Mutanten zu testen, um ihre Aktivität zu überprüfen oder das Vorliegen von VMP-artigen Peptiden in verschiedenen Zellen und Geweben auf molekularer Ebene zu bestimmen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine aufgereinigte Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr. 2. Die Bezeichnung aufgereinigt, wie hier verwendet, soll eine VMP-verwandte Proteinzusammensetzung bezeichnen, wobei das VMP-ähnliche Protein aufgereinigt wird auf irgendeinem Grad relativ zu seinem natürlich auftretenden Zustand, d.h. in diesem Fall relativ zu seiner Reinheit innerhalb eines eukaryontischen Zell-Extraktes. Eine bevorzugte Zelle für Isolierung des VMP-artigen Proteins ist aus Borellia-Organsimen; jedoch kann VMP-artiges Protein auch isoliert werden aus verschiedenen Proben von Patienten, Proben von infizierten Tieren, rekombinanten Zellen, Geweben, isolierten Zuchtpopulationen von Geweben und dergleichen, wie für den Fachmann auf dem Gebiet klar sein wird, speziell im Licht der vorliegenden Offenbarung. Eine aufgereinigte VMP-artige Proteinzusammensetzung bezieht sich folglich auch auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, frei von der Umgebung, in welcher es natürlicherweise vorkommen kann.
  • Falls gewünscht kann man auch Fusionsproteine und Peptide herstellen, beispielsweise wo die Regionen, welche das VMP-artige Protein kodieren, in der gleichen Expressions-Einheit mit anderen Proteinen oder Peptiden in Einklang gebracht worden sind, wobei diese gewünschte Funktionen aufweisen, wie z.B. zur Aufreinigung oder aus Gründen der Immunodetektionen (beispielsweise Proteine, welche durch Affinitäts-Chromatografie aufgereinigt werden können bzw. durch Enzym-Label-kodierende Regionen).
  • Wendet man sich der Expression des vls-Gens zu, entweder basierend auf cDNA oder genomischer DNA, kann man voranschreiten, ein Expressionssystem für die rekombinante Herstellung von VMP-artigem Protein herzustellen. Das technische Erzeugen von DNA-Segment(en) zur Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System kann durch Techniken durchgeführt werden, welche den Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten Expression wohl vertraut sind. Beispielsweise kann man ein VMP-GST(Glutathion-S-Transferase)-Fusions-Protein herstellen, das ein geeignetes Mittel der bakteriellen Expression ist. Jedoch glaubt man, dass virtuell jedes Expressionssystem in der Expression von VMP-artigen Proteinen eingesetzt werden kann.
  • VMP-artige Proteine können erfolgreich exprimiert werden in eukaryontischen Expressionssystemen, jedoch glauben die Erfinder, dass bakterielle Expressionssysteme für die Herstellung von VMP für alle Zwecke verwendet werden können. Die cDNA kodierend das vls-Gen kann separat exprimiert werden in bakteriellen Systemen, wobei die kodierten Proteinen auch fusioniert mit β-Galactosidase, Avidin, Ubiquitin, Schistosoma japonicum Gluthadion-S-Transferase, verschiedenen Histidinen, Epitop-Tags und dergleichen exprimiert werden können. Man glaubt, dass bakterielle Expression ultimativ Vorteile gegenüber eukaryontischen Expressionssystemen aufweisen wird, im Hinblick auf die Vereinfachung der Anwendung und der Menge an Materialien, welche dadurch erhalten werden.
  • Es wird vorgeschlagen, dass die Transformation von Wirtszellen mit DNA-Segmenten kodierend VMP-artige Proteine, ein geeignetes Mittel zum Erhalt eines VMP-artigen Pro teins zur Verfügung stellen wird. Es wird auch vorgeschlagen, dass cDNA, genomische Sequenzen und Kombinationen davon, modifiziert durch die Zugabe eines eukaryontischen oder viralen Promoters, geeignet für die eukaryontische Expression sind, die Wirtszelle selbstverständlich die genomischen Transkripte verarbeiten wird und so funktionale mRNA für die Translation in Protein ergibt.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Herstellen einer Proteinzusammensetzung, enthaltend wachsende rekombinante Wirtszellen, umfassend einen Vektor, welcher ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr. 2 wie in den oben genannten Ausführungsformen definiert, enthält, und zwar unter Bedingungen, welche die Expression der Nukleinsäure und Proteinproduktion gefolgt von der Rückgewinnung des so erzeugten Proteins erlauben. Die Wirtszelle, Bedingungen welche die Nukleinsäureexpression erlauben, Proteinproduktion und Rückgewinnung werden von den Fachleuten auf dem Gebiet gekannt werden, speziell im Licht der vorliegenden Offenbarung betreffend das vls-Gen.
  • 2.4 Genkonstrukte und DNA-Segmente
  • Wie hier verwendet werden die Begriffe "Gen" und "DNA-Segment" beide verwendet, um sich auf ein DNA-Molekül zu beziehen, das isoliert worden ist, frei aus der gesamten genomischen DNA einer speziellen Spezies. Folglich bezieht sich ein Gen oder ein DNA-Segment, kodierend ein VMP-artiges Polypeptid, auf ein DNA-Segment, welches Sequenzen enthält, welche VMP-ähnliches Protein kodieren, jedoch isoliert wurde aus oder aufgereinigt aus gesamter genomischer DNA der Spezies, von welcher die DNA erhalten wird. Enthalten innerhalb des Begriffs "DNA-Segment" sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente von solchen Sequenzen und auch rekombinante Vektoren einschließend beispielsweise Plasmide, Cosmide, Phagen, Retroviren, Adenoviren und dergleichen.
  • Die Bezeichnung "Gen" wird aus Gründen der Einfachheit verwendet und bezieht sich auf ein funktionelles Protein oder eine peptidkodierende Einheit. Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, dass dieser funktionelle Begriff sowohl genomische Sequenzen als auch DNA-Sequenzen einschließt. "Isoliert substantiell aus anderen kodierenden Sequenzen" bedeutet, dass das Gen von Interesse, in diesem Fall ein Gen, welches ein VMP-ähnliches Protein kodiert, den signifikanten Teil der kodierenden Region des DNA-Segments ausbildet und dass das DNA-Segment keine großen Teile von natürlich vorkommender kodierender DNA enthält, wie z.B. große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder cDNA kodierende Regionen. Selbstverständlich be zieht sich dies auf ein DNA-Segment wie ursprünglich isoliert und schließt keine Gene oder kodierenden Regionen aus, wie z.B. Sequenzen, welche Leader-Peptide oder Target-Sequenzen kodieren, welche später zu den Segmenten, die durch Menschenhand erzeugt wurden, hinzugefügt wurden.
  • 2.5 Rekombinante Vektoren exprimierend VMP-ähnliche Proteine
  • Ein spezieller Aspekt dieser Erfindung stellt neue Wege zur Verfügung, mit welchen VMP-kodierende DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, umfassend vls-DNA-Segmente eingesetzt werden können. Wie den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt ist, sind viele solcher Vektoren fertig verfügbar und ein detailliertes Beispiel eines geeigneten Vektors der Expression in Säuger-Zellen ist jenes, beschrieben in US-Patent 5,186,050. Jedoch besteht keine Notwendigkeit, dass ein hoch aufgereinigter Vektor verwendet wird, solange als das kodierende Segment, welches eingesetzt wird, ein VMP-artiges Protein kodiert und nicht irgendeine kodierende oder regulatorische Sequenz, welche einen nachteiligen Effekt auf die Zellen ausüben würde. Folglich wird es sich verstehen, dass geeignete Nukleinsäure-Sequenzen zusätzliche Reste einschließen, wie z.B. zusätzliche nicht kodierende Sequenzen, welche entweder die 5'- oder 3'-Enden der kodierenden Region flankieren, einschließend beispielsweise Promotorregionen oder verschiedene internale Sequenzen, d.h. Introns, von denen man weiß, dass sie innerhalb von Genen enthalten sein können.
  • Nach Identifizieren eines geeigneten VMP-kodierenden Gens oder DNA-Moleküls kann es in irgendeinen der vielen derzeit bekannten Vektoren auf dem Gebiet insertiert werden, so dass er die Expression und Produktion des VMP-artigen Proteins, bei Inkorporation in eine Wirtszelle, lenken wird. In einem rekombinanten Expressionsvektor wird der kodierende Teil des DNA-Segments unter der Kontrolle eines Promotors positioniert. Der Promotor kann in der Form des Promotors sein, der natürlicherweise assoziiert ist mit einem VMP-kodierenden Gen, wie er erhalten werden kann durch Isolieren der 5' nicht kodierenden Sequenzen lokalisiert strangaufwärts des kodierenden Segmentes oder Exons, beispielsweise unter Verwendung rekombinanten Klonens und/oder PCRTM-Technologie, zusammen mit den hier offenbarten Zusammensetzungen.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist beabsichtigt, dass spezielle Vorteile durch Positionieren des VMP-kodierenden DNA-Segments unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors erzielt werden. Wie hier verwendet, soll ein rekombinanter oder heterologer Promotor sich auf einen Promotor beziehen, welcher nicht normalerweise assoziiert ist mit einem vls-Gen in einer natürlichen Umgebung. Solche Promotoren können einschließen, diejenigen welche normalerweise assoziiert sind mit anderen Borellia-inhibitorischen Polypeptid-Genen und/oder Promotoren, isoliert von anderen bakteriellen, viralen, eukaryontischen oder Säuger-Zellen. Natürlicherweise wird es wichtig sein, einen Promotor einzusetzen, welcher effektiv die Expression des DNA-Segments in der speziellen Zelle, enthaltend den Vektor umfassend ein vls-Gen oder Gensegment, lenkt.
  • Die Verwendung von rekombinanten Promotoren, um Proteinexpression zu erreichen, ist im Allgemeinen den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt, beispielsweise siehe Sambrook et al., (1989). Die eingesetzten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein und können verwendet werden unter geeigneten Bedingungen, um hohe Spiegel oder regulierte Expression des eingeführten DNA-Segments zu steuern. Die derzeit bevorzugten Promotoren sind diejenigen, wie z.B. CMV, RSV, LTR, der SV40 Promotor allein und der SV40 Promotor in Kombination mit dem SV40 Verstärker (Enhancer).
  • 2.6 Verfahren zur DNA-Transfektion
  • Die Technologie zum Einbringen von DNA in Zellen ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt. Fünf allgemeine Verfahren zum Einführen eines Gens in eine Zelle wurden beschrieben: (1) chemische Verfahren (Graham und VanDerEb, 1973); (2) physikalische Verfahren wie z.B. Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Wong und Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) und das Gengewehr (gene gun) (Yang et al., 1990); (3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Danos und Heard, 1992; Eglitis und Anderson, 1988); (4) rezeptormediatisierte Mechanismen (Wu et al., 1991; Curiel et al., 1991; Wagner et al., 1992); und (5) direkte Injektion von aufgereinigter DNA in Menschen oder Tiere.
  • 2.7 Liposome und Nanokapseln
  • Die Ausbildung und Verwendung von Liposomen ist im Allgemeinen den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt (siehe beispielsweise Couvreur et al., 1991, welcher die Anwendung von Liposomen und Nanokapseln in der zielgerichteten antibiotischen Therapie von intrazellulären bakteriellen Infektionen und Erkrankungen beschreibt). Jüngst wurden Liposome entwickelt mit verbesserter Serumstabilität und verbesserten Zirkulations-Halbwertszeiten (Gabizon und Papahadjopoulos, 1988; Allen und Choun, 1987). Im Folgenden wird eine kurze Beschreibung dieser DNA-Zufuhrarten gegeben.
  • Nanokapseln können im Allgemeinen Verbindungen in einer stabilen und reproduzierbaren Art und Weise einkapseln (Henry-Michelland et al., 1987). Um Nebeneffekte aufgrund von interzellulären polymeren Überladen, wie z.B. ultrafeine Partikel (von einer Größe um 0,1 mm) zu vermeiden, sollten sie konzipiert werden unter Verwendung von Polymeren, welche in vivo abbaubar sind. Bioabbaubare Polyalkyl-Cyanoacrylat Nanopartikel, welche diese Anforderungen erfüllen, sind für die Verwendung der vorliegenden Erfindung angedacht und solche Partikel sind einfach herzustellen, wie in der Literatur beschrieben (Couvreur et al., 1984; 1988).
  • Liposomen werden ausgebildet aus Phospholipiden, welche in einem wässrigen Medium dispergiert werden und sich spontan aus multilaminaren konzentrischen zweischichtigen Vesikeln bildet werden (auch bezeichnet als multilaminare Vesikel (MLVs)). MLVs haben im Allgemeinen Durchmesser in einer Größenordnung von 25 mm bis 4 mm. Ultraschallbehandlung von MLVs resultiert in der Ausbildung von kleinen unilaminaren Vesikeln (small unilamellar vesicles, SUVs) mit Durchmessern in der Größenordnung von 200 bis 500, welche eine wässrige Lösung im Kern enthalten. Zusätzlich zu den Lehren von Couvreur et al (1991) kann die folgende Information verwendet werden beim Erzeugen von liposomalen Formulierungen. Phospholipide können eine Vielzahl von Strukturen ausbilden, verschieden von Liposomen, wenn sie in Wasser dispergiert werden, abhängig vom molaren Verhältnis des Lipids zum Wasser. Bei niedrigen Verhältnissen ist das Liposom die bevorzugte Struktur. Die physikalischen Charakteristika von Liposomen hängen vom pH, der Ionenstärke und dem Vorliegen von divalenten Kationen ab. Liposomen können geringe Permeabilität gegen ionische und polare Substanzen zeigen, jedoch werden sie bei erhöhten Temperaturen einem Phasenübergang unterzogen, welcher merklich ihre Permeabilität verändert. Der Phasenübergang involviert eine Veränderung von einer dicht gepackten, geordneten Struktur, bekannt als Gel-Zustand in eine lose gepackte, wenig geordnete Struktur, bekannt als Flüssig-Zustand. Dies tritt bei einer charakteristischen Phasenübergangstemperatur auf und resultiert in einem Ansteigen der Permeabilität gegen Ionen, Zucker und Wirksubstanzen.
  • Liposomen interagieren mit Zellen über vier verschiedene Mechanismen. Endozytose durch phagozytotische Zellen des retikuloentdothelialen Systems wie z.B. Makrophagen und Neutrophile; Adsorption der Zelloberfläche, entweder durch nicht spezifische schwache hydrophobe oder elektrostatische Kräfte oder durch spezifische Wechselwirkung mit Zelloberflächen-Komponenten; Fusion mit der Plasmazellmembran durch Insertion der Lipid-Doppelschicht des Liposoms in die Plasmamembran unter gleichzeitiger Freisetzung des liposomalen Inhalt in das Zytoplasma; und durch Transfer von liposomalen Lipiden zu zellulären oder subzellulären Membranen oder umgekehrt, ohne irgendeine Assoziation des Liposom-Inhalts. Es ist oft schwierig zu bestimmen, welcher Mechanismus operativ ist und es kann mehr als einer zur gleichen Zeit wirken.
  • 2.8 Expression von VMP-artigen Proteinen
  • Für die Expression von VMP-artigen Proteinen kann man, sobald ein geeigneter (falls benötigt, Volllängen-)Klon oder Klone erhalten worden ist (sind), egal, ob er (sie) cDNA basiert oder genomisch basiert ist (sind), fortfahren, ein Expressionssystem für die rekombinante Herstellung von VMP-artigen Proteinen zu erzeugen. Das technische Konzipieren eines DNA-Segments (von DNA-Segmenten) zur Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System kann durchgeführt werden durch Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten Expression im Allgemeinen bekannt sind. Man glaubt, dass virtuell jegliches Expressionssystem für die Expression von VMP-artigen Proteinen eingesetzt werden kann.
  • VMP-ähnliche Proteine können erfolgreich exprimiert werden in eukaryontischen Expressionssystemen, jedoch ist auch angedacht, dass bakterielle Expressionssysteme für die Herstellung von VMP-artigen Proteinen für alle Zwecke bevorzugt sind. Die cDNA für VMP-artige Proteine kann separat exprimiert werden in bakteriellen Systemen, wobei die kodierten Proteine als Fusionen mit β-Galaktosidase, Ubiquitin, Schistosoma japonica Glutathion-S-Transferase, grün fluoreszierendem Protein und dergleichen exprimiert werden können. Man glaubt auch, dass bakterielle Expression ultimativ Vorteile gegenüber eukaryontischer Expression in Hinblick auf die Einfachheit der Verwendung und der Menge des daraus erhaltenen Materials aufweisen wird.
  • Es wird vorgeschlagen, dass die Transformation von Wirtszellen mit DNA-Segmenten, kodierend VMP-ähnliche Proteine ein geeignetes Mittel zum Erhalt von VMP-ähnlichen Peptiden zur Verfügung stellen wird. Sowohl cDNA als auch genomische Sequenzen sind geeignet für eukaryontische Expression, da die Wirtszelle selbstverständlich die genomische Transkripte verarbeiten wird, und funktionelle mRNA zur Translation in Proteine erzielen wird.
  • Es wird in ähnlicher Art und Weise geglaubt, dass beinahe jegliches eukaryontische Expressionssystem zur Expression von VMP-ähnlichen Proteinen und Polypeptiden wie oben definiert eingesetzt werden kann, beispielsweise könnten Baculovirus-basierte, Glu taminsynthase-basierte oder Dihydrofolatreductase-basierte Systeme eingesetzt werden. Jedoch in bevorzugten Ausführungsformen ist es beabsichtet, dass Plasmid-Vektoren, welche einen Ursprung der Replikation enthalten und einen effizienten eukaryontischen Promotor, beispielsweise einen eukaryontischen Vektor der pCMV-Serie, wie z.B. pCMV5 am bedeutsamsten sein werden.
  • Zur Expression auf die Art und Weise würde man die kodierenden Sequenzen benachbart zu und unter der Kontrolle des Promotors positionieren. Es sollte sich auf dem Gebiet verstehen, dass, um eine kodierende Sequenz unter Kontrolle eines Promotors zu bringen, man das 5'-Ende der Transkriptionsinitiationsstelle des transkriptionellen Leserahmens des Proteins zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 Nukleotide "strangabwärts" (d.h. 3') vom gewählten Promotor positioniert.
  • Wo eukaryontische Expression beabsichtigt ist, wird man auch typischerweise wünschen, eine geeignete Polyadenylierungsstelle (beispielsweise 5'-AATAAA-3') in die transkriptionelle Einheit, welche VMP-ähnliches Protein einschließt, zu inkorporieren, falls keine innerhalb des ursprünglich geklonten Segments enthalten war. Typischerweise wird eine Poly-A-Additions-Stelle platziert, ungefähr 30 bis 2000 Nukleotide "strangabwärts" von der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptions-Termination.
  • Translatorische Verstärker können auch als Teil der Vektor-DNA eingebracht werden. Folglich sollten DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung auch vorzugsweise eine oder mehrere 5'-nichttranslatierte Leader-Sequenzen enthalten, welche dazu dienen, die Expression von Genprodukten von den resultierenden mRNA-Transkripten zu verstärken. Solche Sequenzen können vom Promotor abgeleitet werden, welcher ausgewählt wurde, das Gen zu exprimieren oder spezifisch modifiziert werden, um die Translation der RNA zu verstärken. Solche Regionen können auch erhalten werden aus viralen RNAs, aus geeigneten eukaryontischen Genen, oder aus einer synthetischen Gensequenz (Griffiths et al., 1993).
  • Solche "Verstärker"-Sequenzen können wünschenswert sein, um die translatorische Effizienz der resultierenden mRNA zu verstärken oder zu verändern. Die vorliegende Erfindung ist nicht limitiert auf Konstrukte, wobei der Verstärker abgeleitet ist von der nativen 5' nicht-translatierten Promotorsequenz, sondern kann auch nicht translatierte Leader-Sequenz, abgeleitet von anderen nicht-verwandten Promotoren enthalten, wie z.B. andere Verstärker, transkriptionelle Aktivatoren oder Gene.
  • Es ist angedacht, das virtuell irgendeine der im Allgemeinen eingesetzten Wirtszellen in Verbindung mit der Expression von VMP in Übereinstimmung hiermit verwendet werden kann. Beispiel schließen Zelllinien ein, welche typischerweise für eukaryontische Expression eingesetzt werden, wie z.B. 293, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, WI 38, BHK, COS-7, RIN und MDCK-Zelllinien.
  • Es ist angelacht, das VMP-ähnliches Protein "überexprimiert" werden kann, das heißt in erhöhten Spiegeln relativ zu seiner natürlichen Expression in Borellia-Zellen exprimiert werden kann, oder sogar relativ zur Expression von anderen Proteinen in einer rekombinanten Wirtszelle, enthaltend VMP-kodierende DNA-Segmente. Solche Überexpression kann durch eine Vielzahl von Verfahren ausgewertet werden, einschließend Radiolabel und/oder Protein-Aufreinigung. Jedoch sind einfache und direkte Verfahren bevorzugt, beispielsweise diejenigen, welche SDS/PAGE und Proteinanfärben oder Western Blotting einschließen, gefolgt von quantitativen Analysen, wie z.B. densitometrisches Scannen des resultierenden Gels oder Blots. Ein spezifischer Anstieg im Spiegel des rekombinanten Proteins oder Peptids im Vergleich zum Spiegel im natürlichen VMP-produzierten tierischen Zellen ist ein Hinweis auf die Überexpression, wie auch ein relativer Überfluss des spezifischen Proteins im Verhältnis zu den anderen Proteinen produziert durch die Wirtszelle und beispielsweise sichtbar auf einem Gel.
  • Wie hier verwendet, soll sich die Bezeichnung "technisch erzeugte" oder "rekombinante" Zelle auf eine Zelle beziehen, in welche ein rekombinantes Gen, wie z.B. ein Gen, kodierend ein VMP-Peptid, eingebracht worden ist. Folglich sind technisch erzeugte Zellen unterscheidbar von natürlich vorkommenden Zellen, welche kein rekombinant eingebrachtes Gen enthalten. Technisch erzeugte Zellen sind folglich Zellen mit einem Gen oder Genen, eingebracht darin durch Menschenhand. Rekombinant eingebrachte Gene werden entweder in der Form eines cDNA-Gens (d.h. sie werden keine Introns enthalten), einer Kopie eines genomischen Gens vorliegen, oder werden Gene enthalten, welche benachbart zu einem Promotor positioniert sind, der nicht natürlicherweise assoziiert mit dem speziell eingebrachten Gen ist.
  • Es wird sich verstehen, dass rekombinante VMPs vom natürlich produzierten VMP in bestimmten Arten unterschiedlich sein können. Insbesondere der Grad der posttranslatorischen Modifikation, beispielsweise der Lipidation, Glykosylierung und Phosphorylierung kann unterschiedlich sein zwischen dem rekombinanten VMP und dem VMP-Polypeptid, das aus einer natürlichen Quelle aufgereinigt worden ist, wie z.B. aus Borellia.
  • Nach dem Identifizieren eines geeigneten DNA-Moleküls sowie irgendeines oder einer Kombination von Mitteln wie oben beschrieben, kann die DNA dann in irgendeinen der vielen Vektoren, welche derzeit im Stand der Technik bekannt sind, eingebracht werden, und in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle transferiert werden, wo die Expression und Produktion der sogenannten "rekombinanten" Version des Proteins reguliert wird. Die rekombinante Wirtszelle kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus S. mutans, E. coli, S. cerevisae, Bacillus sp., Lactocooci sp., Enterococci sp. oder Salmonella sp. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die rekombinante Wirtszelle einen recA-Phänotyp aufweisen.
  • Wo das Einbringen einer rekombinanten Version von einem oder mehreren der oben genannten Gene benötigt wird, wird es wichtig sein, das Gen einzubringen, so dass es unter der Kontrolle eines Promotors ist, welcher effizient die Expression des Gens in dem gewählten Zelltyp für die technische Erzeugung reguliert. Im Allgemeinen wird man wünschen, einen Promotor einzusetzen, welcher konstitutive (konstante) Expression des gewünschten Gens ermöglicht. Die Verwendung dieser konstitutiven Promotoren wird einen hohen konstanten Grad der Expression der eingebrachten Gene sicherstellen. Der Grad der Expression vom eingebrachten Gen von Interesse, kann in verschiedenen Klonen variieren, wahrscheinlich als eine Funktion der Stelle der Insertion des rekombinanten Gens in die chromosomale DNA. Folglich kann der Grad der Expression eines speziellen rekombinanten Gens ausgewählt werden durch Evaluieren verschiedener Klone, abgeleitet von jeder Transfektionsuntersuchung; sobald diese Linie ausgewählt worden ist, stellt der konstitutive Promotor sicher, dass der gewünschte Grad der Expression permanent beibehalten wird. Es kann auch möglich sein, Promotoren zu verwenden, welche der Regulation unterzogen sind, wie z.B. diejenigen, reguliert durch die Gegenwart von Lactose-Analog oder durch die Expression von Bakteriophagen-T7 DNA-Polymerase.
  • 2.9 Rekombinante VMP-ähnliche Polypeptide
  • Rekombinante Versionen eines Proteins oder Polypeptids gelten als Teil der vorliegenden Erfindung. Folglich kann man unter Verwendung von Techniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet vertraut sind, eine rekombinante Version des Polypeptid in einer rekombinanten Zelle exprimieren, um das Polypeptid von solch einer Zelle zu erhalten. Die Techniken basieren auf dem Klonen eines DNA-Moleküls, kodierend das Polypeptid aus einer DNA-Bibliothek, d.h. auf dem Erhalt eines spezifischen DNA-Moleküls verschieden von anderen DNAs. Man kann beispielsweise ein cDNA-Molekül klonieren oder ein genomisches DNA-Molekül klonieren. Techniken wie diese würden auch geeignet sein für die Herstellung von VMP-artigen Polypeptiden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
  • 2.10 Verstärkte Produktion von VMP-ähnlichen Proteinen
  • Potenzielle Probleme mit VMP-ähnlichen Proteinen, isoliert aus natürlichen Quellen, sind niedere Ausbeuten und extensive Aufreinigungsverfahren. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die verstärkte Produktion von VMP-ähnlichen Proteinen durch rekombinante Methoden in einem bakteriellen Wirt, wobei DNA-Konstrukte eingesetzt werden, um Gram-positive oder Gram-negative bakterielle Zellen zu transformieren. Beispielsweise ist die Verwendung des Escherichia coli Expressionssystems den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt, wie auch die Verwendung von anderen bakteriellen Spezies, wie z.B. Bacillus subtilis oder Streptococcus sanguis.
  • Weitere Aspekte der Erfindung schließen starke Expressionsvektoren ein, welche DNA einbringen, kodierend neues vls, kombinatorische Segmente und Varianten davon. Es ist auch bevorzugt, dass Vektoren, welche verstärkte Expression von VMP in anderen Systemen zur Verfügung stellen wie z.B. S. mutans auch erhältlich sein werden. Wo es gewünscht wird, können Modifikationen von physikalischen Eigenschaften von VMP gefragt sein, um die Löslichkeit oder Expression in löslicher Kultur zu verbessern. Die vls-Stelle kann unter Kontrolle eines starken Expressionspromotors platziert werden oder die Komponenten dieses Expressionssystems können verändert werden, um die Expression zu steigern.
  • In weiteren Aspekten ermöglicht die DNA, welche die VMP-ähnlichen Proteine der vorliegenden Erfindung kodiert, eine Produktion und Isolation von VMP-ähnlichen Polypeptiden im großen Maßstab. Dies kann realisiert werden durch Regulieren der Expression des VMP-ähnlichen Polypeptids durch Klonieren der DNA, kodierend das VMP-ähnlichen Polypeptid in einen geeigneten Expressionsvektor. Solch ein Expressionsvektor kann dann in eine Wirtszelle transformiert werden, welche in der Lage ist, die VMP-ähnlichen Proteine zu produzieren. Das VMP-ähnliche Protein kann dann gereinigt werden, beispielsweise mit Mitteln, bereitgestellt durch diese Offenbarung und eingesetzt werden in einer biologisch aktiven Form. Nicht biologisch aktive rekombinante VMP-ähnliche Proteine können auch von Bedeutung sein, beispielsweise als ein Immunogen, um Anti-VM-Antikörper herzustellen.
  • 2.11 Genimmunisierung
  • Das Adenovirus ist insbesondere geeignet für die Verwendung als ein Gen-Transfer-Vektor, da er ein DNA-Genom mittlerer Größe aufweist, einfach zu manipulieren ist, hohe Titer aufweist, einen hohen Target-Zellbereich aufweist und hohe Infektivität. Das ungefähr 36 kB virale Genom wird gebunden durch 100–200 Basenpaare (bp) invertierte terminale Enden (inverted terminal repeats, ITR), in welchen cis-wirkende Elemente, notwendig für die virale DNA-Replikation und Verpackung, enthalten sind. Die frühen (early, E) und späten (late, L) Regionen des Genoms, welche verschiedene Transkriptionseinheiten enthalten, sind unterteilt nach dem Einschalten der viralen DNA-Replikation.
  • Die E1-Region (E1A und E1B) kodiert Proteine, welche für die Regulation der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Regionen (E2A und E2B) resultiert in der Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind in die DNA-Replikation involviert, in die späte Gen-Expression und das Ausschalten von Wirtszellen (Renan 1990). Die Produkte der späten Gene (L1, L2, L3, L4 und L5), einschließlich der Mehrheit der viralen Capsidproteine werden nur nach signifikanter Verarbeitung der einzelnen primären Transkripte exprimiert, ausgegeben durch den hauptsächlichen späten Promotor (major late promotor, MLP). Der MLP (lokalisiert bei 16,8 map-Einheiten), speziell effizient während der späten Phasen der Infektion, und alle der mRNAs ausgegeben von diesem Promotor besitzen eine 5' Tripartite Leader (TL) Sequenz, welche sie zu bevorzugten mRNAs für die Translation macht.
  • Um den Adenovirus für die Gentherapie zu optimieren, ist es notwendig, die Beladungskapazität zu maximieren, so dass große Segmente von DNA enthalten sein können. Es ist auch sehr wünschenswert, die Toxizität und die immunologe Reaktion assoziiert mit bestimmten adenoviralen Produkten zu reduzieren.
  • Die Verteilung von DNA ist möglich, da die cis-Elemente benötigt für die virale DNA-Replikation alle in den invertierten terminalen Repeats (inverted terminal repeat, ITR) (100–200 bp) an jedem Ende des linearen viralen Genoms lokalisiert sind. Plaside enthaltend ITRs können in der Gegenwart eines nicht defizienten Adenovirus replizieren (Hay et al., 1984). Folglich sollte der Einschluss dieser Elemente in einem Adenovirus-Vektor die Replikation ermöglichen.
  • Darüber hinaus ist das Verpackungs-Signal für die virale Verkapselung zwischen 194–385 bp (0,5–1,1 map-Einheiten) am linken Ende des viralen Genoms (Hearing et al., 1987) lokalisiert. Dieses Signal mimt die Protein-Erkennungsstelle in Bakteriophagen λ DNA, wo eine spezifische Sequenz nahe am linken Ende, aber jedoch außerhalb der kohäsiven End-Sequenz das Binden an Proteine mediatisiert, welche benötigt werden für die Insertion der DNA in die Kopfstruktur. E1-Substitutions-Vektoren von Ad haben gezeigt, dass ein 450 bp (0–1,25 map-Einheiten) Fragment am linken Ende des viralen Genoms das Verpacken in 293-Zellen steuern konnte (Levrero et al., 1991).
  • Es wurde gezeigt, dass bestimmte Regionen von Adenovirus-Genom in das Genom von Säuger-Zellen inkorporiert werden können und dass die kodierten Gene dadurch exprimiert werden. Die Zelllinien sind in der Lage, die Replikation des Adenovirus-Vektors zu unterstützen, welche defizitär in der adenoviralen Funktion ist, kodiert durch die Zelllinie. Es gibt auch Berichte der Komplementation von replikationsdefizitären adenoviralen Vektoren durch "helfenden" Vektoren, beispielsweise Wildtypvirus oder bedingt defizitäre Mutanten.
  • 2.12 VMP-ähnliche Varianten
  • VMP-ähnliche Proteine und funktionelle Varianten werden auch als Teil der Erfindung betrachtet. Folglich ist zu erwarten, dass trunkierte und mutierte Versionen von VMP-ähnlichem Protein (SEQ ID Nr. 2) günstigere und effizientere Formen von VMP für Behandlungs-Kuren hervorbringen werden. Folglich sind irgendwelche funktionellen Versionen von SEQ ID Nr. 2, wie z.B. trunkierte Spezies oder homologe, wie in den oben wiedergegebenen Ausführungsformen definiert, sowie mutierte Versionen von VMP-ähnlichem Protein als Teil der Erfindung angedacht.
  • Mutierte rekombinante VMPs können verbessertes Potential und verlängerte in vivo-Halbwertszeit aufweisen, und dabei effiziente Langzeitbehandlungen anbieten. Neue VMPs könnten folglich erhalten werden durch Modifizieren der vls-Gene (wie z.B. ortspezifische Mutagenese).
  • Des Weiteren können die 15 ruhenden vls-Kassetten von B. burgdorferi in verschiedenen Kombinationen rekombiniert werden, wodurch beispielsweise ein Cocktail von Peptid-Zusammensetzungen zur Anwendung als Immunogene bereitgestellt wird, und, um Vakzine zur Anwendung in der Lyme-Krankheit und verwandten Zuständen zu entwickeln.
  • 2.13 Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmtazeutische Zusammensetzungen, hergestellt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung finden Anwendung beim Verhindern oder Lindem von Bedingungen, assoziiert mit Borellia-Infektionen, insbesondere der Lyme-Krankheit. Solche Verfahren schließen im Allgemeinen das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine effektive Menge eines VMP-ähnlichen Antigens wie z.B. SEQ ID Nr. 2 oder verschiedene Epitope davon ein. Andere exemplarische Zusammensetzungen können eine effektive Menge entweder einer VMP-ähnlichen Variante oder einer VMP-ähnlichen kodierenden Nukleinsäure-Zusammensetzung enthalten. Solche Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Tier zu erzeugen, in solchen Fällen, wo es wünschenswert sein mag, den Effekt eines natürlich produzierten VMP-ähnlichen Proteins zu blockieren.
  • Auch enthalten als Teil der vorliegenden Erfindung sind folglich neue Zusammensetzungen, umfassend Nukleinsäuren, welche ein VMP-ähnliches Protein kodieren. Es wird sich selbstverständlich verstehen, dass ein oder mehr als ein Gen in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können. Die Verfahren zur Nukleinsäurezufuhr können folglich die Verabreichung von einem, zwei, drei oder mehreren homologen VMP kodierenden Genen einschließen. Die maximale Anzahl von Genen, welche verabreicht werden können, ist limitiert nur durch praktische Überlegungen wie z.B. die Bemühung, involviert in das gleichzeitige Herstellen einer großen Anzahl von Genkonstrukten oder gar die Möglichkeit des Auslösens eines nachteiligen zytotoxischen Effekts.
  • Die spezielle Kombination von Genen kann aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Genen bestehen; oder kann so sein, dass ein vls-Gen mit einem anderen Gen und/oder anderen Protein kombiniert wird, einem Cofaktor oder anderem Molekül; ein Cytokin-Gen kann sogar mit einem Gen kombiniert werden, welches einen Zelloberflächen-Rezeptor kodiert, welcher in der Lage ist, mit dem Polypeptid-Produkt des ersten Genes wechselzuwirken.
  • Bei der Verwendung von multiplen Genen können sie auf einem einzelnen genetischen Konstrukt unter Steuerung von einem oder mehreren Promotoren kombiniert werden oder sie können hergestellt werden als separate Konstrukte der gleichen oder verschiedener Typen. Folglich kann eine beinahe endlose Kombination verschiedener Gene und genetischer Konstrukte eingesetzt werden. Bestimmte Gen-Kombinationen können konzipiert werden, um, oder ihre Anwendung kann anderweitig so resultieren, um synergistische Effekte zu erzielen, um Schutz gegen Borellia und/oder der Stimulation einer Immunantwort zu erreichen. Irgendwelche und alle solche Kombinationen sollen beabsichtigter Weise innerhalb den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Tatsächlich wurden viele synergistische Effekte in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben, so dass ein Fachmann auf dem Gebiet spontan in der Lage sein würde, wahrscheinliche synergistische Gen-Kombinationen zu identifizieren oder sogar Gen-Protein-Kombinationen.
  • Es wird sich auch verstehen, falls es gewünscht ist, dass das Nukleinsäure-Segment oder das Gen kodierend ein VMP-ähnliches Protein in Kombination mit weiteren Genen verabreicht werden könnte, wie z.B. Proteinen oder Polypeptiden oder verschiedenen pharmazeutisch aktiven Wirksubstanzen. Solange als die Zusammensetzung ein vls-Gen umfasst, besteht virtuell keine Grenze für weitere Komponenten, die auch enthalten sein können, geht man davon aus, dass weitere Wirksubstanzen keine signifikanten nachteiligen Effekte bei Kontakt mit der Target-Zelle oder Wirtszellen erzeugen. Die Nukleinsäuren können folglich zusammen mit verschiedenen anderen Wirksubstanzen, wie im speziellen Fall benötigt, zugeführt werden.
  • 2.14 Kits
  • Therapeutische Kits, umfassend VMP-ähnliche Peptide oder VMP-kodierende Nukleinsäure-Segmente, umfassen einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Solche Kits werden im Allgemeinen in geeigneten Container-Hilfsmitteln eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung eines VMP-ähnlichen Peptids oder eine VMP-kodierende Nukleinsäure-Zusammensetzung enthalten. Der Kit kann ein einzelnes Container-Hilfsmittel aufweisen, welches die VMP-Zusammensetzung enthält, oder es kann verschiedene Container-Hilfsmittel für die VMP-Zusammensetzung aufweisen sowie weitere Reagenzien, welche innerhalb solcher Kits enthalten sein können.
  • Die Komponenten des Kits können als flüssige Lösung(en) bereitgestellt werden oder als trockene Pulver. Wenn die Komponenten in einer flüssigen Lösung zur Verfügung gestellt werden, ist die flüssige Lösung eine wässrige Lösung mit einer sterilen wässrigen Lösung als besonders bevorzugte Ausführungsform. Wenn Reagenzien oder Komponenten als ein trocknes Pulver bereitgestellt werden, kann das Pulver rekonstituiert werden durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels. Es ist angedacht, dass das Lösungsmittel in einem weiteren Container-Hilfsmittel zur Verfügung gestellt wird.
  • Kits können auch Reagenzien umfassen zum Nachweis von VMP-ähnlichen Polypeptiden, beispielsweise benötigt für Immunoassays. Das Immuno-Nachweisreagenz wird typischerweise einen Label umfassen, assoziiert mit dem Antikörper oder Antigen oder assoziiert mit einem zweiten bindenden Liganden. Exemplarische Liganden könnten einen sekundären Antikörper gerichtet gegen den ersten Antikörper und/oder einen Antigen- oder einen Biotin- oder Avidin-(oder Streptavidin-)Liganden mit einem daran assoziierten Label einschließen. Natürlich ist eine Vielzahl von exemplarischen Labeln im Stand der Technik bekannt und alle diese Label können in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Die Kits können Antikörper-Label-Konjugate enthalten, entweder in vollständig konjugierter Form, in der Form von Zwischenstufen oder als separate Gruppen, die durch den Anwender des Kits konjugiert werden.
  • Die Container-Hilfsmittel werden im Allgemeinen zumindest eine Phiole, Testtube, Glaskolben, Flasche, Spritze oder andere Container-Hilfsmittel enthalten, in welcher das Antigen oder der Antikörper platziert werden können und vorzugsweise geeignet aliquotiert werden. Wo einer zweiter Bindeligand zur Verfügung gestellt wird, wird der Kit auch im Allgemeinen eine zweite Phiole oder einen anderen Container enthalten, in welchen dieser Ligand oder Antikörper platziert werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden auch typischerweise ein Mittel zum Enthalten der Antikörper-, Antigen- und Reagenz-Container in einer umschlossenen Umgrenzung zum kommerziellen Verkauf enthalten. Solche Container können Einlegeteil umschmolzene oder blasgeschmolzene Plastikcontainer enthalten, in welchen die gewünschten Phiolen aufbewahrt werden können.
  • 2.15 VMP-Antikörper
  • In einem weiteren Aspekt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung an einen Antikörper gedacht, welcher immunoreaktiv mit einem Polypeptid der Erfindung ist. Ein Antikörper kann ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Mittel zum Herstellen und Charakterisieren von Antikörpern sind im Gebiet wohl bekannt (siehe, z.B. Howell und Lane, 1988).
  • Kurz gesprochen wird ein polyklonaler Antikörper hergestellt durch Immunisieren eines Tiers mit einem Immunogen, umfassend ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und Einsammeln von Antiseren vom immunisierten Tier. Ein großer Bereich von Tierspezies kann verwendet werden für die Produktion von Antiserum. Typischerweise ist ein Tier, verwendet zur Produktion von Anti-Antisera ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster oder ein Meerschweinchen. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen, ist ein Kaninchen die bevorzugte Wahl für die Produktion polyklonaler Antikörper.
  • Gemäß den oben definierten Ausführungsformen sind sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, spezifisch für VMP-ähnliche Polypeptide, speziell diejenigen repräsentiert durch SEQ ID Nr. 2 Varianten und Epitope davon, Teil der Erfindung und können hergestellt werden unter Verwendung konventioneller Immunisierungstechniken, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet im Allgemeinen bekannt sind. Eine Zusammensetzung enthaltend antigene Epitope von VMP kann verwendet werden, um eines oder mehrere Versuchstiere zu immunisieren, wie z.B. ein Kaninchen oder eine Maus, welche dann sich entwickeln werden, um spezifische Antikörper gegen vls-Expression und ruhende Regionen zu produzieren. Polyklonale Antiseren können erhalten werden, nachdem man hinreichend bis zur Antikörpererzeugung gewartet hat, einfach durch Zur-Ader-Lassen der Tiere und Präparieren von Serum-Proben aus dem Vollblut.
  • Um monoklonale Antikörper zu erhalten, würde man auch ursprünglich ein Versuchstier immunisieren, häufig bevorzugt eine Maus mit einer VMP-Zusammensetzung. Man würde dann, nach einem hinreichenden Zeitraum, um die Antikörpererzeugung zu ermöglichen, eine Population von Milz- oder Lymphzellen vom Tier erhalten. Die Milz- oder Lymphzellen können dann fusioniert werden mit Zelllinien, wie z.B. menschlichen oder Maus-Myeloma-Stämmen, um Antikörper sekretierende Hybridomas zu produzieren. Diese Hybridomas können isoliert werden, um individuelle Klone zu erhalten, welche dann sekretiert werden können zur Produktion eines Antikörpers gegen das gewünschte VMP-Peptid.
  • Auf die Immunisierung hin werden die Milzzellen entfernt und fusioniert unter Verwendung eines Standard-Fusionierungs-Protokolls mit Plasmazytom-Zellen, um Hybridomas zu erzeugen, welche monoklonale Antikörper gegen VMP sekretieren. Hybridomas, welche monoklonale Antikörper produzieren gegen ausgewählte Antigene, werden identifiziert unter Verwendung von Standardtechniken, wie z.B. ELISA- und Western-Blot-Verfahren. Hybridomaklone können dann kultiviert werden in flüssigen Medien und die Kultur-Überstände aufgereinigt werden, um die VMP-spezifischen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen.
  • Es wird vorgeschlagen, dass die monoklonalen Antikörper der Erfindung bedeutsame Anwendung in immunochemischen Standard-Prozeduren, wie z.B. ELISA- und Western- Blot-Verfahren finden werden, wie auch anderen Prozeduren, welche Antikörper spezifisch für VMP-Epitope einsetzen.
  • Des Weiteren wird vorgeschlagen, dass monoklonale Antikörper spezifisch für das spezielle Polypeptid in anderen bedeutsamen Anwendungen eingesetzt werden können. Beispielsweise kann ihr Einsatz in immunoabsorbierenden Protokollen bedeutsam für das Aufreinigen nativer oder rekombinanter VMP-Spezies oder Varianten davon sein.
  • Im Allgemeinen können sowohl poly- als auch monoklonale Antikörper gegen VMP in einer Vielzahl von Ausführungsformen verwendet werden. Beispielsweise können sie eingesetzt werden in Antikörper klonierenden Protokollen, um cDNAs oder Gene zu erhalten, welche VMP oder verwandte Proteine kodieren. Sie können auch verwendet werden in Inhibitionsuntersuchungen, um die Effekte von VP in Zellen oder Tieren zu analysieren. Anti-VMP-Antikörper werden auch bedeutsam sein in Immunolokalisations-Untersuchungen, um die Verteilung von VMP-Peptiden während verschiedener zellulärer Ereignisse zu untersuchen, beispielsweise um die zelluläre oder gewebespezifische Verteilung des VP-Peptids unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu bestimmen. Eine besonders bedeutsame Anwendung solcher Antikörper besteht in der Aufreinigung nativer oder rekombinanter VMP, beispielsweise unter Verwendung einer Antikörper-Affinitätssäule. Die Durchführung all solcher immunologischer Techniken wird den Fachleuten auf dem Gebiet im Licht der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
  • 3. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A. Korrelation der Infektivität von B. burgdorferi B31-Klonen 5A1 bis 5A10 in der Gegenwart des 28 kb linearen Plasmids (pBB28La). Plasmidprofile von B31-Klonen, wie durch Puls-Feld-Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung bestimmt. Niedrig (–) und hoch (+) infektive B31-Klone haben ein virtuell identisches Plasmidbandenmuster durch dieses Verfahren.
  • 1B. Korrelation der Infektivität von B. burgdorferi B31-Klonen 5A1 bis 5A10 in der Gegenwart eines 28 kb linearen Plasmids (pBB28La). Die Hybridisierung eines DNA-Blots des Gels, dargestellt in 1A mit der pJRZ53-Sonde. Die Sonde hybridisierte spezifisch mit einem 28-kb-Plasmid, das in allen 5 hochinfektiven Klonen vorlag, jedoch in nur einem von 4 niedrig infektiven Klonen. Molekulare Größen der Standards werden in Kilobasen angegeben und ein Stern markiert die Lokalisation von pBB28La in dem Ethidiumbromid-angefärbten Plasmid-Profil.
  • 2A. Struktur der vls-Stelle von B. burgdorferi-Klon B31-5A3. Diagrammartige Illustration der insgesamten Anordnung der vls-Stelle im B. burgdorferi-Plasmid pBB28La. Abstände vom linken Telomer sind in kb angegeben und die Stellen des substraktiven Hybridisierungsklons pJRZ53 und des λDASH-Bb12 Inserts sind dargestellt.
  • 2B. Struktur der vls-Stelle von B. burgdorferi-Klon B31-5A3. Struktur von vlsE.
  • 2C. Struktur der vls-Stelle von B. burgdorferi-Klon B31-5A3. Struktur von vlsE. Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenzen des Allels vlsE1 des B. burgdorferi B31-5A3 vls-Gens. Die verhergesagten –10 und –35 Promotorsequenzen, die putative Ribosom-Bindungsstelle (ribosome binding site, RBS) und Primer, verwendet für die PCRTM und RT-PCRTM sind markiert.
  • 3A. Sequenzähnlichkeit der vorhergesagten vlsE-Sequenz (Allel vlsE1) mit den variablen hauptsächlichen Proteinen (variable major proteins, Vmps) von B. hermsii und den vorhergesagten Aminosäuresequenzen der ruhenden vls-Kassetten. Alignment der vorhergesagten Aminosäure-Sequenz von vlsE (Allel vlsE1) mit derjenigen von Vmp17 (Genbankeintrag L04788). Identische Aminosäurereste werden durch vertikale Striche (|) und ähnliche Reste werden mit Doppelpunkten (:) und Punkten (.) dargestellt.
  • 3B. Sequenzähnlichkeit der vorhergesagten vlsE-Sequenz (Allel vlsE1) mit den variablen hauptsächlichen Proteinen (Vmps) von B. hermsii und den vorhergesagten Aminosäuresequenzen der ruhenden vls-Kassetten. Alignment der deduzierten Peptidsequenzen von 16 vls-Kassetten. Reste identisch mit der vlsE-Kassettenregion (vls1) von B. burgdorferi sind als Striche (–) markiert; ähnliche Aminosäuren sind als Kleinbuchstaben dargestellt. Lücken und die vorhergesagten Stop-Kodons werden durch Punkte (.) bzw. Sterne (*) dargestellt. Variable Regionen VR-I bis VR-VI sind verschattet dargestellt.
  • 4A. Oberflächenlokalisation von vlsE, wie sie durch Behandlung von intaktem B. burgdorferi mit Proteinase K angezeigt wird. Frisch kultivierte B. burgdorferi B31-Klon 5A3-Zellen wurden mit (+) oder ohne (–) Proteinase K bei Raumtempera tur für 10 Minuten inkubiert. Die Proteine der gewaschenen Organismen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Protein-Blots wurden mit Antiserum gegen GST-vls1-Fusions-Protein umgesetzt.
  • 4B. Oberflächenlokalisation von vlsE, wie sie durch Behandlung von intaktem B. burgdorferi mit Proteinase K angezeigt wird. Frisch kultivierte B. burgdorferi B31-Klon 5A3-Zellen wurden mit (+) oder ohne (–) Proteinase K bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Die Proteine der gewaschenen Organismen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Protein-Blots wurden mit Antiserum gegen B. burgdorferi B31 OspD umgesetzt.
  • 4C. Oberflächenlokalisation von vlsE, wie sie durch Behandlung von intaktem B. burgdorferi mit Proteinase K angezeigt wird. Frisch kultivierte B. burgdorferi B31-Klon 5A3-Zellen wurden mit (+) oder ohne (–) Proteinase K bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Die Proteine der gewaschenen Organismen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Protein-Blots wurden mit dem monoklonalen Antikörper H9724 gegen B. burgdorferi Flagellin (Fla) umgesetzt.
  • 5A. Veränderungen in deduzierten Aminosäuresequenzen von vlsE auftretend während der Infektion von C3H/HeN-Mäusen mit B. burgdorferi B31-5A3. Flussdiagramme des gesamten experimentellen Konzepts.
  • 5B. Veränderungen in den deduzierten Aminosäuresequenzen von vlsE auftretend während der Infektion von C3H/HeN-Mäusen mit B. burgdorferi B31-5A3. Aminosäuresequenz-Alignment der vlsE-Allele in einer klonalen Population von jedem der 11 verschiedenen Isolate.
  • 5C. Veränderungen in den deduzierten Aminosäuresequenzen von vlsE auftretend während der Infektion von C3H/HeN-Mäusen mit B. burgdorferi B31-5A3. Aminosäuresequenz-Alignment der vlsE-Allele in fünf klonalen Populationen von einem einzelnen Ohr-Isolat. In 5B und 5C wurden die deduzierten Aminosäuresequenzen der Maus-Isolate mit denjenigen des inokulierenden Klons (vlsE1) verglichen; die Ähnlichkeit zu dieser Sequenz wird wie in 3B dargestellt. Aminosäure-Reste (EGAIK), kodiert durch das direkte 17-bp Repeat, werden hervorgehoben, um die Grenzen der vls-Kassette anzuzeigen.
  • 6A. Veränderte vlsE-Antigenizität von B. burgdorferi-Klonen (m1e4A bis m8e4A), isoliert aus C3H/HeN-Mäusen 4 Wochen nach Infektion. Die antigenen Reaktivitäten von 9 Klonen isoliert von Mäusen (Zeilen 109) wurden verglichen mit denjenigen des elterlichen Klons B31-5A3, verwendet zur Maus-Inoculation (Zeile 11), und dem niedrig-infektiven Klon B31-5A2 (Zeile 10), welcher das Plasmid, welches vlsE kodiert, nicht aufweist. Zwei identische SDS-PAGE Western-Blots wurden umgesetzt mit dem monoklonalen Antikörper H9724, gerichtet gegen das B. burgdorferi Flagellin-Protein (Fla) als eine Positivkontrolle.
  • 6B. Veränderte vlsE-Antigenizität von B. burgdorferi-Klonen (m1e4A bis m8e4A), isoliert von C3H/HeN-Mäusen 4 Wochen nach Infektion und Antiserum gegen das GST-vls1 Fusionsprotein. Antiserum gegen das GST-vls1-Fusionsprotein. Verlängerte Expositionen des Immunoblots gegen das GST-vls1-Fusionsprotein zeigten das Vorliegen von schwach reaktiven Banden in allen 9 Mausisolaten. Die relativen Lokalisierungen der Proteinstandards sind angegeben.
  • 6C. Reaktivität von Serum-Antikörpern einer entsprechenden Mus musculus C3H/HeN-Maus mit vlsE. Ein Immunoblot von B. burgdorferi-Proteinen aus den angegebenen Stämmen und das GST-vls1-Fusionsprotein wurden mit Serum von Maus 1, erhalten 28 Tage nach Nadel-Inoculation mit 105 B. burgdorferi B31, Klon 5A3, umgesetzt.
  • 6D Reaktivität von Serum-Antikörpern einer repräsentativen Mus musculus C3H/HeN-Maus mit vlsE. Ein Immunoblot von B. burgdorferi-Proteinen aus den angegebenen Stämmen und das GST-vls1-Fusionsprotein wurden mit Serum einer Peromyscus leukopcus-Maus, infiziert mit B. burgdorferi B31 über einen Zeckenbiss, zur Reaktion gebracht. Die Proteinbanden korrespondieren mit vlsE und dem SGT-vls1-Fusionsprotein (wie durch die Reaktivität mit Anti-GST-vls1 Antiserum bestimmt; Daten nicht angegeben) werden durch Pfeile angezeigt. Die relativen Lokalisierungen von Proteinstandards sind in Kilodalton angegeben.
  • 6E. Reaktivität von Serum-Antikörpern einer repräsentativen Mus musculus C3H/HeN-Maus mit vlsE. Ein Immunoblot von B. burgdorferi-Proteinen von den angegebenen Stämmen und das GST-vls1-Fusionsprotein wurden mit Serum eines an Lyme-Krankheit leidenden Patienten im Frühstadium umgesetzt. Die Protein-Banden korrespondieren zu vlsE und dem GST-vls1-Fusionsprotein (wie durch die Reaktivität mit Anti-GST-vls1-Antiserum bestimmt; Daten nicht gezeigt) werden durch Pfeile angezeigt. Die relativen Lokalisierungen der Proteinstandards sind in Kilodalton angegeben.
  • 7 Vorgeschlagenes Modell für die genetische und antigenetische Variation an der vls-Stelle. Rekombination von Segmenten der ruhenden vls-Kassetten vls7 und vls 4 in die vls1-Kassette von B. burgdorferi B31-5A3 VlsE-Gen ist dargestellt. Eine Serie von ähnlichen Rekombinationsereignissen würde einzigartige vlsE-Allele erzeugen, bestehend aus einem Mosaik von Segmenten von mehreren verschiedenen ruhenden vls-Kassetten.
  • 4.0 DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ILLUSTRATIVEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Arbeit offenbart die Identifikation und Charakterisierung eines komplexen genetischen Systems in dem Lyme-Krankheits-Spirochäten Borrelia burgdorferi, welcher extensive antigene Variation eines oberflächen-exponierten Lipoproteins, VlsE vorantreibt. Ein 28 Kilobasen großes lineares Plasmid von B. burgdorferi B31 (pBB28La) wurde als eine vmp-artige Sequenz (vls)-Stelle enthaltend identifiziert, welche stark dem variablen Hauptprotein(variable major protein)(vmp)-System für antigene Variation von rezidivierenden Fieberorganismen ähnelt. Teile von mehreren der 15 nicht exprimierten (ruhenden) vls-Kassettensequenzen, lokalisiert strangaufwärts von vlsE, rekombinierten in die zentrale vlsE-Kassettenregion während der Infektion von C3H/HeN-Mäusen, was in der antigenen Variation des exprimierten Lipoproteins resultierte. Die resultierende kombinatorische Variation wird potenziell Millionen von einzigartigen antigenen Varianten erzeugen und dabei zur Immun-Evasion, zum Langzeitüberleben und zur Pathogenese im Säugetierwirt beitragen.
  • Ein Infektivitäts-assoziiertes 28 kb-lineares Plasmid, pBB28La, in B. burgdorferi B31 wurde durch substraktive Hybridisierung identifiziert. DNA-Sequenzanalyse der klonierten Fragmente aus diesem Plasmid brachten die vls-Stelle bestehend aus 15 ruhenden vls-Kassetten und ein exprimiertes vls-Gen zutage. Nachfolgende Infektionsuntersuchungen demonstrierten, dass bunt gewürfelte Rekombination an der vls-Stelle in C3H/HeN-Mäusen auftritt. Obwohl die vls-Stelle sorgsam nur in einer klonalen Population von B. burgdorferi B31 charakterisiert wurde, zeigen Southern-Hybridisierungsergebnisse, dass diese Stelle in infektiösen Stämmen von drei wohldefinierten Lyme-Erkrankungs-Borreliae-Genospezies (B. burgdorferi, B. afzelii und B. garinii) vorliegt, trotz der insge samten genetischen Heterogenität unter diesen Organismen (Casjens et al., 1995; Xu und Johnson, 1995).
  • Die vls-Stelle ähnelt dem vmp-System von B. hermsii, und zwar sowohl hinsichtlich der Sequenz als auch der genetischen Organisation. Es besteht gewisse Sequenzhomologie zwischen beiden Systemen, insbesondere zwischen den vlsE- und großen vmp-Genen. Dies wird exemplarisch verdeutlicht durch direkten Sequenzvergleich zwischen vlsE und vmp17, welche Homologie über ihre vorhergesagten Aminosäuresequenzen hinweg aufweisen (3A). Die vlsE- und die ruhenden vls-Kassetten weisen auch einen stärkeren Grad an Homologie zu kleinen vmps und B. burgdorferi ospC-Genen auf. Darüber hinaus haben sowohl vls- als auch vmp-Systeme eine einzige Expressionsstelle kodierend ein oberflächenlokalisiertes Lipoprotein, wie auch multiple nichtexprimierte Sequenzen (Plasterk et al., 1985; Barbour et al., 1991a). Schließlich sind die Expressionsstellen für beide Systeme nahe einem der Telomere der entsprechenden linearen Plasmide lokalisiert (Kitten und Barbour, 1990; Barbour et al., 1991b). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die vls-Stelle die Lyme-Erkrankungs-Borreliae mit der Fähigkeit der antigenen Variation versorgt, analog zum vmp-System von B. hermsii (Barbour, 1993). Die obigen Ähnlichkeiten deuten auch darauf hin, dass das vlsE-Gen, ruhende vls-Kassetten und große vmp-Gene von rezidivierenden Fieber-Organismen sich alle aus einem gemeinsamen Vorläufer-Gen entwickelt haben. Die relativ hohen G + C-Zusammensetzungen (beispielsweise 45% für vlsE und 37% für vmp17) sind im Vergleich mit Borrelia G + C-Gehalt (ungefähr 28%) auch mit dieser evolutionären Beziehung konsistent und legen weiter die Möglichkeit des lateralen Transfers von anderen Organismen nahe.
  • Es gibt mehrere Unterschiede zwischen den vls- und den vmp-Systemen. Als erstes besitzt B. hermsii zumindest zwei vmp-enthaltende lineare Plasmide (Meier et al., 1985; Plasterk et al., 1985), wohingegen nur ein vls-enthaltendes lineares Plasmid in Lyme-Erkrankungs-Borreliae unter Hybridisierungsbedingungen (1A und 1B) nachgewiesen wurde. Zum Zweiten werden die nahenden vmp-Gene durch intergenische nichtkodierende Regionen getrennt und sind in jeder Orientierung angeordnet (Barbour et al., 1991a), während die ruhenden vls-Kassetten in Kopf-Schwanz-Verknüpfung als ein einzelner offene Leserahmen über beinahe die vollständige Region (2A und 2B) organisiert sind. Zum Dritten fehlen den vmp-Genen Promotersequenzen, aber die meisten kodieren vollständige oder beinahe vollständige offene Leserahmen mit ihren eigenen Ribosom-Bindungsstellen (Barbour et al., 1991a). Auf der anderen Seite repräsentieren die vls-Kassetten nur das zentrale Drittel der Expressionsstelle. Zum Letzten wird jede Phase der B. hermsii-Infektion in erster Linie verursacht durch Organismen, exprimierend ein einzelnes vmp-Allel (Meier et al., 1995; Plasterk et al., 1985), wohingegen ein hoher Grad der vlsE-Allel-Variation unter Organismen während der B. burgdorferi-Infektion auftritt, isoliert selbst aus einer kleinen Ohrbiopsie-Probe (5A, 5B und 5C).
  • Die Sequenzveränderungen an der vlsE-Stelle könnten aus der genetischen Rekombination mit Sequenzen von den ruhenden vls-Kassetten resultieren. Trotz merklicher Sequenz-Variationen innerhalb der vls-Region verschiedener vlsE-Allele blieben die Sequenzen untersucht außerhalb der 17-bp-gerichteten Repeats unverändert (5B und 5C). Innerhalb der vls-Region sind die Veränderungen nicht zufällig sondern prädominant in sechs hoch variablen Regionen, gefunden in 15 ruhenden vls-Kassetten, geclustert (3B). Beinahe alle der Sequenz-Variationen, beobachtet in Maus-Isolaten, sind identisch mit Teilen der ruhenden vls-Kassetten, obwohl Kombinationen von Sequenz-Variationen alle diese Allele einzigartig machten.
  • Die Erfinder haben gezeigt, dass B. burgdorferi einem unüblichen Typ der genetischen Variation unterliegt (7):
    • (i) die vls-Kassetten enthalten konservierte und variable Regionen;
    • (ii) die konservierten Sequenzen ermöglichen die Rekombination zwischen den exprimierten und ruhenden vls-Sequenzen, wahrscheinlich durch eine reziprokalen Gen-Konversions-Mechanismus;
    • (iii) die konservierten 17-bp-gerichteten Repeat-Sequenzen können in das Alignment der vls-Sequenzen während der Rekombination involviert sein oder in das Binden von vorgeschlagenen Orts-spezifischen Rekombinase(n);
    • (iv) durch multiple Rekombinationsereignisse werden Teile der Expressionsstellen ersetzt durch Segmente verschiedener ruhender vls-Kassetten, welche in einem breit angelegten Array von potenziellen vlsE-Allelen resultieren; und
    • (v) der ortsspezifische Mechanismus wird aktiviert in vivo, was in einer hohen Rate der Rekombination resultiert. Da sowohl die vlsE als auch die ruhenden vls-Kassetten im gleichen linearen Plasmid pBB28La lokalisiert sind, wird in B. burgdorferi (2A) intraplasmische Rekombination höchstwahrscheinlich involviert sein. Jedoch ist es auch möglich, dass interplasmische Rekombination von multiplen Kopien des pBB28La-Plasmids in jedem Organismus vorliegen, wie dies für die vmp-kodierenden Plasmide von B. hermsii gezeigt wurde (Kitten und Barbour, 1992).
  • Genetische Variation involviert in multiplen Gen-Familien wurde in mehreren anderen pathogenen Mikroorganismen beschrieben (Borst und Geaves, 1987; Borst et al., 1995; Donelson, 1995). Im Kontext der kombinatorischen Rekombination ist die genetische Variation an der vlsE-Stelle ähnlich zu derjenigen der Pilin-kodierenden Gene von N. Gonorrhoeae (Seifert und So, 1988). Der Gonococcal-Pilus besteht in erster Linie aus sich wiederholten Untereinheiten von 18 Kilodalton-Pilin-Protein und ist für die Adhärenz des Bakteriums an eine Vielzahl von menschlichen Zellen notwendig (Swanson und Koomey, 1989). Während die vollständigen Pilin-Gene nur an den beiden Expressionsstellen exprimiert werden (pilE1 und pilE2), finden sich multiple ruhende Kopien (pilS) enthaltende Teile der Pilin-Gene über einen breiten Bereich auf dem Gonococcal-Chromosom (Haas und Meyer, 1986). Durch multiple kombinatorische rekombinante Ereignisse kann ein einzelner Gonococcal-Klon, welcher einen Pilin-Stereotyp exprimiert, eine große Anzahl von Nachkommen hervorbringen, welche antigenetisch unterschiedliche Pilin-Varianten exprimieren (Meyer et al., 1982; Hagblom et al., 1985; Segal et al., 1986). Die Rekombination zwischen der Expression und ruhenden Stellen tritt prädominant über einen nicht-reziproken Gen-Konversions-Mechanismus auf (Haas und Meyer, 1986; Koomey et al., 1987).
  • Die kodierenden Sequenzen von Neisseria Pilin-Varianten werden in konstante, semivariable und hypervariable Regionen unterteilt (Haas und Meyer, 1986), welche analog zu den konservierten und variablen Regionen der vls-Kassetten sind (3B, 5B und 5C). Die konstanten Regionen und eine konservierte DNA-Sequenz (Sma/Cla-Repeat), lokalisiert am 3'-Ende aller Pilin-Stellen, sollen die Regionen involviert in die Rekombinationsereignisse paaren (Wainwright et al., 1994). In diesem Kontext können die 17-bp-gerichteten Repeats (2C) und die konservierten Regionen (3B) der vls-Kassetten eine ähnliche Rolle in Rekombinationsereignissen spielen. Die ruhenden Stellen der Gonococcal Pilin-Gene enthalten verschiedene Regionen der kompletten Pilin-Gene (Haas und Meyer, 1986), wohingegen die ruhenden vls-Kassetten von B. burgdorferi nur die zentrale Kassettenregion des vlsE-Gens repräsentieren (3B).
  • Nicht-reziproke Rekombinationen treten auch zwischen den exprimierten und den ruhenden Genen auf, welche Varianten-Oberflächen-Glykoproteine (variant surface glycoproteins, Vsgs) in afrikanischen Trypanosomen kodieren (Donelson, 1995). Basierend auf Ähnlichkeiten zwischen der vls-Stelle und den multiplen Gen-Familien der anderen pathogenen Mikroorganismen ist es wahrscheinlich, dass ein unidirektionaler Gen- Konversionsmechanismus auch an der vls-Stelle aktiv ist. Jedoch gibt es bislang keine Daten in Bezug auf die Präsentation der ruhenden vls-Kassetten, und der exakte Mechanismus der vls-Rekombination muss noch bestimmt werden.
  • Es gibt starken Hinweis darauf, dass genetische Variation an der vls-Stelle Antigen-Variation erzeugt. Die proliferierte Rekombination an der vlsE-Stelle in C3H/HeN-Mäusen unterstützt die Möglichkeit der Antigen-Variation bei Lyme-Erkrankungen, verursacht durch Borreliae. Die verminderte Reaktivität auf Antikörper gegen die parentale vls-Kassettenregion unter den klonalen Populationen von Maus-Isolaten demonstriert, dass genetische Variation an der vlsE-Stelle in Veränderungen in der Antigenizität der vlsE-Varianten resultierte. Schließlich erzeugten C3H/HeN-Mäuse, infiziert mit B. burgdorferi, starke Antikörperantworten gegen das parentale vlsE-Protein, jedoch zeigten die gleichen Antiseren konsistent mit den Ergebnissen, erhalten mit Antikörpern gegen das GST-Vls1-Fusionsprotein, verminderte Reaktivitäten mit einigen der vlsE-Varianten, isoliert von den Mäusen (6C). Da vlsE ein Oberflächen-exponiertes Lipoprotein ist, wie durch die Verdauung mit Proteinase K (4A und 4B) und [3H]-Palmitat-Radiolabeling-Untersuchungen angezeigt wird, kann diese vorgeschlagene antigene Variation ermöglichen, dass die Lyme-Krankheit Borreliae Immunattacken, gerichtet gegen vlsE, überlebt.
  • Variation von B. burgdorferi Oberflächenproteinen, wie z.B. vlsE, kann auch die Viruleszenz der Organismen beeinträchtigen und deren Fähigkeit, sich an verschiedene Mikroumgebungen während der Infektion des Säugetierwirts anzupassen. Jüngste Untersuchungen eines Borrelia turicatae Mausinfektionsmodells, welches Lyme-Erkrankung ähnelt, zeigte, dass ein Serotyp, welcher VmpB exprimierte, stärkere arthritische Manifestationen zeigte, wohingegen ein anderes, exprimierend VmpA, ernstere Involvierung des zentralen Nervensystems zeigte (Cadavid et al., 1994). Die Zahlen der Borreliae, vorliegend in den Gelenken und im Blut von Serotyp B-infizierten Mäusen, waren viel höher als diejenigen von Mäusen, infiziert mit Serotyp A, was konsistent ist mit einer Beziehung zwischen dem Vmp-Serotyp und der Schwere der Erkrankung (Pennington et al, 1997). Antigen-Variation von Neisseria Pilin (Lambden et al., 1980; Rudel et al., 1992; Nassif et al.; 1993; Jonsson et al, 1994) und Opa-Proteinen (Kupsch et al., 1993) ist als die Adhärenz der Organismen gegen menschliche Leukozyten und Epithelzellen beeinträchtigend bekannt.
  • Die Bedeutung des vls-enthaltenden Plasmids pBB28La während der Infektion wird unterstützt durch den folgenden Nachweis:
    • (i) alle hochinfektiven Klone und Stämme, welche bislang getestet wurden, enthalten das vls-enthaltende Plasmid pBB28La und der Verlust dieses Plasmids korreliert mit einer Abnahme der Infektivität (1B);
    • (ii) pBB28La wurde in allen tierischen Isolaten, welche bislang getestet wurden, aufrecht erhalten; und
    • (iii) die vls-Sequenzen sind über drei Lyme-Erkrankungs-Genospezies hinweg konserviert trotz ihrer genetischen Heterogenität (Casjens et al., 1995) sowie der Diversität in Plasmidprofilen (Xu und Johnson, 1995). Auf der anderen Seite zeigten B. burgdorferi-Klone mit oder ohne Plasmid pBB28La ähnliche Wachstumsraten in Kulturmedium. Darüber hinaus wird pBB28La leicht verloren, solange sich in vitro-Subkulturen in einer frühen Phase bis Passage 5 befinden. Folglich scheint das Vorliegen von pBB28La wenig, falls überhaupt, einen Effekt auf das in vitro-Wachstum zu haben, aber sehr wohl einen profunden Effekt auf die Fähigkeit, Säugetierwirte zu infizieren, aufzuweisen.
  • VlsE (oder potenziell andere Gene, kodiert durch pBB28La) scheint eine andere bedeutsame, jedoch undefinierte Funktion aufzuweisen, welche nicht mit der Antigen-Variation verwandt ist. Klone geringer Infektivität, welche das vls-kodierende Plasmid pBB28La nicht aufweisen, propagieren nicht in Severe Combined Immunodeficiency(SCID)-Mäusen, was darauf hindeutet, dass der benötigte Faktor (die benötigten Faktoren) eine bedeutende Funktion nicht verwandt zur Umgehung des adaptiven Immunsystems zur Verfügung stellt (stellen). Des Weiteren scheint die in vivo-Selektion gegen Bb-Klone, welchen pBB28La fehlt, früh in der Infektion aufzutreten (innerhalb der ersten Woche), bevor die adaptive Immunantwort nach allgemeiner Erwartung signifikantem Selektionsdruck ausgesetzt würde. Folglich ist es wahrscheinlich, dass vlsE eine bedeutsame Rolle in einigen Aspekten der Infektion spielt (beispielsweise Kolonisierung, Dissemination, Adhärenz, Extravasion, Umgehung des immanenten Immunmechanismus oder der Nährstoffversorgung), und dass die Antigen-Variation in erster Linie die Oberflächenexpression dieses Proteins ermöglicht, ohne zur Eliminierung des Bakteriums durch die Immunantwort des Wirtes zu führen. Der Erhalt dieser Aktivität würde verlangen, dass die Variation in den Aminosäuresequenzen nicht mit den aktiven Stellen (der aktiven Stelle) des Proteins Wechselwirken würde; diese Notwendigkeit kann die Existenz von hochkonservierten Regionen an den N- und C-Termini und innerhalb der vls-Kassette erklären. Sequenzvariation als ein Mechanismus des Erhalts der Oberflächen-Proteinfunktion angesichts einer Immunantwort des Wirts kann eine Strategie sein, die pathogenen Mikroorganismen gemeinsam ist.
  • 4.1 Antigen-Variation in B. hermsii
  • Ein komplexer Antigen-Variationsmechanismus wurde in Borrelia hermsii charakterisiert, einem Verwandten von B. burgdorferi, welche rezidivierendes Fieber erzeugt (Balmelii und Piffatetti, 1996; Barbour, 1993; Donelson, 1995). Oberflächen-exponierte Lipoproteine, genannt variable hauptsächliche Proteine (variable major proteins, Vmps), werden durch homologe Gene kodiert, lokalisiert in 28 bis 32 kb-linearen Plasmiden mit kovalent geschlossenen Telomeren (Barbour und Garon, 1987; Kitten und Barbour, 1990). Die vmp-Gene wurden in zwei Gruppen unterteilt: kleine und große (Restrepo et al., 1992). Große vmp-Gene, wie z.B. vmp7 und vmp17, und kleine vmp-Gene, wie z.B. vmp1 und vmp3, sind ungefähr 1 kb bzw. 0,6 kb groß. Jeder Organismus enthält sowohl kleine als auch große vmp-Gene in einer unexprimierten (ruhenden) Form in den sogenannten Lagerungsplasmiden (Plasterk et al., 1985). Nur ein vmp-Gen lokalisiert in der Nähe von den Telomeren eines verschiedenen Plasmids (genannt das Expressionsplasmid) wird in jedem Organismus exprimiert (Kitten und Barbour, 1990; Barbour et al., 1991a). Antigen-Variation tritt auf, wenn das exprimierte vmp vollständig oder partiell durch eines der ruhenden vmp-Gene an der telomeren Expressionsstelle ersetzt wird durch interplasmische Rekombination (Meier et al., 1985; Plasterk et al., 1985; Barbour et al., 1991b) intraplasmische Rekombination (Restrepo et al., 1994) und Post-Switch-Reorganisation (Restrepo und Barbour, 1994). Der Antigen-Switch tritt spontan bei einer Häufigkeit von 10–3 bis 10–4 pro Generation auf (Stoenner et al., 1982).
  • 4.2 Identifikation von vls
  • Ein genetischer Ort (vmp-ähnliche Sequenz oder vls) wurde identifiziert und charakterisiert in B. burgdorferi, welcher überraschenderweise dem vmp-System von B. hermsii ähnelt. Eine vls-Expressionsstelle (vlsE) und 15 weitere ruhende vls-Kassetten wurden auf einem 28 kb-linearen Plasmid (mit der Bezeichnung pBB28La) identifiziert. Das Vorliegen von pBB28La korreliert mit dem hochinfektiven Phenotyp B. burgdorferi Sensu Lato Stämmen, die getestet wurden. VlsE, lokalisiert in der Nähe eines Telomers von pBB28La, kodiert ein Oberflächen-exponiertes Lipoprotein. Untersuchungen von Ohr- und Blut-Isolaten von C3H/HeN-Mäusen, infiziert 4 Wochen zuvor mit dem B31-Klon 5A3, demonstrierte die Untersuchung von verschiedener Rekombination an der vlsE-Stelle, so dass jeder der B. burgdorferi-Klone, der untersucht wurde, einzigartig war und scheinbar multiplen Rekombinationsereignissen mit Teilen der ruhenden vls-Kassetten unterlegen war. Die resultierenden vlsE-Varianten zeigten eine verminderte Reaktivität gegen Antiserum gerichtet gegen die parentale vls-Kassettenregion. Dieses aufwendige genetische System ermöglicht kombinatorische Antigen-Variation von vlsE in Säugetierwirten, und trägt dabei zur Umgehung der Immunantwort und zum Langzeit-Überleben in dem Säugetierwirt bei.
  • Die vorliegende Erfindung illustriert das rasche Auftreten von unterschiedlicher Rekombination an der vls-Expressionsstelle (vlsE), was in einer kombinatorischen Form von genetischer und antigenischer Variation an der vlsE-Stelle resultiert. Antigen-Variation an der vlsE-Stelle wurde nachgewiesen unter Verwendung eines in vivo-Selektionsansatzes.
  • Die Sequenzvariation führt scheinbar zu einer signifikanten Antigen-Variation. Kaninchen-Antiserum, erzeugt gegen ein vls-GST-Fusionsprotein, reagierte stark mit dem ursprünglichen B. burgdorferi-Klon (B31 5A3), reagierte jedoch nicht mit mehreren der Klone, reisoliert aus Mäusen 4 Wochen nach Infektion.
  • B. burgdorferi induziert einen ortsspezifischen Rekombinationsmechanismus während der Infektion des Säugetierwirts. Die vlsE-Kassettensequenz in jedem der Maus-Isolate ist einzigartig. Auf der Nukleotid-Ebene besteht jede vlsE-Kassette aus Regionen, identisch zu einigen der ruhenden vls-Kassetten. Die verschiedene Rekombination von ruhenden vls-Kassetten-Segmenten erzeugt eine kombinatorische Diversivität an der vlsE-Expressionsstelle, ähnlich zu der Diversivität, möglich in den Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor-variablen Regionen. Im Gegensatz dazu involviert die antigene Variation in rezidivierenden Fieberorganismen üblicherweise das Ersetzen des ganzen Gens an der Expressionsstelle mit einem der "ruhenden" VMP-Gene. Des Weiteren ist ein einziger VMP-Serotyp während jedem Rückfall prädominant.
  • Der Mechanismus des genetischen Switchings scheint verschieden von irgendeinem anderen antigenen Variationsmechanismus, beschrieben in Bakterien oder Protozoen zu sein und hat bedeutsame Implikationen für die Lyme-Krankheit. Durch Kombinieren verschiedener Regionen der ruhenden vls-Kassetten ist es möglich, für viele verschiedene vlsE-"Serotypen" im gleichen Patienten zu koexistieren. Es kann für den Wirt möglich sein, eine schützende Antwort gegen eine dieser klonalen Populationen zu etablieren, aufgrund der kleinen Anzahl eines jeden Typus. Selbst die Etablierung einer Antwort gegen einen Serotyp würde nicht gegen sich schnell ausbreitende neue Serotypen schützen. Die Tatsache, dass B. burgdorferi solch einen komplexen Mechanismus zum Variieren der Sequenz an vlsE entwickelt hat, zeigt die Bedeutung des Proteins in der Pathogenese und/oder Immun-Umgehung.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine repetitive DNA-Sequenz ungefähr 500 bp an Länge, welche in multiplen, nicht identischen Kopien in einem 28 kb-linearen Plasmid von infektiösem Borrelia burgdorferi, dem verursachendem Erreger der Lyme-Erkrankung, vorliegt. Die DNA-Sequenzen kodieren Polypeptide, welche Sequenzähnlichkeit zu den variablen Hauptproteinen (variable major proteins, VMPs) des rezidivierenden Fiebers Borreliae (wie z.B. B. hermsii), aufweisen. VMPs sind hochantigene Oberflächenproteine und das rezidivierende Fieber Borreliae ist in der Lage, diese durch einen rekombinanten genetischen Mechanismus zu verändern und dabei die Immunantwort zu umgehen. Antikörper gegen ein spezielles VMP verleihen Schutz, was in der schnellen Leerung von Bakterien des korrespondierenden Serotyps resultiert. In B. burgdorferi liegen VMP-ähnliche Sequenzen (vls) auf einem 28 kb-linearen Plasmid vor, und dieses Plasmid scheint Viruleszenzfaktor(en), benötigt für die Infektivität, zu kodieren. Die Sequenz einer 16 kb-Region dieses Plasmids enthält zumindest 20 Kopien der VMP-ähnlichen Sequenz.
  • Die Erfinder haben Gene identifiziert sowie Genprodukte, welche wichtig in der Infektivität und Pathogenese von B. burgdorferi zu sein scheinen. In früheren Untersuchungen (Norris et al., 1995) wurde gezeigt, dass klonale Populationen von B. burgdorferi isoliert nach 5 bis 15 in vitro-Passagen signifikant in ihrer Infektivität in dem C3H/HeN-Mausmodell variierten. Sogenannte hochinfektive und niederinfektive Klone unterschieden sich um das 500-fache in ihrer mittleren Infektionsdosis (1,8 × 102 gg. 1 × 105), zeigten aber dennoch keine offensichtlichen Unterschiede im Hinblick auf den Proteingehalt (wie durch zweidimensionale Gelelektrophorese und Silber-Anfärben bestimmt wurde) oder im Hinblick auf Plasmidgehalt (bestimmt durch Agarosegel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärben). Jedoch unter Verwendung subtraktiver Hybridisierung zwischen DNA von hochinfektiven und niedriginfektiven Organismen wurden spezifische Sequenzen identifiziert, welche zwischen den beiden Typen unterschiedlich waren. Diese Sequenzen wurden als VMP-ähnliche Sequenzen (vls) charakterisiert, die nun erstmals in B. burgdorferi identifiziert wurden.
  • In ursprünglichen Untersuchungen wurden unklonierte Hoch-Passagen-(HP) und Niedrig-Passagen-(low-passage, LP)Populationen vom B. burgdorferi-Strang B31 als eine Quelle von DNA für subtraktive Hybridisierung verwendet. HP B31 wurde in vitro für ungefähr 1000 Passagen kultiviert und als nicht infektiös identifiziert, wohingegen LP B31-Passagen in vitro ungefähr fünfmal infektiös in dem C3H/HeN-Mausmodell bleiben. Die Plasmid-DNA eines jeden Strangs wurde aufgereinigt. Die DNA von HP B31 wurde zufällig zerstückelt durch Ultraschall, wohingegen die DNA von LP B31 vollständig mit dem Restriktionsenzym Sau3AI verdaut wurde. Die DNA der beiden Stränge wurde denaturiert durch Erhitzen auf 100°C, in einem Verhältnis von 50:1 HP DNA zu LP DNA gemischt, und man ließ sie mit gestückelter HP DNA hybridisieren; als ein Ergebnis wurden die Sau3AI-Restriktionsstellen nicht regeneriert. Einzigartige Segmente von LP DNA tendieren dazu, mit dem komplementären LP DNA-Strang zu hybridisieren und die Sau3AI "Sticky Ends" werden regeneriert. Ein Teil der hybridisierten Mischung wurde in den pBluescript II SK (Stratagene) ligiert, welcher zuvor mit BamHI und alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die ligierte Präparation wurde verwendet, um E. coli XL-1 Blue-Zellen zu transformieren und die Transformanten wurden durch Plattieren der Bakterien auf Luria Broth (LB)-Agarplatten, enthaltend Ampicillin und Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG) sowie 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactosid (X-Gal) ausgewählt. Jegliche resultierende weißen Kolonien (E. coli, enthaltend ein Plasmid mit einem DNA-Insert) wurden ausgewählt für weitere Untersuchungen und zur Sequenzanalyse.
  • Eines der resultierenden rekombinanten Plasmide mit der Bezeichnung pJRZ53 enthielt DNA, kodierend einen einzelnen zusammenhängenden offenen Leserahmen (ORF) mit 562 bp an Länge. Die deduzierte Aminosäuresequenz dieses ORF zeigte eine signifikante Homologie mit VMP-Proteinen von B. hermsii, hauptsächlich von Vmp17, Vmp21, Vmp7 und Vmp25 (27,2 bis 20,3% Identität, 50,0 bis 56,8% Similantät). Hybridisierung von pJRZ53 mit Southern Blots von B. burgdorferi-Plasmiden zeigte, dass diese VMP-ähnliche DNA-Sequenz auf einem 28 kb-linearen Plasmid lokalisiert war.
  • Weitere DNA-Rekombinanten, enthaltend Sequenzen hybridisierend mit pJRZ53, wurden abgeleitet von einer PstI-Bibliothek von B. burgdorferi B31-Plasmid-DNA. B. burgdorferi B31-Plasmid-DNA wurde behandelt mit mehreren Restriktionsenzymen, um die beste Kombination zum Klonieren eines größeren Fragments, enthaltend die pJYZ53-Sequenz, zu bestimmen. Überraschenderweise lagen verschiedene Bänder hybridisierend mit pJRZ53-Sonde in DNA verdaut mit PstI, RsaI, Sau3AI und anderen Enzymen vor. Dieses Ergebnis demonstrierte, dass multiple Sequenzen, welche dem pJRZ53-Insert ähnelten, in dem 28 kb-Plasmid vorlagen.
  • Verschiedene zusätzliche rekombinante Klone wurden erhalten durch Behandeln von B. burgdorferi-Plasmid-DNA mit PstI, Ligieren der Fragmente in pBluescript II SK, Transformieren von E. coli mit den resultierenden Rekombinanten und Screenen der Bibliothek hinsichtlich Hybridisierung mit pHRZ53. Sequenzbestimmungen dieser rekombinanten Klone bestätigen das Vorliegen von multiplen Sequenzen, welche hochhomolog, jedoch nicht identisch mit der pHRZ53-Sequenz waren. Diese Homologie auf der DANN- sowie auf der Protein-Ebene wird exemplarisch dargestellt durch den Vergleich der beiden zusammenhängenden Repeats, welche in pHRZ53-31 sowie in dem unabhängig erhaltenen 1143 bp PstI-Klon, welcher mit der pJRZ53-Sequenz überlappt, gefunden wurden. Das Alignment der 5'- und 3'-Regionen von pJRZ53-31 zeigt hoch homologe Wiederholungen (Repeats) in der DNA-Sequenz des rekombinanten Klons pJRZ53-31. Die DNA-Sequenz von den 5'-(nt 1–578) und 3'-(nt 579–1143)Regionen wurden aligned unter Verwendung des GCG-Programms GAP. Es trat 93% Identität zwischen den 5'- und 3'-Regionen auf. Die deduzierten Aminosäuresequenzen der DNA-Regionen wurden aligned unter Verwendung des GCG-Programms GAP. Die gesamte Sequenzähnlichkeit und Identität betrug 92% bzw. 85%.
  • Nachfolgende Untersuchungen verwendeten klonale Populationen von B. burgdorferi, erhalten durch Suboberflächen-Kolonieausbildung von Passage 5-Organismen auf Agarplatten (Norris et al., 1995). Diese Klone waren charakterisiert im Hinblick auf die Infektivität und wurden unterteilt in hochinfektive und niederinfektive Phenotypen. pJRZ53 hybridisierte mit einem 28 kb Band in 6/9 B31-Klonen und 7/10 sH2-2-82-Klonen. Alle 12 hochinfektiösen Klone enthielten das Plasmid, wohingegen 6 von 7 niederinfektiven Klonen das Plasmid nicht aufwiesen (Tabelle 2). Es trat eine Korrelation des Vorliegens eines 28 kb Plasmids, enthaltend die pJRZ53-Sequenz mit der Infektivität von B. burgdorferi klonalen Population auf. Genomische DNA-Präparationen von 10 Sh2-2-82-Klonen und 9 B31-Klonen (Norris et al., 1995) wurden einer Gelelektrophorese im pulsierten Feld unterzogen und auf Nylonmembranen übertragen. Das 562 bp große pJRZ53-Insert, gelabeled mit 32P, wurde an Southern Blots hybridisiert. Kontrollen bestanden aus nicht klonierten Populationen von Hoch-Passagen-, nicht infektiösen B31 (–) und Niedrig-Passagen-, infektiösen B31 (+). Alle hochinfektiven Klone (+) besaßen ein 28 kb Plasmid, das mit pJRZ53 hybridisierte, wohingegen nur 1/7 der niederinfektiven Klone (–) das Plasmid aufwiesen.
  • Folglich besteht eine starke Korrelation zwischen dem Vorliegen des 28 kb Plasmids und der Infektivität. Plasmidprofile im gleichen Gel, verwendet für die Southern Blot-Hybridisierung, förderten keinerlei Unterschiede in der Ethidiumbromid-Anfärbung in der Region des 28 kb Plasmids aufgrund des Vorliegens von mehreren anderen, gleichzeitig mitwandernden Plasmide zutage. Der eine niederinfektive Klon, welcher das Plasmid enthielt, kann möglicherweise ein funktionales Gen oder Gene, welche andere viruleszente Faktoren kodieren, nicht aufweisen.
  • TABELLE 2 Korrelation zwischen der Infektivität und dem Vorliegen des 28 kb-linearen Plasmids, hybridisierend mit der pJRZ53-Sequenz
    Figure 00490001
  • Eine Kartierung des 28 kb-linearen Plasmids (mit der Bezeichnung pBb28L) zeigte ein 16 kb Fragment des pBb28L des bakteriellen Klons B31-5A3, welches in den Vektor Lambda Dash II (Strategene, LaJolla, CA) kloniert worden war. Kurz gesprochen wurde eine Präparation von Plasmid-DNA mit S1-Nuklease behandelt, um die kovalenten geschlossenen Enden (Telomere) des linearen Plasmids zu zerstören. Nach der Behandlung mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase wurde ein Oligonukleotid-Linker, enthaltend eine EcoRI-Stelle auf die Enden ligiert. Die Herstellung wurde dann mit EcoRI behandelt (um die DNA sowohl am Linker als auch an der zuvor markierten internalen EcoRI-Stelle zu schneiden) und in die EcoRI-Stelle des Lambda Dash II ligiert. Klone, enthaltend die pJRZ53-Sequenz wurden durch Hybridisierung identifiziert und enthielten zwei überlappende Klone mit 12 kb und 16 kb an Länge. Partielle Sequenzanalyse der Sequenz des 16 kb Fragments förderten das Vorliegen von zumindest 17 VMP-ähnlichen Sequenzen innerhalb dieser Region zutage.
  • Über 9500 bp an DNA-Sequenz des B. burgdorferi-DNA-Inserts in Lambda Dash II-Klon 12-1 wurden erhalten. Diese Sequenz wurde bestimmt durch automatisierte Sequenzanalyse (unter Verwendung von T3, T7 und internalen Primern) von Dash II 12-1 selbst, wie auch von Teilen von 12-1 kloniertem pBluescript unter Verwendung von Fragmenten, erhalten durch zufälliges DNasel-mediatisiertes Schneiden oder durch Verdauen mit PstI oder RsaI. Sequenzen wurden zusammengesetzt unter Verwendung des GCG-Programms Gelassemble und zeigten eine durchschnittliche Redundanz von 4-fach. Der hohe Grad der Sequenzidentität unter verschiedenen Regionen verlangte eine sorgsame Verifikation von Sequenz-Unterschieden und manuelles Alignment der Sequenzen in einigen Fällen.
  • Die erhaltenen Sequenzen deuten auf das Vorliegen von zumindest einem offenen Leserahmen hin, welcher eine Expressionsstelle (vlsE1) repräsentiert, und von zumindest 16 zusätzlichen, nicht identischen offensichtlich "ruhenden" (nicht exprimierte) vls-Kassetten. Eine Consensus-Ribosom-Bindungsstelle (RBS, unterstrichen) ist 8 Nukleotide (nt) strangaufwärts von der vorhergesagten Translationsstartstelle an den Nukleotiden 75 bis 77 lokalisiert. Das vorhergesagte Produkt vlsE1 hat ein Molekulargewicht von 35881 kDa. Die ersten 19 Aminosäuren des vorhergesagten N-Terminus enthalten eine mögliche Signalpeptidsequenz mit einem Motiv eines geladenen N-Terminus, einer hydrophoben Region und einer potentiellen Signal-Peptidase II-Schnittstelle (FINC, doppelt unterstrichen), welche denjenigen, gefunden in anderen borrelialen Lipoproteinen ähneln. Die vorhergesagte Polypeptidgröße nach Schneiden an dieser Stelle ist 33957 kDa, und der vorhergesagte isoelektrische Punkt ist 7,3. Außer für das Signalpeptid ist das vorhergesagte Protein größtenteils hydrophil. Das putative Stopkodon ist an nt 1143–1145 lokalisiert, nur 82 nt vom telomeren Ende von pBb28L entfernt.
  • Expression von vlsE1 in hochinfektivem B. burgdorferi B31-Klon 3 wurde verifiziert durch Northern Blot-Analyse und reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCRTM). Hybridisierung des radiogelabelten pJRZ53-Inserts mit Blots von RNA, abgetrennt durch Agarose-Elektrophorese, deuteten auf das Vorliegen eines Transkripts hin, welches eine homologe Sequenz enthielt. Für RT-PCRTM wurden Primer korrespondierend zu nt 835–857 (Plusstrang) und nt 1010–1032 (Minusstrang) der Sequenz in 2C konstruiert. Der Minusstrang-Primer wurde verwendet in Kombination mit AMV reverser Transkriptase und RNA isoliert vom B31-Klon 3, um ein cDNA-Produkt zu erzeugen. Die cDNA wurde dann amplifiziert durch Standard-PCRTM unter Verwendung der Plus- und Minus-Primer, was in einem 198 bp Produkt resultierte, welches nachweisbar ist durch Ethidiumbromid-Anfärben von Agarose-Gelen.
  • Das PCRTM-Produkt wurde ligiert in den pCRII-Vektor (Invitrogen) und drei unabhängig abgeleitete Klone förderten Sequenzen zutage, identisch mit denjenigen gezeigt in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3. Kontrollpräparierungen bestanden aus identischen Reaktionen, außer, dass die reversive Transkriptase weggelassen wurde; kein Produkt wurde nachgewiesen. Dieses Ergebnis demonstrierte, dass vlsE1 in B. burgdorferi B31-Klon 3-Organismen transkribiert wird.
  • Die DNA-Sequenz einer vorgeschlagenen "Lagerungs-Stelle" enthält zumindest 15 benachbarte Kopien der vls-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3. Der Beginn und das Ende einer jeden vls-"Kassette" wurde ausgewählt, um zur repetitiven Sequenz (vls1) in vlsE1 zu passen. Die vls-Kassetten, die bisher identifiziert wurden, rangieren von 474 bis 582 nt an Länge; Längenvariation tritt in erster Linie aufgrund von kurzen Insertionen oder Deletionen in vielen von drei Nukleotiden auf, was die selektive Konservierung der offenen Leserahmen anzeigt. Längere Deletionen werden in vls7, vls8 und vls10 beobachtet. vls14 und vls16 enthalten jeweils einen Frameshift und vls11 enthält ein Stopkodon. Ansonsten repräsentiert die 7766 bp Sequenz von SEQ ID Nr. 1 bzw. von SEQ ID Nr. 3 einen zusammenhängenden offenen Leserahmen.
  • Die vls-Kassetten zeigen einen merklichen Grad der Sequenzkonservierung sowohl auf der DANN- als auch der kodierten Aminosäuren-Ebene. Siehe Figuren. Nukleotidsequenzen von B. burgdorferi B31 vls wurden aligned unter Verwendung des GCG-Programms PILEUP. Vls1 korrespondiert mit nt 420–1003 in der Sequenz von 4 und 5. Beim Vergleich mit vls1 unter Verwendung des GCG-Programms GAP zeigen die vls-Sequenzen 90,0% bis 96,1% Nukleotid-Sequenzidentität (6) bzw. 76,9% bis 91,4% vorhergesagte Aminosäure-Sequenzidentität (7). Keine von den bislang identifizierten vls-Kopien zeigt komplette Sequenzidentität, jedoch sind alle eng miteinander verwandt.
  • Tabelle 3 zeigt die identifizierte vls-Segmente und zeigt die Positionen an, an welchen die Segmente möglicherweise als Teil von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 gefunden werden können. Rekombinante Repeat-Segmente werden als "Repeats" identifiziert.
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Der Grad der Sequenzähnlichkeit zwischen den VMP-ähnlichen Sequenzen und B. hermsii-VMP-Proteinen wurde exemplarisch durch ein Alignment des vorhergesagten Translationsproduktes von vlsE1 mit einigen der am ähnlichsten VMP-Sequenzen (vmp17, vmp21, vmp7) dargestellt. Regionen der Ähnlichkeit werden unterbrochen von Flächen von geringer Sequenzidentität. Der G + C-Gehalt von B. burgdorferi-VMP-ähnlichen Sequenzen ist relativ hoch (beispielsweise 49,9% für pJRZ53-31) im Vergleich zum genomischen B. burgdorferi G + C-Gehalt (27 bis 30%) oder desjenigen von B. hermsii-VMP-Genen (beispielsweise 37% für vmp17). Die Sequenzähnlichkeit auf der Protein-Ebene kann aufgrund der divergenten oder konvergenten Evolution bestehen. Es ist auch möglich, dass VMP-ähnliche Sequenzen von einem anderen Organismus akquiriert wurden, geht man vom unterschiedlichen G + C-Anteil aus.
  • Das Alignment entweder der DNA-Sequenzen oder der deduzierten Aminosäuresequenzen der offenen Leserahmen fördert das Vorliegen sowohl von konservierten als auch variablen Regionen der repetitiven Sequenzen zutage. Die konservierten Sequenzen können "Framework"-Regionen repräsentieren, welche bedeutsam für die Gesamtstruktur der Polypeptide sind, wohingegen variable Sequenzen verschiedene Epitope produzieren können. Man glaubt, dass schützende Antikörper erzeugt werden können, entweder gegen die konservierten oder die variablen Teile der putativen Aminosäuresequenzen.
  • Die exprimierte Kopie von vls (vlsE1) wurde identifiziert und sequenziert. Ein Segment des vlsE-Gens korrespondierend zur Kassettenregion wurde subkloniert in den pGEX-2T-Expressionsvektor und das resultierende GST-vls1-Fusionsproteinprodukt wurde erzeugt und aufgereinigt. Antikörper gegen das rekombinante Protein wurden verwendet zur Identifizierung des nativen Proteins in SDS-PAGE und zweidimensionalen Gelelektrophorese-Mustern von B. burgdorferi-Proteinen durch Immunoblotten. Infizierte Patienten und Tiere erzeugten Antikörper gegen das Protein, welche durch Immunoblot-Analyse nachgewiesen wurden, unter Verwendung des rekombinanten Proteins als Antigen (6C, 6D und 6E). Darüber hinaus kann das aufgereinigte rekombinante Protein zur Immunisierung von Mäusen und anderen Tieren verwendet werden, um zu bestimmen, ob Antikörper oder zelluläre Antworten gegen das Protein schützend gegen Infektion mit B. burgdorferi und anderen Lyme-Krankheits-Borreliae sind. Solche tierische Untersuchungen würden das Potenzial der Impfung von Menschen und Tieren mit vls-Proteinsequenzen oder DNA-Sequenzen zur Immunoprofilaxe bestimmen.
  • 4.3 ELISAs
  • ELISAs können verwendet werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. In einem ELISA-Assay werden Proteine oder Peptide inkorporierend Borrelia-VMP-ähnliche Antigensequenzen auf einer ausgewählten Oberfläche immobilisiert, vorzugsweise eine Oberfläche, welche eine Proteinaffinität zeigt, wie z.B. Wells einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach Waschen, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen, ist es wünschenswert, die Assay-Platten-Wells mit einem nichtspezifischen Protein zu binden oder zu coaten, von dem man weiß, dass es antigenetisch neutral ist im Hinblick auf die Test-Antiseren wie z.B. Bovinserumalbumin (BSA), Kasein oder Lösungen von Milchpulver. Dies ermöglicht das Blockieren der nichtspezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und reduziert folglich den Hintergrund verursacht durch nichtspezifisches Binden von Antiseren auf der Oberfläche.
  • Nach Binden von antigenetischem Material an die Wells, Coaten mit nichtreaktivem Material, um den Hintergrund zu reduzieren, und Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die immobilisierende Oberfläche in Kontakt gebracht mit den Antiseren oder dem klinischen oder biologischen Extrakt, der getestet werden soll, in einer Art und Weise, welche der Immunkomplex(Antigen/Antikörper)-Ausbildung dienlich ist. Solche Zustände schließen vorzugsweise der Antisera mit Verdünnern wie z.B. BSA, Bovingammaglobulin (BGG) und gepufferter Salzlösung (PBS)/Tween® ein. Diese hinzugegebenen Agenzien tendieren auch dazu, bei der Reduktion des nichtspezifischen Hintergrundes zu assistieren. Die geschichteten Antiseren lässt man dann für zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 4 Stunden inkubieren, bei Temperaturen vorzugsweise in einer Größenordnung von ungefähr 25°C bis ungefähr 27°C. Auf die Inkubation wird die Antiserum-kontaktierte Oberfläche gewaschen, damit nicht-immunokomplexiertes Material entfernt wird. Eine bevorzugte Waschprozedur schließt das Waschen mit einer Lösung wie z.B. PBS/Tween® oder Boratpuffer ein.
  • Auf die Ausbildung von spezifischen Immunokomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antigen und nachfolgendem Waschen kann das Auftreten einer bestimmten Menge an Immunokomplexausbildung bestimmt werden, indem man selbigen einem zweiten Antikörper aussetzt mit einer Spezifität für den ersten. Um Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, wird der zweite Antikörper vorzugsweise ein assoziiertes Enzym aufweisen, welches eine Farbentwicklung erzeugen wird auf die Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat. Folglich wird man beispielsweise darauf aus sein, die Antiserengebundene Oberfläche mit Urease, alkalischer Phosphatase oder Peroxidasekonjugiertem Anti-IgG für einen Zeitraum und unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Immunokomplexausbildung dienen, zu inkubieren (beispielsweise Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS-enthaltenden Lösung wie z.B. PBS/Tween®).
  • Nach Inkubation mit dem zweiten Enzym-getaggten Antikörper und auf das Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, hin wird die Menge an Label quantifiziert durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat wie z.B. Harnstoff und Bromocresol Purple oder 2,2'-Azino-di(3-ethyl-benzthiazolin)-6-sulfosäure(ABTS) und H2O2 im Falle von Peroxidase als enzymatischem Label. Die Quantifikation wird dann erreicht durch Messen des Grades der Farberzeugung, beispielsweise unter Verwendung eines Spektralfotometers im sichtbaren Spektrum.
  • 4.4 Epitop-Kernsequenzen
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf Protein- oder Peptidzusammensetzungen gerichtet, welche frei von Zellen und anderen Peptiden sind, welche eine aufgereinigtes Protein oder Peptid umfassen, welches ein Epitop einbringt, das immunologisch kreuzreaktiv mit einem oder mehreren anti-Borrelia-VMP-ähnlichen Antikörpern ist.
  • Wie hier verwendet soll sich der Begriff "einbringend ein Epitop (Epitope), welche(s) immunologisch kreuzreaktiv mit einem oder mehreren anti-VMP-ähnlichen Antikörpern sind (ist), auf ein Peptid- oder Protein-Antigen beziehen, welches eine primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur aufweist, ähnlich zu einem Epitop lokalisiert innerhalb eines Borrelia-VMP-ähnlichem Polypeptids. Der Grad der Ähnlichkeit wird bis zu solch einem Grad sein, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper gerichtet gegen das Borrelia-VMP-ähnliche Polypeptid auch mit dem kreuzreaktiven Peptid oder Proteinantigen binden, reagieren werden oder es sonstwie erkennen werden. Verschiedene Immunoassay-Verfahren können eingesetzt werden in Verbindung mit solchen Antikörpern wie z.B.
  • Westernblotten, ELISA, RIA und dergleichen, und alle diese sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt.
  • Die Identifikation von Borrelia-VMP-ähnlichen Epitopen oder ihren funktionellen Äquivalenten geeignet für die Verwendung in Vakzinen ist ein relativ direkter Prozess. Beispielsweise kann man Verfahren von Hopp, wie sie im US-Patent 4,554,101 gelehrt werden, einsetzen, welches die Identifikation und Präparation von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Die Verfahren beschrieben in mehreren anderen Artikeln und Softwareprogrammen basierend darauf können auch zur Identifizierung von Epitop-Kernsequenzen verwendet werden (siehe beispielsweise Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; US-Patent Nr. 4,544,101). Die Aminosäuresequenz dieser "Epitop-Kernsequenzen" kann dann leicht in Peptide eingebracht werden, entweder durch die Anwendung der Peptidssynthese oder rekombinanter Technologie.
  • Bevorzugte Peptide zur Anwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen in der Größenordnung von ungefähr 8 bis ungefähr 20 Aminosäuren an Länge sein. Es wird vorgeschlagen, dass kürzere antigene Borrelia-VMP-ähnlicheabgeleitete Peptidsequenzen Vorteile unter bestimmten Voraussetzungen zur Verfügung stellen, beispielsweise in der Herstellung von Vakzinen oder bei immunologischen Nachweis-Assays. Beispielhafte Vorteile schließen die Vereinfachung der Herstellung und Aufreinigung, die relativ geringen Kosten und verbesserte Reproduktivität der Produktion sowie vorteilhafte Bioverteilung ein.
  • Es wird vorgeschlagen, dass spezielle Vorteile der vorliegenden Erfindung realisiert werden durch die Herstellung synthetischer Peptide, welche modifizierte und/oder ausgedehnte Epitope/immunogene Kernsequenzen einschließen, welche in einem "universellen" Epitop-Peptid gerichtet auf Borrelia-VMP-ähnliche und zu Borrelia-VMP-ähnlichen verwandte Sequenzen resultieren. Es wird vorgeschlagen, dass diese Regionen diejenigen repräsentieren, welche die am höchsten wahrscheinlichen sind, um T-Zell- oder B-Zellstimulation in einem Tier voranzutreiben und folglich spezifische Antikörperproduktion in solch einem Tier auslösen.
  • Eine Epitop-Kernsequenz wie hier verwendet ist ein relativ kurzes Stück von Aminosäuren, welches "komplementär" mit Antigenbindungsstellen auf transferierenden-bindenden Protein-Antikörpern ist und folglich daran binden wird. Zusätzlich oder alternativ ist eine Epitop-Kernsequenz eine, welche Antikörper erzeugen wird, welche kreuzreaktiv mit Antikörpern sind gerichtet gegen Peptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Es wird sich verstehen, dass im Kontext der vorliegenden Offenbarung der Begriff "komplementär" sich auf Aminosäuren oder Peptide bezieht, welche eine anziehende Kraft zueinander aufweisen. Folglich können bestimmte Epitop-Kernsequenzen der vorliegenden Erfindung optional im Hinblick auf ihre Fähigkeit definiert werden, mit dem Binden des gewünschten Proteinantigens an korrespondierende Protein-gerichtete Antiseren zu konkurrieren oder diese möglicherweise zu ersetzen.
  • Im Allgemeinen glaubt man, dass die Größe des PolyPeptid-Antigens nicht besonders kritisch ist, solange sie zumindest groß genug ist, um die identifizierte Kernsequenz oder Sequenzen zu tragen. Die kleinste bedeutsame Kernsequenz, welche in dieser Offenbarung erwartet wird, würde im Allgemeinen in der Größenordnung von 8 oder 25 sein. Folglich wird diese Größe im Allgemeinen mit den kleinsten Peptid-Antigenen erzeugt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung korrespondieren. Jedoch kann die Größe des Antigens größer sein, wo dies gewünscht ist, solange als sie die grundlegende Epitop-Kernsequenz enthält.
  • Die Identifikation von Epitop-Kernsequenzen ist den Fachleuten auf dem Gebiet, wie beispielsweise in US-Patent 4,554,101 beschrieben, bekannt, welches die Identifikation und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Des Weiteren sind verschiedene Computerprogramme verfügbar zur Anwendung bei der Vorhersage von Antigen-Anteilen von Proteinen (siehe beispielsweise Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Computerisierte Peptidsequenz-Analyseprogramme (beispielsweise DNAStar® Software, DNAStar, Inc. Madison, Wisc.) können auch bedeutsam sein bei der Konzeption synthetischer Borrelia-VMP-ähnlicher Polypeptide und von Peptid-Analoga in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung.
  • Synthesen von Epitopsequenzen oder Peptiden, welche ein antigenes Epitop einschließen innerhalb ihrer Sequenz werden leicht erhalten unter Verwendung konventioneller synthetischer Techniken, wie z.B. der Festphasenmethode (beispielsweise durch die Anwendung von kommerziell verfügbaren Peptidsyntheseautomaten wie z.B. einem Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer), realisiert. Peptid-Antigene synthetisiert in dieser Art und Weise können dann aliquotiert werden in vorbestimmten Mengen und gelagert werden in herkömmlichen Arten und Weisen, wie z.B. in wässriger Lösung oder noch mehr bevorzugt in einem Pulver- oder lyophilisierten Zustand, je nach Anwendung.
  • Im Allgemeinen können sie aufgrund der relativen Stabilität der Peptide leicht in wässrigen Lösungen gelagert werden über relativ lange Zeiträume, falls gewünscht, beispielsweise bis zu 6 Monaten oder mehr, in beinahe jeglicher Art von wässriger Lösung ohne merklichen Abbau oder Verlust von antigener Aktivität. Jedoch, wo ausgedehnte wässrige Lagerung beabsichtigt ist, wird es im Allgemeinen wünschenswert sein, Wirkstoffe einzuschließen, welche Puffer wie z.B. Tris- oder Phosphatpuffer enthalten, um einen pH von ungefähr 7,0 bis ungefähr 7,5 aufrechtzuerhalten. Des Weiteren kann es wünschenswert sein, Wirkstoffe einzuschließen, welche das mikrobielle Wachstum inhibieren, wie z.B. Natriumazid oder Merthiolat. Für die ausgedehnte Lagerung in einem wässrigen Zustand wird es wünschenswert sein, die Lösungen bei 4°C oder, noch mehr bevorzugt, gefroren zu lagern. Selbstverständlich können Peptide, wo sie in einem lyophilisierten oder pulverisierten Zustand gelagert werden, virtuell unbegrenzt gelagert werden, beispielsweise in abgemessenen Aliquots, welche rehydratisiert werden mit einer vorbestimmten Menge an Wasser (vorzugsweise in destillierter Form) oder Puffer vor der Anwendung.
  • 4.5 Immunopräzipitation
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind insbesondere bedeutsam zur Isolation von Antigenen durch Immunopräzipitation. Immunopräzipitation involviert die Separation von Target-Antigenkomponenten aus einer komplexen Mischung und wird verwendet, um isolierte Spuren-Mengen von Proteinen zu diskriminieren oder isolieren. Zur Isolation der Membran-Proteine müssen Zellen in Detergensmyzellen solubilisiert werden. Nichtionische Salze sind bevorzugt, da andere Agenzien, wie z.B. Gallen-Salze, bei saurem pH präzipitieren oder in der Gegenwart bivalenter Kationen.
  • In einer alternativen Ausführungsform sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung bedeutsam für die enge Juxtaposition von zwei Antigenen. Dies ist besonders bedeutsam zum Erhöhen der lokalen Konzentration von Antigenen (beispielsweise Enzym-Substratpaaren).
  • 4.6 Western Blots
  • Die Kompositionen der vorliegenden Erfindung werden bedeutsame Anwendung in Immunoblot- oder Western-Blot-Analyse finden. Die anti-Borrelia-VMP-ähnlichen Antikörper können verwendet werden als hochaffine primäre Reagenzien für die Identifikation von Proteinen immobilisiert auf einer festen Unterlagenmatrix, wie z.B. Nitrocellulose, Nylon oder Kombinationen davon. Im Zusammenhang mit der Immunopräzipitation, gefolgt von Gelelektrophorese, können diese als ein Ein-Stufen-Reagens zur Anwendung beim Nachweis von Antigenen, gegen welche sekundäre Reagenzien, verwendet zum Nachweis des Antigens, einen nachteiligen Hintergrund erzeugen, verwendet werden. Dies ist speziell bedeutsam, wenn die untersuchten Antigene Immunoglobuline (vorausgesetzt, die Verwendung von Immunoglobulinen, welche bakterielle Zellwandkomponenten binden) sind, die untersuchten Antigene mit dem nachweisenden Agens kreuzreagieren oder sie mit dem gleichen relativen Molekulargewicht wie das kreuzreagierende Signal wandern.
  • Immunologisch basierte Nachweisverfahren zur Anwendung im Zusammenhang mit Western Blots schließen enzymatische, Radiolabel- oder fluoreszent-gelabelte sekundäre Antikörper gegen die Toxingruppe ein und werden als besonders anwendbar in dieser Hinsicht betrachtet.
  • 4.7 Vakzine
  • Die vorlieger de Erfindung zielt auf Vakzine zur Anwendung sowohl in aktiven als auch passiven Immunisierungs-Ausführungsformen ab. Immunogene Zusammensetzungen, welche als geeignet zur Anwendung als ein Vakzin vorgeschlagen werden, können am einfachsten direkt von immunogenen Borrelia-VMP-ähnlichen Peptiden hergestellt in einer hier offenbarten Art und Weise erzeugt werden. Vorzugsweise wird das antigene Material extensiv dialysiert, um ungewünschte nieder-molekulargewichtige Moleküle zu entfernen und/oder lyophilisiert zur leichten Formulierung in ein wünschenswertes Vehikel.
  • Die Herstellung von Vakzinen, welche Borrelia-VMP-ähnliche immunogene Peptidsequenzen enthalten als aktive Ingredienzien, ist im Allgemeinen im Stand der Technik gut verstanden, wie exemplifiziert wird durch die US-Patente 4,608,241; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 und 4,578,770. Typischerweise werden solche Vakzine als injizierbare Formen hergestellt. Entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen: feste Formen, geeignet zur Lösung in, oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion können auch hergestellt werden. Die Präparation kann auch emulgiert sein. Das aktive immunogene Ingredienz wird häufig mit Hilfsstoffen vermischt, welche pharmazeutisch akzeptabel und kompatibel mit dem aktiven Ingredienz sind. Geeignete Hilfsstoffe sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glyzerol, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Darüber hinaus kann das Vakzin, falls gewünscht, kleinere Mengen an Hilfsstoffen, Substanzen, wie z.B. benetzende oder emulgierende Wirkstoffe, pH-Puffer-Wirkstoffe oder Adjuvans-Stoffe enthalten, welche die Effektivität der Vakzine verbessern Vakzine sind zur konventionellen Verabreichung, parenteral, per Injektion beispielsweise entweder subkutan oder intramuskulär. Weitere Formulierungen, welche für andere Arten der Verabreichung sind, schließen Suppositorien und in einigen Fällen orale Formulierungen ein. Für Suppositorien können traditionelle Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkylenglycole oder Triglyzeride enthalten: solche Suppositorien können aus Mischungen, enthaltend aktive Ingredienzen in der Größenordnung von ungefähr 0,5% bis ungefähr 10%, vorzugsweise ungefähr 1% bis ungefähr 2% enthalten. Orale Formulierungen enthalten solche normal eingesetzten Hilfsstoffe wie beispielsweise pharmazeutische Spuren von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, verzögerte Freisetzungsformulierungen oder Pulver ein und enthalten ungefähr 10 bis ungefähr 95% an aktivem Ingredienz, vorzugsweise ungefähr 25 bis ungefähr 70%.
  • Die Borrelia-VMP-ähnlichen-abgeleiteten immunogenen Peptide der vorliegenden Erfindung können in das Vakzin als neutrale oder als Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen die sauren Additionssalze (ausgebildet mit der freien Aminogruppe des Peptids) diejenigen ein, welche mit anorganischen Säuren wie z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure gebildet werden, oder organische Säuren wie z.B. Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen. Salze, ausgebildet mit den freien Carbonsäuregruppen, können auch aus anorganischen Basen abgeleitet werden, wie z.B. Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxid und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen.
  • Die Vakzine sind in einer Art und Weise zu verabreichen, die kompatibel ist mit der Dosierungsformulierung und in solch einer Menge, die therapeutisch effektiv und immunogen sein wird. Die Menge, welche verabreicht werden soll, hängt vom zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich beispielsweise, von der Kapazität des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren und vom Grad des gewünschten Schutzes. Präzise Mengen an aktivem Ingredienz, welche benötigt werden zur Verabreichung, hängen vom Urteil des behandelnden Arztes ab. Jedoch sind geeignete Dosierungsbereiche in der Größenordnung von mehreren Hundert Mikrogramm aktivem Ingredienz pro Impfung. Geeignete Therapiepläne zur ursprünglichen Verabreichung und Booster-Injektionen sind auch variabel, jedoch typifiziert durch eine ursprüngliche Administration gefolgt von nachfolgenden Inokulationen oder anderen Administrationen.
  • Die Art und Weise der Verabreichung kann weit variieren. Irgendeines der konventionellen Verfahren zur Verabreichung eines Vakzins ist geeignet. Man glaubt, dass solche Verfahren orale Verabreichung auf einer soliden physiologisch akzeptablen Grundlage oder in physiologisch akzeptabler Dispersion parenteral, per Injektion oder dergleichen einschließen. Die Dosierung des Vakzins wird von der Art der Verabreichung abhängen und wird gemäß der Größe des Wirts variieren.
  • Verschiedene Verfahren zum Erreichen des Adjuvans-Effekts für das Vakzin schließen die Verwendung von Wirksubstanzen, wie z.B. Aluminiumhydroxid oder Phosphat (Alaun), allgemein verwendet als ungefähr 0,05 bis ungefähr 0,1%-Lösung in Phosphat gepufferter Salzlösung, Mischung mit synthetischen Polymeren von Zucker (Carbopol®), verwendet als ungefähr 0,25%-Lösung, Aggregation des Proteins im Vakzin durch Hitzebehandlung mit Temperaturen, welche von ungefähr 70° bis ungefähr 1°C reichen, und zwar für einen Zeitraum von 30 Sekunden bis 2 Minuten, ein. Die Aggregation durch Reaktivieren mit Pepsin-behandelten (Fab) Antikörpern gegen Albumin, eine Mischung mit bakteriellen Zellen wie z.B. C. parvum oder Endotoxinen oder Lipopolysaccharid-Komponenten von Gramm-negativen Bakterien, eine Emulsion in physiologisch akzeptablen Ölvehikeln wie z.B. Mannidmonooleat (Aracel A) oder eine Emulsion mit einer 20%-igen Lösung von Perfluorocarbon (Fluosol-DA®), verwendet als ein Blocksubstitut, können auch eingesetzt werden.
  • In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, multiple Verabreichungen des Vakzins zur Hand zu haben, üblicherweise nicht hinausgehend über sechs Impfungen, noch üblicherer Weise nicht über vier Impfungen hinausgehend und vorzugsweise eine oder mehrere, üblicherweise zumindest ungefähr drei Impfungen. Die Impfungen werden normalerweise in von 2 bis 12 Wochen langen Intervallen sein, mehr üblich in von 3 bis 5 Wochen langen Intervallen. Periodische Booster in Intervallen von 1 bis 5 Jahren, üblicherweise 3 Jahren, werden wünschenswert sein, um schützende Spiegel der Antikörper aufrechtzuerhalten. Der Verlauf der Immunisierung kann von Assays für Antikörper der Überstand-Antigene begleitet werden. Die Assays können durchgeführt werden durch Labeln mit konventionellen Labeln, wie z.B. Radionukleotiden, Enzymen, fluoreszierenden Farbstoffen und dergleichen. Diese Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt und können in einer großen Vielzahl von Patenten gefunden werden, beispielsweise in den US-Patenten Nr. 3,791,932, 4,174,384 und 3,949,064, als illustrativ für diesen Typ an Assay.
  • 4.8 DNA-Segmente
  • In anderen Ausführungsformen ist es beabsichtigt, dass bestimmte Vorteile durch Positionieren des kodierenden DNA-Segmentes unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors erzielt werden. Wie hier verwendet soll ein rekombinanter oder heterologer Promotor sich auf einen Promotor beziehen, welcher normalerweise mit einem DNA-Segment assoziiert ist, das ein Borrelia-VMP-ähnliches Peptid in seiner natürlichen Umgebung kodiert. Solche Promotoren können Promotoren einschließen, welche normalerweise mit anderen Genen assoziiert sind und/oder Promotoren, isoliert aus irgendeiner viralen, prokaryotischen (beispielsweise bakteriellen), eukaryotischen (beispielsweise fungalen, Hefe, Pflanzen oder Tier)-Zelle, und können insbesondere diejenigen von Säugetierzellen einschließen. Natürlicherweise wird es wichtig sein, einen Promotor einzusetzen, welcher effektiv die Expression des DNA-Segments in dem Zelltyp, Organismus oder sogar Tier, ausgewählt zur Expression, steuert. Die Verwendung von Promotor- und Zelltyp-Kombinationen zur Proteinexpression ist im Allgemeinen den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt, beispielsweise siehe Sambrook et al., 1989. Die Promotoren, welche eingesetzt werden, können konstitutiv oder induzierbar sein und können verwendet werden unter geeigneten Bedingungen, um Expression mit hohen Spiegeln des eingeführten DNA-Segments zu steuern, wie es von Vorteil ist in der Produktion von rekombinanten Protein oder Peptiden im Großmaßstab. Geeignete Promotor/Expressionssysteme beabsichtigt zur Anwendung zur Expression im großen Maßstab schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf, ein Pichia Expressionsvektorsystem (Pharmacia LKB Biotechnology), ein Baculovirus-System zur Expression in Insektenzellen oder irgendein geeignetes Hefe- oder bakterielles Expressionssystem.
  • In Verbindung mit Expressions-Ausführungsformen, um rekombinante Proteine und Peptide herzustellen, ist es beabsichtigt, dass größere DNA-Segmente am häufigsten mit DNA-Segmenten, kodierend die gesamte Peptidsequenz als am meisten bevorzugt verwendet werden. Jedoch wird es einsichtig sein, dass die Verwendung kürzerer DNA-Segmente, um die Expression von Borrelia-VMP-ähnlichen Peptiden oder Epitop-Kernregionen zu steuern, wie sie z.B. verwendet werden können, um anti-Borrelia-VMP-ähnliche Antikörper zu erzeugen, auch innerhalb des Umfangs der Erfindung fallen. DNA-Segmente, welche Borrelia-VMP-ähnliche Peptid-Antigene von ungefähr 10 bis ungefähr 100 Aminosäuren an Länge kodieren oder, mehr bevorzugt, von ungefähr 20 bis ungefähr 80 Aminosäuren an Länge oder, noch mehr bevorzugt, von ungefähr 30 bis ungefähr 70 Aminosäuren an Länge, werden als besonders bedeutsam betrachtet.
  • Zusätzlich zu ihrer Verwendung bei der Steuerung der Expression von Borrelia-VMP-ähnlichen Peptiden der vorliegenden Erfindung weisen die Nukleinsäure-Sequenzen, auf die hier abgezielt wird, eine Vielzahl anderer Anwendungen auf. Beispielsweise haben sie Bedeutung als Sonden oder Primer in Nukleinsäure-Hybridisierungs-Ausführungsformen. Als solche ist beabsichtigt, dass Nukleinsäure-Segmente, welche eine Sequenzregion umfassen, welche aus zumindest einer ungefähr 20 Nukleotid langen zusammenhängenden Sequenz besteht, welche dieselbe Sequenz aufweist wie, oder komplementär ist zu einem ungefähr 20 Nukleotid langen zusammenhängenden DNA-Segment von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3, besondere Bedeutung erlangen werden. Längere zusammenhängende identische oder komplementäre Sequenzen, beispielsweise diejenigen von ungefähr 20, 30, 40, 50, 100, 200 (einschließlich aller Zwischenlängen) und sogar diejenigen von bis zu und einschließlich ungefähr 1227-bp (Volllängen) Sequenzen werden auch bedeutsam in bestimmten Ausführungsformen sein.
  • Die Fähigkeit solcher Nukleinsäuresonden, spezifisch mit Borrelia-VMP-ähnlichen kodierenden Sequenzen zu hybridisieren, wird sie befähigen, bedeutsam beim Nachweis des Vorliegens von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe zu sein. Jedoch sind andere Anwendungen angedacht, einschließlich der Verwendung der Sequenzinformation zur Herstellung von mutierten Spezies-Primern oder Primern zur Anwendung beim Herstellen anderer genetischer Konstruktionen.
  • Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzregionen bestehend aus zusammenhängenden Nukleotidstücken von ungefähr 20, 30, 40, 50 oder sogar ungefähr 100 bis ungefähr 200 Nukleotiden oder dergleichen, identisch oder komplementär zur DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3, sind von besonderer Bedeutung als Hybridisierungssonden zur Anwendung in beispielsweise Southern und Northern Blotten. Kleinere Fragmente werden im allgemeinen Anwendung in Hybridisierungs-Ausführungsformen finden, wobei die Länge der zusammenhängenden komplementären Region variiert werden kann, beispielsweise zwischen ungefähr 20 und ungefähr 100 Nukleotiden, jedoch größere zusammenhängende komplementäre Stücke verwendet werden können gemäß der Länge der komplementären Sequenzen, die man nachzuweisen wünscht.
  • Die Verwendung von Hybridisierungssonden von ungefähr 20 Nukleotiden an Länge ermöglicht die Ausbildung eines Duplexmoleküls, welches sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle mit zusammenhängenden komplementären Sequenzen über Stücke von mehr als 20 Basen an Länge sind im Allgemeinen bevorzugt, vor allem, um die Stabilität und die Selektivität des Hybrids zu verbessern und dadurch die Qualität und den Grad der spezifi schen Hybridmoleküle, die erhalten werden, zu verbessern. Man wird im Allgemeinen bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle mit Gen-komplementären Stücken von 20 zusammenhängenden Nukleotiden oder sogar länger zu konzipieren, wo dies gewünscht wird.
  • Selbstverständlich können Fragmente auch erhalten werden durch andere Techniken, wie z.B. mechanisches Spalten oder durch Restriktions-Enzymverdauung. Kleine Nukleinsäure-Segmente oder Fragmente können leicht hergestellt werden beispielsweise durch Direktsynthese der Fragmente mit chemischen Mitteln, wie dies im Allgemeinen praktiziert wird unter Verwendung eines automatisierten Oligonukleotid-Syntheseautomaten. Des Weiteren können Fragmente erhalten werden durch die Anwendung der Nukleinsäure-Reproduktionstechnologie, beispielsweise von PCRTM, durch Einbringen ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion oder durch andere rekombinante DNA-Techniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind.
  • Dementsprechend können die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, um selektiv Duplex-Moleküle mit komplementären Strängen an DNA-Fragmenten auszubilden. Abhängig von der beabsichtigten Anwendung wird man wünschen, variierende Bedingungen der Hybridisierung einzusetzen, um variierende Grade der Selektivität der Sonde gegen die Targetsequenz zu erzielen. Für Anwendungen, welche höhere Selektivität verlangen, wird man typischerweise verlangen, relativ stringente Bedingungen einzusetzen, um Hybride auszubilden, d.h. Bedingungen hoher Stringenz, wo man relativ wenig Salz auswählen wird und/oder hohe Temperaturbedingungen, wie z.B. bereitgestellt durch ungefähr 0,02 M bis ungefähr 0,15 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 50°C bis ungefähr 70°C. Solche selektiven Bedingungen tolerieren wenig, falls überhaupt, Mismatches zwischen der Sonde und dem Templat- oder dem Target-Strang und würden besonders geeignet zum Isolieren von Borrelia-VMP-ähnlichen kodierenden DNA-Segmenten sein. Der Nachweis von DNA-Segmenten über die Hybridisierung ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und die Lehren von US-Patenten Nr. 4,965,188 und 5,176,995 (jeweils eingeschlossen per Verweis) sind exemplarisch für die Verfahren der Hybridisierungsanalysen. Lehren wie diejenigen, gefunden in Texten von Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop, 1991 und Kuby, 1994 sind besonders relevant.
  • Selbstverständlich werden für einige Anwendungen, beispielsweise, wo man wünscht, Mutanten herzustellen, welche einen mutierten Primer-Strang, hybridisiert mit einem un terliegenden Templat, herzustellen, oder wo man danach sucht, Borrelia-VMP-ähnliche kodierende Sequenzen aus verwandten Spezies zu isolieren, funktionellen Äquivalenten oder dergleichen typischerweise weniger stringente Hybridisierungsbedingungen benötigt werden, um die Ausbildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Umständen wird man wünschen, Bedingungen einzusetzen wie z.B. ungefähr 0,15 M bis ungefähr 0,9 M Salz, bei Temperaturen, welche von 20°C bis ungefähr 55°C reichen. Kreuzhybridisierende Spezies können dabei leicht identifiziert werden als positiv hybridisierende Signale im Hinblick auf die Kontrollhybridisierungen. In jedem Fall ist es generell günstig, dass Konditionen stringenter durch Zugabe erhöhter Mengen von Formamid gemacht werden, welches dazu dient, den Hybridduplex in der gleichen Art und Weise wie erhöhte Temperatur zu destabilisieren. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und folglich wird im Allgemeinen ein Verfahren der Wahl von den gewünschten Resultaten abhängen.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird es von Vorteil sein, Nukleinsäure-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit geeigneten Mitteln einzusetzen, wie z.B. einem Label zum Nachweis der Hybridisierung. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Stand der Technik bekannt, einschließend fluoreszierende, radioaktive, enzymatische oder andere Liganden, wie z.B. Avidin/Biotin, welche in der Lage sind, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. In bevorzugten Ausführungsformen wird man möglicherweise wünschen, einen fluoreszenten Label oder ein Enzym-Tag einzusetzen, wie z.B. Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle von radioaktiven oder anderen umweltgefährdenden Reagenzien. Im Falle von Enzym-Tags sind colorimetrische Indikatorsubstanzen bekannt, welche eingesetzt werden können, um ein Mittel sichtbar für das menschliche Auge oder spektrofotometral sichtbar zur Verfügung zu stellen, um spezifische Hybridisierung mit komplementäre Nukleinsäuren enthaltenden Proben zur Verfügung zu stellen.
  • Im Allgemeinen ist es beabsichtigt, dass die Hybridisierungssonden, wie hier beschrieben, einsetzbar sowohl als Reagenzien bei Lösungs-Hybridisierungen als auch wie in Ausführungsformen, welche eine feste Phase einsetzen, sind. In Ausführungsformen, welche eine feste Phase einschließen, wird die Test-DNA (oder RNA) adsorbiert oder sonstwie fixiert zu einer ausgewählten Matrix oder Oberfläche. Diese fixierte einzelsträngige Nukleinsäure wird dann spezifischer Hybridisierung unterzogen mit ausgewählten Sonden und gewünschten Bedingungen. Die ausgewählten Bedingungen werden von speziellen Umständen abhängen, basierend auf den speziellen benötigten Kriterien (abhängig beispielsweise vom G + C-Anteil, vom Typ der Target-Nukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde, etc.). Auf das Waschen der hybridisierten Oberfläche hin, um nicht spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird spezifische Hybridisierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert mit Hilfe des Labels.
  • 4.9 Biologisch funktionelle Äquivalente
  • Modifikation und Veränderungen können durchgeführt werden in der Struktur der Peptide der vorliegenden Erfindung und den DNA-Segmenten, welche sie kodieren, womit noch immer ein funktionelles Molekül erhalten wird, welches ein Protein oder Peptid mit wünschenswerten Charakteristika kodiert. Es folgt eine Diskussion, basierend auf Veränderungen der Aminosäuren eines Proteins, um ein Äquivalent zu erzeugen oder sogar ein verbessertes Molekül der zweiten Generation. Die Aminosäure-Veränderungen können erreicht werden durch Verändern der Kodons der DNA-Sequenz gemäß der folgenden Kodon-Tabelle.
  • TABELLE 4
    Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Beispielsweise können bestimmte Aminosäuren substituiert werden, um andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur zu ersetzen, ohne dass ein merklicher Verlust der interaktiven Bindungskapazität mit Strukturen wie z.B. Antigen-bindenden Regionen oder Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen auftritt. Da es die interaktive Kapazität und Natur eines Proteins ist, welche die funktionelle biologische Aktivität des Proteins definiert, können bestimmte Aminosäure-Sequenz-Substitutionen in einer Proteinsequenz durchgeführt werden und selbstverständlich auch in der zugrundeliegenden DNA-kodierenden Sequenz, so dass nichtsdestoweniger ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten wird. Es ist folglich durch die vorliegenden Erfinder angedacht, dass verschiedene Veränderungen in den Peptidsequenzen der offenbarten Zusammensetzungen durchgeführt werden bzw. in den korrespondierenden DNA-Sequenzen, welche besagte Peptide kodieren, ohne dass ein merklicher Verlust ihrer biologischen Einsatzfähigkeit oder Aktivität auftritt.
  • Bei der Durchführung solcher Veränderungen kann der hydropatische (hydropathic) Index von Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropatischen Aminosäureindex beim Verleihen der interaktiven biologischen Funktion für ein Protein ist im Stand der Technik prinzipiell verstanden (Kyte und Doolittle, 1982, eingeschlossen per Verweis). Es ist akzeptiert, dass der relative hydropatische Charakter der Aminosäure einen Beitrag der Sekundärstruktur des resultierenden Proteins leistet, welche wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen definiert, beispielsweise mit Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen.
  • Jede Aminosäure wird einem hydropatischen Index auf der Basis ihrer Hydrophobizität und ihrer Ladungscharakteristik zugeordnet (Kyte und Doolittle, 1982); diese sind wie folgt: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
  • Es ist im Stand der Technik bekannt, dass bestimmte Aminosäuren substituiert werden können durch andere Aminosäuren mit einem ähnlichen hydropatischen Index oder Rang und dennoch in einem Protein mit ähnlicher biologischer Aktivität resultieren, d.h. immer noch ein biologisch funktionelles Protein erhalten wird. Bei der Durchführung solcher Veränderungen sind die Substitution von Aminosäuren, deren hydropatische Indizes innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, diejenigen, die zwischen ±1 liegen besonders bevorzugt und diejenigen zwischen ±0 sogar noch mehr speziell bevorzugt.
  • Es versteht sich auch auf dem Gebiet, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis der Hydrophilie realisiert werden kann. US-Patent 4,554,101 hält fest, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins wie durch die Hydrophilie der benachbarten Aminosäuren bestimmt, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
  • Wie in US-Patent 4,554,101 detailliert ausgeführt wird, wurden die folgenden Hydrophiliewerte den Aminosäureresten zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+3,0); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
  • Es versteht sich, dass eine Aminosäure substituiert werden kann durch Ersetzen mit einer anderen, welche einen ähnlichen Hydrophiliewert aufweist, so dass immer noch ein biologisches Äquivalent erhalten wird und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Protein. Bei solchen Veränderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophiliewerte innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt; diejenige, welche zwischen ±1 liegen, sind besonders bevorzugt und diejenigen, die zwischen ±0,5 liegen, sind sogar noch mehr besonders bevorzugt.
  • Wie oben erläutert sind Aminosäure-Substitutionen im Allgemeinen daher basierend auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäurenseitenketten-Substituenten, beispielsweise ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und dergleichen. Exemplarische Substitutionen, welche verschiedene der oben genannten Charakteristika berücksichtigen, sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen ein: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin und Valin, Leucin und Isoleucin.
  • 4.10 Ortsspezifische Mutagenese
  • Ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik bedeutsam zur Herstellung von individuellen Peptiden oder biologisch funktionellen äquivalenten Proteinen oder Peptiden, durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Die Technik stellt des Weiteren eine leichte Fähigkeit zur Verfügung, Sequenz-Varianten herzustellen und zu testen, beispielsweise das Einbringen einer oder mehrerer der oben genannten Betrachtungen durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsequenz-Veränderungen in die DNA. Ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von Mutanten durch die Anwendung spezifischer Oligonukleotid-Sequenzen, welche die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodieren, wie auch eine hinreichende Anzahl benachbarter Nukleotide, um eine Primersequenz von hinreichender Größe und Sequenzkomplexität zur Verfügung zu stellen, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der Deletionsverknüpfung, welche durchquert werden soll, auszubilden. Typischerweise wird ein Primer von ungefähr 17 bis 25 Nukleotiden an Länge bevorzugt sein, mit ungefähr 1 bis 10 Resten auf beiden Seiten der Verknüpfung der zu verändernden Sequenz.
  • Im Allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese im Stand der Technik wohlbekannt, wie durch verschiedene Publikationen exemplarisch belegt wird. Wie eingesehen werden wird, setzt die Technik typischerweise einen Phagen-Vektor ein, welcher sowohl in einer einzelsträngigen als auch in einer doppelsträngigen Form existiert. Typische Vektoren, bedeutsam zur ortsspezifischen Mutagenese, schließen Vektoren ein z.B. den M13 Phagen. Diese Phagen sind kommerziell fertig verfügbar und ihre Verwendung ist im Allgemeinen den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Doppelsträngige Plasmide werden auch routinemäßig eingesetzt in der ortsspezifischen Mutagenese, was die Schritte des Übertragens des Gens von Interesse von einem Plasmid auf einen Phagen eliminiert.
  • Im Allgemeinen wird ortsspezifische Mutagenese in Übereinstimmung hiermit durchgeführt durch zunächst Erhalten eines einzelsträngigen Vektors oder das Abschmelzen von zwei Strängen eines doppelsträngigen Vektors, welcher innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, welche das gewünschte Peptid kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, welcher die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird herstellt, im allgemeinen synthetisch. Dieser Primer wird dann mit dem einzelsträngigen Vektor annealed, und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z.B. E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des Mutation-tragenden Stranges zu vervollständigen. Folglich wird ein Heteroduplex ausgebildet, in welchem ein Strang die originale nichtkodierte Se quenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen zu transformieren, wie z.B. E. coli-Zellen, und Klone werden ausgewählt, welche rekombinante Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
  • Die Herstellung von Sequenz-Varianten der ausgewählten Peptid-kodierenden DNA-Segmente verwendend ortsspezifische Mutagenese wird als ein Mittel zum Erzeugen potenziell bedeutsamer Spezies zur Verfügung gestellt und soll nicht als limitierend betrachtet werden, da es andere Wege gibt, auf welchen Sequenz-Varianten von Peptiden und der DNA-Sequenzen, welche sie kodieren, erhalten werden können. Beispielsweise können rekombinante Vektoren, welche die gewünschten Peptidsequenzen kodieren, mit mutagenen Agenzien behandelt werden, wie z.B. Hydroxylamin, um Sequenz-Varianten zu erhalten.
  • 4.11 Monoklonale Antikörper
  • Mittel zum Herstellen und Charakterisieren von Antikörpern sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe beispielsweise Harlow und Lane, 1988).
  • Die Verfahren zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern (mAbs) beginnen im Allgemeinen etwa mit den gleichen Schritten wie diejenigen zum Herstellen von polyklonalen Antikörpern. Kurz gesprochen wird ein polyklonaler Antikörper erzeugt durch Immunisieren eines Tiers mit einer immunogenen Zusammensetzung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und Sammeln von Antiseren eines immunisierten Tiers. Ein großer Bereich von Tierspezies kann verwendet werden zur Produktion von Antisera. Typischerweise ist das Tier verwendet zur Produktion von Anti-Antisera ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen ist ein Kaninchen die bevorzugte Wahl zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern.
  • Wie im Stand der Technik wohlbekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenizität variieren. Es ist häufig folglich notwendig, das Wirtsimmunsystem zu boosten, wie dies realisiert werden kann durch Koppeln eines Peptids- oder Polypeptidimmunogens an einen Carrier. Beispielhafte und bevorzugte Carrier sind Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) und Bovinserumalbumin (BSA). Andere Albumine, wie z.B. Ovalbumin, Maus-Serumalbumin oder Kaninchen-Serumalbumin, können auch als Carrier verwendet werden. Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids an ein Carrierprotein sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bis-biazotiertes Benzidin ein.
  • Wie auch im Stand der Technik wohlbekannt ist, kann die Immunogenizität einer speziellen immunogenen Zusammensetzung durch die Anwendung von nichtspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, bekannt als Adjuvanzien, verstärkt werden. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvanzien schließen vollständiges Freund'sches Adjuvans (einen nichtspezifischen Stimulator der Immunantwort, enthaltend getötetes Mycobakterium tuberculosis), unvollständiges Freund'sches Adjuvans und Aluminiumhydroxid-Adjuvans ein.
  • Die Menge der immunogenen Zusammensetzung, verwendet in der Herstellung von polyklonalen Antikörpern, variiert gemäß der Natur des Immunogens wie auch des Tiers, verwendet zur Immunisierung. Eine Vielzahl von Wegen kann verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion polyklonaler Antikörper kann überwacht werden durch das Sammeln von Blut des immunisierten Tiers an verschiedenen Punkten, folgend auf die Immunisierung. Eine zweite, Booster-Injektion, kann auch gegeben werden. Der Prozess des Boostings und des Titerns wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht wird. Wenn ein gewünschter Spiegel der Immunogenizität erreicht wird, kann das immunisierte Tier ausgeblutet werden und das Serum isoliert und gelagert werden und/oder das Tier kann verwendet werden, um mAbs zu erzeugen.
  • mAbs können leicht hergestellt werden durch die Anwendung von wohlbekannten Techniken, wie z.B. diejenigen exemplarisch dargestellt in US-Patent Nr. 4,196,265. Typischerweise involviert diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tiers mit einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, beispielsweise einem aufgereinigten oder partiell aufgereinigten LCRF-Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird verabreicht in einer Art und Weise, welche effektiv ist, Antikörper produzierende Zellen zu stimulieren. Nager, wie z.B. Mäusen und Ratten, sind bevorzugte Tiere, jedoch die Anwendung von Kaninchen-, Schaf- oder Froschzellen ist auch möglich. Die Verwendung von Ratten kann bestimmte Vorteile zur Verfügung stellen (Goding, 1986), jedoch sind Mäuse bevorzugt, wobei BALB/c-Maus am meisten bevorzugt ist, da diese Maus am routineartigsten verwendet wird und im Allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionierungen ergibt.
  • Auf die Immunisierung hin werden somatische Zellen mit dem Potenzial zum Erzeugen von Antikörpern, spezifisch gesagt B-Lymphozyten (B-Zellen), ausgewählt zur Anwen dung in dem mAb erzeugenden Protokoll. Diese Zellen können erhalten werden aus Biopsie-Milzproben, Mandeln oder Lymphknoten oder aus peripheralen Blutproben. Milzzellen und peripherale Blutzellen sind bevorzugt, erstgenannte, da sie eine reiche Quelle von Antikörper produzierenden Zellen darstellen, welche im teilenden Plasmablast-Zustand sind, und die letztgenannten, weil das peripherales Blut leicht zugänglich ist. Häufig wird ein Panel von Tieren immunisiert worden sein, und die Milz des Tiers mit den höchsten Antikörpertiters wird entfernt und die Milzlymphozyten, erhalten durch Homogenisieren der Milz, werden mit einer Spritze entfernt werden. Typischerweise enthält die Milz einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 107 bis 2 × 108 Lymphozyten.
  • Die Antikörper erzeugenden B-Lymphozyten aus dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer immortalen Myelomzelle, im Allgemeinen eine der gleichen Spezies wie das Tier, das immunisiert worden ist, fusioniert. Myelomzelllinien, geeignet zur Anwendung in Hybridom-produzierenden Fusionsprozeduren sind bevorzugt nicht Antikörper produzierend, haben hohe Fusionseffizienz und Enzymdefizite, welche das Wachsen in bestimmten selektiven Medien, welche das Wachstum nur der gewünschten fusionierten Zellen unterstützen (Hybridomas), unmöglich machen.
  • Eine der Vielzahl der Myelomzellen kann verwendet werden, wie dies den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist (Goding, 1986; Campbell, 1984). Beispielsweise kann man, wo das immunisierte Tier eine Maus ist, verwenden P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden, und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-Hmy2 und UC729-6 sind alle einsetzbar im Zusammenhang mit menschlichen Zellfusionen.
  • Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1-Myelomzelllinie (auch bezeichnet als P3-NS-1-Ag4-1), welche fertig verfügbar ist von NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, dadurch dass man die Zelllinien Repository Nr. GM3573 anfordert. Eine andere Maus-Myelomzelllinie, welche verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente Maus-murine Myelom SP2/0 Non-Producer-Zelllinie.
  • Verfahren zum Erzeugen von Hybriden von Antikörper produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen üblicherweise das Mixen von somatischen Zellen mit Myelomazellen in einem 2:1-Verhältnis, obwohl das Verhältnis von ungefähr 20:1 bzw. 1:1 variieren kann, in der Gegenwart eines Agens oder von Agenzien (chemisch oder elektrisch), welche die Fusion der Zellmembranen vorantreiben. Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendai Virus wurden beschrieben (Kohler und Milstein, 1975; 1976) und solche unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG), wie z.B. 37% (v/v) PEG von Gefter et al., (1977). Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist auch geeignet (Goding, 1986).
  • Fusionsprozeduren erzeugen üblicherweise lebensfähige Hybride in geringen Häufigkeiten, ungefähr 1 × 10–6 bis 1 × 10–8. Jedoch stellt dies kein Problem dar, als die überlebensfähigen fusionierten Hybride aus den parentalen nichtfusionierten Zellen differenziert werden (speziell die unfusionierten Myelomzellen, welche sich normalerweise unentwegt weiterteilen würden) durch Kultivieren in einem selektiven Medium. Das selektive Medium ist im Allgemeinen eines, welches ein Agens enthält, welches die de Novo-Synthese der Nukleotide in den Gewebskulturmedien blockiert. Exemplarische und bevorzugte Wirksubstanzen sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de Novo-Synthese sowohl von Purin als auch Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wo Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, ist das Medium angereichert mit Hypoxanthin und Thymidin als Quellen der Nukleotide (HAT-Medium). Wo Azaserin verwendet wird, ist das Medium angereichert mit Hypoxanthin.
  • Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, welche in der Lage sind, Nukleotid Rettungs-Pfade zu betreiben, sind fähig, in einem HAT-Medium zu überleben. Die Myelomzellen sind defektiv hinsichtlich von Schlüsselenzymen des Rettungs-Pfades, beispielsweise Hypoxanthinphosphorribosyl-Transferase (HPRT) und sie können nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Pfad betreiben, jedoch haben sie eine begrenzte Lebensdauer in Kultur und sterben im Allgemeinen innerhalb von ungefähr 2 Wochen ab. Folglich sind die einzigen Zellen, welche in den selektiven Medien überleben können, ausgebildet aus Myelom und B-Zellen.
  • Dieses Kultivieren stellt eine Population von Hybridomas zur Verfügung, aus welchen spezifische Hybridomas ausgewählt werden. Typischerweise wird die Auswahl von Hybridomas durchgeführt durch Kultivieren der Zellen durch Einzel-Klonverdünnung auf Mikrotiterplatten, gefolgt vom Testen der individuellen klonalen Überstände (nach ungefähr 2 bis 3 Wochen) hinsichtlich der gewünschten Reaktivität. Der Assay sollte sensitiv sein, einfach und schnell, wie z.B. Radioimmuno-Assays, Enzymimmuno-Assays, Cytotoxizitäts-Assays, Plaque-Assays, Dot-Immunobindungs-Assays.
  • Die ausgesuchten Hybridomas würden dann seriell verdünnt und kloniert werden in individuelle Antikörper produzierende Zelllinien, wobei die Klone dann unendlich propagiert werden können, um Antikörper bereitzustellen. Die Zelllinien können ausgebeutet werden zur mAb-Produktion auf zwei grundlegende Arten. Eine Probe der Hybridoma kann injiziert werden (häufig in die peritoneale Kavität) in ein histokompatibles Tier des Typs, welcher verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion zur Verfügung zu stellen. Das injizierte Tier entwickelt Tumore, welche den spezifischen monoklonalen Antikörper, erzeugt durch das fusionierte Zellhybrid, sekretieren. Körperflüssigkeiten des Tieres, wie z.B. Serum oder Ascites-Flüssigkeit, können dann aufgesammelt werden, um mAbs in hoher Konzentration bereitzustellen. Die individuellen Zelllinien können auch kultiviert werden in vitro, wo die mAbs natürlicherweise in das Kulturmedium sekretiert werden, von welchen diese leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können. Mabs, erzeugt durch eines der Mittel, können des Weiteren aufgereinigt werden, falls nötig, unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren, wie z.B. HPLC oder Affinitätschromatographie.
  • 4.12 Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen wie hier offenbart sind zur oralen Verabreichung, beispielsweise mit einem inerten Verdünner oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger, oder sie können in hart- oder weichschaligen Gelatinekapseln eingeschlossen sein oder sie können in Tabletten gepresst sein oder sie können eingebracht werden direkt in die Nahrung der Diät. Zur oralen therapeutischen Verabreichung können die aktiven Verbindungen eingebracht werden mit Hilfsstoffen und verwandt werden in der Form von unverdaulichen Tabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Waffeln und dergleichen. Solche Zusammensetzungen und Herstellungen sollten zumindest 0,1% der aktiven Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzung und der Herstellungen kann natürlich variiert werden und kann günstig zwischen 2 bis 60% des Gewichts der Einheit liegen. Die Menge der aktiven Verbindungen in solch therapeutisch bedeutsamen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
  • Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch das Folgende enthalten: ein Bindemittel wie z.B. Gum tragacanth, Akazie, Maisstärke oder Gelatine; Hilfsstoffe wie z.B. Dicalciumphosphat; ein zerfallendes Agens, wie z.B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Algininsäure und dergleichen; einen Weichmacher wie z.B. Magnesiumstearat, und ein süßendes Agens wie z.B. Sucrose, Lactose oder Saccharin können hinzugegeben werden sowie ein geschmacksgebendes Agens, wie z.B. Pfefferminz, Öl von Winter grün oder Kirscharoma. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien des oben genannten Typs einen flüssigen Carrier enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Coatings vorliegen oder um anderweitig die physikalische Form der Dosiereinheit zu modifizieren. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem überzogen werden. Ein Sirup von Elixier kann die aktive Verbindung Sucrose als ein süßendes Agens, Methyl und Propylparabene als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und einen Aromastoff, wie z.B. Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Selbstverständlich sollten alle Materialien, verwendet zum Herstellen irgendeiner Dosierungseinheit, pharmazeutisch rein und substanziell nichttoxisch in den eingesetzten Mengen sein. Darüber hinaus können die aktiven Verbindungen in verzögerte Freisetzungs-Präparierung und -Formulierungen eingebracht werden.
  • Die aktiven Verbindungen können auch zur Verabreichung in parenteraler oder intraperitonealer Weise geeignet sein. Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder als pharmakologisch akzeptable Salze können hergestellt werden in Wasser, geeignet vermischt mit einem Tensid, z.B. Hydroxypropylcellulose. Dispersionen können auch hergestellt werden in Glyzerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen davon und in Ölen. Unter gewöhnlichen Bedingungen der Lagerung und Anwendung enthalten diese Herstellungen eine konservierende Substanz, um das Wachstum der Mikroorganismen zu verhindern.
  • Die pharmazeutischen Formen, geeignet zur Injektionsanwendung, schließen sterile wässrige Lösungen und Dispersionen und sterile Pulver für extemporale Herstellung von steril injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss die Flüssigkeit in einem Maß vorliegen, dass leichte Anwendung in Spritzenform existiert. Sie muss stabil unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung sein und muss geschützt gegen kontaminierende Wirkweise von Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien und Pilzen sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, enthaltend beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glyzerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle. Die geeignete Fluidität kann beispielsweise durch die Anwendung eines Coatings, wie z.B. Lecithin, durch das Aufrechterhalten der benötigten Partikelgröße im Fall der Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden beibehalten werden. Das Verhindern der Wirkung von Mikroorganismen kann realisiert werden durch verschiedene antibakterielle und antifugale Wirksubstanzen, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Agenzien, wie z.B. Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Verlängerte Absorption der injizier baren Zusammensetzungen kann realisiert werden durch die Anwendung von Zusammensetzungen von Agenzien, welche die Adsorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt durch Einbringen der aktiven Verbindungen in gewünschter Menge in das geeignete Solvens mit einer Reihe anderer Ingredienzien wie oben aufgelistet, wie benötigt, gefolgt von gefilterter Sterilisation. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten aktiven Ingredienzien in ein steriles Vehikel, welches das grundlegende Dispersionsmedium enthält und die benötigten weiteren Ingredienzien aus denjenigen wie oben aufgelistet. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von steril injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Verfahren der Herstellung Vakuumtrocknen und Gefriertrocknungstechniken, welche ein Pulver des aktiven Ingredienz plus irgendein zusätzlich gewünschtes Ingredienz von einer zuvor steril gefilterten Lösung davon ergeben.
  • Wie hier verwendet enthält ein "pharmazeutisch akzeptabler Carrier (Träger)" irgendeines bzw. alle von Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Coatings, antibakteriellen und antifungalen Wirksubstanzen, isotonischen und Adsorptions-verzögernden Agenzien und dergleichen. Die Anwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohlbekannt. Außer insoweit als konventionelle Medien oder Agenzien inkompatibel mit dem aktiven Ingredienz sind, ist ihre Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen beabsichtigt. Supplementäre aktive Ingredienzien können auch in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
  • Die Bezeichnung "pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare Entitäten und Zusammensetzungen, welche keine allergische oder ähnliche ungewünschte Reaktion erzeugen, wenn sie einem Menschen verabreicht werden. Die Herstellung der wässrigen Zusammensetzung, welche ein Protein als aktives Ingredienz enthält, ist im Stand der Technik gut verstanden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare Formen hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen geeignet zur Lösung in oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion können auch hergestellt werden. Die Herstellung kann auch emulgiert sein.
  • Die Zusammensetzung kann formuliert werden in einer neutralen oder einer Salz-Form. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen die sauren Additionssalze (ausgebildet mit der freien Aminogruppe des Proteins) ein, welche ausgebildet werden mit anorganischen Säuren wie z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen. Salze ausgebildet mit den freien Carboxylgruppen können auch abgeleitet werden aus anorganischen Basen wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden und solchen organischen Basen wie z.B. Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen.
  • Nach Formulierung wird die Lösung in einer Art und Weise verabreicht, vergleichbar mit der Dosisformulierung und in solch einer Menge, wie sie therapeutisch effektiv ist. Die Formulierungen werden leicht verabreicht in einer Vielzahl von Dosierformen, wie z.B. injizierbaren Lösungen, Wirksubstanz freisetzenden Kapseln und dergleichen.
  • Für die parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung sollte die Lösung beispielsweise geeignet gepuffert sein, falls nötig und der flüssige Verdünner zuerst isotonisch eingestellt werden mit hinreichend Salzlösung oder Glukose. Diese speziellen wässrigen Lösungen sind besonders geeignet für intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung. In dieser Hinsicht werden sterile wässrige Medien, welche eingesetzt werden, den Fachleuten auf dem Gebiet im Licht der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Beispielsweise könnte eine Dosierung aufgelöst werden in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung und entweder zu 1000 ml Hypodermoclysis-Flüssigkeit hinzugegeben werden oder injiziert werden an die vorgeschlagene Stelle der Infusion (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe, Seiten 1035–1038 und 1570–1580). Einige Variationen der Dosierung wird notwendigerweise auftreten je nach dem Zustand des zu behandelnden Subjekts. Die Person verantwortlich zur Verabreichung wird in jedem Falle die geeignete Dosis für das individuelle Subjekt bestimmten. Des Weiteren sollten für die menschliche Verabreichung die Präparationen Sterilitäts-, Pyrogenizitäts-, allgemeine Sicherheits- und Reinheits-Standards einhalten, wie dies von dem FDA Office of Biologics-Standards verlangt wird.
  • 5.0 Beispiele
  • Die folgenden Beispiele berichten von der Evaluation von Bb-Klonen erhalten aus Biopsie und Blutproben von Mäusen infiziert mit infektiösem B. burgdorferi, einem in vivo Selektionsansatz zur Bestimmung von Antigen-Variation an der vls-Stelle und Identifikation und Charakterisierung der vls-Stelle.
  • 5.1 Beispiel 1 – Experimentelle Prozeduren
  • 5.1.1 Bakterielle Stämme
  • B. burgdorferi-Stämme B31 (ATCC 35210), Sh-2-82 und N40 wurden original isoliert aus Ixodes scapularis-Zecken im Staate New York (Burgdorfer et al., 1982; Schwan et al., 1988b; Barthold et al., 1990). Diese Stämme wurden als infektiös in Labortieren demonstriert (Barthold et al., 1990; Norris et al., 1995). Der Hoch-Passagen B31-Stamm (ATCC 35210) war in vitro Passagen für mehrere Jahre unterzogen worden und hatte seine Infektivität verloren. Neun B31 und 10 Sh-2-82-Passagen-5-Klone wurden charakterisiert hinsichtlich Effektivität und zuvor von Norris et al. (1995) beschrieben. Zusätzliche neun hoch- und nieder-infizierende B31-Klone wurden erhalten von P. A. Rosa und T. G. Schwan von den Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, MT. Infektiöse B. afzelii ACA-1 und B. garinii-IP-90-Klone wurden erhalten durch Suboberflächen-Plattieren von Organismen gefolgt von der Isolation von experimentell infizierten C3H/HeN-Mäuse (A. G. B.). Spirochäten wurden in BSK II Medium wie beschrieben kultiviert (Norris et al., 1995). Die E. coli-Stämme XL1-blue MRF (Strategene, La Jolla, CA) und BL-21 (DE3) Novagen, Madison, WI) wurden zum DNA-Klonieren und zur Fusionsprotein-Expression verwendet.
  • 5.2.1 Subtraktive Hybridisierung
  • Subtraktive Hybridisierung wurde durchgeführt gemäß der Prozedur von Seal et al. (1992). B. burgdorferi-Gesamt-DNA wurde isoliert aus späten Logphasen-Kulturen (ungefähr 1010 Zellen) wie zuvor beschrieben (Walker et al., 1995). Die Gesamt-DNA des Hoch-Passagen-B. burgdorferi B31 wurde einer Ultraschallzerstörung ausgesetzt und die resultierenden 0,5 bis 1 kb Fragmente wurden als Driver-DNA eingesetzt. Die Driver-DNA (50 μg) wurde dann mit 1 μg Gesamt-DNA aus dem Niedrig-Passagen B31, verdaut zur Gänze mit Sau 3 A1 (Target-DNA), vermischt. Die Target-Driver-DNA-Mischung wurde denaturiert und reannealed unter den beschriebenen Bedingungen (Seal et al., 1992). Die resultierende DNA-Mischung wurde in BamHI-verdautem pBluescript II SK(–)-Vektor (Strategene) ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli CL-1 blud MRF konkurriende Zellen (Stratagene) zu transformieren und die Transformanten wurden auf Luria-Bertani(LB)-Agar, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, 0,5 mM Isopropylthiogalactopyranosid und 20 μg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactosid, plattiert. LB-Brühe-Kulturen, inokuliert mit weißen Kolonien, wurden auf Hybond-N+-Nylonmembrane geblottet (Amersham, Arlington Heights, IL) mit einem Bio-Dot-Apparat (Bio-Rad, Hercules, CA) und durch Hybridisieren mit [32P]-gelabelter Treiber- und Target-DNA gescreent. Die Klone, welche nur mit der Target-Sonde hybridisierten, jedoch nicht mit der Treiber-Sonde wurden partiell sequenziert unter Verwendung von Vektorsequenz-basierten T3- und T7-Primern.
  • 5.1.3 Elektrophorese und Southern Hybridisierung
  • Die gesamte B. burgdorferi-DNA wurde hergestellt in Agaroseinserts und aufgetrennt in 1% Fastlane Agarosegel (FMC, Rockland, ME) durch Pulsfeldelektrophorese wie zuvor beschrieben (Norris et al., 1995). Restriktionsenzym-verdaute DNA-Fragmente wurden aufgetrennt durch Standard-Agarose-Gelelektrophorese (Sambrook et al., 1989). DNA-Banden wurden visualisiert durch Ethidiumbromid-Anfärben. Zur Southern Hybridisierung wurde die DNA auf Hybone-N+-Nylonmembrane geblottet durch das alkalische Transferverfahren (Sambrook et al., 1989). Die Blots wurden hybridisiert mit [32P]-gelabelten Sonden bei 65°C in der Gegenwart von 1 M NaCl über Nacht, wie früher beschrieben (Walker et al., 1995). Die Blots wurden sequenziell wie folgt gewaschen: einmal in 2 × SSC bei 65°C für 15 Minuten, zweimal in 1 × SSC bei 65°C für 15 Minuten und zweimal in 0,1 × SSC bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Autoradiografie wurde durchgeführt unter Verwendung von X-OMAT-Film (Kodak, Rochester, NY) mit verstärkenden Screens.
  • 5.1.4 DNA-Klonierung und Sequenzanalyse
  • Die Gesamtplasmid-DNA von B31-5A3 wurde hergestellt und behandelt mit Mungbohnen(mungbean)-Nuklease, um die kovalent verknüpften Telomere der linearen Plasmide zu öffnen, wie von Hinnebusch et al. (1990) beschrieben. Das resultierende Plasmid-DNA wurde eingefüllt mit dem Klenow-Fragment an DNA-Polymerase und ein EcoRI-Linker (5'-CCGGAATTCCGG-3') wurde auf die Plasmidenden ligiert unter Verwendung von T4-Ligase. Die Herstellung wurde dann verdaut mit EcoRI und ligiert in EcoRI-behandelten λDASH II-Vektor (Strategene). Die rekombinanten Phagen wurden propagiert und gescreent durch Plaquehybridisierung mit der pJRZ53-Sonde, gemäß den Instruktionen des Vektorherstellers. Lambda Phagen-DNA wurde aufgereinigt durch Cäsiumchlorid-Gradienten-Aufreinigungsverfahren (Sambrook et al., 1989).
  • Zum zufälligen Klonieren der λDASH-Bb12-Inserts wurde aufgereinigte Bakteriophagen-DNA mit DNasel in der Gegenwart von Mn++ behandelt und in EcoRV-verdauten pBluescript II SK (–) wie zuvor beschrieben kloniert (Demolis et al., 1995). Die Insert-DNA von λDASH-Bb12 wurde ausgeschnitten aus Agarosegelen, aufgereinigt unter Verwen dung eines Qiaex II Gel-Extraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA), radiogelabelt und als eine Sonde verwendet, um E. coli XL1-blue MRF-Transformanten durch Southern Hybridisierung zu screenen. Positive Klone wurden sequenziert wie unten beschrieben unter Verwendung von T3 und T7 Primern. In einigen Fällen wurden nicht sequenzierte Regionen eingefüllt durch Primer-Walking. Die sequenzierten Fragmente wurden zusammengesetzt unter Verwendung des GELASSEMBLE-Programms von GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, Madison, WI). Hochstringenz-Einstellungen wurden angewandt, um identische Sequenzen von hochhomologen Sequenzen zu unterscheiden.
  • Alle Plasmide und PCRTM-Template wurden aufgereinigt durch Wizard-Säulen (Promega, Madison, WI) und entsalzt durch Entsalzungssäulen (Amicon, Beverly, MA). DNA-Sequenzen wurden bestimmt mit einem ABI377 automatischen DNA-Sequenzierer (Perkin-Elmer/ABI, Foster City, CA) in dem DNA-Kernlabor des Department of Microbiology and Molecular Genetics an der University of Texas Medical School in Houston. Die GAP und PILEUP-Programme von GCG wurden verwendet, um die Sequenzhomologie zu bestimmen (prozentuale Ähnlichkeit und Identität) und um multiple Sequenz-Alignments durchzuführen. Der grafische Output der Alignments wurde erzeugt teilweise durch die Anwendung des BOXSHADE-Programms (ursprünglich programmiert von K. Hofmann an der Bioinformatics Group, Isrec, Switzerland und M. D. Baron am Institute of Animal Health, Pirbright, U.K., und kompiliert in Pascal-Version für Sun Solaris/Pascal durch P. A. Stockwell an der University of Otago, Dunedin, New Zealand). Suche nach Sequenzähnlichkeit wurden durchgeführt am National Center for Biotechnology Information unter Verwendung des BLAST-Programms (Altschul et al., 1990).
  • 5.1.5 PCRTM-Techniken
  • Alle PCRTM-Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung des Thermalase-PCRTM-Kits (Amresco, Solon, OH) in einem Minicycler von MJ Research (Watertown, MA). Für Primerpaare, enthaltend verschachtelte 5'-Enden Sequenzen F4120 (SEQ ID Nr. 4) und R4121 (SEQ ID Nr. 5) wurde ein zweistufiges Programm wie folgt verwendet: 96°C für 3 Minuten, 5 Zyklen der Denaturierung bei 95°C für 40 Sekunden, Annealen bei 56°C für 40 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei einer höheren Anneal-Temperatur von 65°C. Für Primerpaare ohne verschachtelte Sequenzen F4064 (SEQ ID Nr. 6) und R4066 (SEQ ID Nr. 7) wurden 35 Amplifikationszyklen der Denaturierung bei 95°C für 40 Sekunden, Annealen bei 60°C für 40 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 2 Minuten eingesetzt. Die letztendlichen Zyklen beider Programme waren gefolgt von einer Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten.
  • Für RT-PCRTM wurde Gesamt-RNA extrahiert aus späten Logphasen-Kulturen von B. burgdorferi B31-5A3 mit einem RNA-Reinigungskit (Amresco). Die resultierende RNA-Herstellung wurde verwendet, um cDNA mit dem R4066 Primer (5'-CTTTGCGAACGCAGACTCAGCA-3') (2C) zu erzeugen. Primer R4066 und 1 μl der RT-Reaktion wurden verwendet für die PCRTM-Reaktion wie oben beschrieben, um ein 198 bp Fragment zu erzeugen. Das PCRTM-Produkt wurde dann in den pCR II Vektor (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert gemäß dem Manual des Herstellers und die resultierenden Klone wurden sequenziert.
  • 5.1.6 GST Fusionsprotein-Expression
  • Ein 614 bp Fragment enthaltend die vls-Kassette wurde amplifiziert durch PCRTM unter Verwendung des (+) Strangprimer F4120 (5'-GCGGATCCAGTACGACGGGGAAACCAG-3') und des (–) Strangprimer R4121 (5'-GCGGATCCCCTTCTCTTTCTCACCATCC-3') (2C). Zum Zwecke der Klonierung fügten die Erfinder eine 8 bp Sequenz (unterstrichen) an die 5'-Enden beider Primer, um BamHI-Stellen zu erzeugen, hinzu. Die resultierenden PCRTM-Produkte enthaltend die vollständigen vls-Kassettenregion wurden in die BamHI-Stelle des pGEX-2T-Expressionsvektors kloniert (Pharmacia, Piscataway, NJ), um ein GST-Fusionsprotein zu erzeugen (Designated GST-Vls1) und zwar im E. coli-Strang BL-21 (DE3) gemäß den Instruktionen des Herstellers. Die Insertsequenz des rekombinanten Plasmids wurde verifiziert vor der Anwendung zur Proteinexpression. Das Fusionsprotein wurde aufgereinigt durch Glutathionsepharose 4B-Säule (Pharmacia) entsprechend den Angaben des Herstellers.
  • 5.1.7 Antikörper und Immunoblotting (Western blotting)
  • Antiseren gegen das GST-Vls-1-Fusionsprotein und GST als Kontrolle wurden erzeugt in Kaninchen durch Immunisieren der Kaninchen mit 20 μg Protein in vollständigem Freunds Adjuvans und Boostern mit der gleichen Menge an Protein in unvollständigem Freunds Adjuvans in 3 Wochen-Intervallen (Sambrook et al., 1989). Nichtspezifische Reaktivität des Antiserums wurde entfernt durch Absorption von einem niedriginfektiven B31 Klon 5A2, welcher das pBB28La-Plasmid nicht aufwies (1B), mit Zelllysat, wie bereits beschrieben (Carroll und Gherardini, 1996). Antiserum gegen rekombinantes OspD wurde hergestellt in ähnlicher Art und Weise, und monoklonale Antikörper H9724, reaktiv mit B. burgdorferi Flagellumprotein (Fla), wurden erhalten als ein Hybridom-Kulturüberstand durch D. D. Thomas (University of Texas Health Science Center at San Antonio).
  • Späte Logphasen-B. burgdorferi-Kulturen wurden geerntet durch Zentrifugation und gewaschen in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, 135 mM NaCl, 9 mM Na2HPO4, 6 mM KH2PO4, pH 7,2). Die Organismen wurden bei der Konzentration von 1010 Zellen/ml in PBS resuspendiert. Proteine von ungefähr 107 Organismen wurden der Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, elektrotransferiert auf PVDF-Membrane (Millipore, Bedford, MA) und mit Antikörpern unter Verwendung eines ECL Western Blot-Kits von Amersham nachgewiesen, gemäß den Angaben des Herstellers.
  • 5.1.8 Oberflächenproteolyse
  • Proteinase K-Verdauung von B. burgdorferi B31-5A3 wurde durchgeführt wie früher beschrieben (Norris et al., 1992). Proteine der behandelten Organismen wurden abgetrennt durch SDS-PAGE, elektrotransferiert auf PVDF-Nitrocellulose und umgesetzt mit Antiseren gegen GST-Vls1 oder OspD oder mit monoklonalem Antikörper H9724. Reaktionen wurden sichtbar gemacht unter Verwendung des ECL-Western Blot-Kits.
  • 5.1.9 Mausinfektionen
  • Die ursprüngliche Stammlösung von B31-5A3 (Norris et al., 1995) wurde kultiviert in BSK II-Brühe für 7 Tage und die Kultur wurde verdünnt auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml in BSK II-Brühe. 100 Mikroliter der verdünnten Kultur (105 Organismen) wurden verwendet, um jede der acht 3 Wochen alten weiblichen C3H/HeN-Mäuse durch intradermale Injektion an der Basis des Schwanzes zu inokulieren. Jeder Maus wurde ein Identifikationsmikrochip eingesetzt für Nachfolgeproben während des Verlaufs der Infektion. 4 Wochen nach Infektion wurden die Organismen isoliert durch Inokulieren von 50 μl an Blut oder Voll-Dicken-Biopsie (ungefähr 2 mm im Durchmesser) des Ohrs in 6 ml an BSK II-Brühe. Alle 5 Ohrkulturen und 6 von 8 Blutkulturen waren positiv. Klonale Populationen von B. burgdorferi-Isolaten von C3H/HeN-Mäusen wurden erhalten durch Suboberflächenplattieren (Norris et al., 1995). Die ersten Passagen dieser Kulturen wurden in BSK II-Medium eingefroren mit 20% Glyzerol bei –70°C als Stammlösungen für weitere Untersuchungen. Die vls-Kassettenregion an der Expressionsstelle wurde amplifiziert durch PCRTM unter Verwendung von Primern F4120 und R4066 (2C) und sequenziert unter Verwendung des gleichen Satzes an Primern. Proben der gefrorenen Stammlösungen (ungefähr 3 μl) wurden von der Oberfläche abgesondert, aufgetaut und direkt auf PCRTM-Tuben als die DNA-Templatquelle hinzugefügt, um mögliche Variationen während der in vitro-Kultivierung zu minimieren. Serumprobe wurde auch von jeder Maus gesammelt vor der Infektion und 4 Wochen nach der ursprünglichen Infektion und gelagert bei –70°C für Immunoblot-Analyse.
  • 5.2 Beispiel 2 – Antigenvariation an der vls-Stelle
  • Bb-Klone isoliert von Ohrbiopsien und Blutproben erhalten 4 Wochen nach Inokulation von C3H/HeN-Mäusen mit dem infektiösen B31-Klon 5A3 wurden ausgewertet. Ein Flussdiagramm ist in 8 dargestellt. Ohrdurchstoßbiopsien von ungefähr 2 mm an Durchmesser wurden erhalten von 5 von 8 Mäusen. Die Kulturen wurden gemäß ihren Quellen benannt (d.h. m1e4 bezieht sich auf Maus 1, Ohrkultur, 4 Wochen). Klonale Populationen wurden erhalten durch Plattieren auf Passagen von Kultur BSKY-Agarplatten und 12 Kolonien von jedem Isolat wurden ausgewählt, kurz kultiviert in 2 mm BSKY-Medium und eingefroren. Individuelle Klone wurden bezeichnet als m1e4A, m1e4B, etc. Proben dieser Klone wurden der Amplifikation der vls-Kassette vorliegend an der vlsE-Expressionsstelle unterzogen durch Verwendung von Primern in den "konstanten" Regionen auf jeder Seite der Kassette. Die resultierenden PCRTM-Produkte wurden direkt sequenziert.
  • Überraschenderweise trat keine Antigenvariation durch Substitution der gesamten vls-Kassette an der Expressionsstelle (beispielsweise vls1) mit einer einzelnen, intakten "ruhenden" vls-Kassette auf (beispielsweise vls2 durch vls16) (siehe 9). Die Überprüfung von 5 Klonen des Ohrs von Maus 1 (10) zeigte, dass die vlsE-Sequenzen von jedem Klon von 1) der Originalsequenz (vls1) unterschiedlich waren; 2) voneinander; und 3) jeweils von den ruhenden vls-Kassetten. Diese Ergebnisse wurden verifiziert durch Überprüfung eines Klons von jedem Ohr oder Blut-Isolat von den 8 Mäusen (11). Jede der Maus-Isolatsequenzen umfasste scheinbar ein Mosaik an Segmenten von verschiedenen unterschiedlichen ruhenden vls-Kassetten (zwischen 7 und 11 in ersten Analysen). Sequenzvariabilität wurde begrenzt durch die vls-Kassettenregion, begrenzt durch die Sequenzen, und in allen Fällen wurde der offene Leserahmen konserviert. Die vls-Kassettenregionen der Kontrollen, bestehend aus 5 klonalen Populationen der inokulierenden Kultur waren identisch mit der originalen vls1-Sequenz, wie dies auch die Se quenzen, erhalten von Kulturen, welche zwei- bis viermal in vitro-Passagen unterzogen worden waren (eine Woche pro Passage), waren. Folglich scheint der Reorganisierungsprozess in vivo aktiviert zu werden und nicht in einer schnellen Rate in vitro aufzutreten.
  • 5.3 Beispiel 3 – Identifikation des 28 kb linearen Plasmids pBB28La
  • B. burgdorferi-Stämme zeigen im Allgemeinen den Verlust an Infektivität folgend auf 10 bis 17 in vitro-Passagen (Johnson et al., 1984; Schwan et al., 1988a); Norris et al., 1995), was zusammenfällt mit dem Verlust der Plasmide (Barbour, 1988; Xu et al., 1996). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die verminderte Effektivität, welche während der in vitro-Passage von Lyme-Erkrankungs-Borrelia auftritt aufgrund des Verlusts des genetischen Inhalts auftritt, speziell von Plasmiden, welche Viruleszenzfaktoren kodieren. Folglich erwarteten die Erfinder einige dieser Virulenzfaktoren zu identifizieren durch direkten Vergleich des Plasmidgehalts der Organismen, welcher in ihrer Infektivität unterschiedlich sind.
  • Eine der Komplikationen involviert in das Untersuchen von B. burgdorferi-Plasmiden ist, dass viele Plasmide in der Größenordnung von 20 kb bis 40 kb liegen (Xu und Johnson, 1995), was es schwierig macht, Plasmide mit ähnlichen Größen durch Standardelektrophorese-Techniken aufzutrennen. Darüber hinaus liegen Mutagenese-Techniken und andere genetischen Manipulations-Werkzeuge in einem frühen Stadium der Entwicklung bei B. burgdorferi (Samuels et al., 1994; Rosa et al., 1996), was die Fähigkeit, die Bedeutung dieser Plasmide in der Pathogenese durch direkte genetische Ansätze zu untersuchen, limitiert.
  • Um diese Einschränkungen auszumerzen, setzten die Erfinder eine einfache subtraktive Hybridisierungstechnik ein, um Sequenzen anzureichern und eventuell zu identifizieren, welche nur in hochinfektiösen Organismen vorliegen.
  • Gesamt-DNA aus hochinfektiven (Niedrig-Passagen) B31-Stämmen wurde vollständig mit Sau 3AI (Target-DNA) verdaut. Die Target-DNA wurde mit einem 50-fachen Überschuss an Gesamt-DNA von einem niedriginfektiven (Hoch-Passagen) B31-Derivat vermischt, welches durch Ultraschall gespalten worden war (Driver-DNA). Die DNA-Mischung wurde denaturiert und man ließ sie reannealen. DNA-Fragmente in den resultierenden DNA-Herstellungen, in welchen die Sau 3AI-Stellen regeneriert wurden, wurden in die BamHI-Stelle von pBluescript SK (–) ligiert. Insgesamt 63 Klone wurden isoliert und gescreent durch Southern Hybridisierung unter Verwendung der Target-DNA und von Driver-DNA als Sonden. Acht dieser Klone hybridisierten mit Target-DNA, jedoch nicht mit Driver-DNA.
  • Die Inserts der 8 Klone wurden partiell sequenziert unter Verwendung der Vektor-basierten Primer und die Sequenzen wurden Datenbanksuchen hinsichtlich Sequenzähnlichkeit unterzogen. Einer der Klone mit der Bezeichnung pJRZ53 enthielt ein 562-Basenpaar (bp) Sau 3AI-Fragment, mit einem einzigen zusammenhängenden offenen Leserahmen. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieses offenen Leserahmens wurde mit Vmps von B. hermsii verglichen und zeigte 27,2% Identität und 56,8% Ähnlichkeit mit Vmp17. Basierend auf dieser Sequenzähnlichkeit wurde das pJRZ53-Insert eine vmp-ähnliche Sequenz (vls) genannt. Das pJRZ53-Insert zeigte einen geringeren Grad der Aminosäurensequenzähnlichkeit mit B. burgdorferi B31 äußerem Oberflächenprotein C (OspC) (26,6% Identität und 44,5% Ähnlichkeit).
  • Um die genomische Lokalisierung der vls-Sequenz zu identifizieren, wurde das pJRZ53-Insert mit Southern Blots von Gesamt-B31-DNA hybridisiert, aufgetrennt durch Pulsfeldelektrophorese. Eine DNA-Bande wandernd bei 28 kb hybridisierte mit der Sonde (siehe 1B) und wurde als lineares Plasmid bestimmt durch zweidimensionale Agarosegel-Elektrophorese und Restriktionskartierung. Dieses vls-enthaltende Plasmid von B. burgdorferi B31 wurde als pBB28La bezeichnet.
  • 5.4 Beispiel 4 – Korrelation zwischen pBB28La und Infektivität
  • Dieses Beispiel illustriert die Bestimmung, ob die vls-kodierte Funktion für die Infektion benötigt wurde oder nicht. Frühere Untersuchungen (Norris et al., 1995) hatten gezeigt, dass Klone von Niedrig-Passagen-B. burgdorferi-Stämmen B31 und Sh-2-82 zwei verschiedene infektive Phenotypen zeigten, wenn sie in C3H/HeN-Mäusen getestet wurden. Ein repräsentativer hochinfektiöser Klon zeigte mittlere infektiöse Dosis (ID50) von 1,8 × 102 Organismen, wohingegen der niedriginfektive Klon, der getestet wurde, einen viel höheren ID50 zeigte (≥ 1 × 105 Organismen).
  • Es wurde geschlossen, dass, falls die vls-kodierte Funktion wichtig für die Viruleszenz ist, alle Klone mit hochinfektiösem Phenotyp das vls-enthaltende Plasmid enthalten sollten, und der Verlust dieses Plasmids in einem niedriginfektiösen Phenotyp resultieren würde. Um diese Hypothese zu testen, wurde die pJRZ53-Sonde hybridisiert mit Gesamt-DNA sowohl von hoch- als auch von B. burgdorferi-Klonen. Alle 9 B31-Klone, welche getestet wurden, hatten ein Plasmidband-Muster, welche beinahe identisch miteinander waren, wenn sie durch Ethidiumbromid-Anfärbung visualisiert wurden (1A).
  • Jedoch die Hybridisierung von pJRZ53 mit dem Blot bestehend aus dem gleichen Gel fördem zutage, dass alle 5 hochinfektiven B31-Klone das vls enthaltende pBB28La-Plasmid besaßen, wohingegen nur einer von 4 niederinfektiven Klonen (B31-5A10) dieses Plasmid (1B) hatte. Es schien, dass der niederinfektiöse B31-5A10-Klon auch ein weiteres Plasmid nicht aufweist, welches mit der Infektion korreliert. Neun weitere niederpassagen B31-Klone, erhalten von P. A. Rosa und T. G. Schwan (Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, MT), zeigten ein ähnliches Muster; alle 6 der hochinfektiösen Klone enthielten pBB28La, wohingegen nur einer von drei niederinfektiven Klonen das Plasmid enthielt, basierend auf der Hybridisierung mit der pJRZ53-Sonde. Diese Ergebnisse zeigen eine starke Korrelation von pBB28La mit dem hochinfektiösen Phenotyp in klonalen Populationen von B. burgdorferi B31.
  • Um die Korrelation, gefunden in Strang B31 zu verifizieren, wurden 10 zuvor charakterisierte Klone vom Strang Sh-2-82 (Norris et al., 1995) untersucht. Ein pBB28La-Homolog wurde nachgewiesen in 7 hochinfektiven Klonen, jedoch nicht in drei niederinfektiven Klonen des Stranges Sh-2-82. Ähnliche Untersuchungen förderten das Vorliegen eines einzelnen vls-enthaltenden Plasmids in infektiösem B. afzelii ACA-1 und B. garinii IP-90-Stämmen zutage. Im Gegensatz zu den multiplen vmp-enthaltenden linearen Plasmiden in B. hermsii wurde nur ein vls-enthaltendes Plasmid in jedem der Lyme-Erkrankungs-Isolate gefunden, welche unter den eingesetzten Hybridisierungsbedingungen getestet wurden. Diese vls-enthaltenden Plasmide wanderten konsistent bei ungefähr 28 kb in Agarosegelen in den untersuchten Stämmen.
  • Von insgesamt 32 Klonen oder Strängen, die untersucht wurden, besaßen alle 22 Klone oder Stämme mit dem hochinfektiösen Phenotyp pBB28La und nur 2 von 10 niederinfektiösen Klonen besaßen dieses Plasmid (Tabelle 2). Die Southern Hybridisierungs-Untersuchungen zeigten an, dass das vls-enthaltende Plasmid mit Infektivität assoziiert ist und folglich essenzielle(n) Viruleszenzfaktor(en) kodieren kann.
  • 5.5 Beispiel 5 – Klonieren und Sequenzieren der vls-Stelle
  • Eine spezielle klonale Population von B. burgdorferi B31 (Klon B31-5A3) wurde eingesetzt, um die klonale Variation zu minimieren. B31-5A3 weist einen hochinfektiösen Phenotyp (Norris et al., 1995) auf und besitzt das pBB28La-Plasmid (1B, Zeile 3). Es wurde gezeigt, dass pJRZ53 mit einem einzelnen 14 kb Fragment hybridisiert, erzeugt durch Verdauen von B31-5A3-Plasmid-DNA mit EcoRI. Jedoch die Behandlung von B31-5A3-Plasmid-DNA mit PstI, Sau 3AI oder RsaI brachte jeweils multiple Fragmente in einem Größenbereich von ungefähr 400 bp bis 4000 bp, welche mit der Sonde hybridisierten, zutage, was auf das Vorliegen von multiplen Kopien der vls-Sequenz hinweist.
  • Das 14 kb EcoRI-Fragment wurde in λDASH II kloniert, um eine detaillierte Analyse dieser Region zu erlauben. Vom 14 kb Fragment wurde vorhergesagt, dass es ein kovalent geschlossenes Telomer an jedem Ende aufweist. Folglich wurde eine Technik, entwickelt von Hinnebusch et al. (1992), eingesetzt, um den telomeren Loop mit Mungbohnen-Nuklease zu öffnen und an einen EcoRI-Linker anzuheften, und dadurch die Ligation in den Klonierungsvektor zu ermöglichen. Ein Lambda-Klon mit der Bezeichnung λDASH-Bb12 wurde isoliert, welcher das 14 kb B. burgdorferi-DNA-Fragment enthielt, wie durch Restriktion und Hybridisierung bestätigt wurde. Eine internale EcoRI-Stelle wurde gefunden, welche das λDASH-Bb12-Insert in zwei kleineren 4 und 10 kb Fragmente unterteilt; ein unabhängig abgeleiteter Klon enthaltend das 10 kb Fragment wurde auch isoliert während des Screenings der Bibliothek. Um zu verifizieren, dass die 4 kb und 10 kb EcoRI-Fragmente physikalisch in dem nativen B. burgdorferi-Plasmid verknüpft waren, wurde die Region enthaltend die internale EcoRI-Stelle amplifiziert unter Verwendung von B. burgdorferi B31-5A3-DNA als das Templat. Das resultierende PCRTM-Produkt wies eine Sequenz auf, identisch zu derjenigen der korrespondieren Region von λDASH-Bb12, was darauf hindeutet, dass die 4 und 10 kb EcoRI-Fragmente zusammenhängend im pBB28La sind. Restriktionsverdauung von B. burgdorferi-Plasmid-DNA an dieser EcoRI-Stelle war nicht effizient, wohingegen vollständiges Schneiden konsistent an derselben Stelle in dem λDASH-Konstrukt erhalten wurde. Ähnlich unvollständiger Verdauung wurde beobachtet an bestimmten Restriktionsstellen in B. burgdorferi chromosomaler DNA (Casjens et al., 1995) und kann zur DNA-Modifikation (Hughes und Johnson, 1990) verwandt sein.
  • Eine zufällige Klonierungs-"Shotgun"-Strategie wurde eingesetzt, um beinahe 10 kb des λDASH-Bb12-Inserts zu sequenzieren. Insgesamt 80 zufällige Klone wurden sequenziert unter Verwendung von Vektor-basierten Primern. Zusätzliche Sequenzierungsreaktionen wurden durchgeführt, um die Lücken zwischen den sequenzierten Regionen durch Primer-Walking aufzufüllen. Die resultierenden zusammengesetzten Sequenzen wiesen im Durchschnitt eine 5-fache Bedeckung auf. Ein kurzes Segment (ungefähr 200 bp) 1227 bp von den telomeren Enden gelegen war refraktär gegen das Sequenzieren durch eine Anzahl von Techniken. Im Gegensatz zum gesamten niedrigen Guanosin-Cytosin(G + C)- Anteil des B. burgdorferi-Genoms (ungefähr 28%) weist die vls-Stelle einen G + C-Anteil von 50% auf.
  • 5.6 Beispiel 6 – Organisation der vls-Stelle
  • Die Sequenzdaten förderten eine extensive vls-Stelle innerhalb des 10 kb EcoRI-Fragmentes zutage, bestehend aus einer Expressionsstelle (mit der Bezeichnung vlsE) und 15 vls-Kassetten, welche hochhomolog zum zentralen Teil von vlsE sind (SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3). Das Vorliegen der EcoRI-Linkersequenz zwischen der Insert-DNA und der Vektorsequenz definierte die Stelle des rechten telomeren Endes. VlsE ist 82 bp vom rechten Telomer von pBB28La entfernt. Es besitzt zwei einzigartige Sequenzen an jeder der 5' und 3'-Regionen und eine 570 bp vls-Kassette in der Mitte, welche als die vls1-Kassette bezeichnet wurde (2B). Die vls1-Kassette ist flankiert an jedem Ende durch die 17 bp direkte Repeatsequenz 5'-GAGGGGGCTATTAAGGA-3' (SEQ ID Nr. 8) kodierend die Aminosäuren EGAIK. Ein Array von 15 vls-Kassetten beginnt ungefähr 500 bp strangaufwärts von vlsE auf dem gleichen Plasmid (2A). Die vls1-Kassette und andere vls-Kassetten (vls2 bis vls16) teilen 90,0% bis 96,1% Nukleotid-Sequenzidentität und 76,9% bis 91,4% vorhergesagte Aminosäuresequenzidentität. Das 17 bp direkte Repeat ist konserviert in beinahe allen der strangaufwärts gelegenen Kassettensequenzen.
  • Das vlsE-Gen von B. burgdorferi B31-5A3 ist vorhersagegemäß so, dass es ein 356 Aminosäureprotein mit einer Molekülmasse von 35986 Dalton (2C) kodiert. Eine Konsensus-Ribosom-Bindungsstelle und Konsensus-35 und –10-Sigma-70-ähnliche Promotorsequenzen sind strangaufwärts von der vorhergesagten translationalen Startstelle lokalisiert. VlsE enthält eine putative Lipoprotein-Leadersequenz mit einer offensichtlichen Signalpeptidase II-Schnittstelle (FINC) (Wu und Tokunaga, 1986), welche denjenigen anderer Borrelia-Lipoproteine ähnelt, einschließend OspC (Fuchs et al., 1992). Das Schneiden des 18 Aminosäurenpeptids würde in einem reifen Polypeptid resultieren mit einer kalkulierten Molekülmasse von 33956 Dalton und einem isoelektrischen Punkt (pI) von 7,3. Außerdem ist für das putative Leaderpeptid vlsE in erster Linie hydrophil.
  • VlsE zeigt 37,4% Identität und 57,8% Ähnlichkeit bzw. Homologie auf der Aminosäureebene und 58,8% Identität auf der Nukleinsäureebene mit vmp17 von B. hermsii (3A). VlsE teilt einen geringeren Grad der Homologie mit B. burgdorferi ospC sowohl auf den Nukleotid (41,6% Identität) als auch Aminosäure (26,3% Identität und 47,5% Ähnlichkeit)-Ebenen. Das spezielle vlsE-Allel, enthalten in B. burgdorferi B31-Klon 5A3, wurde als vlsE1 bezeichnet, um es von Varianten-vlsE-Allelen zu unterscheiden.
  • Weitere 15 vls-Kassetten (474 bis 594 bp an Länge) wurden identifiziert, ungefähr 500 bp strangaufwärts von vlsE (2A und 3B, SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3). Diese Kassetten sind in entgegensetzter Richtung zu vlsE orientiert und angeordnet in einer Kopf-zu-Schwanz-Anordnung in einem beinahe zusammenhängenden offenen Leserahmen unterbrochen nur durch ein Stop-Kodon in Kassette vls11 und von zwei Frameshifts in Kassetten vls14 und vls16. Keine dieser vls-Kassetten zeigt erkennbare Ribosom-Bindungsstellen oder Promotorsequenzen. Folglich glaubt man, dass sie nicht exprimiert werden oder "ruhend" sind. Die Enden der vls-Kassetten wurden durch Alignment mit der vls1-Kassette (3B) definiert. Im Allgemeinen weisen die vls-Kassetten das gleiche 17 bp gerichtete Repeat an jedem Ende auf; eine Ausnahme ist die verknüpfte Region zwischen vls9 und vls10, wo nur 10 identische Nukleotide identifiziert wurden. Die erste vls-Kassette (vls2) weist keine der ersten 126 bp der vls-Kassettensequenz auf, enthält jedoch eine 55 bp Sequenz, welche identisch ist mit der 5'-Region von vlsE kodierend für zumindest 11 Aminosäuren des Leaderpeptids und die ersten 7 Aminosäuren des putativen reinen vlsE. Die vls7-Kassette enthält eine 105 bp Deletion relativ zu vls1 in der 5'-Region. Die vls8 und vls10-Kassetten weisen keines der ersten 54 Nukleotide der Kassette auf. Die letzte Kassette in diesem Array, vls16, ist trunkiert am 3'-Ende und auf sie folgt eine offensichtlich nicht kodierende Region. Das 562 bp Insert von pJRZ53 wurde lokalisiert an der verknüpfenden Region zwischen vls8 und vls9 durch Sequenzvergleich.
  • Die vls-Kassetten enthalten 6 hochkonservierte Regionen, welche unterbrochen sind durch 6 variable Regionen (VR) sowohl auf der Nukleotid- als auch auf der Aminosäureebene. 3B zeigt ein Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenzen für alle 16 vls-Kassetten, die identifiziert wurden. Außer für zufällige Kodonveränderungen und Deletionen, welche früher erwähnt wurden, sind die konservierten Regionen beinahe identisch in allen Kassetten. Auf der anderen Seite werden die vls-Kassetten voneinander durch merkliche Sequenzvariationen, limitiert in erster Linie auf die 6 variablen Regionen (VR-I bis VR-VI), voneinander unterschieden. Die variablen Regionen reichen von 21 bp (VR-VI) bis 63 bp (VR-IV) an Länge. Mit der Ausnahme einer Insertion eines TAG-Stop-Kodons in vls11 und TG-Insertionen in vls14 und vls16 resultierend in Frameshifts, sind alle Deletionen und Insertionen Nukleotidtriplets, was auf die Konservierung des offenen Leserahmens hindeutet. Die Sequenzvariationen an den meisten polymorphen Positionen resultieren in konservativen Aminosäureveränderungen, was nahelegt, dass bestimmte Aminosäuren an diesen Positionen für die Funktion benötigt werden. Selbst innerhalb der 6 variablen Regionen besteht eine klare Sequenzkonservierung. Beispielsweise werden variable Sequenzen in VR-I unterbrochen durch Stränge von identischen Sequenzen, welche von 6 bis 9 bp reichen, wie in den vorhergesagten Aminosäuresequenzen reflektiert wird (3B).
  • 5.7 Beispiel 7 – Expression von vlsE
  • Um zu bestimmen, ob vlsE transkribiert wird, wurde die reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCRTM) eingesetzt, um eine 3'-Region von vlsE (191 bp) von Gesamt-RNA von in vitro-kultiviertem B31-5A3 zu amplifizieren. Nach der reversen Transkriptasereaktion, PCRTM-Amplifikation und Agaroseelektrophorese wurde ein Band von erwarteter Größe durch Ethidiumbromid-Anfärbung beobachtet. Das RT-PCRTM-Produkt wurde kloniert in den pCRII-Vektor und die rekombinanten Plasmide wurden sequenziert. Drei unabhängig abgeleitete rekombinante Plasmide enthielten DNA identisch mit der korrespondierenden Region von vlsE, was zeigt, dass vlsE in vitro transkribiert wird. Keine RT-PCRTM-Produkte wurden beobachtet in dem Agarosegel, falls reverse Transkriptase aus der Reaktion weggelassen wurde, was bestätigt, dass RT-PCRTM-Produkte von der mRNA von B31-5A3 abgleitet wurden.
  • Um das Proteinprodukt von vlsE zu identifizieren, wurde ein internales 614 bp Fragment enthaltend vls1 amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCRTM) und in den pGEX-2T-Expressionsvektor kloniert, um ein Glutathion-S-Transferase(GST)-Vls1-Fusionsprotein in E. coli zu erzeugen. Kaninchen-Antiserum gegen das GST-Vls1-Fusionsprotein wurde verwendet, um Proteinblots von B. burgdorferi B31-5A2 und B31-5A3-Klonen nachzuweisen. Der niedriginfektive Klon B31-5A2 wurde verwendet als Negativkontrolle für die Immunoblot-Analyse, da er kein pBB28La (1B, Zeile 2) aufweist. Das Antiserum wies ein Protein nach mit einem Mr von ungefähr 45000 Dalton in dem hochinfektiven Klon B31-5A3, jedoch nicht in dem niedriginfektiven Klon B31-5A2 (6, Zeilen 10 und 11). Weder das Präimmunserum noch das Antiserum gegen GST allein reagierte mit diesem Protein. Die Größe des Proteins, identifiziert durch Immunoblot-Analyse, ist größer als die vorhergesagte molekulare Masse von 33956 Dalton. Das Anbinden an eine Lipidgruppe an den N-Terminus von vlsE durch Signalpeptidase II mag einen Beitrag zur veränderten elektrophoresischen Mobilität leisten.
  • 5.8 Beispiel 8 – Oberflächenlokalisierung von vlsE
  • Das Vorliegen eines putativen Lipoprotein-Leaderpeptids und der insgesamten hydrophilen Natur von vlsE ließ die Möglichkeit zu, dass es angebunden an eine bakterielle Memb ran über einen Lipidanker ist. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde B. burgdorferi B31-5A3 inkubiert in der Gegenwart von [3H]-Palmitat wie früher beschrieben (Norris et al., 1992). VlsE wurde radiogelabelt durch [3H]-Palmitat zusammen mit anderen B. burgdorferi-Lipoproteinen, was nahe legt, dass vlsE ein Lipoprotein ist.
  • Die Exposition von überlebensfähigem B. burgdorferi 5A3 gegen Proteinase K erzeugte Ergebnisse konsistent mit der Oberflächenlokalisation von vlsE. VlsE wurde abgebaut durch Proteinase K in weniger als 10 Minuten (4A) selbst, obwohl die Organismen durch Dunkelfeldmikroskopie intakt erschienen. Konsistent mit früheren Untersuchungen (Norris et al., 1992) wurde auch B. burgdorferi OspD-Protein durch Proteinase K-Behandlung (4B) entfernt. Im Gegensatz dazu wurde die Fla-Untereinheit der periplasmatischen Flagella nicht durch Proteinase K betroffen (4C), was weiteren Beweis zur Verfügung stellt, dass äußere Membranen der Organismen während der Proteinase K-Behandlung intakt blieben.
  • 5.9 Beispiel 9 – Genetische Variation an der vlsE-Stelle
  • Die Ähnlichkeit der vlsE-Stelle mit dem vmp-System von B. hermsii warf unmittelbar die Frage auf, ob genetische Rekombination zwischen den exprimierten und ruhenden vls-Kassetten in dem Säugetierwirt demonstriert werden könnte. Das gesamtexperimentelle Design wird in 5A illustriert. B. burgdorferi B31-5A3 inokuliert direkt aus einer gefrorenen Stammlösung, wurde kultiviert für 7 Tage und verwendet, um intradermal eine Gruppe von 8 weiblichen C3H/HeN-Mäusen (105 Organismen pro Maus) zu injizieren. B. burgdorferi wurde 4 Wochen nach der initialen Infektion reisoliert. Um die infizierten Mäuse für mehrfache Probenentnahme zu erhalten, wurde nur Ohrdurchstoßbiopsien und Blutproben entnommen, um die Organismen zu kultivieren. Insgesamt 5 Ohr- und 6 Blut-Isolate wurden untersucht. Um mögliche genetische Heterogenität innerhalb der Maus-Isolate zu untersuchen, wurden 16 B. burgdorferi-Klone eines jeden Isolats durch Kolonieausbildung auf Agaroseplatten erhalten und durch Einfrieren konserviert. Ein Klon von jedem der Isolate wurde verwendet als eine Quelle für Templat-DNA, um die exprimierte vls-Kassettensequenz unter Verwendung der Primer F4120 und R4066, spezifisch für die 5'- und 3'-einzigartigen Regionen von vlsE, zu amplifizieren (2C). Die gefrorene Stammlösung der ersten Passage wurde verwendet, um DNA-Templat zur PCRTM-Amplifikation zur Verfügung zu stellen, um mögliche Variation während der in vitro-Kultur zu vermeiden. Die PCRTM-Produkte wurden direkt sequenziert unter Verwendung des gleichen Satzes an Primern. Die B. burgdorferi-Klone und assoziierte Sequenzen, abgleitet von 4 Wochen- Isolaten, wurden bezeichnet durch eine Kombination von Mausnummer (m1 bis m8), Gewebsquelle (e für Ohr und b für Blut), Wochen nach Infektion (4) und einer Klonbezeichnung (A bis P) für die 16 Klone von jedem Isolat.
  • Beim Vergleich mit parentalem vlsE der Klon B31-5A3 (Allel-vlsE1)-Inokulation wurden multiple Basensubstitutionen, Deletionen und Insertionen innerhalb der vls-Kassettenregion von vlsE gefunden, was jedes Allel einzigartig macht. Dieser Veränderungen resultierten in verschiedenen Unterschieden in den vorhergesagten Aminosäuresequenzen (5B). Wie in den ruhenden vls-Kassetten (3B) waren diese Mutationen in erster Linie begrenzt auf die 6 variablen Regionen. Die variablen Sequenzen an beinahe allen Positionen in den 11 vlsE-Allelen konnten in den korrespondierenden Regionen der ruhenden vls-Kassetten gefunden werden. Beispielsweise weisen die mle4A- und m5e4A-Allele VR-I und VR-II identisch mit vls4 auf, wohingegen die VR-I und VR-III-Regionen von m6b4A identisch mit den gleichen Regionen von vls10 sind (5B). Diese Resultate zeigten, dass Veränderungen in der ursprünglichen vls-Kassette von den ruhenden vls-Kassetten stammten über genetische Rekombination. Im Gegensatz dazu blieben Sequenzen auf jeder Seite der vls-Kassette in den 11 untersuchten Allelen unverändert (5B).
  • Basierend auf dem Genkonversions-Mechanismus in vmp-Systemen wurde ursprünglich die Hypothese aufgestellt, dass, falls genetische Rekombination an der vlsE-Stelle auftreten sollten, die exprimierte vls-Kassette (vls1 in diesem Fall) vollständig durch eine einzelne ruhende Kassette flankiert durch das 17 bp direkte Repeat ersetzt werden würde. Jedoch brachte sorgsame Untersuchung zutage, dass keines der 11 vlsE-Allele welche untersucht wurden, identisch mit irgendeiner der ruhenden vls-Kassetten identifiziert bis dato waren. Vielmehr schien jedes Allel ein Mosaik von Segmenten von verschiedenen unterschiedlichen ruhenden vls-Kassetten zu sein. Beispielsweise sind, obwohl mle4A eine gemeinsame Sequenz mit vls4 über VR-I und VR-II hinweg teilt, seine VR-III und VR-VI die gleichen wie vls10 bzw. vls2. Interessanterweise scheinen die VR-IV und VR-V-Regionen von mle4A Hybride von Teilen von vls10 und vls5 und vls3 bzw. vls5 zu sein. Ähnliche Muster können auch gefunden werden im Rest dieser vlsE-Allele. Die Beobachtungen legten nahe, dass Segmente, jedoch nicht vollständige Regionen der ruhenden vls-Kassetten in der Expressionsstelle rekombiniert worden sind. Vergleich der ruhenden Kassettensequenzen auf der Nukleotid-Ebene legte nahe, dass 6 bis 11 unterschiedliche Rekombinations-Ereignisse in jedem der Klone, isoliert aus Mäusen, 4 Wochen nach Inokulation auftraten. Dieser Typ an kombinatorischen Reaktionen könnte potenziell in Millionen von unterschiedlichen vlsE-Allelen resultieren.
  • Um zu bestimmen, ob klonale Populationen einer einzelnen Maus auch ähnliche Sequenzvariationen zeigten, wurden 4 weitere Klone aus den Blut- und Ohr-Isolaten von Maus 1 ausgewählt, um die DNA-Sequenz an der vls-Stelle zu bestimmen. Die 5 Klone (m1b4A-E) des Blut-Isolats zeigten Sequenzen identisch miteinander, obwohl sie merkliche Sequenzunterschiede vom parentalen vlsE, wie repräsentiert durch m1b4A (5B), zeigten. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Sequenzen von den 5 Klonen des Ohr-Isolats substanziell sowohl von der parentalen vls1-Kassette als auch voneinander (5C). Konsistent mit den 11 vlsE-Allelen von unterschiedlichen Isolaten wurden die Sequenzvariationen des gleichen Ohr-Isolats auch in 6 variable Regionen konzentriert (5C). Jeder dieser Klone enthielt wiederum eine einzigartige Kombination von Sequenzen identisch mit Teilen von mehreren ruhenden vls-Kassetten. Beispielsweise enthielt (mle4C) VR-I von vls12, VR-II von vls4, VR-III von vls8 und VR-IV und VR-VI von vls11. Die homogene Natur von B. burgdorferi-Klonen, abgeleitet von dem Blut-Isolat von Maus 1, mag von dem Vorliegen der relativ wenigen Organismen im Blut herrühren im Vergleich zu Ohr-Biopsien, was essenziell im Klonieren durch limitierte Verdünnung resultiert. Alternativ kann die Auswahl, vorgegeben durch die Wirts-Immunantwort, in verschiedenen Gewebsumgebungen die Diversivität von vlsE-Varianten beeinträchtigen.
  • Die Sequenzvariationen in den klonalen Populationen von Maus-Isolaten könnten auch von der Hintergrundheterogenität der Stammkultur des Klons B31-5A3 auftretend während der in vitro-Kultur stammen, da der ursprüngliche Klon 7 Tage vor der Inokulation von C3H/HeN-Mäusen kultiviert wurde. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde die Stammkultur von B31-5A3 in BSK II-Medium inokuliert und nachfolgend in zwei in vitro-Passagen von 7 Tagen (insgesamt 14 Tagen) kultiviert. PCRTM-Produkte amplifiziert von der vlsE-Kassettenregion wurden erhalten unter Verwendung einer Probe dieser Kultur als Templat und entweder direkt sequenziert oder in den PCRTM II-Vektor kloniert und sequenziert. Zwei Sätze von PCRTM-Produkten und 4 unabhängig abgeleiteten rekombinanten Plasmiden enthaltend die PCRTM-Produkte wiesen alle Sequenzen auf identisch mit der ursprünglichen vlsE-Sequenz. Diese Ergebnisse zeigten an, dass die Sequenzvariationen nicht in hoher Häufigkeit an der vlsE-Stelle vor der Inokulation der Mäuse auftrat.
  • 5.10 Beispiel 10 – Veränderungen in der Antigenizität von vlsE-Varianten
  • Die häufig auftretende genetische Rekombination an der vlsE-Stelle und die putative Oberflächenlokalisation von vlsE legte nahe, dass Sequenzvariationen in den vlsE-Allelen in Veränderungen in der Antigenizität resultieren. Neun klonale Populationen, welche einzigartige vlsE-Allele trugen (siehe 5B) wurden einer Immunoblot-Analyse unterzogen. Obwohl eine ähnliche Menge an Gesamtproteinen auf die Gele geladen wurde, wie durch die Reaktivität auf Antikörper gegen B. burgdorferi Flaggelinprotein (6A) angezeigt wird, zeigten diese vlsE-Varianten einen dramatischen Abfall in der Reaktivität auf Antiserum gegen GST-Vls1-Fusionsprotein (6B). Die Maus-Isolate enthaltend m1b4A und m3b4A-Allele zeigten Banden, welche schwach reaktiv mit dem Antiserum waren (6, Zeilen 2 und 5). Die anderen Klone, die untersucht worden waren, zeigten schwache Banden, die nur mit einer längeren Chemilumineszenz-Exposition der Membran sichtbar waren. Diese reaktiven Banden wanderten bei geringeren Mrs als vlsE exprimiert durch den parentalen Klon B31-5A3, was Indikativ für Veränderungen entweder der Größe oder der Konformation ist. Keine reaktiven Banden wurden beobachtet im Klon B31-5A2, welcher das pBB28La-Plasmid nicht aufweist. Die verminderte Reaktivität von Maus-Isolaten mit Antiserum gegen parentale vls1-Kassettenregion zeigte, dass Sequenzunterschiede in diesen vlsE-Varianten (5B) in Veränderungen in wichtigen Kassettenregionen-Epitopen resultierten und folglich in der antigenen Variation.
  • 5.11 Beispiel 11 – In vivo-Expression von vlsE und Induktion von Antikörpern in infizierten Menschen und Tieren
  • Seren von den Mäusen in Experimenten, dargestellt in 5A, wurden hinsichtlich Reaktivität mit vlsE als ein Mittel zum Nachweis, ob das Protein in vivo exprimiert wird oder nicht, getestet. Serum erhalten aus Maus 1 am 28. Tag nach Inokulation mit B31-5A3 wurde zur Reaktion gebracht mit Immunoblots von 5A3 (exprimierend vlsE), 5A2 (nicht aufweisend vlsE), dem GST-Vls1-Fusionsprotein, GST als eine Kontrolle und 2 Klonen isoliert aus Maus 1 am Tag 28 (M1e4A und M1b4A). Die Ergebnisse, dargestellt in 6C, zeigten, dass C3H/HeN-Mäuse infiziert mit B. burgdorferi eine starke Antikörperantwort auf vlsE manifestierten. Obwohl das vorgeblutete Serum von Maus 1 keine nachweisliche Reaktivität zeigte, reagierte die Serumprobe, eingesammelt von der gleichen Maus 4 Wochen nach ursprünglicher Infektion mit B. burgdorferi B31-5A3, stark mit dem GST-vls1-Fusionsprotein, jedoch nicht mit GST allein, was auf die Expression von vlsE in einem Säugetierwirt hindeutet. Das gleiche Serum zeigte auch starke Reaktivität mit dem vlsE-Protein von B. burgdorferi B31-5A3, wohingegen keine merkliche vlsE-Bande beobachtet wurde mit B. burgdorferi B31-5A2. Im Gegensatz dazu zeigten die vlsE-Variante M1e4A verminderte Reaktivität, wenn sie mit dem gleichen Mausserum wie in 6C gezeigt zur Reaktion gebracht wurde.
  • Da die C3H/HeN-Mäuse mit einer großen Anzahl (105) der Organismen infiziert wurden (siehe 5A), war es möglich, dass die Antikörperantwort gegen vlsE aus dem ursprünglichen Inokulum resultiert war. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden Seren aus weißfüßigen Mäusen (Peromyscus leucopus), infiziert mit B. burgdorferi B31 über Zeckenbiss, und von menschlichen Lyme-Krankheitspatienten verwendet, um mit den ähnlichen Immunoblots zu reagieren. Die entsprechenden Ergebnisse, dargestellt in 6D, zeigten, dass Zecken-infizierte Peromyscus-Mäuse auch eine starke Reaktivität mit dem vlsE-Protein von B. burgdorferi B31-5A3 und GST-vls1-Fusionsprotein, jedoch nicht mit GST zeigten. Diese Ergebnisse wurden des Weiteren bestätigt mit Seren aus Lyme-Erkrankungspatienten (6E). Eine repräsentative Serumprobe aus einem klinisch diagnostizierten Patienten mit frühen Lyme-Krankheitssymptomen enthielt hochreaktive Antikörper gegen das vlsE-Protein von B31-5A3 und das GST-vls1-Fusionsprotein (6E). Ähnlich mit dem Serum von den C3H/HeN-Mäusen (6C) zeigten die Seren von der Peromyscus-Maus (6D) und dem Lyme-Krankheitspatienten (6E) geringe Aktivität mit der vlsE-Variante M1e4A. Diese Resultate zeigen, dass vlsE exprimiert wird und hoch immunogen in dem Säugetierwirt ist, jedoch dass die genetische Variation einzigartige vlsE-Varianten erzeugen kann, welche nicht länger vollständig durch die Immunantwort gegen das parentale vlsE erkannt werden. Sie zeigen auch an, dass Antikörper, erzeugt gegen vlsE, bedeutsam in der Immunodiagnose von Lyme-Erkrankung sein können.
  • Diese Ergebnisse zeigten, dass vlsE exprimiert wird und hoch immunogen in dem Säugetierwirt ist, jedoch dass die genetische Variation einzigartige vlsE-Varianten erzeugen kann, welche nicht länger vollständig durch die Immunantwort gegen parentales vlsE erkannt werden. Weitere Experimente haben gezeigt, dass einige Seren von an Lyme-Krankheit leidenden Patienten Reaktivität mit dem GST-vls1-Fusionsprotein und vlsE von B. burgdorferi B31-5A3 zeigen, jedoch nicht mit einigen der vlsE-Varianten, was folglich weiter die Expression und die Antigenvariation von vlsE in vivo unterstützt. TABELLE 5 KORRELATION VON PBB28LA MIT INFEKTIVITÄT
    Figure 00940001
    Figure 00950001
    • a nicht bestimmt
  • 6.0 Literaturverweise
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01020001
  • Figure 01030001
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Claims (45)

  1. Ein Polypeptid kodiert von einer Nukleinsäure resultierend von der genetischen Rekombination eines Borrelia-Gen-Segmentes vls2–vls16, wobei besagtes Segment des weiteren definiert ist als umfassend eine Sequenz von Position 712 bis 1293, Position 1294 bis 1869, Position 1870 bis 2439, Position 2440 bis 3009, Position 3010 bis 3483, Position 3484 bis 3990, Position 3991 bis 4548, Position 4549 bis 5058, Position 5059 bis 5652, Position 4653 bis 6219, Position 6220 bis 6789, Position 6846 to 7373, Position 7274 bis 7946 oder Position 7947 bis 8000 von SEQ ID NO: 3 oder einer Wiederholungs-Gen-Sequenz von Position 1293 bis 1309, Position 1869 bis 1885, Position 2439 bis 2456, Position 3009 bis 3025, Position 3483 to 3499, Position 3990 bis 4006, Position 4548 bis 4557, Position 5058 bis 5074, Position 5652 bis 5668, Position 6219 bis 6253, Position 6789 bis 6805, Position 7373 bis 7389, oder Position 7946 bis 7962 von SEQ ID NO: 3.
  2. Ein isoliertes Nukleinsäuresequenz umfassend (a) die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, oder (b) das Komplement von (a), oder (c) 20 zusammenhängende Basen von SEQ ID NO: 1, welche in der Lage sind, mit dem Komplement der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 unter Bedingungen höchster Stringenz zu hybridisieren, oder (d) das Komplement (c), das in der Lage ist, mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 unter Bedingungen von höchster Stringenz zu hybridisieren.
  3. Das Nukleinsäuresegment gemäß Anspruch 2, wobei das Nukleinsäuresegment 30 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID NO: 1, oder das Komplement davon umfasst.
  4. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 oder 3, wobei das Nukleinsäuresegment 40 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID NO: 1, oder das Komplement davon umfasst.
  5. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 oder 4, wobei das Nukleinsäuresegment 50 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID NO: 1, oder das Komplement davon umfasst.
  6. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das Nukleinsäuresegment 100 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID NO: 1, oder das Komplement davon umfasst.
  7. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das Nukleinsäuresegment alle 1227 zusammenhängenden Nukleotide von SEQ ID NO: 1 oder das Komplement davon umfasst.
  8. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Nukleinsäuresegment des weiteren zusätzliche terminale 5' oder 3' Nukleotidsequenzen oder internale Nukleotidsequenzen umfasst.
  9. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 8, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 50 Basen lang ist.
  10. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 9, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 100 Basen lang ist.
  11. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 10, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 500 Basen lang ist.
  12. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 11, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 1 000 Basen lang ist.
  13. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 12, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 2 000 Basen lang ist.
  14. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 13, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 3 000 Basen lang ist.
  15. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 14, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 5 000 Basen lang ist.
  16. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 15, wobei besagtes Nukleinsäuresegment 8 000 Basen lang ist.
  17. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 16, des weiteren definiert, so dass es ein immunogenes Polypeptid kodiert, welches eine Sequenz von Aminosäureresten aufweist, welche zwischen 70% und 80% identisch mit SEQ ID NO: 2 ist.
  18. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 16 des weiteren definiert, so dass es ein immunogenes Polypeptid kodiert, welches eine Sequenz von Aminosäureresten aufweist, welche zwischen 85% und 90% identisch mit SEQ ID NO: 2 ist.
  19. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 16 des weiteren definiert, so dass es ein immunogenes Polypeptid kodiert, welches eine Sequenz von Aminosäureresten aufweist, welche zwischen 90% und 99% identisch mit SEQ ID NO: 2 ist.
  20. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 16 des weiteren definiert, so dass es ein immunogenes Polypeptid kodiert, welches eine Sequenz von Aminosäureresten aufweist, welche zwischen 95% und 99% identisch mit SEQ ID NO: 2 ist.
  21. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 20, des weiteren definiert, so dass es ein immunogenes Polypeptid kodiert, welches die Sequenz von Aminosäureresten umfasst, welche identisch zu SEQ ID NO: 2 ist.
  22. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 21, des weiteren definiert als ein RNA-Segment.
  23. Das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 22, des weiteren definiert als ein DNA-Segment.
  24. Das DNA-Segment von Anspruch 23, welches ein immunogenes Peptid von 8 bis 20 Aminosäuren an Länge kodiert.
  25. Das DNA-Segment von Anspruch 23, welches ein immunogenes Peptid von 20 bis 80 Aminosäuren an Länge kodiert.
  26. Das DNA-Segment von Anspruch 23, welches ein immunogenes Peptid von 50 bis 150 Aminosäuren an Länge kodiert.
  27. Das DNA-Segment von Anspruch 23, welches ein immunogenes Peptid von 100 bis 200 Aminosäuren an Länge kodiert.
  28. Das DNA-Segment von Anspruch 23, welches ein immunogenes Peptid von 200 bis 400 Aminosäuren an Länge kodiert.
  29. Eine rekombinante Wirtszelle umfassend das Nukleinsäuresegment von irgendeinem der vorhergegangenen Ansprüche.
  30. Die rekombinante Wirtszelle von Anspruch 29, des weiteren definiert als eine E. coli-Zelle.
  31. Ein Verfahren zum Verwenden eines DNA-Segments von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 28, um ein Polypeptid herzustellen, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Herstellen eines rekombinanten Vektors, in welchem ein DNA-Segment von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 28 unter der Steuerung eines Promotors positioniert ist; (b) Einbringen besagten rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle; (c) Kultivieren besagter Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids ermöglichen; und (d) Einsammeln von besagtem exprimierten Polypeptid.
  32. Ein isoliertes immunogenes Polypeptid (a) welches zumindest 85% Homologie zur Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist; und (b) welches in der Lage ist, spezifisch mit Antikörpern zu binden, welche in ein Polypeptid erzeugt wurden, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
  33. Ein isoliertes immunogenes Polypeptid kodiert durch eine Nukleinsäure gemäß irgendeinem der Ansprüche 2 bis 28.
  34. Das Polypeptid von Anspruch 33, des weiteren definiert als ein isoliertes Polypeptid, das in der Lage ist, spezifisch an Antikörper zu binden, welche gegen ein Polypeptid erzeugt worden sind, das zumindest die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
  35. Eine Proteinzusammensetzung, umfassend das Polypeptid von Anspruch 33 oder 34.
  36. Die Zusammensetzung von Anspruch 35, des weiteren definiert als enthalten in einem physiologisch akzeptablen Hilfsstoff.
  37. Eine Zusammensetzung von Anspruch 35 oder 36 zur Anwendung in einem Verfahren zum Erzeugen einer Immunantwort, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, umfassend eine immunologisch effektive Menge von besagter Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung geeignet ist, einem Subjekt verabreicht zu werden.
  38. Ein Vakzin zum Schutz gegen Borrelia-Infektion, umfassend ein Polypeptid von Anspruch 33 oder 34.
  39. Ein aufgereinigter Antikörper, welcher spezifisch an das Polypeptid von Anspruch 34 bindet.
  40. Ein Antikörper von Anspruch 39, wobei der Antikörper an einen nachweisbaren Label gebunden ist.
  41. Ein Verfahren zum Diagnostizieren der Lyme-Krankheit umfassend das Untersuchen einer Probe erhalten von einem Subjekt hinsichtlich des Vorliegens eines Nukleinsäuresegments von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 28, einem Polypeptid der Ansprüche 33 bis 34 oder einem Antikörper, welcher immunologisch an ein Polypeptid von Anspruch 34 bindet.
  42. Ein Verfahren zum Assaying hinsichtlich einer Borrelia-Infektion, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Erhalten eines Antikörpers, welcher immunologisch an ein Polypeptid von Anspruch 34 bindet oder eines Polypeptids, welches immunologisch an solch einen Antikörper bindet; (b) Mischen einer Probe, Erhalten von einem Subjekt und des Antikörpers oder des Polypeptids; und (c) Bestimmen, ob immunologisches Binden zwischen dem Antikörper und einem Polypeptid in der Probe auftritt oder zwischen dem Polypeptid und einem Antikörper in der Probe; wobei das immunologische Binden die Borrelia-Infektion anzeigt.
  43. Ein Immuno-Nachweis-Kit umfassend in einem geeigneten Container ein oder mehrere Polypeptide von Anspruch 33 bis 34, oder einen Antikörper, welcher ein Polypeptid von irgendeinem der Ansprüche 33 bis 34 bindet und ein Immuno-Nachweis-Agens.
  44. Das Polypeptid von Anspruch 1, kodiert durch irgendeines der Borrelia-Gen-Segmente vls2–vls16, wobei besagtes Polypeptid durch eine Nukleinsäure kodiert wird, welche eine Sequenz umfasst von Position 712 bis 1293, Position 1294 bis 1869, Position 1870 bis 2439, Position 2440 bis 3009, Position 3010 bis 3483, Position 3484 bis 3990, Position 3991 bis 4548, Position 4549 bis 5058, Position 5059 bis 5652, Position 4653 bis 6219, Position 6220 bis 6768, Position 6846 bis 7373, Position 7274 to 7946, oder Position 7947 bis 8000 von SEQ ID NO: 3, oder wobei besagtes Polypeptid durch eine Nukleinsäure kodiert wird, welche eine Wiederholungs-Gensequenz von Position 1293 bis 1309, Position 1869 bis 1885, Position 2439 bis 2456, Position 3009 bis 3025, Position 3483 bis 3499, Position 3990 bis 4006, Position 4548 bis 4557, Position 5058 bis 5074, Position 5652 bis 5668, Position 6219 bis 6253, Position 6789 bis 6805, Position 7373 bis 7389, oder Position 7946 bis 7962 von SEQ ID NO: 3 umfasst.
  45. Das Polypeptid von Anspruch 44, charakterisiert als fähig zum spezifischen Binden mit einem oder mehreren Antikörpern erzeugt gegen ein Polypeptid kodiert durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID: 3.
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