DE69729473T2 - Pharmazeutisch-genetische verfahren zur verwendung bei der behandlung von krankheiten des nervensystems - Google Patents

Pharmazeutisch-genetische verfahren zur verwendung bei der behandlung von krankheiten des nervensystems Download PDF

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  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen. Das Apolipoprotein E (apoE) fungiert als ein Ligand bei dem Vorgang der Rezeptor-vermittelten Internalisierung von lipidreichen Lipoproteinen. ApoE ist wahrscheinlich auch am reversen Lipidtransport beteiligt. Im zentralen Nervensystem (ZNS) spielt apoE eine zentrale Rolle bei der Mobilisierung und Neuverteilung von Cholesterin und Phospholipid während des Umbaus von Membranen, der mit synaptischer Plastizität assoziiert ist (Poirier, J. et al., 1991, Mol. Brain. Res., 9: 191–195; Poirier J. et al., 1991, Mol. Brain. Res., 11: 97–106; Poirier J. et al., 1993, Neuroscience, 55: 81–90). Die Wichtigkeit von apoE im Gehirn wird weiterhin durch das Fehlen anderer zentraler Apolipoproteine wie apoA1 und apoE im Gehirn unterstrichen (Roheim P. S. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., 76: 4646–4649).
  • Das apoE-Gen auf dem Chromosom 19 hat drei allgemeine Allele (E2, E3, E4), die für drei hauptsächliche apoE-Isoformen kodieren. Es wurde gezeigt, dass die Häufigkeit des apoE4-Allels bei sporadischer Alzheimer-Erkrankung (AD) (Poirier J. et al., 1993, Lancet, 342: 697–699; Noguchi S. et al., 1993, Lancet (letter), 342: 737) und spät auftretender familiärer Alzheimer-Erkrankung (AD) (Corder E. H. et al., 1993, Science, 261: 921–923; Payami H. et al., 1993, Lancet (letter), 342: 738) deutlich erhöht ist. Ein apoE-Gendosiseffekt wurde sowohl bei sporadischen als auch familiären Fällen (d. h. mit Zunahme des Alters, bei dem die Krankheit auftritt, nimmt auch die Kopienzahl des E4-Allels zu) beobachtet. Frauen, die im Allgemeinen ein größeres Risiko für die Entwicklung von Alzheimer-Erkrankung aufweisen, zeigten einen Anstieg der Häufigkeit des apoE4-Allels verglichen mit gleichaltrigen Männern.
  • WO 95/29257 beschreibt Verfahren zur Bestimmung der klinischen Empfindlichkeit von Testpersonen mit einer neurodegenerativen Erkrankung wie Alzheimer, gegenüber geeigneten Therapeutika.
  • WO 96/02670 beschreibt ein Verfahren zum Erstellen einer Prognose für den Fortschritt der Erkrankung und das letztendliche Ausmaß an Demenz, an der eine Testperson während einer an beta-Amyloid-abhängigen Krankheit leiden würde, durch Nachweis der An- oder Abwesenheit von apoE-Isoformen oder DNA.
  • WO 96/03656 beschreibt ein Verfahren zum Erstellen einer Prognose der Wahrscheinlichkeit der Entstehung von chronischer neurodegenerativer Pathologie in einer Testperson mit Kopfverletzung oder in einer Testperson, die ein Risiko für eine Kopfverletzung trägt, durch Nachweis der apoE-Isoformen in der Testperson.
  • Die cholinerge Hypothese der geriatrischen Fehlfunktion des Erinnerungsvermögens führte zu einigen grundlegenden Fragen hinsichtlich der Heterogenität der Reaktionen gegenüber verschiedenen Cholinomimetika bei AD (Bartus R. T. et al., 1982, Science, 217: 408–417). Das Fehlen deutlich heilsamer Auswirkungen von Colin und Lezithin bei geriatrischen Patienten mit und ohne AD ist immer noch verwunderlich. Weiterhin haben zahlreiche klinische Studien, in denen Esterase-Inhibitoren wie Physostigmin und Takrin verwendet wurden, gezeigt, dass im Gegensatz zu jungen Patienten die optimale akute Dosis, die notwendig war, um die Leistung bei Erinnerungsaufgaben zu verbessern, sich bei Patienten unterschiedlichen Alters deutlich unterschied (Bartus R. T. et al., 1982, Science, 217: 408–417).
  • Neurologische Erkrankungen stellen eine einzigartige Reihe von Komplikationen für den behandelnden Arzt, die Patienten und das Pflegepersonal bereit; die Erkrankungen schreiten häufig sehr schnell fort und zerstören eine große Reihe von grundlegenden Lebensfunktionen. Der fortschreitende Charakter dieser Erkrankungen führt dazu, dass der Zeitverlust ein wichtiges Element im Behandlungsprozess ist. EP 0804615 (WO 95/29257) gewährt einen Einblick in die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer mit Therapie mit Cholinomimetika. EP 0804615 beschreibt Verfahren zur Bestimmung der klinischen Empfindlichkeit einer Testperson mit Alzheimer-Erkrankung auf eine Therapie mit Cholinomimetika durch Bestimmung des Allelgehalts der Testperson für Apolipoprotein E2, E3 und E4, wobei die Anwesenheit von apoE2 oder E3 in einer biologischen Probe der Testperson eine Prädisposition für eine Reaktion auf eine Therapie anzeigt, die auf Cholinomimetika basiert, und die Anwesenheit von apoE4 zeigt eine Prädisposition an, nicht auf eine Therapie zu reagieren, die auf Cholinomimetika basiert. EP 0804615 stellt keine Korrelation des apoE-Allelgehalts mit einem Prognose-Protokoll auf, welches z. B. das relative Auftrittsalter und die Rate des Fortschreitens beinhaltet, außerdem beschreibt es nicht die Verwendung der apoE-Allelbestimmung zur Prognose der klinischen Reaktion eines Patienten, der eine andere neurodegenerative Erkrankung als Alzheimer-Erkrankung hat, auf eine Therapie mit Cholinomimetika.
  • WO 96/02670 beschreibt ein Verfahren zur Prognose des Fortschreitens der Krankheit und des letztendlichen Ausmaßes der Demenz, an der eine Testperson leiden würde, die eine beta-Amyloid-verwandte Krankheit hat, durch Nachweis der An- oder Abwesenheit von apoE-Allelen oder -Isoformen, wobei die Anwesenheit einer apoE2-Isoform oder eines apoE2-Allels in einer Testperson, die ein Risiko für eine solche Krankheit trägt oder eine solche Krankheit im Frühstadium hat, einen schwächeren Verlauf der Erkrankung anzeigt. WO 96/02670 ist ausschließlich darauf gerichtet, zu bestimmen, ob eine Testperson einen ernsteren oder einen schwächeren Verlauf einer Betaamyloid-verwandten Erkrankung hat; es werden weder Daten bereitgestellt, um die Wirksamkeit eines Arzneistoffs in diesem Patienten hervorzusagen, noch werden die tatsächlichen Schritte eines Prognose-Protokolls nahe gelegt.
  • WO 96/03656 beschreibt ein Verfahren zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit der Entstehung einer chronischen neurodegenerativen Pathologie in einer Testperson mit Kopfverletzung oder in einer Testperson, die ein Risiko für Kopfverletzungen trägt, durch Nachweis von apoE-Isoformen in der Testperson. WO 96/03656 offenbart nicht, dass der Nachweis von apoE-Isoformen dazu verwendet werden kann, in einer Testperson mit Kopfverletzung die Wirksamkeit eines Arzneistoffs vorherzusagen, und diskutiert die tatsächlichen Schritte eines Prognose-Protokolls nicht.
  • Die Auswahl der Behandlung einer neurologischen Behandlung wird häufig durch die Tatsache erschwert, dass ein signifikanter Behandlungszeitraum notwendig ist, um zu bestimmen, ob ein Arzneistoff einen therapeutischen Effekt hat oder nicht. Dem gemäß ist die Behandlung mit den meisten wirksamen Arzneistoffen häufig verzögert, während die Erkrankung fortschreitet. Ein Verfahren, welches die Vorhersage ermöglicht, welche Patienten auf spezifische Therapeutika und Dosie rungen reagieren würden, würde körperliche und psychologische Nutzen mit sich bringen. Da die Gesundheitspflege immer unzugänglicher wird, wird auch die Fähigkeit, Gesundheitspflegemaßnahmen effektiv zuzuordnen, immer wichtiger.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Wir haben ein Verfahren entdeckt, um eine Prognose für Patienten mit einer neurologischen Erkrankung vorherzusagen. Insbesondere haben wir ein Verfahren entdeckt zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Arzneistofftherapien mit Cholinomimetika, des relativen Alters bei Auftreten der Krankheit und der relativen Rate des Fortschreitens verschiedener Erkrankungen. Aus diesen Entdeckungen haben wir einen Ansatz entwickelt, der hier als Pharmakogenetik bezeichnet wird, um Profile für Patienten zu erstellen, bei denen eine neurologische Erkrankung bereits diagnostiziert wurde. Pharmakogenetik stellt eine Prognose für den Patienten bereit, einschließlich der Bestimmung des wirksamsten Arzneistoffs (wo dies angezeigt ist) und dessen Dosierung. Unser Verfahren ermöglicht es behandelnden Ärzten, Patienten und Familienmitgliedern, eine fundierte Auswahl hinsichtlich der Therapie zu treffen. Weiterhin ermöglichen es die erfindungsgemäßen pharmakogenetischen Verfahren dem behandelnden Arzt zu verhindern, dass, wenn mehr als ein Therapeutikum existiert, Therapeutika so lange verabreicht werden, bis ein Therapeutikum, welches wirkt, durch „trial and error" entdeckt wird; mit Pharmakogenetik kann ein geeignetes Therapeutikum bereits in der ersten Runde der Therapie verabreicht werden. Dieses Verfahren wird eine schnellere Behandlung mit dem geeigneten Arzneistoff und der geeigneten Dosierung bereitstellen. Auch in Fällen, in denen eine Arzneistofftherapie ungeeignet ist, wird das Verfahren eine Prognose für den Patienten bereitstellen und es ihm ermöglichen, nutzlose Nebeneffekte von Arzneistoffen zu verhindern.
  • Das pharmakogenetische Verfahren hat einen weiteren Vorteil bei der Verwendung auf dem Gebiet der Arzneistofftestung. So kann das Verfahren den Patienten, der für die Teilnahme an einem Arzneistoff-Screening in Betracht gezogen wird, als einen Patienten klassifizieren, der von einer Therapie mit Cholinomimetika wahrscheinlich profitiert oder nicht. Wenn der Patient wahrscheinlich auf Cholinomimetika reagieren wird, und der zu untersuchende Arzneistoff kein Cholinomimetikum ist, dann kann der Patient für den Versuch ungeeignet sein oder es kann ethisch ungeeignet sein. Im umgekehrten Fall können Patienten, die wahrscheinlich auf Cholinomimetika ansprechen, statistisch nützlichere Daten hinsichtlich neuer Therapien mit Cholinomimetika bereitstellen. Patienten, die wahrscheinlich nicht auf Cholinomimetika ansprechen, sind besonders gute Kandidaten für Therapien mit Nicht-Cholinomimetika, sowohl aus körperlichen als auch ethischen Gesichtspunkten.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Erstellung eines Prognose-Protokolls für einen Patienten, bei dem Neurofibromatose, eine Erkrankung des entwickelnden Nervensystems, Depression, eine Verletzung des Nervensystems, eine Infektion des Nervensystems, Koma, Multi-Infarkt-Demenz, ein Diätdefizit oder ein kardiovaskulärer Schaden diagnostiziert wurde, wobei das Verfahren umfasst:
    • a) Identifizierung eines Patienten bei dem die Erkrankung bereits diagnostiziert wurde;
    • b) Bestimmung des apoE-Allelgehalts des Patienten durch Genotypisierung oder Phenotypisierung, wobei diese Phenotypisierung die Charakterisierung einer apoE-Proteinisoform einschließt; und
    • c) Konvertieren der Daten, die aus Schritt b) erhalten wurden in ein Prognose-Protokoll, wobei das Prognose-Protokoll eine Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit und des Patientenergebnisses einschließt, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4-Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient wahrscheinlich nicht von cholinomimetischer Therapie profitieren wird.
  • Das Prognose-Protokoll kann eine Vorhersage der Arzneistoffwirksamkeit, eine Vorhersage des Patientenergebnisses oder beides umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen dieser Aspekte umfassen die Verfahren weiterhin die Schritte der Erstellung eines Patientenprofils, welches bevorzugt das Geschlecht des Patienten und/oder den Genotyp (z. B. Presenilin, Apolipoprotein E oder BChE-Genotyp) umfasst.
  • Bei dem Patienten kann zum Beispiel bereits ein kongenitaler Defekt im Aminosäuremetabolismus (z. B. Sukzinylargininurie, Zystathionurie, Histidinämie, Homozystinurie, Hyperammonämie, Phenylketonurie und Tyrosinämie); fragiles X-Syndrom; Schlaganfall; oder Multi-Infarkt-Demenz diagnostiziert worden seien.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Patienten bereit, die geeignet sind zur Teilnahme an einer klinischen Studie eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Neurofibromatose, einer Erkrankung des entwickelnden Gehirns, Depression, amyotroper Lateralsklerose, multipler Sklerose, einer Verletzung des Nervensystems, einer Infektion des Nervensystems, einer Prion-Erkrankung, Koma, Multi-Infarkt-Demenz, einem Diätdefizit oder einem kardiovaskulären Schaden, wobei das Verfahren umfasst:
    • a) Identifizierung eines Patienten mit der Erkrankung;
    • b) Bestimmung des apoE-Allelgehalts des Patienten durch Genotypisierung oder Phänotypisierung, wobei diese Phänotypisierung die Charakterisierung einer apoE-Proteinisoform einschließt; und
    • c) Konvertieren der Daten, die aus Schritt b) erhalten wurden in ein Prognose-Protokoll, wobei das Prognose-Protokoll darauf hinweist, ob der Patient ein Kandidat für eine cholinomimetische Arzneimittelstudie oder eine nicht-cholinomimetische Arzneimittelstudie ist oder nicht, wobei erwartet wird, dass ein Patient, dem beide apoE-Allele fehlen, ein Kandidat für eine cholinomimetische Arzneimittelstudie ist oder wobei erwartet wird, dass ein Patient, der ein oder mehrere apoE4-Allele hat, ein schlechter Kandidat in einer cholinomimetischen Arzneimittelstudie ist.
  • Das Prognose-Protokoll stellt einen Indikator dafür bereit, ob der Patient ein Kandidat für eine cholinomimetische Arzneistoffuntersuchung ist oder nicht. Patienten, die ein oder mehrere apoE4 Allele tragen, sind schlechte Kandidaten für cholinomimetische Arzneistoffuntersuchungen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Bestimmung des Risikos eines Schlaganfalls in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
    • a) Bestimmung des apoE-Allelgehalts durch Genotypisierung oder Phänotypisierung, wobei diese Phänotypisierung die Charakterisierung einer apoE-Proteinisoform einschließt; und
    • b) Bestimmung des BChE-Genotyps des Patienten, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4-Allelen und einem oder mehreren BChE-K-Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient für Schlaganfall gefährdet ist.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Durchführung einer pharmakogenetischen Analyse bereit, wobei das Verfahren ein Mittel zur Konvertierung eines Patientenprofils in einem Prognose-Protokoll einschließt, wobei dieses Mittel die Bestimmung des apoE-Allelgehalts eines Patienten einschließt, bei dem Neurofibromatose, eine Erkrankung des entwickelnden Nervensystems, Depression, eine Verletzung des Nervensystems, eine Infektion des Nervensystems, Koma, Multi-Infarkt-Demenz, ein Diätdefizit, ein kardiovaskulärer Schaden oder Schlaganfall diagnostiziert wurde, durch Genotypisierung oder Phänotypisierung einschließlich der Charakterisierung einer Proteinisoform.
  • Für die vorliegende Erfindung relevante therapeutische Agenzien umfassen sowohl cholinomimetische als auch nicht-cholinomimetische Arzneistoffe, die für die Behandlung einer neurologischen Erkrankung verwendet werden. Cholinomimetische Arzneistoffe können ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Inhibitoren des Azetylcholinabbaus, von Induktoren der Azetylcholinsynthese, aus Azetylcholin-Agonisten oder Mimetika, und Antagonisten des muskarinischen M2-Rezeptors. Es sollte beachtet werden, dass die durch das pharmakogenetische Verfahren gelegten Therapie, alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien verwendet werden können, für die der Patient nicht kontraindiziert ist.
  • Erfindungsgemäß werden die folgenden Begriffe nachstehend definiert. „Kognitive Verstärker" bezeichnet Arzneistoffe, die a) die Gedächtnisleistung, sei es wörtliche, räumliche oder tatsächliche Erinnerung und b) die Lernfähigkeit verstärken.
  • „Cholinomimetische Therapien" bezeichnet Arzneistoffe, die die Funktion von Azetylcholin nachahmen oder die Aktivität der verbleibenden Azetylcholin-synthetisierenden Zellen verstärken, diese Arzneistoffe beinhalten in nichtbeschränkender Form Inhibitoren des Azetylcholinabbaus (Azetylcholinesterase-Inhibitoren wie Takrin), Arzneistoffe, die die Struktur und Funktion von Azetylcholin nachahmen (Agonist: Muskarin-M1-Rezeptor-Agonist ist ein typisches Beispiel), Arzneistoffe, die die Azetylcholinaufnahme durch Neuronen blockieren und Arzneistoffe, die mit präsynaptischen Rezeptoren wechselwirken, um die Azetylcholinfreisetzung aus cholinergen Neuronen zu induzieren.
  • „apoE-Sonden" bezeichnet Nukleinsäuresonden oder apoE-Allel-spezifische Antikörper, die selektiv die apoE2-, apoE3- oder apoE4-Allele bzw. -Proteine erkennen.
  • „Nicht-AD neurologische Erkrankung" bezeichnet eine andere Erkrankung als Alzheimerkrankheit, die die neuronalen Zellen des Nervensystems befällt, spezifisch umfasst sind: Prionerkrankungen (z. B. Creutzfeldt-Jakob-Krankheit); Pathologien des entwickelnden Gehirns (z. B. kongenitale Defekte des Aminosäuremetabolismus, wie Sukzinylargininurie, Zystathionurie, Histidinämie, Homozystinurie, Hyperammonämie, Phenylketonurie und Tyrosinämie und fragiles X-Syndrom); Erkrankungen des reifen Gehirns (z. B. Neurofibromatose, Huntingtonsche Erkrankung, Depression, amyotrope Lateral-Sklerose, Multiple Sklerose und Schlaganfall); Erkrankungen des Erwachsenenalters (z. B. Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Huntingtonsche Erkrankung, Lewy's-Körperchen-Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, Picksche Krankheit, amyotrope Lateral-Sklerose, Multiple Sklerose, Neurofibromatose), Gehirnverletzung, Schlaganfall und Multi-Infarkt-Demenz; und Erkrankungen des Gehirns (z. B. Gehirnausfälle, Gehirnverletzung, Koma, Infektionen durch verschiedene Agenzien, Diät-Defizienzen und kardiovaskuläre Unfälle).
  • „Alzheimersche Erkrankung (AD)" bezeichnet eine Erkrankung, die durch einen frühen und umfassenden Verlust der entorhinalen Kortex-Neurone gekennzeichnet ist. AD-Patienten können durch progressive und degenerative Effekte im Gehirn identifiziert werden, die keinen anderen Gründen zugeordnet werden können. Post-mortem kann die Erkrankung durch die Anwesenheit von Plaques und Fibrillen diagnostiziert werden.
  • „Bereits diagnostiziert" bezeichnet die bereits bestehende Diagnose einer neurologischen Erkrankung, der genetischen Prädisposition zur Erkrankung oder beides.
  • „Patientenprofil" bezeichnet Daten, die sich auf den Patienten beziehen, für den die pharmakogenetische Analyse durchgeführt wird. Daten können Informationen hinsichtlich der Diagnose des Patienten, des Alters, des Geschlechts und des Genotyps umfassen, das Profil des Patienten kann auch Materialien vom Patienten wie Blut oder auch gereinigte RNA oder DNA enthalten.
  • „ApoE-Genotypisierung" bezeichnet die Bestimmung der Art und die Anzahl von apoE-Allelen, die im Patienten anwesend sind, bestimmt durch Nukleinsäuresequenzierung, PCR oder RT-PCR Amplifikation, Untersuchung des apoE-Proteins oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren.
  • „Allelgehalt" bezeichnet das relative Verhältnis von apoE2-, 3- und 4-Allelen in der chromosomalen DNA des Patienten. Der Allelgehalt kann durch Vergleich der relativen Zahlen der vom Patienten bereits bekannten apoE-Allel-Typen bestimmt werden.
  • „PCR oder RT-PCR Amplifikation" bezeichnet die Behandlung einer DNA-Probe mit einem Polymerase-Kettenreaktionsschritt oder einer RNA-Probe mit einem Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsschritt, so dass in Anwesenheit von geeigneten Primern ein DNA-Fragment entweder synthetisiert oder nicht synthetisiert wird und somit den Allelstatus eines Patienten offenbart.
  • „BChE-K-Allel" bezeichnet den Polymorphismus des Butylrylcholinesterase(BChE)-Gens, das am Nukleotid 1615 eine Punktmutation aufweist, die den Aminosäurerest 539 von Alanin zu Threonin verändert und zu einem Enzym führen kann, das eine reduzierte katalytische Aktivität aufweist. Andere Polymorphismen dieses Lokus existieren (z. B. Deletionen (BChE*FS4), Missense-Mutationen (BChE*24M, *1005, *250P, *267R, *330I, *365R, *4185, *515C, *539T) und Nonsense-Mutationen (BChE*119STOP, *465STOP)) und sind in dieser Erfindung umfasst.
  • „Prognose-Protokoll" bezeichnet einen Therapieplan, der durch das pharmakogenetische Verfahren dem behandelnden Arzt oder dem Patienten zur Verfügung gestellt wird. Das Prognose-Protokoll beinhaltet eine Aussage, ob der Patient auf ein cholinomimetisches Therapeutikum positiv ansprechen wird oder nicht. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Protokoll auch eine Aussage über die Dosierung, auf die der Patient am wahrscheinlichsten ansprechen wird.
  • Das „pharmakogenetische Verfahren" ist ein Verfahren, wobei genetische und diagnostische Daten, einschließlich der neurologischen Diagnose des Patienten und des apoE- und/oder BChE-Genotyps des Patienten verarbeitet werden, um therapeutische Optionen und Prognosen bereitzustellen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine Western-Blot-Analyse der apoE-Proteinkonzentrationen im Hippocampus von AD- und nicht-AD-Personen.
  • 2 zeigt eine Northern-Blot-Analyse der apoE-mRNA-Expression im Hippocampus von AD- und nicht-AD-Personen.
  • 3A–3F sind Diagramme, die die Kopienzahl des E4-Allels, die Neurofibrillenbündel und die Dichten von senilen Plaques im Hippocampus bei AD veranschaulichen.
  • 4A und 4B sind Diagramme, die die Kopienzahl des E4-Allels und die Aktivität der Cholinazetyltransferase bei Alzheimerscher Erkrankung veranschaulichen.
  • 5A und 5B sind Diagramme, die den Verlust an Neuronen veranschaulichen, die Azetylcholin im Nukleus basalis von Meynert und im diagonalen Band von Broca synthetisieren.
  • 6A–6J sind Diagramme, die den Effekt der Kopienzahl des apoE4-Allels auf a) die Aktivität der Cholinazetyltransferase, b) die Dichte des nikotinischen Rezeptors, c) die Gesamtdichte des muskarinischen Rezeptors, d) die Rezeptordichte des muskarinischen Rezeptors M1 (post-synaptisch) und e) des muskarinischen Rezeptors M2 in post-mortem nicht-AD- und AD-Gehirnen im Hippocampus und im temporalen Kortex veranschaulichen.
  • 7 ist ein Diagramm, das die individuellen neuropathologischen und morphologischen Charakteristika veranschaulicht, die mit dem cholinergen System im Gehirn verschiedener Alzheimer-Erkrankungen und untersuchten Kontrollfällen assoziiert sind.
  • 8A und 8B sind Diagramme, die die Delta-Werte der AD-Einschätzungsskala (ADAS) (Endwerte minus Screenwerte) in Takrin-behandelten AD-Patienten mit unterschiedlichem apoE-Genotyp veranschaulichen.
  • 9A und 9B sind Diagramme der ADAS-COG Scores mit Takrin bzw. Xanomelin, vom Tage 0 bis zur Woche 30.
  • 10 ist ein Diagramm des Effektes der Anwesenheit des apoE4-Allels auf die ADAS-COG Scores in den 9A und 9B.
  • 11 ist ein Diagramm der apoE-Konzentration im Gehirn von AD-Patienten als Funktion des apoE-Allelgehalts.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wir zeigen hier, dass eine Korrelation des Alters, des Geschlechts, des Genotyps, des apoE-Allelgehalts und der Anwesenheit des BChE-K-Allels dazu verwendet werden kann, geeignete Arzneistoffe, Dosierungen und eine Prognose für einen gegebenen AD- oder nicht-AD-Patienten zu bestimmen. Die Prognose kann eine Vorhersage des relativen Alters beim Auftritt der Erkrankung und der Rate des Fortschreitens umfassen.
  • Verluste cholinerger Neuronen und/oder der Aktivität der Cholinazetyltransferase (ChAT) sind gut bekannte Kennzeichen von AD (Perry E. K. et al, 1977, J. Neurol. Sci., 34: 247–265; Davies P. et al, 1976, Lancet, 2: 1403). Wir haben das Verhältnis zwischen dem apoE4-Genotyp und cholinergen Defiziten untersucht, und wir beobachteten, dass mit Zunahme der Anzahl der apoE4-Allele die apoE-Konzentration sinkt. Weiterhin ist die Abnahme der ChAT-Aktivität im Hippocampus und im temporalen Kortex bei AD-Fällen umgekehrt proportional zur Kopienzahl des apoE4-Allels (d. h. bei erhöhter Kopienzahl des apoE4-Allels ist die ChAT-Aktivität verringert). Zusätzlich haben wir herausgefunden, dass ein anderer präsynaptischer Marker der cholinergen Vorhersage, der Nikotinrezeptor, in apoE4-AD-Patienten deutlich reduziert war. Umgekehrt haben wir gefunden, dass ein typischer postsynaptischer Marker, der M1-Muskarin-Rezeptor in AD- und nicht-AD-Patienten unverändert vorliegt, ungeachtet dessen, ob apoE4 anwesend ist oder nicht. Der M2-Muskarin-Rezeptor, ein zusammengesetzter prä- und postsynaptischer Marker, wird ebenfalls durch die Gendosis des apoE4-Allels nicht beeinträchtigt. Wir haben auch beobachtet, dass die Anwesenheit des apoE4-Allels das Alter bei Auftritt der neurologischen Erkrankung herabsetzt und die Prognose verschlechtert.
  • Die vorherstehend genannten Erkenntnisse zeigen deutlich die Existenz unterschiedlicher genetischer Einheiten bei der neurologischen Erkrankung, die mit differenziellen Ausmaßen der Veränderungen der cholinergen Innervation korrelieren. Umgekehrt korreliert das Maß der Innervierung mit der Prognose, einschließlich der Fähigkeit, auf cholinomimetische Arzneistoffe anzusprechen.
  • Wir glauben, dass die Korrelation zwischen dem apoE4-Allelgehalt und den Abnahmen der ChAT-Aktivität und der nikotinischen Rezeptoren durch wenigstens zwei unterschiedliche Phänomene erklärt werden kann. Zunächst könnten Phospholipide wie Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE), die als Cholinvorläufer bei der Synthese von Azetylcholin (Ach) dienen können, über den klassischen apoE-LDL-Rezeptorweg in Neuronen transportiert werden. Eine Isoform-abhängige gestörte Regulierung des Transports von Phospholipiden im Gehirn von apoE4-Trägern könnte die verminderten Konzentrationen an PC, PE und Cholin erklären, die für AD berichtet wurden (Pettegrew J. W., 1989, Ann. NY Acad. Sci., 568: 5–28; Nitch RM et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 1671–1675). Dies kann wiederum zu verminderten Kapazitäten bei der Ach-Synthese führen. Diese Hypothese stimmt mit Membraneffekten überein, die in AD-Patienten berichtet wurden, wie Veränderungen in der Membranfluidität im Hippocampus und in den Plättchen von AD-Patienten. Der Verlust an Cholesterin, der bei AD berichtet wurde und die Auswirkungen von apoE4 auf die nikotinische Bindeaktivität stimmen mit der apoE4/gestörte Lipidhomeostase Hypothese überein.
  • Zusätzlich zum vorherstehend gesagten könnte die Verminderung der neuronalen ChAT-Aktivitäten und der Cholinspiegel sowohl in AD- und nicht-AD-Patienten gleichzeitig mit dem Verlust an cholinergen Neuronen auftreten. Die Analyse der Anzahl von Azetylcholinesterase-positiven Neuronen im Nukleus basalis von Meynert (NBM) und dem diagonalen Band von Broca (DBB) in AD-Patienten wies bei apoE4-Trägern gegenüber homozygoten-apoE3-AD-Fällen deutliche Verluste an cholinergen Neuronen auf.
  • Obwohl diese Beobachtungen anfänglich in AD- und Schlaganfallpatienten gemacht wurden, glauben wir, dass unsere Beobachtung hinsichtlich des apoE-Allelgehalts und der Arzneistofftherapien auf nicht-AD neurologische Erkrankungen verallgemeinert werden können, da der zugrunde liegende Mechanismus, der durch den apoE-Allelgehalt verändert wird, nicht AD-spezifisch ist. Unsere Entdeckung zeigt, dass der apoE4-Allelgehalt, zusammengenommen mit den Parametern des Patientenprofils, individuelle Variationen in cholinergen Systemen des Gehirns vorhersagen kann. Andere nützliche Vorhersagen beziehen sich auf geeignete Therapien für Erkrankungen wie Parkinson und Multiple Sklerose angesichts des apoE4-Allelgehalts und des BChE-Allelstatus.
  • Prospektive-retrospektive Analysen von Patienten, die entweder gut oder schlecht auf Cholinomimetika als auch auf andere Arzneistoffe ansprechen, die dazu geeignet sein sollen, die Auswirkungen von Schlaganfall, Parkinson und Multipler Sklerose zu lindern (z. B. Aspirin, Antithrombotika, Tiklopidin HCL, (TiclidTM), levodopa-carbidopa, (SinemetTM), und Interferon β-1B (BetaseronTM)) werden in den Beispielen vorgestellt.
  • Man weiß, dass cholinomimetische Arzneistoffe die Erinnerungsleistung sowohl in jungen als auch in alten Testpersonen verstärken, die wenigstens ein apoE2- oder apoE3-Allel tragen. In Individuen mit apoE2 und apoE3 konnte die Gedächtnisleistung durch die Verabreichung von Cholinomimetika wie Azetylcholin-Agonisten (z. B. der M1-Agonist Xanomelin, erhältlich von Eli Lilly), M2-Rezeptor-Antagonisten (z. B. BIBN-99 von Boehringer Ingelheim), Inhibitoren des Azetylcholinabbaus (z. B. Takrin, erhältlich von Parke-Davis, oder E-2020, erhältlich von Pfizer) in Patienten mit apoE2 oder apoE3 aber nicht apoE4 wiederhergestellt oder verstärkt werden. Pharmakogenetik ermöglicht es dem behandelnden Arzt, aus den verschiedenen erhältlichen Behandlungen, die für den jeweiligen Patienten am meisten geeignete Behandlung auszuwählen.
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden werden, die lediglich veranschaulichend und nicht beschränkend gedacht sind.
  • BEISPIEL I
  • Bestimmungen der apoE-Konzentrationen und des Allelgehalts
  • 1 und 2 veranschaulichen Western-Blot- und Northern-Blot-Analysen von apoE-Konzentrationen im Hippocampus von nicht-AD- und AD-Patienten als Funktionen ihres jeweiligen Genotyps.
  • Eingefrorene Hippocampi von post-mortem-Patienten wurden von der Douglas Hospital Brain Bank in Montreal erhalten. Das Alter und Geschlecht und post-mortem-Verzögerungen (etwa 14 Stunden) stimmten in beiden Gruppen überein. Post-mortem-Verzögerungen bis etwa 24 Stunden hatten nur geringe Auswirkungen auf die apoE-Stabilität (Lehtimaki T., 1991, Clin. Chim. Acta, 203: 177–182) und apoE-enthaltendes Gewebe kann für einige Monate bei –80°C gelagert werden, ohne merklichen Abbau. Gesamt-RNA aus dem Hippocampus wurde extrahiert und wie zuvor beschrieben durch Oligo(dT)-Hybridisierung quantifiziert (Poirier J. et al., 1991, Mol. Brain. Res., 11: 97–106). Das Hybridisierungsprotokoll mit der Gesamtlängen-apoE-cRNA-Sonde wurde ebenfalls früher beschrieben (Poirier J. et al., 1991, Mol. Brain. Res., 9: 191–195). DNA mit hohem Molekulargewicht oder aus eingefrorenem Zerebellum oder temporalem Kortexgewebe wurde nach Goelz et al. (Goelz S. E. et al., 1986, Biochem. Biophys. Res. Comm., 130: 118–126) isoliert.
  • Der apoE-Genotyp wurde durch eine Allel-spezifische Primer-Verlängerung der aufgereinigten Gehirn-DNA bestimmt, unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Main et al. (Main R. F. et al., 1991, J. Lipid. Res., 32: 183–187). Die mit D, E, F, G und H bezeichneten Primer wurden für uns durch Genosys Biotech (The Woodland, TX) mit Primer-Sequenzen synthetisiert, die aus Main et al. (Main R. F. et al., 1991, J. Lipid. Res., 32: 183–187) bereitgestellt wurden. Die Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 μl durchgeführt, enthaltend 1 μg DNA; jeweils 0,2 mmol/l Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyzytidintriphosphat, Desoxythymidintriphosphat und Desoxyguanosintriphosphat; 10% Dimethylsulfoxid; jeweils 12,5 pmol der Primer D, E, F oder G; 25 pmol Primer H; und 10 μl eines 10fach PCR Reaktionspuffers (Vector Biosystem, Toronto, ONT). Die DNA im Reaktionsgemisch wurde zuerst 10 Minuten bei 96°C denaturiert und dann auf 4°C abgekühlt. Eine Einheit Taq-Polymerase (Vector Biosystem, Toronto, ONT) wurde dann zu jeder Probe zugegeben. Jede Probe wurde für 2 Minuten bei 96°C wieder erhitzt und 30 Wärmezyklen in einem Wärmezyklusgerät ausgesetzt, wobei jeder Zyklus aus einer 10 Sekunden Denaturierung bei 96°C, 30 Sekunden Anlagerung bei 58°C und 1 Minute Verlängerung bei 65°C besteht. Die Reaktionsprodukte wurden sichtbar gemacht durch Elektrophorese von 10 μl des Reaktionsgemisches auf einem 1-prozentigen Agarose-Gel, das TPE-Puffer (0,08 mol/l Tris-Phosphat, 0,002 mol/l EDTA, Sigma, St. Louis, USA) und Ethidiumbromid (0,15 μg/ml) enthielt, für 1 Stunde bei 67 V. Die Gele wurden dann fotografiert und das Bandenprofil wurde mit bekannten Standards verglichen.
  • Die Analyse des apoE-Proteins wurde durch Immun-Blot durchgeführt. 50 μg eines Hippocampus-Homogenats, das mit einer Einheit Neuraminidase vorbehandelt wurde, wurde auf ein 25 cm langes SDS-Polyacrylamid-Gel (10%) geladen und 3 Stunden bei Raumtemperatur laufen gelassen. Die Proteine wurden mit einer BIORADTM Trans-Blot Zelle auf einen Nitrozellulosefilter übertragen und der Nachweis des apoE-Proteins wurde mit einem polyklonalen Antikörper gegen das menschliche apoE-Protein (International Immunology Corp., CA, Verdünnung 1 : 2000) durchgeführt. Die Adsorption des Antikörpers an aufgereinigtes apoE blockierte den Nachweis des menschlichen apoE-Proteins vollständig, welches ein Molekulargewicht von 34–36 kDa aufweist. Molekulargewichtsmarker (Rainbow markers, Amersham) wurden in benachbarten Vertiefungen aufgetragen; während die Sichtbarmachung der Banden mit einem Chemilumineszenz-Nachweis-Kit (Amersham, Katalog Nr. RPN 2100) durchgeführt wurde. Die Quantifizierung der autoradiografischen Signale wurde mit einem MCID Bildanalysesystem (St. Catherine, Ontario) durchgeführt, welches mit einer 1D-Gel Analysesoftware ausgestattet war.
  • ERGEBNISSE
  • Es wurde gezeigt, dass apoE mRNA im AD-Gehirn anwesend ist, aber als Reaktion auf Zellverlust und Deafferenz nicht heraufreguliert wird. Wir haben vorgeschlagen, dass der Verlust an Synapsen, der bei apoE4/AD-Testpersonen berichtet wird, das Ergebnis einer selektiven Störung des apoE/LDL-Rezeptor-Signalwegs sein könnte. 1 veranschaulicht Konzentrationen von apoE, die im Gehirn von AD-Testpersonen mit verschiedenen Genotypen gemessen wurden, als auch in Kontrolltestpersonen mit apoE3/2- und apoE3/3-Genotypen. Von den etwa 90 neuropathologischen älteren Kontrolltestpersonen, die wir bisher untersucht haben (unter Verwendung von Standardkriterien), wurde bei keinem, der den AD-Kriterien entsprach, das apoE4-Allel nachgewiesen. Eine signifikante Reduktion der Konzentration an apoE wurde im Gewebe von apoE4-Trägern gegenüber nicht-apoE4-Testperson nachgewiesen. Interessanterweise folgt das Risiko der Entstehung von AD, die Anlagerung von senilen Plaques und Neurofibrillen im Gehirn von AD-Patienten, und der Verlust der cholinergen Funktion bei AD-Patienten einem Genotyp-Gradienten: Zunahme des Schadens von E2/2 → E3/3 → E4/4, wobei der letztere Genotyp den „worst case" darstellt.
  • Wir glauben, dass die wichtigste Beobachtung aus diesen Daten darin besteht, dass die Pathologie von AD in apoE4-AD-Trägern sehr viel ernster ist (Zellverlust, Deafferenz, und gesteigerte Expression von GFAP, etc.) als in apoE4-negativen AD-Testpersonen. Somit sind die Konzentrationen von apoE, die als Reaktion auf Schädigung und Zellverlust erhöht sein sollten, tatsächlich in den gleichen apoE4-Individuen verringert.
  • PATHOPHYSIOLOGISCHE KONSEQUENZEN NIEDRIGER apoE
  • KONZENTRATIONEN BEI LEBENSLANGEN apoE4/AD-TRÄGERN
  • Um die Konsequenzen der Tatsache zu beurteilen, ein apoE4-Träger zu sein, haben wir die apoE/apoB (LDL) Rezeptorexpression (Cholesterin-Internalisierung) und die Expression von HMG-CoA-Reduktase (Cholesterinsynthese) im Hippocampus von AD- und Kontrollpatienten mit unterschiedlichen apoE-Genotypen untersucht, um die Konsequenzen des schwachen Transports von Lipiden in apoE-Trägern zu bewerten. Tabelle 1 fasst die mRNA-Prävalenzen zusammen, die für den LDL-Rezeptor, die HMG-CoA-Reduktase und das gliale, fibrilläre, saure Protein (GFAP) in post-mortem Gehirnen von Kontroll- und AD-Patienten mit bekannten apoE-Genotypen gemessen wurden. Beta-Tubulin wurde als ein nichtveränderndes Transkript verwendet, um die RNA-Beladung in den Gelen anzupassen. Die Prävalenz von GFAP mRNA, ein gut bekannter Marker lokaler Gewebeschädigung, war in apoE4-Trägern verglichen mit apoE3/3-AD-Patienten deutlich erhöht. Dies legt die Erkenntnis nahe, dass im Gehirngewebe von apo-E4-Trägern mehr zellulärer Schaden vorhanden war. Es wurde weiterhin nachgewiesen, dass die Prävalenz des LDL-Rezeptors unter HMG-CoA-Reduktase mRNA in AD-Patienten, die das apoE4-Allel tragen, im Vergleich zu nicht-E4-Trägern erhöht war. Diese doppelte Induktion der Cholesterin-Internalisierung und der Synthese stimmte mit Ergebnissen überein, die man in Fibroblasten und Makrophagen erhalten hat, die in Abwesenheit von Cholesterol kultiviert wurden, und in denen sowohl die Aufnahme von Cholesterin (über den LDL-Rezeptor) und die Synthese (über die HMG-CoA-Reduktase) deutlich hochreguliert waren, um einen Anstieg des intrazellulären Cholesterins zu erleichtern.
  • Tabelle 1. Prävalenz von mRNA im Hippocampus aus Gehirn, das von AD-Testpersonen erhalten wurde
    Figure 00160001
  • Mit anderen Worten, die Reduktion des im Gehirn vorliegenden apoE in apoE-Trägern (der einzige Lipoprotein-Träger des ZNS), obwohl nur gering, war ausreichend, um den Cholesterinmetabolismus von seinem normalen ausgeglichenen Zustand zu einem Mangelzustand überzuführen. Dies zwingt die Zellen dazu, eine Kompensation durch Heraufregulierung der Synthese und der Internalisierung zu erzeugen. Es ist somit erkennbar, dass die im Gehirn von apoE4-Trägern beobachtete apoE-Mangelerscheinung den Lipidtransport im ZNS deutlich beeinträchtigen kann.
  • Diese Ergebnisse stellen eine attraktive neue Erklärung für die berichtete Abnahme des Cholesterins im Gehirn von AD-Patienten mit unbekanntem Genotyp dar.
  • BEISPIEL II
  • Korrelationen zwischen der Kopienzahl des apoE4-Allels und senilen Plaques und Neurofibrillen in drei verschiedenen Bereichen des Hippocampus, nämlich im CA-1-Subfeld im Subikulum und im Parasubikulum in Individuen mit unterschiedlicher apoE4-Allel-Kopienzahl
  • Die Ergebnisse werden nachstehend in 3 zusammengefasst.
  • Verfahren
  • Der Genotyp wurde wie für 1 beschrieben bestimmt. Die Messungen der senilen Plaques und der Dichte der Neurofibrillen wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt (Aubert I. et al., 1992, J. Neurochem., 58: 529–541). In Paraffin eingebettetes Hippocampusgewebe aus 59 autopsierten AD-Patienten wurde von der Douglas Hospital Brain Bank erhalten und mit Hematoxylin und Eosin, modifiziertem Bielchowsky und Alkalin CongoTM Rot gefärbt. Quantitative morphometrische Bewertungen der Neurofibrillen und der senilen Plaques wurde wie folgt durchgeführt. Eine mikrometrische Skala wurde für die Kalibrierung verwendet. Ableseschritte wurden mit einem 10fach Objektiv für Plaques und einem 25fach Objektiv für Neurofibrillen durchgeführt. Diffuse Plaques wurden von diesen Messungen ausgeschlossen. Das Screening von alkalischen CongoTM Rot Färbungen unter polarisiertem Licht wurde dazu verwendet, die Zuverlässigkeit der Neurofibrillen-Färbung und, zu einem geringeren Ausmaß, die Affinität der senilen Plaques für den modifizierten Bielchowsky-Farbstoff zu kontrollieren. Idiopathische Parkinsonsche Krankheit (IPD) wurde gemäß der Anwesenheit eines signifikanten Verlust pigmentierter Neuronen, der Anwesenheit von Lewy's-Körperchen in verbleibenden Neuronen, der Anhäufungen von Makrophagen und Gliosis in der Pars Compacta der Substantia Nigra diagnostiziert. Diese histologischen Eigenschaften korrelieren gewöhnlich mit für den prämortalen Zustand klassischen Eigenschaften von IPD, wie Ruhetremor, Steifheit und Akinesie. Die statistische Analyse wurde mit den Multivariate General LinearTM Models als Teil des Systat Statistical SoftwareTM Anordnung durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die Korrelation zwischen Kopienzahl des apoE4-Allels und der Dichte der senilen Plaques ist in allen drei Bereichen des Hippocampus sehr stark. Die Korrelation zwischen der Kopienzahl des apoE4-Allels und dem Neurofibrillen-Index war ebenfalls für die Bereiche CA 1 und das Subikulum signifikant. Diese Ergebnisse unterstützen das Konzept, das apoE4 eine Rolle in der Pathophysiologie von AD spielt.
  • BEISPIEL III
  • Assoziation zwischen neurologischer Pathologie und Azetylcholin-Aktivität
  • Es wurde gezeigt, dass Gehirn-Phospholipide wie Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) eine wichtige Rolle bei der Verfügbarkeit von Cholin, dem konzentrationsbestimmenden Vorläufer von Azetylcholin (Ach) spielen. Im frontalen und parietalen Kortex von AD-Patienten sind die Gehirnkonzentrationen von Cholin um 40 bis 50% vermindert (Nitch RM et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 1671–1675). In ähnlicher Weise wird Cholesterin offensichtlich für die richtige Funktion einiger cholinerger Rezeptorunterarten benötigt (Jones O. T. & McNamee M. G., 1988, Biochemistry, 27: 2364–2374). Auf der Basis möglicher Wechselwirkungen zwischen apoE4, senilen Plaques und Neurofibrillenanzahl und Ach, werteten wir die Assoziation zwischen der Anwesenheit von apoE4 und der cholinergen Dysfunktion, einem klassischen Kennzeichen von AD (Bowen DM et al., 1981, N. Engl. J. Med., 305: 1016; Whitehouse PJ et al., 1982, Science, 215: 1237) aus. Wir konzentrierten unsere Aufmerksamkeit auf die Bestimmung der ChAT-Aktivität, dem Schlüsselenzym, das an der Synthese von Ach beteiligt ist, im post-mortem Hippocampus und im temporalen Kortex von Einzelpersonen, die an AD leiden und in Kontrollpatienten.
  • Verfahren
  • 4 und 6 veranschaulichen den Effekt der Anwesenheit der apoE4-Isoform auf die ChAT-Aktivität im Hippocampus und im temporalen Kortex.
  • Gehirngewebe aus der linken Hemisphäre wurde für biochemische Tests in dicke (10 mm) koronale Scheiben geschnitten und schnell in 2-Methylbutan bei –40°C tiefgefroren, vor der Lagerung bei –80°C. Gewebe aus Hippocampusbereichen und Bereichen des temporalen Kortex wurden homogenisiert und für 15 Minuten in Puffer inkubiert, der [14C]Azetyl-CoA wie bereits früher ausführlich beschrieben (Hubert I. et al., 1992, J. Neurochem., 58: 529–541) enthielt. Die post-mortem Diagnose wurde wie für 3 beschrieben durchgeführt. Der ApolipoproteinE-Genotyp wurde wie für 1 beschrieben bestimmt.
  • Ergebnisse
  • In apoE4-Trägern wurden hochsignifikante Verringerungen der ChAT-Aktivität nachgewiesen. Im Hippocampus (22 ADs und 7 Kontrollen) betragen die ChAT-Aktivitätswerte 9,44 ± 0,93 (Kontrolle apoE3/3, kein ApoE4-Allel), 6.09 ± 0,36 (AD apoE3/3, kein apoE4-Allel), 3,21 ± 0,31 (AD apoE4/3) und 2,94 ± 1,52 (AD apoE4/4) nmol Ach/mg Protein/h. Statistische Analysen zeigen, dass die Kontroll-apoE3/3-ChAT-Werte sich signifikant unterschieden von der AD-apoE3/3-Gruppe (p < 0,05) und der apoE4/3-Gruppe (p < 0,0001) wobei AD-apoE3/3-ChAT-Konzentrationen sich signifikant unterschieden von der AD-apoE4/3-Gruppe (p < 0,0001) und wahrscheinlich von der apoE4/4-Gruppe, obwohl eine statistische Auswertung nicht durchgeführt werden konnte, aufgrund der begrenzten Anzahl von apoE4-Homozygoten. Ähnliche Ergebnisse wurden im temporalen Kortex (26 AD-Patienten und 7 Kontrollen) erhalten mit ChAT-Aktivitätswerten von 7,84 ± 0,74 (Kontroll-apoE3/3), 5,65 ± 0,33 (AD apoE3/3), 2,91 ± 0,66 (AD apoE4/3) und 1,56 ± 0,47 (AD apoE4/4) nmol Ach/mg Protein/h. Statistische Analysen zeigen, dass sich die Kontroll-apoE3/3-ChAT-Werte signifikant von allen AD-Gruppen unterschieden (p < 0,05 für apoE3/3 und p < 0,001 für apoE4/3), wobei AD-apoE3/3-ChAT-Konzentrationen signifikant von der AD-apoE4/3-Gruppe (p < 0,002) und der apoE4/4-Gruppe (p < 0,02) unterschieden.
  • Wir schlagen vor, dass die durch die Kopienzahl des apoE4-Allels beeinflusste Abnahme der ChAT-Aktivität und der nikotinischen Rezeptoren durch wenigstens eines von zwei unterschiedlichen Phänomenen ausgelöst werden kann. Zunächst könnten Phospholipide wie PC und PE, die als Cholinvorläufer bei der Synthese von Ach dienen, in Neuronen über den klassischen apoE-LDL-Rezeptor-Signalweg transportiert werden. Eine Isoform-abhängige gestörte Regulation des Transportes von Phospholipiden im Gehirn von apoE4-Trägern könnte die verringerten Konzentrationen von PC, PE und Cholin erklären, die bei AD berichtet werden; dies führt dann zu verminderten Ach-Synthese-Kapazitäten. Alternativ dazu konnte die Abnahme der neuronalen ChAT-Aktivität und der Cholinkonzentrationen zweitrangig hinter den Verlusten an cholinergen Neuronen sein. Die Analyse der Zahl der Azetylcholinesterase-positiven Neuronen im Nukleus basalis von Meynert (NBM) und dem diagonalen Band von Broca (DBB) einer kleinen Anzahl von AD-Patienten (n = 7) zeigte deutliche Verluste an cholinergen Neuronen in apoE4-gegenüber apoE3-Homozygoten-AD-Fällen auf (eine 70-prozentige Abnahme bei NBM und eine 45-prozentige Abnahme bei DBB, 5).
  • Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass es unterschiedliche genetische Bestandteile neurologischer Erkrankungen gibt und dass Krankheiten wie z. B. AD unterschiedliche Ausmaße veränderter cholinerger Aktivität zeigen, wie dargestellt durch die Aktivität von ChAT und der Anwesenheit von nikotinischen Rezeptoren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die cholinerge Funktion bei apoE3/3-Trägern überflüssig sein könnte und dass diese Patienten besser auf eine Cholinomimetika basierende Therapie ansprechen könnten.
  • BEISPIEL IV
  • Zusätzliche neurochemische Veränderungen und therapeutische Reaktion bei Testpersonen, die mit Cholinomimetika behandelt wurden
  • Verfahren
  • i) Post-mortem Untersuchung cholinerger Marker
  • Fallauswahl und apoE-Genotypisierung: Eingefrorene Gewebe von 84 durch Autopsie bestätigten Fällen sporadischer AD (35 Frauen, 77,3 + 8,7 Jahre; 49 Männer 76,1 + 9,5 Jahre) und 14 Kontrollindividuen (8 Frauen, 71,6 + 3,6 Jahre; 6 Männer, 66,4 + 3,1 Jahre) wurden von der Douglas Hospital Brain Bank in Montreal, Kanada erhalten. Die durchschnittliche post-mortem-Verzögerung betrug 17,2 + 1,3 bzw. 20,0 + 4,6 Stunden für AD- bzw. Kontrollpatienten. Es solle beachtet werden, dass die Zugänglichkeit zu apoE4-homozygoten Patienten sehr beschränkt ist, wahrscheinlich zurückzuführen darauf, dass apoE4/4-homozygote Individuen weniger als ein Prozent der gesamten Population darstellen.
  • DNA mit hohem Molekulargewicht für die Genotyp-Analyse wurde aus gefrorenem Zerebellum oder temporalem Kortexgewebe isoliert (Nalbantoglu J. et al., 1994, Ann. Neurol., 36: 889–895). Der apoE-Genotyp wurde durch Allel-spezifische Primerverlängerung aus aufgereinigter Gehirn-DNA mit Primern und Verfahren wie in Beispiel I beschrieben, bestimmt.
  • Neuropathologische Analysen: Neurofibrillen und senile Plaques wurden wie früher beschrieben bestimmt (Aubert I. et al., 1992, J. Neuro chem., 58: 529–541; Etienne P. et al., 1986, Neuroscience, 19: 1279–1291). Schnitte des Hippocampusgewebe (15 μm; in Paraffin eingebettet) wurden entweder mit Hematoxylin und Eosin, einer modifizierten Bielchowsky-Färbung oder alkalischem CongoTM Rot gefärbt, um Neurofibrillen und senile Plaques sichtbar zu machen. Quantitative morphometrische Bewertung der Neurofibrillen und seniler Plaques wurde mit einer mikrometrischen Skala für kalibrierte Leseschritte unter Verwendung eines 10fach Objektivs für senile Plaques und eines 25fach Objektivs für Neurofibrillen durchgeführt. Diffuse Plaques wurden aus allen Messungen ausgeschlossen. Ein Screening der Färbungen mit alkalischem CongoTM Rot unter polarisiertem Licht wurde dazu verwendet, die Zuverlässigkeit der Färbung der Neurofibrillen und zu einem geringeren Ausmaß die Affinität der senilen Plaques für die modifizierte Bielchowsky-Färbung, zu gewährleisten. Diese Kriterien stimmen mit jenen überein, die in der Klassifizierung von Khachaturian verwendet werden (Aubert I. et al., 1992, J. Neurochem., 58: 529–541).
  • ii) Cholinerge Funktion im post-mortem-Gehirn von Kontroll- und AD-Testpersonen
  • Materialien: [3H]QNB (45,7 Ci/mmol, [3H]PZ (87,0 Ci/mmol), [3H]AF-DX 116 (49,3, 57,0 oder 70,0 Ci/mmol), [3H]MCC (84,5 Ci/mmol) und [4C]Azetyl-CoA (48,8 mCi/mmol) wurden bei New England Nuclear (Boston, MA, USA) erworben. Nikotin (freie Base) Atropinsulfat, Cholinchlorid und Eserinhemisulfatsalze wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft. Ach-Chlorid stammte von Hoffmann-LaRoche (Basel, Schweiz). Unmarkiertes Azetyl-CoA stammte von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland). TetraphenylboronTM (Natriumsalz) und 3-Heptanon wurden bei Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) erworben. Ethylazetat wurde von American Chemicals Co. (Montreal, Quebec, Kanada) erworben. Rinderserum Albumin (98% fettsäurefrei) und Ecolite Szintillationscocktail wurden von ICN Biochemicals (Irvine, CA, USA) erworben. TritonTM X-100 (100%), szintillations-geeignet wurde von Amersham (Arlington, IL, USA) erhalten. Alle anderen Chemikalien wurden von Fisher Scientific (Montreal, Quebec, Kanada) erhalten.
  • Menschliche Hirngewebe wurden bei der Autopsie aus Einzelpersonen erhalten, die klinisch als AD, PD oder PD/AD diagnostiziert wurden, und aus neurologisch normalen Kontrollen, die das gleiche Alter hatten. Gewebe wurden von der Brain Bank des Douglas Hospital Research Centers (Y. Robitaille, Neuropathologe) zur Verfügung gestellt. Die Kriterien für die Histopathologie wurden früher beschrieben. Hemisphären des Gehirngewebes zur Verwendung in biochemischen Tests wurden in dicke (10 mm) koronale Scheiben geschnitten und in 2-Methylbutan bei –40°C schnell tiefgefroren vor der Lagerung bei –80°C. Für die biochemischen Tests wurden die Gehirngewebescheiben langsam auf einem kalten Teller aufgetaut und die folgenden Strukturen wurden wie folgt aufgetrennt: frontale (Brodmannbereiche 9 und 10) und temporale (Brodmannbereiche 20, 21, 22 und 38) Kortizes, Hippocampus und Zerebellum (verwendet als Probe für ein Gehirngewebe mit geringer Pathologie).
  • iii) Analyse der Ergebnisse
  • Bindeparameter (Kd- und Bmax-Werte) wurden aus Sättigungsexperimenten abgeleitet, die durch das automatisierte Verfahren LIGANDTM analysiert wurden (Aubert I. et al., 1992, J. Neurochem., 58: 529–541). Statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen Kontroll- und AD-Gehirngewebe (0, 1, 2 Kopien von E4-Allelen) wurde mit dem unpaired Student-T-Test ausgewertet, wobei Werte von p < 0,05 als signifikant betrachtet wurden.
  • iv) Assay für Cholinazetyltransferase (ChAT) Aktivität
  • Gewebe aus verschiedenen Gehirnbereichen wurden homogenisiert und für 15 Minuten in Puffer inkubiert, der [14C]Azetyl-CoA enthielt, zur Bestimmung der ChAT-Aktivität, wie bereits früher ausführlich beschrieben (Aubert I. et al., 1992, J. Neurochem., 58: 529–541).
  • Zahlreiche biochemische und anatomisch-pathologische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Immunreaktivitäten und Aktivitäten cholinerger Markerenzyme wie ChAT sowohl im Neokortex als auch im Hippocampus im Patienten mit AD abnehmen. Wie in 6 gezeigt, ist die Kopienzahl des apoE4-Allels invers korreliert mit der ChAT-Aktivität im Hippocampus und im temporalen Kortex von gleichaltrigen Kontroll- und AD-Testpersonen. In den 6A–6J bezieht sich jeder Balken auf den Mittelwert plus Standardabweichung. Signifikante Differenzen zwischen den Gruppen werden durch die Zahl von Sternen gezeigt: * = p < 0,05; ** = p < 0,01; und *** = p < 0,001. Auffallende Abnahmen der Aktivität von ChAT fand man im Gehirngewebe von apoE4-Trägern. ChAT-Werte, die im Hippocampus (23 ADs und 30 Kontrollen) und im temporalen Kortexgewebe (30 ADs und 12 Kontrollen) von AD-Testpersonen mit unterschiedlichem apoE4-Gehalt gemessen wurden, sind in 4 dargestellt. Statistische Analysen zeigten, dass die ChAT-Konzentrationen in AD-Testpersonen mit 1 bis 2 Kopien des apoE4-Allels signifikant niedriger waren, verglichen mit AD- und Kontrolltestpersonen mit 0 bis 1 Kopie des apoE4-Allels.
  • Die Dichte von Azetylcholinesterase-positiven Neuronen in den Subkortexbereichen, die in den temporalen Kortex hineinreichen, und in Hippocampusstrukturen sind in 7 dargestellt. Die neuronale Zelldichte in den Ch2, Ch4a und Ch4i-Bereichen sind als Prozent der Kontrollwerte dargestellt. Das Kernvolumen ist in μm3 und die Plaquedichte als Anzahl von Plaques pro mm2 im Hippocampus der gleichen Patienten angegeben. Der Genotyp dieser Patienten war zuerst unbekannt. Wir haben die Daten für jene Patienten, für die ein Genotyp bestimmt werden konnte, nochmals analysiert. Drei AD-Patienten waren apoE4-negativ, während vier Patienten apoE4-positiv waren. Diese Ergebnisse bestätigen deutlich frühere Erkenntnisse, dass AD-Patienten einen deutlichen Verlust an cholinergen Neuronen in Ch2, Ch4a und Ch4i-Bereichen haben, und unterstreichen auch die Tatsache, dass die Anwesenheit des apoE4-Allels einen signifikanten Verlust an Neuronen in den Ch2, Ch2a (p < 0,01) und in den Ch4i (p < 0,05)-Bereichen verstärkt.
  • v) Bindung von [3H]QNB an Gesamtpopulationen von muskarinischen Stellen
  • Ausstanzungen kortikaler und subkortikaler Gewebe aus Kontrollpatienten und AD-Gehirnen wurden homogenisiert, zentrifugiert und wie vorstehend beschrieben in Krebspuffer resuspendiert. Endgültige Membranpellets wurden in Puffer in einer Konzentration von etwa 3–5 mg Protein/ml suspendiert. Aliquots des Membranangereicherten Homogenats (0,6–1,0 mg Protein) wurden in Krebspuffer in Anwesenheit einer sättigenden Konzentration von [3H]QNB (10 nM) für 60 Minuten bei Raumtemperatur (23°C) in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml inkubiert. Alle Assays wurden im Doppelansatz durchgeführt. Gebundenes [3H]QNB wurde von freiem Liganden durch schnelle Filtration unter vermindertem Druck durch Schleicher & Schuell Nr. 32 Glasfilter abgetrennt, die in 0,1% Polyethyleniminlösung vorgebadet wurden, unter Verwendung eines Brandel-Cell-Harvester-Gerätes (Brandel, Gaithersburg, MD, USA). Die Filter wurden dann mit eiskaltem Puffer dreimal mit jeweils 4,5 ml vor der Trocknung schnell gewaschen. Die Radioaktivität der Filter wurde durch Flüssig-Szintillationszählung in einem Beckmann Modell LS7000 Szintillationszähler bei 48% Effizienz bestimmt. Unspezifische Bindung, die in Anwesenheit von 1 μM Atropinsulfat definiert wurde, stellt gewöhnlicherweise weniger als 15% der Gesamtbindung dar.
  • vi) Bindung von [3H]PZ an menschliche muskarinische M1-Stellen im Gehirn
  • Das Gehirngewebe wurde wie vorstehend beschrieben bearbeitet. Aliquots letztendlicher Homogenate wurden in Krebspuffer mit verschiedenen Konzentrationen von [3H]PZ (0,1–20 nM) für 60 Minuten bei Raumtemperatur (23°C) inkubiert. Die Assays wurden beendet und die Radioaktivität wurde wie vorstehend für [3H]QNB-Bindung beschrieben bestimmt. Die unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit der Gesamtbindung bei Ligandenkonzentrationen, die sich Kd-Werten annäherten, definiert.
  • vii) Bindung von [3H]AF-DX 116 an menschliche, muskarinische mögliche M2-Stellen im Gehirn
  • Das Gehirngewebe wurde wie vorstehend beschrieben für den [3H]QNB-Test verarbeitet. Die Aliquots der endgültigen Homogenate wurden in Krebspuffer mit verschiedenen Konzentrationen von [3H]AF-DX 116 (0,1–20 nM) für 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Assays wurden beendet und die Radioaktivität wie vorstehend beschrieben bei der [3H]QNB-Bindung bestimmt. Unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von 1 μM Atropinsulfat definiert, welches gewöhnlich weniger als 40% der gesamten Bindung bei Ligandenkonzentrationen darstellt, die sich Kd-Werten annähern.
  • Muskarinische Bindestellen (entweder gesamt, M1 oder M2) waren im Hippocampusgewebe von AD- gegenüber Kontrollpatienten nicht verändert. Der apoE-Genotyp hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität dieser Rezeptoren. Die Muskarin-M1 und M2-Rezeptorstellen waren in AD- gegenüber Kontrollpatienten im temporalen Kortexgewebe nicht verändert, wobei die sogenannten gesamten (QNB) Muskarin-Bindestellen in AD- gegenüber Kontrollpatienten leicht vermindert waren (d. h. für diese Rezeptorgruppe wurde keine Genotypeffekt beobachtet).
  • viii) Bindung von [3H]MCC an menschliche nikotinische Stellen im Gehirn
  • Gehirngewebe wurde wie vorstehend beschrieben für den [3H]QNB-Test verarbeitet, mit der Ausnahme, dass die Proben in 50 mM Tris-HCl Puffer homogenisiert wurden. Aliquots der Homogenate wurde in 50 mM Tris-HCl Puffer mit verschiedenen Konzentrationen von [3H]MCC (0,1–20 nM) für 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Assays wurden beendet und die Radioaktivität wurde wie vorstehend beschrieben für den [3H]QNB-Bindetest bestimmt. Unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von 10 μM Nikotin definiert und stellt gewöhnlich weniger als 50% der totalen Bindung bei Ligandenkonzentrationen dar, die sich Kd-Werten annähern.
  • Ergebnisse
  • Bindestellen für den nikotinischen Rezeptor waren in AD-Testpersonen, die ein apoE4-Allel tragen, signifikant verringert im Vergleich mit AD-Testpersonen, die kein apoE4-Allel tragen, die sich von Kontrolltestpersonen nicht unterschieden. Die gleiche Korrelation wurde sowohl für Hippocampusbereiche als auch für temporale Bereiche im Gehirngewebe beobachtet, das von AD-Testpersonen entnommen wurde.
  • Diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass der apoE-Genotyp die synaptische Plastizität des cholinergen Systems als Reaktion auf den Verlust von neuronalen Zellen direkt beeinflussen kann. In diesem Modell stört apoE4 die Lipidhomeostase und folglich den Umbau der Membran. Die Tatsache, dass das cholinerge System das einzige Neurotransmittersystem des Gehirns ist, welches Lipid erfordert (anstelle von Aminosäuren) zur Synthese seines Neurotransmitters, (das Azetylcholin) unterstreicht weiter die selektive Verletzbarkeit dieses Systems in einer Situation des schwachen Lipidtransports und/oder -erhältlichkeit.
  • BEISPIEL V
  • Azetylcholinesterase-Inhibitorbehandlung in Menschen mit AD: Klinische Auswirkungen des apoE-Genotyps
  • Aufbau der Studie
  • Eine 30 Wochen andauernde Studie wurde durchgeführt, in der Patienten zufällig auf eine von vier Behandlungsgruppen verteilt wurden: Placebo oder ansteigende Dosierungen des Azetylcholinesterase-Inhibitors Takrin.
  • Verfahren
  • In der mit Takrin behandelten Gruppe begannen die Patienten mit 40 mg/Tag. In einer Gruppe wurde das Takrin auf 80 mg/Tag erhöht, eine Dosierung, die bis zum Ende der Studie beibehalten wurde. Die anderen beiden Gruppen erhielten Takrin in Dosierungen über 80 mg/Tag bis 120 und 160 mg/Tag. Nur die letztere Gruppe von Patienten wurde in der vorliegenden Genotyp-Analyse betrachtet.
  • 40 AD-Patienten, die die maximale Dosis von Takrin (40 mg/Tag für 6 Wochen, 80 mg/Tag für 6 Wochen, 120 mg/Tag für 6 Wochen und 160 mg/Tag für 12 Wochen für insgesamt 30 Wochen) erhielten und den Arzneistoffversuch abschlossen, wurden für eine Bestimmung ihres apoE-Phenotyps durch Bewertung von Serumpro teinen, wie früher beschrieben, ausgewählt (siehe oben und Poirier et al., 1993, Lancet 342: 697–699). Die Patienten wurden auf der Basis der An- oder Abwesenheit einer Reaktion auf die Arzneistoffbehandlung ausgewählt. Die Alzheimer-Krankheit-Bewertungsskala (ADAS) wurde dazu verwendet, Behandlungseffekte zu überwachen. Die Hälfte der ausgewählten Patienten zeigte ein Ansprechen auf den Arzneistoff (positive AD Unterschiede). Patienten wurden dann hinsichtlich der Auswirkungen untersucht, die unterschiedliche apoE-Genotypen (z. B. 2/2, 3/2, 3/3, 3/4, 2/4 und 4/4) auf die therapeutische Reaktion unter Verwendung des ADAS-cog und auf die Gesamttestergebnisse, die vor und nach der Verabreichung von Takrin erhalten wurden. ADAS-cog ist ein objektiver Test, der das Gedächtnis, die Aufmerksamkeit, die Fähigkeit zur Überlegung, die Orientierung und die Praxis bewertet: ein über einen Zeitverlauf abnehmender Wert stellt einen positiven Unterschied dar und zeigt eine Verbesserung an (Rosen W. G. et al., 1984, Am. J. Psychiatr., 141: 1356–1364). Der Gesamtwert für AD beinhaltet den kognitiven und nicht-kognitiven Teil der ADAS-Auswertung.
  • Ergebnisse
  • Cholinerge Arzneistoffreaktion in genotypisierten AD-Testpersonen
  • 8 veranschaulicht die Empfindlichkeit auf den Arzneistoff (ADAD-cog und Gesamt-AD) von AD-Testpersonen als Funktion des apoE4-Allelgehalts. Ein jeder Balken stellt eine einzelne Testperson dar. Positive Deltawerte (Unterschiede im AD-Wert am Ende der Behandlung minus dem AD-Wert vor der Behandlung) zeigen eine Verbesserung der kognitiven Leistung (ADcog) und der Gesamtleistung (ADAS-total) an. Negative Werte stellen Patienten dar, die sich über den Zeitverlauf der Behandlung verschlechtert haben. In dieser Untersuchung waren alle Patienten AD-Patienten und wurden mit dem gleichen Arzneistoff in der gleichen Menge und für dieselbe Dauer behandelt. Der einzige kritische Faktor, der diese Patienten unterschied, war die An- oder Abwesenheit des apoE4-Allels.
  • Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass mehr als 85% der apoE4-negativen Testpersonen eine Verbesserung nach Takrinverabreichung (Gesamt-AD) zeigen, wobei 60% der apoE4-positiven Patienten nach der Behandlung eine Verschlechterung erleiden. In anderen Worten sind vier von fünf Patienten, die auf Takrin nicht ansprechen, apoE4-positiv. Die ADAS-cog Skala zeigt ein ähnliches Antwortprofil in apoE4-Trägern und Nicht-Trägern.
  • Zusammengefasst legen diese Daten deutlich nahe, dass die cholinerge Funktion in AD-E3/3, 3/2 und 2/2-Patienten wenigstens teilweise überflüssig war, im Vergleich mit AD-E4/3, AD-E4/2 und AD-E4/4-Trägern. Wichtigerweise resultierte diese genetische Empfänglichkeit offenbar in Untergruppen von AD-Patienten, die unterschiedlich auf Therapien reagieren, die auf Cholinomimetika basieren; wobei E4-Träger ein größeres Risiko haben, ihre Fähigkeit zur Synthese von Ach zu verlieren. Diese Hypothese wurde in mit Takrin behandelten AD-Patienten formal untersucht, die verschiedene apoE-Genotypen zeigten. Wie erwartet fand man, dass apoE4-negative Testpersonen sehr gut auf den Azetylcholinesterase-Inhibitor Takrin (ein Azetylcholinmetabolismusverstärker) reagierten, im Vergleich zu apoE4-Trägern.
  • Die cholinerge Hypothese der geriatrischen Erinnerungsdysfunktion (Bartus R. T. et al., 1982, Science, 217: 408–417) stellt einige grundlegende Fragen hinsichtlich der beobachteten Heterogenität der klinischen Reaktionen gegenüber verschiedenen Cholinomimetika in verschiedenen AD-Patienten. Das Fehlen von deutlich heilsamen Effekten von Cholin und Lezithin in geriatrischen Patienten mit und ohne AD, waren oft sehr verwunderlich. Weiterhin haben klinische Untersuchungen basierend auf der Verwendung von Esterase-Inhibitoren wie Physostigmin und Takrin (Davis K. L. et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1253–1259) gezeigt, dass im Gegensatz zu jungen Patienten, die optimale akute Dosis, die notwendig ist, um die Leistung bei Erinnerungsaufgaben zu erleichtern, sich unter Kontrollpatienten und AD-Patienten unterschiedlichen Alters deutlich unterschieden.
  • Die Anwesenheit des apoE4-Allels scheint nun der wichtigste Faktor zu sein, der für individuelle Variationen in der verbleibenden cholinergen Innervierung im Gehirn von AD-Patienten verantwortlich ist und scheint eine deutliche Vorhersage hinsichtlich des klinischen Ausgangs von Therapien zu geben, die auf Cholinomimetika basieren. Klinische Reaktion auf cholinerge Agenzien, die in genotypisierten AD-Patienten überwacht wurde, zeigte, dass apoE4-Träger wahrscheinlich nicht gut ansprechen, zumindest mit der Verwendung von Ach-Vorläufern und Esterasebasierten Therapien.
  • BEISPIEL VI
  • Auswirkungen des Geschlechts und des apoE-Genotyps auf den Arzneistoff und die Wirksamkeit der Arzneistoffdosierung
  • In dieser Untersuchung charakterisierten wir die AD-Patienten, die für eine große Studie von Takrin in vielen Prüfungszentren ausgewählt wurden, um den Einfluss des apoE-Allelgehalts auf den Ausgang der Behandlung zu untersuchen, wenn die Behandlung mit einem Placebo oder unterschiedlichen Dosierungen von Takrin erfolgte. Die Patienten wurden nach Geschlecht und Dosierung klassifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
  • Verfahren
  • i) Aufbau der Studie
  • Die 30-Wochen-dauernde Studie war eine randomisierte, doppelblinde, Placebokontrollierte und in parallelen Gruppen durchgeführte klinische Untersuchung, die in 33 Zentren in den USA durchgeführt wurde (siehe Knapp, M. J. et al. JAMA 271: 985–991 (1995) für die komplette Vorgehensweise). Patienten wurden hinsichtlich Takrinbehandlung randomisiert und erhielten eine anfängliche Dosis von 40 mg/Tag (10 mg QID) und wurden in 6-Wochen-Intervallen in ansteigenden Schritten von 40 mg auf maximale Dosiskonzentration von 80, 120 und 160 mg/Tag für die Gruppen II, III bzw. IV titriert. Die Gruppe I erhielt für die gesamten 30 Wochen ein Placebo. Das Protokoll wurde von den Überprüfungsinstitutionen jedes Untersuchungszentrums genehmigt und folgten den Richtlinien der Declaration of Helsinki und der Good Clinical Practice.
  • Patienten, die die 30 Wochen andauernde Studie abschlossen oder die ihre Teilnahme in der Untersuchung beendeten, konnten für eine offene Langzeit-Takrinbehandlung ausgewählt werden. In der offenen Phase betrug die anfängliche Dosis für alle Patienten 40 mg/Tag (10 mg QID) und konnte alle 4 Wochen in 40-mg-Schritten auf eine maximale Dosierung von 160 mg/Tag erhöht werden. Das Protokoll spezifizierte Besuche in der offenen Phase und alle 3 Monate, sobald der Patient eine stabile Dosierung erreicht hatte. Für alle Patienten waren Dosisaufzeichnungen erhältlich. Etwa zwei Jahre nachdem der letzte Patient die doppelblinde Phase abgeschlossen hat, wurde das Protokoll verbessert um die Genotypisierung von Ausgangs-Plasmaproben zu ermöglichen und um Information über Einlieferung in Pflegeheime (NHP) und Sterblichkeit zu ermöglichen. Es wurden durch die Studienzentren Anstrengungen unternommen, um die Familien aller 663 Patienten zu kontaktieren, die ursprünglich randomisiert wurden.
  • ii) Patientenpopulation
  • Patienten, die für die 30-wöchige Studie ausgewählt wurden, waren Männer und Frauen, wenigstens 50 Jahre alt, und trafen die Kriterien für eine Diagnose einer wahrscheinlichen AD des National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke (NINCDS). Die Patienten waren ansonsten gesund und hatten keine anderen signifikanten pyramidalen, zerebrovaskulären, kardialen oder hepatischen Erkrankungen; Insulin-abhängigen Diabetes mellitus; oder chronische Niereninsuffizienz. Der Schweregrad der Erkrankung zu Beginn der Untersuchung wurde als leicht bis mäßig definiert, basierend auf der Mini-Mental State Examination (MMSE). MMSE-Werte zwischen 10 und 26 wurden umfasst betrachtet. Schriftliche Zustimmung wurde von Pflegepersonal und Patienten oder ihren gesetzlichen Vertretern erhalten. Eine Medikation mit bekannten, zentralnervösen, systemischen Effekten war während der doppelblinden Behandlung verboten. Sobald die Patienten die doppelblinde Phase der Untersuchung abgeschlossen hatten oder ihre Teilnahme beendeten, wurde gleichzeitigen Medikationen keine Beschränkungen auferlegt. Patienten, die die Takrinbehandlung beendeten, konnten andere Arzneistoffe nehmen, die sich in der Untersuchung befanden.
  • iii) Messung des Ausgangs
  • Der ADAS-cog ist ein objektiver Test, der das Erinnerungsvermögen, die Sprache und die Praxis auswertet und ist ein empfindliches Maß der Leistung der Patienten (der maximale Wert des Schweregrads ist 7). Ein Rückgang des Wertes zeigt eine Verbesserung an.
  • Das CIBIC ist eine globale Auswertung der Veränderung und ist dazu gedacht, zu bestimmen, ob die Auswirkungen einer Anti-Demenz-Medikation groß genug sind um von einem erfahrenen, gut ausgebildeten, klinischen Beobachter während eines umfassenden klinischen Interviews mit dem Patienten nachgewiesen zu werden. Bei der Ausgangsposition wird Input vom Patienten und von Familienmitgliedern zusätzlich zu einer Durchsicht der Leistung des Patienten im Test ebenfalls akzeptiert. Während nachfolgenden Besuchen, ist die Bewertung des behandelnden Arztes nur auf ein Interview mit dem Patienten beschränkt, ohne Berücksichtigung der Testleistung oder der familiären Beobachtungen. Der Patient wird auf einer 7-Punkt-Skala bewertet: 1, sehr viel besser; 4, keine Veränderung; und 7, sehr viel schlechter.
  • Das FCCA ist ebenfalls eine 7-Punkt-Bewertung. Ähnlich zum CIBIC wird ein Überblick über die psychometrischen Testwerte ausgeschlossen, aber Input von Familienmitgliedern ist zugelassen. FCCA wurde nach CIBIC durchgeführt und nur dann, wenn der Patient die Untersuchung abgeschlossen oder abgebrochen hatte.
  • Jeder Untersuchungsort stellte Daten hinsichtlich der Todestage oder NHP bereit, wenn ein Ereignis davon während der 2-Jahre-andauernden nachfolgenden Periode auftrat.
  • iv) Statistische Verfahren
  • Es wurden vier Vergleiche einer Dosierung von Takrin 160 mg/Tag gegenüber Placebo durchgeführt: (1) ohne Anpassung für apoE4; (2) mit Anpassung hinsichtlich An- oder Abwesenheit von apoE4; (3) für Patienten, die ein apoE4-Allel tragen; und (4) für Patienten ohne ein apoE4-Allel. Die abgeschätzten Unterschiede in der Behandlung, 95% Konfidenzintervalle für die Behandlungsunterschiede und parametrische p-Werte wurden von einer Varianzanalyse berechnet (ANOVA), die Effekte für die randomisierte Behandlungsgruppe (Placebo, 80 mg/Tag, 120 mg/Tag und 160 mg/Tag) und den Untersuchungsort beinhaltete. Eine Analyse der Kovarianz (ANCOVA) für ADAS-cog beinhaltete auch den Grundwert als Kovariante. Annäherungsverfahren wurden dazu verwendet, die Auswirkungen des E4-Allels auf die Wirksamkeitswerte, die in der Woche 30 genommen wurden, abzuschätzen.
  • Ähnliche ANOVA- und ANCOVA-Modelle, die die Effekte der Behandlungsgruppe, des apoE4-Genotyps, des Ortes und des Grundwertes (für ADAS-cog) und die Behandlung und die apoE4-Wechselwirkungen beinhalteten, wurden dazu verwendet, die Verallgemeinerbarkeit der Haupteffekte der Behandlung in Populationen mit und ohne das apoE4-Allel zu testen.
  • CIBIC- und FCCA-Werte wurden mit Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)-Verfahren auf modifizierten Ridit-Werten analysiert, durch Aufschichtung nach Untersuchungsort in den nicht-angepassten Analysen und Aufschichtung nach Untersuchungsort und apoE4-Status in den angepassten Analysen. Nicht parametrische p-Werte für CIBIC und FCCA wurden dazu verwendet, um zu bestimmen, ob die Effekte der Takrinbehandlung statistisch signifikant waren.
  • Die Veränderung der ADAS-cog-Werte in der Woche 30 wurden abgeschätzt hinsichtlich: (1) Placebo-Patienten mit einem apoE4-Allel, (2) Placebo-Patienten ohne ein apoE4-Allel, (3) Takrin-160 mg/Tag-Patienten mit apoE4-Allel, und (4) Takrin-160 mg/Tag-Patienten ohne apoE4-Allel unter Verwendung von ANCOVA, die hinsichtlich Ort und Grundwert ausgleichte. Ähnlicherweise wurden in der Woche 30 CIBIC- und FCCA-Werte unter Verwendung von ANOVA abgeschätzt, die hinsichtlich Auswirkungen des Untersuchungsortes angepasst waren.
  • Eine PROC LOGISTIC-Analyse, die hinsichtlich „baseline Instrumental Activities of Daily Living (IADL)", anderer in Untersuchung befindlicher Anti-Demenz-Agenzien, Alter, Geschlecht und An- oder Abwesenheit des apoE4-Allels angepasst war, wurde dazu verwendet, logistische Regressionen zur Analyse von NHP und Sterblichkeitsdaten durchzuführen. Die Patienten wurden hinsichtlich der letzten täglichen Dosis von Takrin, die erhalten wurde, gruppiert (0–40 mg/Tag, > 40–80 mg/Tag, > 80–120 mg/Tag und > 120–160 mg/Tag). Die abgeschätzten Behandlungsunterschiede zwischen den 0 bis 40 mg/Tag-Gruppen und den drei anderen Gruppen wurden verhältnismäßig berechnet. Um die Verallgemeinerbarkeit der Auswirkung der letzten täglichen Dosis von Takrin zu überprüfen, beinhaltete ein ähnliches Modell zusätzliche Indikatorvariablen für die Behandlung und apoE4-Wechselwirkungen. NHP und Mortalitätsdaten wurden auch ohne Anpassung hinsichtlich An- oder Abwesenheit des apoE4-Allels für alle randomisierten Patienten und für Patienten mit und ohne apoE4-Allel analysiert.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 2 zeigt eine Korrelation der Arzneistoffdosierung des Geschlechts des Patienten und des apoE4-Allelgehalts und zeigt, dass der apoE4-Allelgehalt ein kritisches Element bei der Bestimmung eines geeigneten Behandlungsprotokolls ist. So geht es Männern ohne apoE4-Allelgehalt am besten mit niedrigen oder hohen Dosierungen, Männer mit einem einzigen apoE4-Allel benötigen für den maximalen Effekt eine höhere Dosis und Männer mit zwei apoE4-Allelen reagieren auf Takrin nicht. Im Gegensatz dazu benötigen Frauen ohne apoE4-Allel am besten eine mittlere Takrindosierung, während jene mit einem apoE4-Allel auf jede Dosis gut reagieren. Genauso wie bei den Männern reagieren Frauen ohne apoE4-Allel nicht auf Takrin. Wenn die vorstehenden Daten in den pharmakogenetischen Ansatz eingebaut wurden, dann ermöglichte es unser Verfahren, für den behandelnden Arzt und den Patienten einen Bericht bereitzustellen, der die niedrigste Dosierung anzeigt, die die höchste Wirksamkeit für einen gegebenen Patienten darstellt. Dieses Ergebnis ermöglicht eine Korrelation der maximalen Höhe der Reaktion auf einen therapeutischen Arzneistoff mit einem minimalen Level von Nebenwirkungen. Tabelle 2. Verbesserungen des ADAS-Cog-Wertes bei Männern und Frauen die mit Takrin behandelt wurden und die unterschiedlichen apoE-Allelgehalt aufweisen Männer
    Figure 00320001
    Frauen
    Figure 00320002
    % Patienten mit einer Verbesserung des ADAS-Cog-Wertes um wenigstens 5 Punkte auf der Skala
  • BEISPIEL VII
  • Zusammenhang zwischen apoE-Genotyp und Ausgang der Arzneistofftherapie bei Patienten, die an einem Schlaganfall leiden
  • Verfahren
  • Wir haben 51 Schlaganfall-Patienten analysiert, um zu bestimmen, ob es einen Zusammenhang zwischen dem apoE-Genotyp und dem Ausgang einer Arzneistofftherapie gibt. Unsere kleine Untersuchungsgruppe bestand aus weißen Frauen, die gegenwärtig einen Schlaganfall erlitten hatten und gegenwärtig eine Therapie entweder mit Aspirin oder mit Anti-Trombose-Arzneistoffen erhielten (z. B. Tiklopidin (TiclidTM)). Obwohl unsere Untersuchungsgruppe klein und hinsichtlich des Geschlechtes nicht randomisiert ist, haben die Patienten in dieser Untersuchung eine Verteilung des apoE-Allels, die ähnlich zu einer sehr viel größeren, randomisierten, nordamerikanischen Population (siehe Tabelle 3) ist. Zur Bestimmung der apoE-Genotypen der Patienten wurden 5 ml Vollblut aus jedem Patienten entnommen und als Quelle von genetischem Material für die hier beschriebene Bestimmung des apoE-Allels verwendet. Der apoE-Genotyp des Patienten wurde dann mit Information aus der Krankenakte des Patienten verglichen. Wir haben die Geschwindigkeit gemessen, bei der Patienten sich von einem Schlaganfall erholen und die Dauer ihrer Rehabilitation um den möglichen Zusammenhang zwischen dem apoE-Genotyp eines Patienten und einer Prognose für Schlaganfall zu bewerten.
  • Ergebnisse Tabelle 3. ApoE-Allelverteilung der Untersuchungsgruppe verglichen mit einer repräsentativen Population
    Figure 00330001
  • Zur Bestimmung des Zusammenhangs zwischen dem apoE-Genotyp und der Zeit, die ein Patient braucht, um sich von einem Schlaganfall vollständig zu erholen, haben wir die Daten wie folgt analysiert. Wir haben die Untersuchungsgruppe in zwei Populationen aufgeteilt, in Patienten, die sich nach Arzneistofftherapie schnell erholen (schnelle Reaktion) und jene Patienten die sich nach Arzneistofftherapie langsam erholen (langsame Reaktion) und fragten dann nach der apoE-Allelverteilung (Tabelle 4).
  • Tabelle 4. Verteilung des apoE-Genotyps bei Schlaganfall-Patienten die sich nach Arzneistofftherapie vollständig erholen, schnell gegenüber langsam
    Figure 00340001
  • Wenn die Genotypen dieser beiden Populationen verglichen wurden, beobachteten wir eine Verbindung zwischen der Schnelligkeit der Erholung vom Schlaganfall und der Tatsache, ein Träger des apoE4-Allels zu sein. Die Patienten mit der schnellsten Reaktion auf Arzneistofftherapie nach einem Schlaganfall waren die Patienten, die ein apoE4-Allel tragen (Tabelle 4). Wenn diese Daten als eine Funktion des apoE4-Allelgehalts analysiert wurden, dann waren die Patienten mit einem größeren apoE4-Allelgehalt überrepräsentiert unter den Patienten, die sich gut erholen (Tabelle 5).
  • Tabelle 5. Vergleich des apoE4-Genotypgehaltes und der Erholung nach einem Schlaganfall
    Figure 00340002
  • Analyse des Alters beim Auftreten der Erkrankung gegenüber der Reaktion auf Arzneistofftherapie
  • Um den Zusammenhang zwischen dem apoE-Genotyp und dem Alter zu bestimmen, bei dem die Krankheit auftritt, wurden die Daten hinsichtlich des apoE-Genotyps als eine Funktion des Alters des Patienten analysiert, bei dem der Schlaganfall zuerst auftrat (Tabelle 6). In dieser Untersuchung hatte die Mehrheit der Patienten, nämlich 74%, kein apoE4-Allel und die Genotypen waren in allen Altersgruppen gleichmäßig verteilt, wodurch irgendwelche günstigen Effekte, die möglicherweise auf längere Lebensdauer, die mit dem apoE-Genotyp verbunden ist, minimiert wurden.
  • Tabelle 6. Verteilung des apoE4-Allels als Funktion des Alters, bei dem ein Patient einen Schlaganfall erlitt
    Figure 00350001
  • Zusätzlich zeigt die Analyse dieser Daten nach Altersgruppen keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Wirksamkeit der Behandlung, obwohl die Gruppe der Patienten, die 70 Jahre alt sind, im Allgemeinen am besten auf die Behandlung auf die Behandlung anzusprechen scheinen (Tabelle 7).
  • Tabelle 7. Wirksamkeit der Arzneistoffbehandlung bei Schlaganfall-Patienten als Funktion des Alters
    Figure 00350002
  • Zur Bestimmung, ob der apoE-Genotyp die gesamte Zeit beeinflusst, die ein Schlaganfall-Patient für die Rehabilitation benötigt (nach einem Schlaganfall ist häufig eine sehr lange Rehabilitationszeit nötig) haben wir die Rehabilitationszeit des Patienten als Funktion des apoE-Genotyps des Patienten analysiert. Wir beobachteten eine direkte und positive Verbindung zwischen der Anwesenheit eines apoE4-Allels und einer kurzen Rehabilitationszeit (Tabelle 8).
  • Tabelle 8. Gesamtrehabilitationszeit, die nach einem Schlaganfall nötig ist als Funktion des apoE-Genotyps des Patienten
    Figure 00360001
  • Zur Bestimmung ob der apoE-Genotyp eines Patienten die Erholung direkt nach einem Schlaganfall beeinflusst, haben wir die Fähigkeit eines Patienten analysiert, sich nach einem Schlaganfall unmittelbar zu erholen als Funktion des apoE-Genotyps des Patienten. Wir beobachteten, dass die Geschwindigkeit der Erholung unmittelbar nach einem Schlaganfall nicht vom apoE-Genotyp abhängt (Tabelle 9).
  • Tabelle 9. Fähigkeit von Patienten zur Erholung unmittelbar nach einem Schlaganfall als Funktion des apoE-Genotyps des Patienten
    Figure 00360002
  • Zusammengefasst haben wir entdeckt, dass eine direkte Verbindung zwischen der Anwesenheit eines apoE4-Allels und der Entwicklung eines Schlaganfall-Patienten besteht. Wir glauben, dass das apoE4-Allel für den Schlaganfall-Patienten heilsam sein kann. Wir sagen weiter voraus, dass die Fähigkeit, die Expression oder Stabilität des apoE4-Genproduktes heraufzuregulieren, heilsame Konsequenzen für einen Patienten haben kann, der an einem Schlaganfall leidet. Diese Erfindung legt nahe, dass die Fäligkeit eines Arzneistoffs, das apoE4-Gen oder die Stabilität zu steigern, diesen Arzneistoff als therapeutisch wirksam bei der Erholung nach einem Schlaganfall, z. B. Verminderung der Rehabilitationszeit, implizieren würde.
  • BEISPIEL VIII
  • Zusammenhang zwischen apoE-Genotypen und dem Ausgang einer Arzneistofftherapie im Patienten, die an Parkinsonscher Krankheit leiden
  • Verfahren
  • Wir haben 59 Patienten analysiert, die an Parkinsonscher Erkrankung (PD) leiden, um zu bestimmen, ob ein Zusammenhang zwischen dem apoE-Genotyp des Patienten und dem Ausgang einer Arzneistofftherapie besteht. Unsere kleine Gruppe bestand aus weißen Männern, die an PD litten und sich gegenwärtig in Behandlung mit levodopa-carbidopa (SinemetTM) befanden. Diese Patienten litten an keiner anderen Erkrankung des Zentralnervensystems. Um den apoE-Genotyp der Patienten zu bestimmen, wurden 5 ml Vollblut aus jedem Patienten entnommen und als Quelle von genetischem Material für die wie hier beschriebene apoE-Allel-Bestimmung verwendet. Der apoE-Genotyp des Patienten wurde dann mit Informationen aus der Krankenakte des Patienten verglichen. Unsere Analyse basierte auf einem Vergleich der Reaktion des Patienten auf die Behandlung, und war dazu gedacht, die Symptome des Tremors und der Steifheit als Funktion des apoE-Genotyps des Patienten zu verbessern.
  • Ergebnisse Tabelle 10. Verteilung des apoE-Genotyps der Untersuchungsgruppe, einer größeren Population, und über verschiedene Altersgruppen
    Figure 00370001
  • Obwohl unsere Untersuchungsgruppe klein und nicht nach Geschlecht randomisiert ist, haben die Patienten in dieser Untersuchung eine apoE-Allelverteilung, die zu einer viel größeren randomisierten nordamerikanischen Population (Tabelle 10) ähnlich ist. Wir haben eine ähnliche Verteilung auch unter verschiedenen Altersgruppen beobachtet, was nahe legt, dass der apoE-Genotyp nicht mit einer langen Lebensdauer gekoppelt ist (Tabelle 10). Wir haben das Durchschnittsalter der Patienten, die gut auf eine Arzneistofftherapie ansprachen (gute Reaktion), mit jenen verglichen, die schlecht ansprachen (schlechte Reaktion) und beobachteten ein ähnliches Durchschnittsalter, nämlich 64–67, so dass in diesem Datensatz kein Zusammenhang mit dem Alter bestätigt werden konnte. Eine Analyse des apoE-Allelgehaltes zwischen Patienten, die gut und schlecht auf die Arzneistofftherapie ansprachen, legte ebenfalls offen, dass Altersunterschiede den Ausgang der Behandlung nicht beeinflussen.
  • Im Gegensatz dazu beobachteten wir eine starke negative Korrelation zwischen der Reaktion eines Patienten auf die Arzneistofftherapie und den apoE4-Allelgehalt. Patienten ohne apoE4-Allel zeigten eine bessere Reaktion, wie gemessen durch Verbesserungen der Symptome der Steifheit und des Tremors, als jene Patienten mit einem apoE4-Allel (Tabelle 11). Somit ziehen wir die Schlussfolgerung, dass zwischen Trägern eines apoE4-Allels und dem Ausgang der Behandlung eines Patienten mit Parkinsonscher Erkrankung eine direkte Verbindung besteht.
  • Tabelle 11. Reaktion auf einen Arzneistoff in Patienten mit Parkinsonscher Erkrankung mit unterschiedlichen apoE-Genotypen
    Figure 00380001
  • BEISPIEL IX
  • Zusammenhang zwischen dem apoE-Genotyp und dem Ausgang einer Arzneistofftherapie in Patienten mit Multipler Sklerose
  • Verfahren
  • Wir haben 65 Patienten, die an Multipler Sklerose (MS) leiden, analysiert, um zu bestimmen, ob es einen Zusammenhang zwischen dem apoE-Genotyp eines Patienten und dem Ausgang einer Arzneistofftherapie gibt. Unsere kleine Gruppe bestand aus weißen Frauen, die an MS leiden, und gegenwärtig unter Behandlung mit Interferon β-1B (BetaseronTM) stehen. Zur Bestimmung der apoE-Genotypen der Patienten wurden aus jedem Patienten 5 ml Vollblut entnommen und als Quelle für genetisches Material für die vorstehend beschriebene Bestimmung des apoE-Allels verwendet. Der apoE-Genotyp des Patienten wurde dann mit Informationen aus der Krankenakte des Patienten verglichen. Unsere Analyse basierte auf einem Vergleich der Reaktion des Patienten auf die Arzneistoffbehandlung symptomatischer Verschlechterungen als Funktion des apoE-Genotyps des Patienten.
  • Ergebnisse
  • Wir beobachteten, dass die Patienten in dieser Untersuchung eine Verteilung des apoE-Allels aufwiesen, die ähnlich zu einer viel größeren randomisierten nordamerikanischen Population (Tabelle 12) ist. Wir beobachteten auch eine ähnliche Verteilung unter verschiedenen Altersgruppen, was nahe legt, dass der apoE-Genotyp nichts mit einer langen Lebensdauer (Tabelle 12) zu tun hat.
  • Tabelle 12. Verteilung des apoE-Genotyps der Untersuchungsgruppe, einer größeren Population und unter verschiedenen Altersgruppen
    Figure 00390001
  • Zur Bestimmung der Verbindung zwischen dem apoE-Genotyp und der Reaktion des Patienten auf eine Arzneistofftherapie, die dazu gedacht ist, das symptomatische Aufflackern der MS zu vermindern, haben wir die Daten wie folgt analysiert. Wir haben die Untersuchungsgruppe in zwei Populationen aufgeteilt, in jene Patienten, die nach Arzneistofftherapie weniger Attacken haben (gute Reaktion) und jene Patienten, die während der Arzneistofftherapie sehr viele Attacken haben (schlechte Reaktion) und fragten nach der apoE-Allelverteilung (Tabelle 13). Wir berichten ebenfalls die Frequenzen dieser Genotypen in der Untersuchungsgruppe und in einer größeren Population. Wir haben beobachtet, dass Nicht-apoE4-Patienten auf eine Arzneistofftherapie besser ansprachen, als jene Patienten, die apoE4 (Tabelle 13) aufwiesen.
  • Tabelle 13. apoE-Genotyp-Verteilung in MS-Patienten, die auf eine Arzneistofftherapie gut ansprechen, im Vergleich mit Patienten, die schlecht ansprechen
    Figure 00400001
  • Bei Analyse dieser Patienten nach Anwesenheit des apoE4-Allels war die Korrelation zwischen jenen Patienten, die gut ansprechen und dem Fehlen eines apoE4-Allels noch deutlicher (Tabelle 14).
  • Tabelle 14. apoE4-Allelgehalt in MS-Patienten, die auf eine Arzneistofftherapie gut ansprechen gegenüber jenen Patienten, die schlecht ansprechen
    Figure 00400002
  • In einer anderen Analyse untersuchten wir den Zusammenhang zwischen dem apoE4-Allelgehalt und der qualitativen Art der MS-Attacken in jedem Jahr während einer Arzneistoff-Behandlung. Die folgenden Ergebnisse sind in acht Gruppen eingeteilt, schwächere Attacken, die auf Behandlung schlecht ansprechen, verglichen mit schwächeren Attacken, die auf Behandlung gut ansprechen, und ernstere Attacken, die auf die gleiche Weise verglichen wurden (Tabelle 15). Wir beobachteten einen gewissen Einfluss des apoE-Allelgehaltes und der Wirksamkeit der Arzneistoffbehandlung von MS, wenn die Verminderung der Anzahl von verschlechternden Attacken gemessen wurde (Tabelle 15).
  • Tabelle 15. apoE4-Allelgehalt in MS-Patienten mit einer qualitativen Veränderung der Attacken
    Figure 00410001
  • Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass das Apolipoprotein-E-Gen nicht nur mit der Wirksamkeit eines Arzneistoffes bei der Alzheimer-Erkrankung gekoppelt ist, aber ebenso direkt mit der Wirksamkeit eines Arzneistoffes in unterschiedlichen ZNS-Krankheiten wie Schlaganfall, Parkinsonscher Krankheit und Multipler Sklerose in Verbindung steht. Aufgrund der spezifischen Rolle des apoE-Gens und seiner Beteiligung bei der Zellregeneration und den Plastizitätserfordernissen, die für eine Krankheit spezifisch sind, wird erwartet, dass sich der für die Krankheit relevante Genotyp sich von Krankheit zu Krankheit unterscheiden wird.
  • BEISPIEL X
  • Bestimmung einer Risikoprognose und des Ausgangs einer therapeutischen Behandlung nach Schlaganfall mit genetischer Analyse von apoE4 und BchE-K
  • Ein Schlaganfall ist ein akutes neurologisches Ereignis, das zum Absterben von neuralem Gewebe des Gehirns und zu einem Verlust der motorischen, sensorischen und/oder kognitiven Funktion führt. Man sagt, dass es in den Vereinigten Staaten die dritt häufigste Todesursache ist. Eine genetische Veranlagung kann bei der Pathogenese von Schlaganfall wichtig sein. Eine solche Veranlagung kann nicht nur Gene beinhalten, die zu einem erhöhten Blutdruck beitragen, aber auch Gene, die unabhängig vom Blutdruck wirken. Zwillingsuntersuchungen und familiäre Häufung legen Hinweise für genetische Faktoren nahe, die zu einem Schlaganfall mit einer polygenischen Ätiologie beitragen.
  • Genetische Faktoren, die zur Pathogenese eines Schlaganfalls beitragen, sind nur wenig etabliert. Man nimmt an, dass die folgenden Gene und Polymorphismen bei einem Schlaganfall beteiligt sind: ACE Insertions-/Deletionspolymorphismus, Faktor-V-Gen, Faktor-VII-Gen, PIA2-Polymorphismus des Glykoprotein-IIIa-Gens, ApoE und die Interleukin-1β-konvertierendes Enzym(ICE)-Gen-Familie.
  • Die Butyrylcholinesterase (BChE) wird in den meisten menschlichen Geweben exprimiert, aber ihre genaue metabolische Funktion im Körper ist immer noch unbekannt. Die polymorphe Genvariante BChE-K, die aus einer Punktmutation am Nukleotid 1615 (GCA zu ACA) besteht, die das Alanin an Position 539 zu Threonin umwandelt, hat eine verminderte katalytische Aktivität (Bartels et al., Am. J. Hum. Genet. 50: 1086–1103, 1992). Neuere Forschungsarbeiten von Lehmann et al. (Hum. Mol. Genet. 11: 1933–1936 (1997)) legen nahe, dass BChE-K mit einem weiteren Anstieg des Risikos einer spät auftretenden AD in apoE4-Trägern assoziiert ist.
  • Wir haben entdeckt, dass die Kombination von apoE4 und BChE-K dazu beitragen, das Risiko einer Einzelperson hinsichtlich der Entwicklung eines Schlaganfalls zu definieren. Wir haben den apoE4- und den BChE-K-Genotyp für 50 weibliche Schlaganfallpatienten und 64 in Alter und Geschlecht übereinstimmende gesunde Kontrollen (Tabelle 16) bestimmt. In der Kontrollgruppe beobachteten wir 17 von 64 heterozygote und 4 von 64 homozygote Träger des BChE-K-Allels. Wir beobachteten, dass 15 von 64 Versuchspersonen eine Kopie des apoE-Allels aufwiesen. Diese beiden Allelverteilungen stimmen mit einem Hardy-Weinberg-Equilibrium für die identifizierte Allelfrequenz überein (Tabelle 16). In den Schlaganfallpatienten trugen 22 von 50 Personen eine Kopie von BChE-K und 3 von 50 wiesen zwei BChE-K-Allele auf. Von diesen 50 Testpersonen waren 15 Träger eines apoE4-Allels. Der identifizierte Trägerstatus stimme mit einer Hardy-Weinberg-Population für die beobachtete Allelfrequenz (Tabelle 16) überein.
  • Tabelle 16. Allelfrequenzen von apoE4 und BChE-K
    Figure 00430001
  • Für Patienten im Alter von 58 Jahren und älter, betrug die Allelfrequenz von BChE-K 0,195 bei den Kontrollen, und 0,28 in den 50 Fällen von Schlaganfall, wodurch ein Chancenverhältnis von Schlaganfall von 1,6 (basierend auf Allelhäufigkeiten) und 2,1 (basierend auf Trägerhäufigkeiten) (Tabelle 17) bereitgestellt wird. In apoE4-Trägern betrug das Chancenverhältnis eines Schlaganfalls etwa 1 (Tabelle 17).
  • Tabelle 17. Chancenverhältnisse für Schlaganfall für BChE-K-Allele
    Figure 00430002
  • Die Allelfrequenz von apoE4 betrug 0,12 in Kontrollen und 0,15 in 50 Fällen von Schlaganfall, woraus sich ein Chancenverhältnis von Schlaganfall von 1,3 (basierend auf Allelfrequenzen) und 1,4 (basierend auf Trägerfrequenzen) (Tabelle 18) ergibt. In BChE-K-Trägern war das Chancenverhältnis von Schlaganfall 1,9 (berechnet für den Trägerstatus) (Tabelle 18).
  • Tabelle 18. Chancenverhältnis für Schlaganfall für apoE4-Allele
    Figure 00440001
  • Unter Beachtung des Trägerstatus beider Genmutationen haben wir entdeckt, dass in den Fällen von Schlaganfall eine zweifache Zunahme (8% vs 18%) verglichen zu Kontrollen vorliegt, in Trägern sowohl mit dem apoE4- als auch dem BChE-K-Allel (Tabelle 19). Dieser Trend zeigt sich auch in den apoE4-Trägern.
  • Tabelle 19. Verhältnisse der Kontrollen und Schlaganfälle sowohl mit BChE-K und apoE4
    Figure 00440002
  • In Tabelle 20 stellen wir das Chancenverhältnis für Schlaganfall für Testpersonen bereit, die wenigstens ein apoE4- und BChE-K-Allel aufweisen, verglichen mit Kontroll-Testpersonen, die keines der beiden Allele besitzen. In weiblichen Personen über 58 Jahre, die sowohl das apoE4- als auch das BChE-K-Allel tragen, war das Chancenverhältnis, einen Schlaganfall zu erleiden 2,8fach höher als in gleichaltrigen Kontrollen. Diese Daten sagen für weibliche Träger dieses genetischen Status ein fast 3fach höheres Risiko für einen Schlaganfall voraus.
  • Tabelle 20. Chancenverhältnis für Schlaganfall
    Figure 00440003
  • Zusammengefasst haben wir entdeckt, dass die Bestimmung des Allelstatus hinsichtlich apoE4 und BChE-K einer Einzelperson ein nützliches Werkzeug bei der Vorhersage des Risikos einer Einzelperson für einen Schlaganfall ist. Weiterhin legen unsere Ergebnisse nahe, dass eine prognostische Vorhersage es dem Patienten ermöglichen könnte, prophylaktische Therapien durchzuführen, bevor die Krankheit zuschlägt. So könnte z. B. das Schlaganfallrisiko für asymptomatische und gesunde Personen wie junge Erwachsene und lange bevor ein Schlaganfall aufgetreten ist, berechnet werden. Dann könnte mit zunehmendem Alter der Einzelperson eine präventive Therapie begonnen werden, um die Wahrscheinlichkeit eines katastrophalen Schlaganfalls im späteren Leben zu verhindern oder zu verringern.

Claims (13)

  1. Verfahren zur Erstellung eines Prognoseprotokolls für einen Patienten, bei dem Neurofibromatose, eine Erkrankung des entwickelnden Nervensystems, Depression, eine Verletzung des Nervensystems, eine Infektion des Nervensystems, Koma, Multiinfarkt-Demenz, ein Diät-Defizit oder ein kardiovaskulärer Schaden diagnostiziert wurde, wobei das Verfahren umfasst: a) Identifizierung eines Patienten, bei dem die Erkrankung bereits diagnostiziert wurde; b) Bestimmung des apoE Allel-Gehalts des Patienten durch Genotypisierung oder Phenotypisierung, wobei diese Phenotypisierung die Charakterisierung einer ApoE Proteinisoform einschließt; und c) Konvertieren der Daten, die aus Schritt b) erhalten wurden in ein Prognoseprotokoll, wobei das Prognoseprotokoll eine Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit und des Patientenergebnisses einschließt, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4 Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient wahrscheinlich nicht von cholinomimetischer Therapie profitieren wird.
  2. Verfahren zur Erstellung eines Prognoseprotokolls für einen Patienten, bei dem Schlaganfall diagnostiziert wurde, wobei dass Verfahren umfasst: a) Identifizierung eines Patienten, bei dem Schlaganfall bereits diagnostiziert wurde; b) Bestimmung des apoE Allel-Gehalts des Patienten durch Genotypisierung oder Phenotypisierung, wobei diese Phenotypisierung die Charakterisierung einer ApoE Proteinisoform einschließt; und c) Konvertieren der Daten, die aus Schritt b) erhalten wurden in ein Prognoseprotokoll, wobei das Prognoseprotokoll eine Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit und des Patientenergebnisses einschließt, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4 Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient wahrscheinlich von cholinomimetischer Therapie profitieren wird.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren weiterhin das Erhalten von Daten einschließt, die den Patienten betreffen, von dem das Prognoseprotokoll erstellt wird, wobei diese Daten Informationen hinsichtlich der Diagnose des Patienten, des Alters, des Geschlechts und des Genotyps einschließen, wobei der Genotyp der Presenilin-Genotyp oder der Apolipoprotein C1 Genotyp ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Erkrankung des entwickelnden Nervensystems das Fragile X Syndrom oder ein kongenitaler Defekt im Aminosäuremetabolismus ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der kongenitale Defekt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Argininosukzinoazidurie, Cystathioninurie, Histidinämie, Homocystinurie, Hyperammonämie, Phenylketonurie und Tyrosinämie.
  6. Verfahren zur Identifizierung von Patienten, die geeignet sind zur Teilnahme an einer klinischen Studie eines Arzneimittels zu Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Neurofibromatose, einer Erkrankung des entwickelnden Gehirns, Depression, einer Verletzung des Gehirns, einer Infektion des Gehirns, Koma, Multiinfarkt-Demenz, einem Diät-Defizit oder einem kardiovaskulären Schaden, wobei das Verfahren umfasst: a) Identifizierung eines Patienten mit der Erkrankung; b) Bestimmung des apoE Allel Gehalts des Patienten durch Genotypisierung oder Phenotypisierung, wobei diese Phenotypisierung die Charakterisierung einer ApoE Proteinisoform einschließt; und c) Konvertieren der Daten, die aus Schritt b) erhalten wurden in ein Prognoseprotokoll, wobei das Prognoseprotokoll darauf hinweist, ob der Patient ein Kandidat für eine cholinomimetische Arzneimittelstudie oder eine nicht-cholinomimetische Arzneimittelstudie ist, oder nicht, wobei erwartet wird, dass ein Patient, dem beide ApoE Allele fehlen, ein Kandidat für eine cholinomimetische Arzneimittelstudie ist oder wobei erwartet wird, dass ein Patient, der ein oder mehrere apoE4 Allele hat, ein schlechter Kandidat in einer cholinomimetischen Arzneimittelstudie ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei dieses Verfahren weiterhin die Bestimmung des BChE Genotyps des Patienten umfasst.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4 Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient eine schlechtere Genesungsprognose hat.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4 Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient eine bessere Genesungsprognose hat.
  10. Verfahren zur Bestimmung des Risikos eines Schlaganfalls in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: a) Bestimmung des apoE Allel Gehalts des Patienten durch Genotypisierung oder Phenotypisierung, wobei diese Phenotypisierung die Charakterisierung einer ApoE Proteinisoform einschließt; und b) Bestimmung des BChE Genotyps des Patienten, wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren apoE4 Allelen und einem oder mehreren BChE-K Allelen in dem Patienten darauf hinweist, dass der Patient gefährdet für Schlaganfall ist.
  11. Verfahren zur Durchführung einer pharmakogenetischen Analyse, wobei das Verfahren ein Mittel zur Konvertierung eines Patientenprofils in ein Prognoseprotokoll einschließt, wobei dieses Mittel die Bestimmung des apoE Allel Gehalts eines Patienten einschließt, bei dem Neurofibromatose, eine Erkrankung des entwickelnden Nervensystems, Depression, eine Verletzung des Nervensystems, eine Infektion des Nervensystems, Koma, Multiinfarkt-Demenz, ein Diät-Defizit, ein kardiovaskulärer Schaden oder Schlaganfall diagnostiziert wurde, durch Genotypisierung oder Phenotypisierung, einschließlich der Charakterisierung einer ApoE Proteinisoform.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Verfahren ein Mittel zur Durchführung der Schritte der Konvertierung enthält.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Verfahren ein Mittel zur Erstellung der Daten von dem Patientenprofil enthält.
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