DE69727833T2

DE69727833T2 - Membraneinbau von texaphyrinen

Info

Publication number: DE69727833T2
Application number: DE1997627833
Authority: DE
Inventors: W. Stuart YOUNG; Meredith Wright; L. Jonathan SESSLER; D. Tarak MODY; Darren Magda
Original assignee: Pharmacyclics LLC; University of Texas System
Current assignee: Pharmacyclics LLC; University of Texas System
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2017-06-05
Also published as: WO1997046262A3; IL127315A; IL127315A0; AU3226497A; JP2000512279A; CN1225591A; NZ333072A; AU727138B2; BR9710685A; EP0954336B1; CA2257225A1; NO985645D0; EP0954336A2; NO985645L; ATE260121T1; DE69727833D1; WO1997046262A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein System zur Verabreichung von Arzneimitteln sollte das Arzneimittel während der Behandlungsdauer mit einer Geschwindigkeit verabreichen, die durch die Anforderungen einer medizinischen Behandlung vorgegeben ist, dass heißt, Aufgabe eines jeglichen Arzneimittelverabreichungssystems ist es, eine therapeutische Menge an Arzneimittel an der betreffenden Stelle im Körper zur Verfügung zu stellen, so dass die gewünschte Arzneimittelkonzentration umgehend erzielt und dann aufrechterhalten wird. Bei dieser Aufgabe wird die Anforderung nach räumlicher Platzierung und zeitlich definierter Verabreichung eines Arzneimittels bzw. einer Behandlung betont. Räumliche Platzierung ist die gezielte Anreicherung eines Arzneimittels in einem bestimmten Organ, Gewebe oder System des Körpers wie dem Blutstrom, während zeitlich definierte Verabreichung sich auf die Steuerung der Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel dem Ziel zugeführt wird, bezieht.
Zu den Systemen zur gezielten Verabreichung von Arzneimitteln zählen kolloidale Systeme zur Verabreichung von Arzneimitteln und wieder verschlossene oder modifizierte Zellen, beispielsweise wieder verschlossene oder modifizierte Erythrozyten oder Leukozyten. Zu den kolloidalen Systemen zur Verabreichung von Arzneimitteln gehören Nanopartikel, Mikrokapseln, Nanokapseln, makromolekulare Komplexe, Polymerperlen, Mikrosphären, Liposomen und Lipidvesikel.
Liposomen werden aus Phospholipiden, die in einem wässrigen Medium dispergiert sind und spontan multilamellare konzentrische Doppelschichtvesikel (auch als multilamellare Vesikel (MLVs) bezeichnet) bilden, gebildet. MLVs haben im allgemeinen Durchmesser von 4 mm bis 25 mm. Durch Ultraschallbehandlung oder Lösungsmittelverdünnung von MLVs kommt es zur Bildung kleiner unilamellarer Vesikel (small unilamellar vesicles, SUVs) mit Durchmessern im Bereich von 300 bis 500 A.
Liposomen ähneln Zellmembranen, und es ist möglich, wasser- bzw. fettlösliche Substanzen in den wässrigen Kompartimenten bzw. der Doppelschicht einzulagern. Eine wichtige Determinante bei der Einlagerung von Verbindungen sind die physikochemischen Eigenschaften der Verbindung selbst. Polare Verbindungen werden in den wässrigen Kompartimenten eingelagert und durch Permeation oder wenn die Doppelschicht aufgebrochen wird freigesetzt; unpolare Verbindungen binden sich an die Lipiddoppelschicht des Vesikels und neigen dazu, dort zu verbleiben, bis die Doppelschicht durch Temperatureinflüsse oder die Einwirkung von Lipoproteinen aufgelöst wird.
Liposomen können über eine Reihe verschiedener Mechanismen mit Zellen in Wechselwirkung treten, beispielsweise durch: Endozytose durch phagozytische Zellen des retikuloendothelialen Systems wie Makrophagen und neutrophile Zellen; Adsorption an der Zelloberfläche, entweder durch unspezifische schwache hydrophobe oder elektrostatische Kräfte oder durch spezifische Wechselwirkungen mit Zelloberflächenkomponenten; Fusion mit den Plasmazellmembranen durch Insertion der Lipiddoppelschicht des Liposoms in die Plasmamembran mit gleichzeitiger Freisetzung des Inhalts des Liposoms in das Zytoplasma; oder durch Transfer von liposomalen Lipiden zu zellulären oder subzellulären Membranen, oder umgekehrt, ohne irgendeine Assoziation des Inhalts des Liposoms. Es ist häufig schwie rig, zu bestimmen, welcher Mechanismus wirkt, und es kann sein, dass mehrere Mechanismen gleichzeitig wirken.
Intravenös injizierte Liposomen können je nach ihrer Zusammensetzung über Stunden oder Tage in Geweben verbleiben, und die Halbwertszeiten im Blut liegen im Bereich von Minuten bis zu mehreren Stunden. Größere Liposomen werden schnell von phagozytischen Zellen des retikuloendothelialen Systems aufgenommen und verlassen dieses nur dort, wo große Öffnungen bzw. Poren im Kapillarenendothel vorhanden sind, wie beispielsweise in den Sinusoiden von Leber oder Milz. Diese Organe sind somit die Hauptaufnahmestellen. Andererseits zeigen kleinere Liposomen eine breitere Gewebeverteilung, werden jedoch immer noch in großen Mengen in Leber und Milz sequestriert. Allgemein ist durch dieses in-vivo-Verhalten das mögliche Targeting von Liposomen nur auf die aufgrund ihrer großen Größe zugänglichen Organe und Gewebe beschränkt. Hierzu zählen das Blut, die Leber, die Milz, das Knochenmark und Organe des Lymphsystems.
Versuche, die Einschränkungen beim Targeting von Liposomen zu überwinden, haben sich auf zwei Ansätze konzentriert. Bei dem einen handelt es sich um die Verwendung von an die Liposomenoberfläche gebundenen Antikörpern, mit denen der Antikörper und der Liposomeninhalt spezifischen, an der Oberfläche eines bestimmten Zelltyps befindlichen antigenen Rezeptoren zugeführt werden. Weiterhin kann man auch Kohlenhydrat-Determinanten (Glycoprotein- oder Glycolipid-Zelloberflächenkomponenten, die bei Zell-Zell-Erkennung, – Wechselwirkung und -Adhäsion eine Rolle spielen) als Erkennungsstellen verwenden, da sie die Möglichkeit bieten, Liposomen zu bestimmten Zelltypen zu dirigieren.
Andere Lipidvesikel wie nicht-phospholipidhaltige paucilamellare Lipidvesikel (PLVs) werden aus Materialien wie Polyoxye thylenfettsäureestern, Polyoxyethylenfettsäureethern, Diethanolaminen, langkettigen Acylaminosäureamiden, langkettigen Acylamiden, Polyoxyethylensorbitanmono- und -tristearaten und -oleaten, Polyoxyethylenglycerylmonostearaten und – monooleaten und Glycerylmonostearaten und -monooleaten gebildet (US-Patentschriften 4 911 928, 4 917 951 und 5 000 960). Schenning et al. (134a, Tetrahedron Letters, 34 (1993), 29, 7077–7080) betrifft die Bildung von Vesikeln beim Dispergieren eines amphiphilen Porphyrins in Wasser.
Eine weitere Form der zielgerichteten Verabreichung von Arzneimitteln sind wiederverschlossene Erythrozyten. Suspendiert man Erythrozyten in einem hypotonen Medium, so schwellen sie auf das etwa Eineinhalbfache ihrer normalen Größe an und die Membran wird geschwächt, was zur Bildung kleiner Poren führt. Die Poren ermöglichen eine Äquilibrierung der intrazellulären und extrazellulären Lösungen. Wird die Ionenstärke des Mediums dann auf isotonisch eingestellt, schließen sich die Poren, wodurch die Membran der Erythrozyte in den Normalzustand bzw. „wiederverschlossenen" Zustand zurückkehrt. Wendet man dieses Verfahren in Gegenwart eines Arzneimittels in der extrazellulären Lösung an, so ist es möglich, eine beträchtliche Menge des Arzneimittels in der wiederverschlossenen Erythrozyte einzulagern und dieses System zur zielgerichteten Verabreichung mittels intravenöser Injektion zu verwenden.
Untersuchungen zum Verhalten normaler und modifizierter reinfundierter Erythrozyten deuten darauf hin, dass im allgemeinen normale alternde Erythrozyten, leicht geschädigte Erythrozyten und leicht mit Antikörpern beschichtete Erythrozyten nach intravenöser Reinfusion in der Milz sequestriert werden, während schwer geschädigte oder modifizierten Erythrozyten durch die Leber aus dem Blutkreislauf entfernt werden. Dies legt nahe, dass wiederverschlossene Erythrozyten sich selektiv entweder der Leber oder der Milz zuführen las sen, was auch als Nachteil angesehen werden kann, da andere Organe und Gewebe nicht zugänglich sind. Die Anwendung dieses Systems für die zielgerichtete Verabreichung war daher vorwiegend auf die Behandlung von lysosomalen Speicherkrankheiten und Metalltoxizität, bei denen die Wirkungsstelle des Arzneimittels im retikuloendothelialen System liegt, beschränkt.
Die Markierung von roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen mit Chrom-51 bzw. Indium-111 sowie das Markieren von Liposomen mit Kontrastmedien und therapeutischen Mitteln ist bekannt. Die US-Patentschrift 5 466 438 betrifft fettlösliche Komplexe paramagnetischer Ionen und Verbindungen mit langen Acylketten, die sich als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie eignen. Die US-Patentschrift 5 000 960 betrifft die Kupplung eines Moleküls mit einer freien Sulfhydrylgruppe an ein Lipidvesikel mit einer freien Sulfhydrylgruppe, das als eines der Strukturmoleküle in die Lipidphase eingebettet ist, wobei eine kovalente Disulfidbrückenbindung ausgebildet wird. Die US-Patentschrift 4 931 276 betrifft Verfahren zur Einschleusung gewünschter Mittel in rote Blutkörperchen, und die US-Patentschrift 4 478 824 betrifft Verfahren und Geräte zum Herbeiführen einer reversiblen intrazellulären Hypertonizität in roten Blutkörperchen von Säugetieren zum Einschleusen gewünschter Materialien in die Zellen, oder zum Erzielen therapeutisch wünschenswerter Veränderungen bei den Charakteristika des intrazellulären Hämoglobins. Weiterhin wurden von König et al. (Lasers in Surgery and Medicine 13:522, 1993; in Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers, P. Spinelli, M. Dal Fante und R. Marchesini, Hrsg., Elsevier Science Publishers, 1992, 802) eine schlechte Anreicherung von liposomalem Cadmium-Texaphyrin in Tumorgewebe als eine mögliche Erklärung für die geringe Effizienz bei der photodynamischen Therapie angeführt.
Die photodynamische Therapie (PDT) ist eine Behandlungstechnik, die sich eines photosensibilisierenden Farbstoffs bedient, der bei Bestrahlung in Gegenwart von Sauerstoff aus unschädlichen Vorstufen (z.B. (O₂(³S_g_)) zytotoxische Substanzen wie Singulett-Sauerstoff (O₂(¹D_g)) bildet. Es können auch andere reaktive Arten wie Hyperoxid-, Hydroperoxyl- oder Hydroxyl-Radikale beteiligt sein. Bei den verwendeten Dosen zeigen weder das Licht noch das Arzneimittel irgendwelche unabhängige Aktivität am Zielort.
Die Wirksamkeit von PDT basiert auf drei Hauptfaktoren: i) Die photosensibilisierenden Farbstoffe, die bei der PDT zum Einsatz kommen, haben vorzugsweise die Fähigkeit, sich am Behandlungsort und nicht im umgebenden Gewebe anzusammeln. ii) Die hohe Reaktivität und die kurze Halbwertszeit von aktiviertem Sauerstoff bedeuten, dass es eine sehr kurze Reichweite hat und es unwahrscheinlich ist, dass es aus der Zelle entweicht, in der es erzeugt wurde; die Zytotoxizität ist somit auf genau die Region des photoaktivierten Arzneimittels beschränkt. iii) Entwicklungen in der Lichtabgabe, wie Laser, Leuchtdioden und Faseroptik, ermöglichen die präzise Aussendung eines intensiven Lichtstrahls zu zahlreichen Körperteilen.
In den letzten Jahren wurden beträchtliche Anstrengungen auf die Synthese und Untersuchung neuer photosensibilisierender Verbindungen gerichtet (eine Übersicht findet sich in Brown, S.B. und Truscott, T.G., 1993, Chemistry in Britain, 955-958). Für die Entwicklung wirksamerer photochemotherapeutischer Mittel ist die Synthese von Verbindungen erforderlich, die in dem Spektralbereich absorbieren, in dem lebende Organismen relativ transparent sind (d.h. 700–1000 nm), eine hohe Triplett-Quantenausbeute haben, eine minimale Toxizität aufweisen und physiologisch unbedenkliche Wasser/Lipid-Verteilungskoeffizienten haben. Texapyrine haben sich als ef fektive Sensibilisatoren für die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff und für die photodynamische Therapie erwiesen (US-Patentschriften 5 272 142, 5 292 414, 5 439 570 und 5 451 576).
Die Magnetresonanztomographie hat sich zu einem wichtigen diagnostischen Werkzeug in der Medizin insbesondere zur bildlichen Darstellung von Tumoren entwickelt. Die Gewebeabbildung beruht auf unterschiedlichen Relaxationsraten des Kernspins von Wasserprotonen aus verschiedenen Geweben in einem magnetischen Feld. Die Relaxationsrate lässt sich durch die Verwendung eines Kontrastmittels steigern, wodurch das erhaltene Bild verbessert wird. Aufgrund seiner sieben ungepaarten f-Elektronen und seinem hohen magnetischen Moment handelt es sich bei dem Gadolinium-Kation um ein überlegenes Kontrastmittel. Das Gadolinium-Kation ist jedoch für einen direkten Einsatz zur Bilddarstellung bei den für eine effektive Verstärkung erforderlichen Konzentrationen zu toxisch. Texaphyrine binden das Gadoliniumion in stabiler Weise und haben sich als nichttoxische und effektive Kontrastmittel für die Bilddarstellung erwiesen (US-Patentschriften 5 252 720, 5 451 576 und 5 256 399). Eine Weiterentwicklung von auf Texaphyrinen basierenden Protokollen für die Magnetresonanztomographie würde für eine bessere medizinische diagnostische Bilddarstellung von erheblichem Wert sein.
Makuladegeneration aufgrund einer Schädigung oder eines Abbaus der Makula, darunter liegenden oder benachbarten Gewebes ist die Hauptursache für Sehschärfeverlust, Leseschwäche und den Verlust der Fähigkeit zu präzisem Nahsehen. Die altersbedingte Makuladegeneration (age-related macular degeneration, ARMD) ist die Hauptursache für ernsten Sehverlust bei älteren Menschen. Die häufigste Form der Makuladegeneration ist die "trockene" oder atrophierende Makuladegeneration aufgrund einer Rückbildung von vaskulären und anderen Struktur- oder Nährgeweben unterhalb der Retina im Makulabereich. Eine ernsthaftere Form wird als "feuchte" oder exsudierende Makuladegeneration bezeichnet. Bei dieser Form durchbrechen Blutgefäße in der Aderhaut (einer Schicht unterhalb der Netzhaut, die die Netzhaut mit Nährstoffen versorgt) eine dünne Schutzschicht zwischen diesen beiden Geweben. Diese Blutgefäße können rapide und auf unkontrollierte Weise abnorm direkt unter der Retina wachsen, was zu Flüssigkeitsaustritt, Blutungen und schließlich der Bildung von Narbengewebe in der Macula führt, was wiederum einen schweren Verlust des zentralen Sehens zur Folge hat. Dieser Prozess wird als choroidale Gefäßneubildung bezeichnet.
Eine Gefäßneubildung führt auch bei anderen Augenkrankheiten, einschließlich des neovaskulären Glaukoms, des okulären Histoplasmose-Syndroms, Myopie, Diabetes, Pterygium sowie Infektionen und Entzündungen, zu Sehverlust. Beim Histoplasmose-Syndrom kommt es in der Aderhaut der Innenschicht des hinteren Auges zu einer Reihe von Ereignissen, die zu einer lokalisierten Entzündung der Aderhaut mit anschließender Narbenbildung und Funktionsverlust der betroffenen Retina sowie der Entstehung eines blinden Flecks (Skotom) führen. In einigen Fällen wird die Aderhaut zur Neubildung von Blutgefäßen angeregt, die sehr viel schwächer sind als normale Blutgefäße. Diese neigen zu Blutungen mit weiterer Narbenbildung und weiterem Funktionsverlust der darüber liegenden Netzhaut. Bei der diabetischen Retinopathie sind nicht die Blutgefäße der Aderhaut, sondern die der Netzhaut betroffen, die zu Blutungen, vaskulären Unregelmäßigkeiten und weißlichen Exsudaten führen. Bei ganz besonders schweren Formen kann auch eine Gefäßneubildung in der Netzhaut auftreten.
Die derzeit angewendeten Diagnosemethoden bei Augenstörungen umfassen häufig den Einsatz eines Farbstoffs wie Fluorescein oder Indocyanin-Grün in einem Angiogramm. Bei diesem Verfah ren wird der Farbstaff durch eine Vene im Arm in die Blutbahn injiziert. Im Strahlengang und vor dem Film werden Spezialfilter angeordnet, mit deren Hilfe nur der fluoreszierende Farbstoff sichtbar gemacht wird, während er durch die Gefäße der Retina passiert. Während der Farbstoff durch die Blutgefäße des hinteren Auges passiert, werden Bilder der Gefäßanatomie von Retina und Makula aufgenommen. Gefäßverschlüsse oder das Austreten von Farbstoff deuten auf ein anormes Gefäßnetz hin. Eine andere Technik der kontaktlosen bildgebenden Darstellung, die Schnitttomogramme der Retina mit hoher Tiefenauflösung liefert, ist die optische Kohärenztomographie.
Die derzeitige Behandlung der Neovaskularisation beruht auf der Abhebung von Blutgefäßen mit Hilfe der Photokoagulation mit heißem Laser. Eine solche Behandlung erfordert jedoch die Zerstörung von Gewebe mittels hoher Temperaturen und wird von einer Netzhautschädigung in voller Dicke sowie Schädigung mittelgroßer und großer choroidaler Gefäße begleitet. Außerdem bleiben beim Patient eine atrophierende Narbe und ein visuelles Skotom zurück. Weiterhin sind Rückfälle häufig und die Prognose für den Zustand des Patienten ist schlecht.
Mit Hilfe von Entwicklungsstrategien wie der PDT wurde nach einer selektiveren Schließung der Blutgefäße gesucht, um die darüber liegende neurosensorische Retina zu erhalten. Die PDT von Augenleiden, die durch Neovaskularisation gekennzeichnet sind, wurde bereits mit herkömmlichen Porphyrinderivaten wie dem Hämatoporphyrinderivat und PHOTOFRIN^® Porfimer-Natrium versucht. In diesem Zusammenhang traten aufgrund der Interferenz von Augenpigmenten Probleme auf. Darüber hinaus wurden Phthalocyanin- und Benzoporphyrinderivate zur photodynamischen Therapie herangezogen. Die PCT-Veröffentlichung WO 95124930 und Miller et al. (Archives of Ophthalmology, Juni, 1995) betreffen die Behandlung von Augenleiden, die durch unerwünschte Neovaskularisation gekennzeichnet sind, wobei ein grünes Porphyrin in das neovaskuläre Gewebe verabreicht wird und das neovaskuläre Gewebe mit Licht einer Wellenlänge von 550–695 nm bestrahlt wird. Die US-Patentschrift 5 166 197 betrifft Phthalocyaninderivate, die offenbar bei Makuladegeneration von Nutzen sind. Asrani und Zeimer (British Journal of Ophthalmology, 1995, 79:766–770) betrifft den Verschluss von okulären Gefäßen mit Hilfe eines in wärmeempfindlichen Liposomen eingekapselten Phthalocyanins. Levy (Semin. Oncol. 1994, 21/6, Suppl. 15 (4–10)) betrifft eine photodynamische Therapie und Makuladegeneration mit Porfimer-Natrium (PHOTOFRIN^®, das Licht von 630 nm erfordert und eine kutane Photosensibilisierung herbeiführt, die bis zu sechs Wochen anhalten kann) und einem Benzoporphyrinderivat (BPD Verteporfin, das eine kutane Photosensibilisierung von einigen Tagen Dauer bewirkt). Lin et al. betrifft den photodynamischen Verschluss von Gefäßen der Aderhaut mittels des Benzoporphyrinderivats BPD-MA. Weiterhin sind BPD und Zinnpurpurin (SnET2) in wässrigen Lösungen unlöslich und benötigen zur Verabreichung hydrophobe Vehikel.
Texaphyrine sind aromatische fünfzähnige makrocyclische "expandierte" Porphyrine, die als MAI-Kontrastmittel, als Radiosensibilisatoren und bei der photodynamischen Therapie zum Einsatz kommen. Texaphyrin wird als aromatisches Benzannulen mit Delokalisierungswegen für sowohl 18 als auch 22 Elektronen betrachtet. Texaphyrinmoleküle haben im gewebedurchlässigen Bereich von 700–900 nm eine hohe Absorption und zeigen eine inhärent selektive Aufnahme bzw. Biolokalisierung in bestimmten Gewebearten, insbesondere in Regionen wie beispielsweise der Leber, Atheromen oder Tumorgewebe. Paramagnetische Texaphyrine zeigen signifikante Tumorselektivität, was mittels Magnetresonanztomographie nachgewiesen wurde. Texaphyrine und wasserlösliche Texaphyrine, Herstellungsverfahren und verschiedene Anwendungen sind in den US-Patentschriften 4 935 498; 5 162 509; 5 252 720; 5 256 399; 5 272 142; 5 292 414; 5 369 101; 5 432 171; 5 439 570; 5 451 576; 5 457 183; 5 475 104; 5 504 205; 5 525 325; 5 559 207; 5 565 552; 5 567 687; 5 569 759; 5 580 543; 5 583 220; 5 587 371; 5 587 463; 5 591 422; 5 594 136; 5 595 726; 5 599 923; 5 599 928; 5 601 802; 5 607 924 und 5 622 946; den PCT-Veröffentlichungen WO 90/10633; 94/29316; 95/10307; 95/21845 und 96/09315; den erteilten US-Patentanmeldungen 08/484,551 und 08/624,311 und den anhängigen US-Patentanmeldungen 08/458,347; 08/657,947; 08/591,318; 081700,277 und 08/763,451 beschrieben.
Zu den Problemen mit Arzneimitteln aus dem Stand der Technik und PDT-Verabreichungssytemen zählen neben anderen mangelnde Spezifität, Toxizität, Kosten und technische Schwierigkeiten. Zu den Problemen mit Kontrastmitteln für die Magnetresonanztomographie zählen neben anderen unzureichend differenzierte Biolokalisierung, unzureichendes Signal, Toxizität und langsame Clearance. Wegen dieser Probleme sind die bekannten Verfahren nicht völlig zufriedenstellend, und die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nach Verbesserungen gesucht.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der zielgerichteten Verabreichung von Arzneimitteln und die medizinische Bilddarstellung, Diagnose und Behandlung. Sie betrifft insbesondere Zusammensetzungen mit einem mit einem Konjugat aus Texaphyrin und einem lipophilen Molekül beladenen biologischen Vesikel und Verfahren zur Bilddarstellung, Diagnose und Behandlung unter Anwendung dieses beladenen Vesikels.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die einen Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel enthalten, wobei der Komplex ein mit ei nem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül beladenes Vesikel umfasst. Solche Zusammensetzungen schließen Zellen des Gefäßsystems wie rote Blutkörperchen oder weiße Blutkörperchen und mizellartige Vesikel wie Liposomen oder Nichtphospholipidvesikel ein, die mit einem mit einem lipophilen Molekül konjugierten Texaphyrin beladen sind. Ist der Texaphyrinteil des Komplexes photosensibel und bestrahlt man den Komplex, so bricht der Komplex unter Freigabe seines Inhalts auf. Die Erfindung schließt daher Verfahren zur Verabreichung von diagnostischen oder therapeutischen Mitteln mittels beladenen Komplexen aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel ein.
„Beladen" bedeutet das Markieren von Membranen eines Vesikels, das Einbetten in eine Vesikelmembran oder das Einschleusen ins Innere eines Vesikels. Beladen schließt insbesondere die Anbindung an oder in im Gefäßsystem zirkulierenden Zellen bzw. an oder in Liposomen oder anderen Lipidvesikeln ein.
Ein Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und biologischem Vesikel ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. „Biologisches Vesikel" bedeutet eine membranartige Struktur mit einer Lipid-Doppelschicht bzw. eine Mizelle. „Lipid-Doppelschicht" bedeutet eine bimolekulare Schicht von Phospholipiden und/oder Glycolipiden. Bei dem biologischen Vesikel kann es sich um eine Zelle wie z.B. eine rote Zelle oder eine weiße Zelle oder Membranfragmente davon, eine liposomale Membran, ein Nichtphospholipidvesikel oder ein kolloidales System zur Verabreichung von Arzneimitteln handeln. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem biologischen Vesikel um ein wiederverschlossenes rotes Blutkörperchen.
Bei einem „lipophilen Molekül" handelt es sich so, wie der Begriff hier verwendet wird, um ein Molekül mit einem Lipid/Wasser-Verteilungskoeffizienten, der optimal für eine Anreicherung in lipidreichen Geweben bzw. Materialien ist, verglichen mit der Anreicherung in umgebenden, nicht lipidreichen Geweben bzw. Materialien. „Lipidreich" bedeutet mit einem größeren Anteil an Triglycerid, Cholesterin, Fettsäuren oder dergleichen. Zu den lipophilen Molekülen, die mit einem Texaphyrin konjugiert werden können, zählen Cholesterin, Steroide einschließlich Progestagenen wie Progesteron, Glucocorticoide wie Cortisol, Mineralcorticoide wie Aldosteron, Androgene wie Testosteron und Androstenedion, und Östrogene wie Östron und Östradiol; Phospholipide wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit oder Cardiolipin, Sphingolipide wie Sphingomyelin, Glycolipide wie Cerebrosid oder Gangliosid, Moleküle mit isoprenoiden Seitenketten wie Vitamin K₂, Coenzym Q₁₀, Chlorophyll oder Carotenoide, Lipoprotein geringer Dichte (lowdensity lipoprotein, LDL) oder dergleichen. Bevorzugte lipophile Moleküle sind Steroide, besonders bevorzugt beispielsweise Östradiol oder Cholesterin.
Ist ein beladenes Vesikel mit einem photosensiblen Konjugat aus Texaphyrin und einem lipophilem Molekül beladen, so eignet es sich als diagnostisches oder therapeutisches Mittel, da sich die Zelle bzw. das Liposom mit einer geeigneten Lichtquelle aufbrechen lässt, wodurch ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel in vivo freigesetzt wird. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Verabreichung eines Mittels an ein dafür vorgesehenes biologisches Ziel. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: i) ein Vesikel wird mit einem photosensiblen Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül und dem Mittel zur Bildung eines Komplexes beladen, ii) man ermöglicht es dem Komplex, sich am vorgesehenen biologischen Ziel anzureichern, und iii) man bestrahlt den Komplex. Der Komplex wird durch die Bestrahlung gespalten, wodurch das Mittel zum vorgesehenen Ziel gebracht wird. Bei dem Mittel kann es sich um ein diagnostisches Mittel, ein Mittel für die photodynamische Therapie, ein chemotherapeutisches Mittel, ein strahlungssensibilisierendes Mittel oder natürlich vorkommende zelluläre Zellinhalte handeln. Eine bevorzugte Vesikelportion eines zu beladenden Komplexes ist ein rotes Blutkörperchen, ein bevorzugtes lipophiles Molekülteil eines Komplexes ist Östradiol oder Cholesterin, und das photosensible Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül kann ein vom Texaphyrin gebundenes diamagnetisches Metallkation aufweisen. Bevorzugte diamagnetische Metallkationen sind Lu(III), La(III), In(III), Y(III), Zn(II) und Cd(II); ein ganz besonders bevorzugtes diamagnetisches Metallkation ist Lu(III). Stehen mit photosensitivem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül beladene rote Blutkörperchen bereit, so verfügt man über ein Verfahren, mit dem man einem gewünschten Ziel mit hoher Sauerstoffkonzentration ein therapeutisches PDT-Mittel zuführen kann. Es ist zu erwarten, dass der Patient bei der Verabreichung eines PDT-Mittels auf diese Weise weniger toxische Wirkungen erfährt.
Bei dem Verfahren der Photolyse der beladenen Blutzellen bzw. Liposomen gibt es wenigstens zwei Spezifitätsquellen. Eine erste Spezifitätsquelle ist die natürliche Lokalisierung der beladenen Zellen bzw. Liposomen im Blut, in der Leber, in der Milz, im Knochenmark oder in lymphoiden Organen. Eine zweite Spezifitätsquelle ist die Positionierung des Laserlichts. Eine solche Positionierung des Laserlichts, entweder manuell oder mechanisch, wäre besonders vorteilhaft, wenn die Photolyse an einem bestimmten biologischen Ort wie beispielsweise einer tiefsitzenden Tumorstelle erfolgen soll. Besonders vorteilhaft ist hier die Tatsache, dass die Texaphyrine Licht bei Wellenlängen absorbieren, bei denen Körpergewebe relativ transparent sind (700–900 nm). Mit dieser Vorgehensweise ist es möglich, die auf Lichtwirkung basierenden Strategien an Stellen tief im Körper umzusetzen, wobei andere Gewebe, an denen die Texaphyrinkonjugate nicht lokalisiert sind bzw. wo das Licht nicht fokussiert ist, relativ wenig schädliche Photosensibilisierung aufgrund von Lichteinwirkung erfahren.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es weiterhin, das Blut des Patienten selbst zum Beladen mit einem diagnostischen oder einem therapeutischen Mittel und einem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül zu verwenden. Dies führt zu einer einzigartig „maßgeschneiderten" Therapie mit reduzierter Toxizität, erhöhter Zirkulation und maximaler therapeutischer Wirkung.
Mit einem photosensiblen Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül und einem chemotherapeutischen Arzneimittel beladene Vesikel sind bei der konventionellen Chemotherapie von Nutzen. In einem solchen Fall wird, indem man Laserlicht auf einen Tumor richtet und das Vesikel aufbricht, nur in unmittelbarer Nähe des Krebsgeschwürs ein chemotherapeutisches Mittel freigesetzt. Darüber hinaus kommt es zu einer lokalisierten photodynamischen therapeutischen Wirkung der Bestrahlung des Texaphyrins.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Komplexes aus nachweisbarem Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel zur Herstellung einer Zusammensetzung zur bildgebenden Darstellung eines Patienten, bei dem man dem Patienten die Zusammensetzung verabreicht und den Komplex abbildet.
Wenn das nachweisbare Texaphyrin fluoreszierend ist, kann die bildgebende Darstellung durch Beobachtung der Fluoreszenz erfolgen; wenn das nachweisbare Texaphyrin einen Komplex mit einem paramagnetischen Kation bildet, kann die bildgebende Darstellung durch Magnetresonanztomographie erfolgen. Außerdem kann die bildgebende Darstellung auch mittels Röntgenstrahlung, Raman-Streuung, Magnetometrie (Biolumineszenz) oder, wenn das Texaphyrin mit einem gamma-emittierenden Isotopen komplexiert ist, durch Gamma-scanning erfolgen. Bei Fluoreszenzaufnahmen können Texaphyrine mit Licht einer Wellenlänge von 400–500 nm (die Soret-Bande) oder Licht einer Wellenlänge von 700–900 nm, vorzugsweise 700–800 nm (die Q-Bande) aktiviert werden, wodurch sich im Menschen überaus vielseitige Anwendungmöglichkeiten ergeben.
Der Ausdruck „fluoreszent" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, dass bei Photobestrahlung mit Licht, das mit dem Absorptionsprofil von Texaphyrin assoziiert ist, vom bestrahlten Texaphyrin Licht mit einer längeren Wellenlänge emittiert wird. Alle Texaphyrine sind fluoreszent, wenn auch unterschiedlich stark, und beispielsweise mit Y(III), Lu(III), Gd(III), Dy(III), Eu(III) oder Mn(III) komplexierte Texaphyrine sind besonders bevorzugte fluoreszente Texaphyrine.
Zusätzlich zum Nachweis durch Fluoreszenz können Texaphyrine auch durch Röntgenstrahlung, Raman-Streuung oder Magnetometrie abgebildet werden; weiterhin können mit einem paramagnetischen Metallkation komplexierte Texaphyrine in der Magnetresonanztomographie eingesetzt werden. Für die Komplexierung mit einem Texaphyrin bevorzugte paramagnetische Metallkationen schließen Mn(II), Mn(III), Fe(III) oder trivalente Lanthanidmetalle mit Ausnahme von La(III), Lu(III) und Pm(III) ein. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem paramagnetischen Metall um Mn(II), Mn(III), Dy(III) oder Gd(III), ganz besonders bevorzugt um Gd(III). Bei der Durchführung der Erfindung kann man sich einer der verschiedenen Verfahren der Magnetresonanztomographie bedienen, beispielsweise der kernmagnetischen Resonanz (NMR), der NMR- Spektroskopie und der Elektronenspin-Resonanz. Das bevorzugte Verfahren zur bildgebenden Darstellung ist die NMR.
Zur bildgebenden Darstellung eines mit einem gammaemittierenden Metall komplexierten Texaphyrins kann man die Gammapartikeldetektion anwenden. ⁵¹Chrom, ⁶⁸Gallium, ⁹⁹Technetium oder ¹¹¹Indium sind die für das Komplexieren mit Texaphyrinen für das Gammapartikelscanning bevorzugten Metalle. Monochromatische Röntgenphotonquellen können ebenfalls für die bildgebende Darstellung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich zur allgemeinen bildgebenden Darstellung eines Patienten und/oder zur spezifischen Diagnose des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe in einem Patienten. Das Verfahren der bildgebenden Darstellung der vorliegenden Erfindung lässt sich durchführen, indem man einem Patienten einen erfindungsgemäßen Komplex aus nachweisbarem Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel verabreicht und dann den Patienten scannt, um so sichtbare Bilder einer inneren Region des Patienten und/oder von erkranktem Gewebe in der Region zu erhalten. Die Komplexe der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere zur Aufnahme von Bildern des Blut-Pools, der Leber, des retikuloendothelialen Systems, der Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und von Muskeln; sie sind besonders effektive Mittel für den Blut-Pool und hochwirksam zur Bildverstärkung bei Leberaufnahmen und überaus nützlich für die Verbesserung des Nachweises von Metastasen in der Leber. Es wurde gezeigt, dass mit einem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül beladene rote Blutkörperchen, intravenös injiziert, als Kontrastmittel für das MRI dienen. Mit einem Konjugat aus paramagnetischem Texaphyrin und lipophilem Molekül beladene Vesikel eignen sich als Kontrastmittel für den Blut-Pool, erleichtern die Bildverstärkung bei normalen Geweben, Magnetresonanzangiographie, und markieren Regionen, in denen das Endothel geschädigt ist, in dem sie durch Öffnungen oder geschädigte Stellen des Blutgefäßsystems austreten. Bei dem Patienten kann es sich um eine beliebige Art von Tier handeln, es ist jedoch vorzugsweise ein Säugetier und ganz besonders bevorzugt ein Mensch.
Konjugate aus Texaphyrin und lipophilem Molekül und Komplexe aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel werden auch für die Verwendung in der Augendiagnostik und -therapie, insbesondere einer Therapie, die eine photodynamische Therapie von durch ein anormales Gefäßsystem gekennzeichneten Augenleiden beinhaltet, bereitgestellt.
Für die Angiographie können die Texaphyrine mit Licht einer Wellenlänge von 400–500 nm (der Soret-Bande) oder Licht einer Wellenlänge von 700–800 nm (der Q-Bande) aktiviert werden, wodurch sich im Menschen überaus vielseitige Anwendungsmöglichkeiten ergeben. Bei der Phototherapie können die Texaphyrine bei 400–500 nm und bei längeren Lichtwellenlängen bestrahlt werden, bei denen die Augengewebe relativ transparent sind, insbesondere Licht, das Blut und Gefäßgewebe durchdringen kann, d.h. 700–800 nm, insbesondere etwa 732 nm. Aufgrund ihrer Anreicherung in Regionen von anormaler Permeabilität oder Schädigungen sind Texaphyrine bei der Angiographie der Blutgefäße der Augen als Visualisierungsmittel besonders effektiv, wie in USSN 08/763,451, das hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird, beschrieben.
Damit ausreichend große Mengen an Arzneimittel im Blut vorhanden sind und damit zwischen der Verabreichung der Dosis und dem Einsetzen der Wirkung nicht zuviel Zeit verstreicht, kann man Komplexe aus Texaphyrin und lipophilen Molekülen bzw. aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel als Bolusinjektion verabreichen. Texaphyrine werden weiterhin schnell aus dem Körper eliminiert; bei der Verwendung von Texaphyri nen in der Angiographie wurden keine toxischen Wirkungen am Auge festgestellt.
Ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines nachweisbaren Komplexes aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel zur Zubereitung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Antikörpers mit Bindungsspezifität für ein Texaphyrin in einem Patienten. Bei der Verwendung verabreicht man einem Patienten die Zusammensetzung und bestrahlt den Komplex. Durch das Bestrahlen mit Licht wird das Vesikel aufgebrochen, wodurch der Inhalt im Patienten freigesetzt wird, wodurch der Patient dem Texaphyrin ausgesetzt wird und die Produktion von Antikörpern gegen das Texaphyrin induziert wird. In diesem Fall kann man das Texaphyrin als Hapten ansehen; handelt es sich bei dem Vesikel um eine fremde Zelle, so kann das Vesikel zusätzlich dazu, dass es der Träger ist, der das Texaphyrin transportiert, als Adjuvans betrachtet werden. „Fremd" ist so zu verstehen, dass das beladene Vesikel von einer Tierspezies herrührt, die sich von dem Tier unterscheidet, dem die beladene Zelle verabreicht wird. Bei der Zelle, die beladen wird, kann es sich beispielsweise um eine Ziegenzelle handeln, und der Empfänger, dem die beladene Zelle verabreicht wird, kann ein Kaninchen sein.
Darüber hinaus kann man das Vesikel mit einem weiteren Immunogen beladen, mit dem die Bildung von Antikörpern induziert wird, die für dieses Immunogen Bindungsspezifität haben. Auch können sich Antikörper mit Bindungsspezifität für die zellulären Inhalte der aufgebrochenen Zelle bilden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Antikörper mit Bindungsspezifität für ein Texapyrinmolekül. Solche Antikörper eignen sich zur Aufreinigung eines Texaphyrins oder für Screening-Assays auf das Vorhandensein eines Texaphyrins oder das Vorhandensein von Texaphyrin-Abbauprodukten aus Stoffwechselprozessen.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Zelle umfasst die folgenden Schritte: i) Herstellung eines Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül und ii) Inkubieren einer Zelle mit dem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül in einer hypotonen Kochsalzlösung, solange und unter solchen Bedingungen, dass sich ein Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Zelle bildet. Gegebenenfalls kann man beim Inkubieren in der hypotonen Lösung ein Arzneimittel oder therapeutisches Mittel zusetzen. Als Zelle bevorzugt wird eine Erythrozyte. Die Vorteile der Verwendung von wiederverschlossenen oder modifizierten autologen Erythrozyten als Träger für Arzneimittel ist, dass sie biologisch abbaubar, voll biologisch kompatibel und nichtimmunogen sind; je nach ihren physikochemischen Eigenschaften sind sie flexibel, was die Umlaufzeit betrifft; das eingeschlossene Arzneimittel ist gegenüber einer immunologischen Detektion geschützt, und es ist nicht erforderlich, das Arzneimittel chemisch zu modifizieren.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Liposom umfasst den Schritt der Inkubation eines Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül mit einem Lipid oder den Einbau eines Texaphyrin/lipophilen Moleküls in ein bereits gebildetes Liposom oder eine bereits gebildete Mizelle, unter Bedingungen, bei denen ein Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Liposom gebildet wird. Gegebenenfalls kann man beim Inkubieren bzw. Einbauen ein Arzneimittel oder therapeutisches Mittel zusetzen.
Kurz gesagt ist ein mit einem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül beladenes Vesikel bei der medizinischen Bilddarstellung, Diagnose und Therapie von Nutzen.
Nach bereits lange Zeit bestehenden Übereinkünften im Patentrecht bedeuten die Ausdrücke „ein" und „eine" so wie sie hier in dieser Anmeldung einschließlich den Ansprüchen verwendet werden, jeweils „ein(e) oder mehrere".
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das Beladen eines biologischen Vesikels wie eines roten Blutkörperchens (RBK), eines weißen Blutkörperchens (wBK) oder eines Liposomen mit einem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Konjugat wurde bislang noch nicht gezeigt. In der vorliegenden Erfindung wurden RBK erfolgreich mit GdT2BET-Östradiol-Konjugat (GTE 1_A) beladen. Beladungsversuche mit GdT2BET alleine waren jedoch nicht erfolgreich, was darauf hinweist, dass für den Beladungserfolg ein „Henkel" eines lipophilen Moleküls ein wichtiger Aspekt des Texaphyrin-Konjugats ist. Wenngleich in den folgenden Beispielen die Beladung roter Blutkörperchen gezeigt wird, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt; es wird in Betracht gezogen, dass auch andere Zellen wie Stammzellen, Knochenmarkzellen, Blutplättchen, Granulozyten, Lymphozyten einschließlich T- und B-Zellen, Monozyten, neutrophile Zellen, eosinophile Zellen, Plasmazellen, Makrophagen, dendritische Zellen oder eine Zelle mesenchymalen, ektodermalen oder endodermalen Ursprungs beladen werden können. Es wird erwartet, dass mit einem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül beladene Makrophagen für die Behandlung von Atheromen geeignet sind, da Makrophagen sich unter Bildung von Schaumzellen, einer Komponente des frühen Atheroms, mit Cholesterin komplexieren.
Beladene Vesikel reichern sich biologisch natürlich im Blut, der Leber, der Milz, dem Knochenmark oder lymphoiden Organen an. Aufgrund der Größe eines Vesikels wie eines roten Blutkörperchens oder eines Liposoms, verglichen mit der Größe ei nes Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül, steht zu erwarten, dass das Vesikel hinsichtlich der biologischen Anreicherung dominiert und eventuelle lokalisierende Effekte eines auf eine Stelle hinlenkenden lipophilem Moleküls bzw. die inherente biologische Anreicherung von Texaphyrinen sekundär sein wird. Ein in ein Vesikel geladenes Konjugat aus Texaphyrin und Östradiol beispielsweise könnte, wenn sich das Östradiol an der Oberfläche des Vesikels befindet, eine gewisse Spezifität für einen Östradiolrezeptor zeigen. In ähnlicher Weise könnte ein mit einem Konjugat aus Texaphyrin und Cholesterin beladenes Vesikel sich zusätzlich zur natürlichen Lokalisierung des Vesikels in der Leber auch weiter in der Leber anreichern.
Humanes LDL ist ein physiologisches Serumprotein, dass über die Aufnahme durch hochaffine Rezeptoren von Zellen metabolisiert wird. Es wurde gezeigt, dass insbesondere neugebildete Gefäße erhöhte Anzahlen von LDL-Rezeptoren aufweisen, und man nimmt an, dass durch Erhöhung der Verteilung des Texaphyrins in die Lipoproteinphase des Bluts das LDL bei der Anreicherung des Texaphyrins in das Zielgewebe effizienter ist. Ein Konjugat aus Texaphyrin und LDL ist selektiv für neugebildete Gefäße, da anzunehmen ist, dass es aufgrund der großen Größe des Konjugats nur in neugebildeten Gefäßen zu einem Austritt des Konjugats kommt. LDL lässt sich gemäß der Vorschrift von Hauel et al., (J. Clin. Invest., 34:1345, 1995) isolieren und aufreinigen.
Beim erfindungsgemäßen Beladen von roten Blutkörperchen werden die roten Blutkörperchen vom Plasma abgetrennt und in normaler Kochsalzlösung gewaschen. Sie werden dann mit hypertonischer Kochsalzlösung behandelt, wodurch sie, da ihre innere Salzkonzentration höher als normal ist, eine Stechapfelform annehmen. Das Zellpellet mit der Stechapfelform wird in einer das Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül ent haltenden hypotonischen Kochsalzlösung resuspendiert. Aufgrund des Konzentrationsgefälles zwischen dem Inneren der Zelle und der hypotonischen Lösung werden Wasser und das Konjugat in die Zellen gedrängt. Die Zellen werden dann mehrmals mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Diese Vorgehensweise liefert rote Blutkörperchen, die extensiv mit dem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül markiert sind. Der Fachmann wird sich angesichts der vorliegenden Offenbarung weiteren Verfahren zum Beladen von Zellen bewusst, die sich zur Herstellung von Komplexen der vorliegenden Erfindung eignen, beispielsweise dem Herbeiführen eines osmotischen Gefälles durch die Verwendung von Saccharoselösungen, durch Behandlung mit Calciumchlorid oder Calciumphosphat oder dergleichen.
Weiße Blutkörperchen werden beispielsweise durch Zentrifugieren über Ficoll Hypaque-Medium aus Blut erhalten. Hierdurch werden die weißen Blutkörperchen von Plasmakomponenten und roten Blutkörperchen getrennt. Andere Verfahren zum Erhalt spezifischer Zelltypen werden dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
Liposomen lassen sich durch eine Reihe von Verfahren herstellen, unter anderem beispielsweise durch Gefrieren/Auftauen, Ultraschallbehandlung, Chelatdialyse, Homogenisieren, Lösungsmittelinfusion, Mikroemulgation, spontane Bildung, Lösungsmittelverdampfung, Umkehrphase, Verfahren unter Anwendung einer French-Presse oder kontrollierte Tensiddialyse. Solche Herstellungsverfahren sind dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt. Die Herstellung kann in einer das Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül enthaltenden Lösung wie z.B. einer Phosphatpufferlösung erfolgen, so dass das Konjugat in die Liposomenmembran eingebaut wird. Alternativ dazu kann man das Konjugat bereits gebildeten Liposomen zusetzen. Bei den in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Liposomen kann es sich um beliebige einer Reihe verschiedener Größen handeln; bevorzugt sind Liposomen mit einem Außendurchmesser von weniger als etwa 100 nm, besonders bevorzugt weniger als etwa 50 nm.
Mizellen lassen sich herstellen, indem man in einem orgnanischen Lösungsmittel Texaphyrin/lipophiles Molekül und Lipidverbindung(en) suspendiert, das Lösungsmittel abdampft, in einem wässrigen Medium resuspendiert, ultraschallbehandelt und dann zentrifugiert. Alternativ dazu kann man Texaphyrin/lipophiles Molekül bereits gebildeten Mizellen, die durch dem Fachmann angesicht der vorliegenden Offenbarung bekannten Verfahren hergestellt wurden, zusetzen.
Verfahren und Lipide zur Herstellung von Liposomen und Mizellen werden in der US-Patentschrift 5 466 438 und den dort zitierten Literaturstellen diskutiert.
Bei den hier verwendeten Konjugaten aus Texaphyrin und lipophilem Molekül handelt es sich um ein aromatisches fünfzähniges expandiertes Porphyrinanalogon mit daran befindlichen funktionellen Gruppen, von denen wenigstens eine ein lipophiles Molekül ist. Die Seitengruppen können die Löslichkeit oder die biologische Anreicherung verbessern oder Kupplungsstellen für zu bestimmten Stellen dirigierende Moleküle zur Verfügung stellen.
Konjugate aus Texaphyrin und lipophilem Molekül sind beispielsweise die der Struktur I oder der Struktur II:
M steht für H oder ein divalentes oder trivalentes Metallkation. Bevorzugte divalente Metallkationen sind Ca(II), Mn(II), Co(II), Ni(II), Zn(II), Cd(II), Hg(II), Fe(II), Sm(II) und UO₂(II). Bevorzugte trivalente Me tallkationen sind Mn(III), Co(III), Ni(III), Fe(III), Ho(III), Ce(III), Y(III), In(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Eu(III), Gd(III), Tb(III), Dy(III), Er(III), Tm(III), Yb(III), Lu(III), La(III), und U(III). Ganz besonders bevorzugte trivalente Metallkationen sind Lu(III) und Gd(III).
R₁–R₄, R₇ und R₈ stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Halogenaryl, Nitro, Formyl, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Hydroxyalkoxy, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Saccharid, Carboxyl, Carboxyalkyl, Carbonsäureamid, Carbonsäureamidalkyl, Amino, Aminoalkyl, ein lipophiles Molekül oder ein Kupplungsglied, dass an ein lipophiles Molekül gekuppelt ist.
R₆ und R9 sind unabhängig voneinander aus den Gruppen von R₁–R₄, R₇ und R₈ ausgewählt, mit der Maßgabe, dass das Halogen nicht für Iod steht und das Halogenalkyl nicht für Iodalkyl steht.
R₅ und R₁₀–R₁₂ stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyalkyl Alkoxy, Hydroxyalkoxy, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Carboxyalkyl, Carbonsäureamid, Carbonsäureamidalkyl, Amino, Aminoalkyl oder ein Kupplungsglied, das an ein Saccharid oder ein lipophiles Molekül gekuppelt ist. Der Ausdruck „n" steht für eine ganze Zahl mit einem Wert kleiner als oder gleich 5.
R₁₃ steht für Alkyl, Alkenyl, Oxyalkyl oder Hydroxyalkyl mit bis zu etwa 3 Kohlenstoffatomen und Rotationsflexibilität um ein erstgebundenes Kohlenstoffatom. Durch die Rotationsflexibilität ist es möglich, dass der Rest der Gruppe außerhalb der Ebene des Texaphyrins liegt. Ein bevorzugtes Alkenyl beispielsweise ist somit CH₂-CH=CH₂. Der Substituent am Pyrrol-Stickstoff ist ganz besonders bevorzugt eine Methylgruppe. Ein Texaphyrin mit einer an einem Ring-Stickstoff gebundenen Methylgruppe ist in der US-Patenschrift 5 457 183 beschrieben.
In diesem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül steht wenigstens einer der reste R₁–R₁₂ für ein lipophiles Molekül oder ein Kupplungsglied zu einem lipophilen Molekül. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht wenigstens einer der Reste R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₈ für ein lipophiles Molekül, besonders bevorzugt Östradiol oder Cholesterin, oder ein an Östradiol oder Cholesterin gekuppeltes Kupplungsglied. Bei einer für die vorliegende Erfindung bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül um das hier als 1_A oder 1_B abgebildete Konjugat.
Die Texaphyrine der vorliegenden Konjugate können metallfrei oder in einem Komplex mit einem Metall vorliegen. Übereinkunftsgemäß werden divalente und trivalente Metallkomplexe von Texaphyrinen mit einer formalen Ladung n+ gezeigt, wobei n=1 bzw. 2. Der Wert „n" ist typischerweise eine ganze Zahl kleiner als oder gleich 5; dem Fachmann wäre jedoch angesichts der vorliegenden Offenbahrung klar, dass sich der Wert von n ändern würde, wenn an den Substituenten R₁–R₁₂ Ladungen vorhanden sind.
Für den Fachmann versteht sich, dass Komplexe aus Texaphyrin und Metall einen oder mehrere zusätzliche Liganden aufweisen, die für eine Neutralisierung der Ladung und/oder eine koordinative Absättigung des Metallions sorgen. Zu diesen Liganden zählen unter anderem Chlorid, Nitrat, Acetat, Cholat und Hydroxid.
Photosensible Texaphyrine werden für die PDT verwendet. Bei einem photosensiblen Texaphyrin kann es sich um eine freie Texaphyrinbase oder um ein mit einem diamagnetischen Metall metalliertes Texaphyrin handeln. Der Ausdruck „photosensibel" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, dass beim Bestrahlen mit mit dem Absorptionsprofil des Texaphyrins assoziiertem Licht das Texaphyrin die Bildung von zytotoxischen Sauerstoffprodukten bewirkt. Bei den zytotoxischen Sauerstoffprodukten kann es sich um Sinqulett-Sauerstoff, Hydroxylradikale, Superoxid, Hydroperoxylradikale oder dergleichen handeln. Bei dem photosensiblen Texaphyrin kann es sich um ein Texaphyrin-Metallkomplex handeln, und in diesem Ausführungsbeispiel ist das Metall M ein diamagnetisches Metallkation, und das diamagnetische Metallkation ist vorzugsweise Lu(III), La(III), In(III), Y(III), Zn(II) oder Cd(II). Ein besonders bevorzugtes diamagnetisches Metallkation ist Lu(III).
Repräsentative Beispiele für Alkane, die sich als Alkylgruppensubstituenten der vorliegenden Erfindung eignen, schließen Methan, Ethan, geradkettige, verzweigte oder cyclische Isomere von Propan, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan ein, wobei Methan, Ethan und Propan bevorzugt sind. In der vorliegenden Erfindung werden Alkylgruppen mit bis zu etwa dreißig oder bis zu etwa fünfzig Kohlenstoffstatomen in Betracht gezogen. Repräsentative Beispiele für substituierte Alkylreste schließen Alkylreste ein, die durch zwei oder mehr wie hier beschriebene funktionelle Gruppen substituiert sind.
Repräsentative Beispiele für Alkene, die sich als Alkenylgruppensubstituenten eignen, schließen Ethen und geradkettige, verzweigte oder cyclische Isomere von Pro pen, Buten, Penten, Hexen, Hepten, Octen, Nonen und Decen ein, wobei Ethen und Propen bevorzugt sind. In der vorliegenden Erfindung werden Alkenylgruppen mit bis zu etwa dreißig oder fünfzig Kohlenstoffatomen und bis zu etwa fünf Doppelbindungen oder mehr, vorzugsweise bis zu etwa drei Doppelbindungen, in Betracht gezogen.
Repräsentative Beispiele für Alkine, die sich als Alkinylgruppensubstituenten eignen, schließen Ethin und geradkettige, verzweigte oder cyclische Isomere von Propin, Butin, Pentin, Hexin, Heptin, Octin, Nonin und Decin ein, wobei Ethin und Propin bevorzugt sind. In der vorliegenden Erfindung werden Alkinylgruppen mit bis zu etwa dreißig oder bis zu etwa fünfzig Kohlenstoffatomen und bis zu etwa fünf oder bis zu etwa drei Dreifachbindungen, in Betracht gezogen.
Beim Aryl kann es sich um eine Verbindung handeln, deren Moleküle die für Benzol, Naphthalin, Phenanthren, Anthracen und dergleichen typische Ringstruktur aufweisen, d.h. entweder den 6-Kohlenstoff-Ring von Benzol oder die kondensierten 6-Kohlenstoff-Ringe der anderen aromatischen Derivate. Bei der Arylgruppe kann es sich beispielsweise um Phenyl oder Naphthyl handeln, und der Ausdruck schließt, so wie er hier verwendet wird, sowohl unsubstituierte Aryle als auch Aryle mit einem oder mehreren Nitro-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Hydroxyl-, Oxyalkyl- oder Halogensubstituenten ein. In diesem Fall kann der Substituent am Phenyl bzw. Naphthyl in einem Syntheseschritt nach dem Kondensationsschritt, bei dem der Makrocyclus gebildet wird, eingeführt werden.
Von den Halogensubstituenten werden bei der Durchführung der Erfindung Chlor, Brom, Fluor und Iod in Betracht gezogen, wobei für R₆ und R₉ Iod ausgenommen ist. R₆ und R₉ können Chlor-, Brom- oder Fluorsubstituenten aufweisen. Repräsentative Beispiele für in der vorliegenden Erfindung verwendete Halogenalkylreste schließen Halogenide von Methan, Ethan, Propan, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan ein, wobei Halogenide, vorzugsweise Chloride oder Bromide, von Methan, Ethan und Propan bevorzugt sind.
„Hydroxyalkyl" bedeutet Alkohole von Alkylgruppen. Bevorzugt sind Hydroxyalkylgruppen mit einem bis zwanzig, besonders bevorzugt einem bis zehn, Hydroxylresten.
„Hydroxyalkyl" soll Glykole und Polyglykole, Diole von Alkylresten, wobei Diole von C_1–10-Alkylresten bevorzugt und Diole von C_1–3-Alkylresten besonders bevorzugt sind, und Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Polybutylenglykol sowie Polyalkylenglykole mit Kombinationen von Ethylen, Propylen und Butylen einschließen.
Repräsentative Beispiele für Oxyalkylreste schließen die hier beschriebenen Alkylgruppen mit Etherbindungen ein. „Oxyalkyl" soll Polyether mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen einschließen. Die Anzahl sich wiederholender Oxyalkylreste in einem Substituenten kann bis zu 200 betragen und ist vorzugsweise 1–20, besonders bevorzugt 1–10 und ganz besonders bevorzugt 1–5. Ein bevorzugter Oxyalkylrest ist O(CH₂CH₂O )_xCH₃, wobei x = 1-100, vorzugsweise 1–10 und besonders bevorzugt 1–5.
„Oxyhydroxyalkyl" bedeutet Alkylgruppen mit Ether- oder Esterbindungen, Hydroxylgruppen, substituierten Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, substituierten Carboxylgruppen oder dergleichen.
Repräsentative Beispiele für Thioalkylresten schließen Thiole von Ethan, Thiole von geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Isomeren von Propan, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan ein, wobei Thiole von Ethan (Ethanthiol, C₂H₅SH) oder Propan (Propanthiol, C₃H₇SH) bevorzugt sind. Sulfatsubstituierte Alkylreste schließen wie oben beschriebene Alkylreste ein, die durch eine oder mehrere Sulfatgruppen substituiert sind, wobei Diethylsulfat (( C₂H₅ )₂SO₄) ein repräsentatives Beispiel ist.
Repräsentative Beispiele für Phosphatreste schließen Phosphat- oder Polyphosphatgruppen ein. Repräsentative Beispiele für phosphatsubstituierte Alkylreste schließen wie oben beschriebene Alkylreste ein, die durch eine oder mehrere Phosphat- oder Polyphosphatgruppen substituiert sind. Repräsentative Beispiele für phosphonatsubstituierte Alkylreste schließen wie oben beschriebene Alkylreste ein, die durch eine oder mehrere Phosphonatgruppen substituiert sind.
Repräsentative Beispiele für Carboxylgruppen schließen Carbonsäuren der oben beschriebenen Alkylreste sowie Arylcarbonsäuren wie Benzoesäure ein. Repräsentative Beispiele für Carbonsäureamide schließen primäre Carbonsäureamide (CONH₂), sekundäre (CONHR') und tertiäre (CONR'R") Carbonsäureamide ein, wobei R' und R" jeweils für wie hier beschriebene funktionelle Gruppen stehen.
Repräsentative Beispiele für brauchbare Amine schließen primäre, sekundäre oder tertiäre Amine eines wie oben beschriebenen Alkylrests ein.
„Carbonsäureamidalkyl" bedeutet Alkylgruppen mit sekundären oder tertiären Amidbindungen oder dergleichen. „Carboxyalkyl" bedeutet Alkylgruppen mit Hydroxylgrup pen, carboxyl- oder amidsubstituierte Ether, Esterbindungen, tertiäre Amidbindungen, die sich nicht unmittelbar am Ether befinden, oder dergleichen.
Der Ausdruck „Saccharid" schließt oxidiertes, reduziertes oder substituiertes Saccharid, Hexosen wie D-Glucose, D-Mannose oder D-Galactose, Pentosen wie D-Ribose oder D-Arabinose, Ketosen wie D-Ribulose oder D-Fruktose, Disaccharide wie Saccharose, Lactose oder Maltose, Derivate wie Acetale, Amine und phosphorylierte Zucker, Oligosaccharide sowie offenkettige Formen verschiedener Zucker und dergleichen ein. Beispiele für aminderivatisierte Zucker sind Galactosamin, Glucosamin, Sialylsäure und D-Glucaminderivate wie 1-Amino-1desoxysorbit.
Ein Kupplungsglied kann als Bindeglied beschrieben werden, d.h. das bei der Reaktion einer reaktiven Gruppe, die so beschaffen ist, dass sie sich kovalent an ein anderes Molekül in einer gewissen Entfernung vom Texaphyrin-Makrocyclus bindet, gebildete kovalente Produkt. Beispielhafte Binde- bzw. Kupplungsglieder sind kovalente Amid-, Amin-, Disulfid-, Thioether-, Ether-, Polyether-, Ester- oder Phosphatbindungen. Die PCT-Publikation WO 94/29316 stellt Synthesen von Texaphyrinkonjugaten mit diesen Arten von Bindungen bzw. Kupplungsgliedern bereit.
Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind Konjugate und anhängige Gruppen kovalent über eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Stickstoff-, Kohlenstoff-Schwefel- oder eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung, besonders bevorzugt eine Kohlenstoff-Sauerstoff- oder eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung, an das Texaphyrin gebunden.
Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugte Funktionalisierungen für die Texaphyrine I bzw. II sind: wenn R₆ und R₉ nicht für Wasserstoff stehen, dann stehen R₅ und R₁₀ für Wasserstoff oder Methyl, und wenn R₅ und R₁₀ nicht für Wasserstoff stehen, dann stehen R₆ und R₉ für Wasserstoff, Hydroxyl oder Halogen mit Ausnahme von Iod. Andere bevorzugte Funktionalisierungen sind die, bei denen, wenn R₆ und R₉ für Wasserstoff stehen, R₅, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Phenyl, niederes Alkyl oder niederes Hydroxyalkyl stehen. Bei dem niederen Alkyl handelt es sich vorzugsweise um Methyl oder Ethyl, besonders bevorzugt um Methyl. Das niedere Hydroxyalkyl hat vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffe und 1 bis 4 Hydroxygruppen und ist besonders bevorzugt 3-Hydroxypropyl. Das Phenyl kann substituiert oder unsubstituiert sein.
Bei einem in der vorliegenden Erfindung bevorzugten Texaphyrin I oder II steht R₁ für CH₂CH₃ oder (CH₂)CH₂OH, R₂ und R₃ stehen für CH₂CH₃, R₄ steht für CH₃, R₅, R₆ und R₉-R₁₂ stehen für H, R₈ steht für ein lipophiles Molekül oder ein Kupplungsglied, das an ein lipophiles Molekül gekuppelt ist, und R₇ steht für H, OH, OCH₃ oder O(CH₂CH₂O)_xCH₃, wobei x für 1–10 und vorzugsweise für 1-5, besonders bevorzugt für 3, steht. Vorzugsweise steht R₈ für Östradiol oder Cholesterin oder ein an Östradiol oder Cholesterin gekuppeltes Kupplungsglied.
Ein an ein lipophiles Molekül gekuppeltes Kupplungsglied kann weiterhin als O(CH₂CH₂O)_m- , wobei m für 1–10 und vorzugsweise für 1-5 steht, oder als O(CH₂)_nCO-, wobei n für 1–10 und vorzugsweise für 1–3 steht, beschrieben werden.
Für die vorliegende Erfindung bevorzugte Konjugate aus Texaphyrin und lipophilem Molekül, T2BET-Östradiol-Konjugate, werden als 1_A und 1_B bereitgestellt.
„T2" bezieht sich auf zwei Hydroxylgruppen am Tripyrranteil des Texaphyrins, „BET" bezieht sich auf die Ethoxy-R-Gruppen am Benzolteil des Moleküls, und das lipophile Molekül dieses Konjugats ist Östradiol. Die Synthese dieses Konjugats findet sich in Beispiel 1.
Bei anderen für die vorliegende Erfindung bevorzugten Texaphyrinverbindungen I oder II sind R₁–R₁₂ wie in den Tabellen A und B für die Texaphyrine A1–A108 definiert, und M ist wie oben definiert. Die aufgeführten Texaphyrine sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, jedoch ist die Erfindung nicht hierauf beschränkt.
Ein Fachmann für organische Synthese kann angesichts der vorliegenden Beschreibung und der Beschreibungen der angeführten Patente, Anmeldungen und Veröffentlichungen die in Rede stehende grundlegende Synthesechemie zur Herstellung von Texaphyrinen mit verschiedenen Substituenten ausweiten und verfeinern. So können beispielsweise polyhydroxylierte Gruppen mit Polyether-Bindungen, Saccharidsubstituenten, wobei das Saccharid über eine acetalähnliche glycosidische Bindung angebunden ist, ein Oligosaccharid oder ein Polysaccharid auf ähnliche Weise an ein Texaphyrin gebunden werden. Ein doppelt carboxyliertes Texaphyrin, wobei die Carboxylgruppen über aromatische Ether oder funktionalisierte Alkylsubstituenten an den Texaphyrinkern gebunden sind, kann in verschiedene veresterte Produkte umgewandelt werden, wobei die Esterbindungen zur Anbindung weiterer hydroxylhaltiger Substituenten genutzt werden. Polyhydroxylierte Texaphyrinderivate können unter Verwendung sekundärer Amidbindungen synthetisiert werden. Die Saccharidanteile können über Amidbindungen angebunden werden. Polyhydroxylierte Texaphyrinderivate mit verzweigtkettigen Polyhydroxyl- (Polyol)-Untereinheiten können über Arylether- oder -esterbindungen an den Texaphyrinkern angebunden werden.
Die Behandlung carboxylierter Texaphyrine mit Thionylchlorid oder p-Nitrophenolacetat kann aktivierte Acylarten hervorbringen, die zur Anbindung an monoklonale Antikörper oder andere interessante Biomoleküle geeignet sind. Zur Durchführung der Konjugation können übliche In-situ-Kupplungsverfahren (beispielsweise 1,1'-Carbonyldiimidazol) verwendet werden.
Substituenten in den R₆- und R₉-Stellungen des B-Teils (Benzolring) des Makrocyclus werden durch ihre Anbindung an das ortho-Phenylendiamin in der 3- und 6-Stellung des Moleküls in den Makrocyclus eingebaut. Substituenten in den R₅- und R₁₀-Stellungen des T-Teils (Tripyrran) des Makrocyclus werden durch entsprechende Funktionalisierung der Carboxylgruppen in den 5-Stellungen des Tripyrrans in einem Syntheseschritt vor der Kondensation mit einem substituierten ortho-Phenylendiamin eingebaut. Nach dem Kondensationsschritt unter Ausbildung des Texaphyrinmakrocyclus kann man ein lipophiles Molekül einführen.
Lipophile Moleküle mit Aminfunktionalität werden nach der Synthese mit einem aktivierten Carbonsäureesterderivat eines Texaphyrins modifiziert. In Gegenwart einer Lewis-Säure wie FeBr₃ reagiert ein bromidderivatisiertes Texaphyrin mit einer Hydroxylgruppe eines lipophilen Moleküls unter Ausbildung einer Etherbrücke zwischen dem Texaphyrinbindeglied und dem lipophilen Molekül. Ein mit einem lipophilen Molekül gekuppeltes Kupplungsglied kann weiter als O(CH₂CH₂O)_m-, wobei m für 1–10 und vorzugsweise für 1–5 steht, oder als O(CH₂)_nCO-, wobei n für 1–10 und vorzugsweise für 1–3 steht, beschrieben werden.
Konjugate aus Texaphyrin und lipophilem Molekül lassen sich nach den hier beschriebenen Verfahren und nach bekannten und im Stand der Technik wie in den hier angeführten US-Patentschriften und anhängigen Anmeldungen beschriebenen Verfahren darstellen. Texaphyrine weisen eine Reihe von Eigenschaften auf, aufgrund derer sie für eine Verwendung in Anwendungen zur bildgebenden Darstellung und für photodynamische Behandlungsprotokolle geeignet sind, beispielsweise: Texaphyrine verfügen über eine inhärente biologische Anreicherung – sie reichern sich in Tumoren, Atheromen oder der Leber an; sie absorbieren im physiologisch wichtigen Bereich von 700–900 nm; sie chelatisieren Metallkationen, die sonst toxisch wären, in stabiler Weise; und sie sind ausreichend nicht-toxisch für eine in-vivo-Anwendung.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Komplexen aus Texaphyrin und lipophilem Molekül oder aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel in der Augendiagnose und -therapie, insbesondere für diagnostische Angiogramme, und für die photodynamische Therapie von Augenleiden, die durch ein anormales Gefäßsystem gekennzeichnet sind.
„Anormales Gefäßsystem" bezeichnet, so wie der Begriff hier verwendet wird, ein unerwünschtes Gefäßsystem, die Gefäßneubildung, unregelmäßige, verstopfte, leckende oder entzündete Augengefäße oder Augengewebe, entzündliche Augenmembranen, anormale Zustände, die mit der Leitung von Flüssigkeiten in der Augenregion in Zusammenhang stehen, insbesondere Blutgefäße, und schließt Leiden wie Makuladegeneration, Glaukom, Gefäßneubildung in der Linse oder der Netzhaut bei diabetischer Retinopathie, Pannus, bei dem es sich um ein anormales oberflächliches Gefäßsystem der Kornhaut oder Bindehaut handelt, Pterygium, bei dem es sich um eine Verdickung der Tunica conjunctiva bulbaris auf der Hornhaut handelt, Leiden mit Gefäßneubildung in der Netzhaut oder Aderhaut, das okuläre Histoplasmose-Syndrom, Myopie, entzündliche Augenkrankheiten, zentrale seröse Retinopathie, subretinale neovaskuläre Membran oder durch Neoplasma wie z.B. Melanom oder retinales Blastom induzierte Gefäßneubildung, ein.
Das „Gefäßsystem beobachten" bedeutet, so wie der Begriff hier verwendet wird, dass man eine bildgebende Darstellung durchführt und Informationen aus einem Angiogramm, bei dem fluoreszente Texaphyrine verwendet werden, aus einer Röntgenaufnahme oder aus einem Magnetresonanztomogramm gewinnt, beispielsweise zur Bewertung des Augenzustands. Der Zustand des Auges kann normal sein oder beispielsweise auslaufende oder verstopfte Gefäße umfassen. „Auge" bzw. „Augen-" schließt, so wie der Begriff hier verwendet wird, das Auge, das darunterliegende und in der Nähe befindliche Gewebe und verwandte Ge webe in der Nähe und um das Auge ein, die die Funktion des Auges beeinflussen.
Die Parameter für eine erfolgreiche Angiographie und eine wirksame Behandlung bei den erfindungsgemäßen PDT-Verfahren sind miteinander verknüpft. Aus diesem Grund wird die Dosis an andere Parameter angepasst, beispielsweise Strahlungsfluss, Bestrahlungsstärke, die Dauer der Bestrahlung während der photodynamischen Therapie und die zwischen der Verabreichung der Dosis und der therapeutischen Bestrahlung verstrichene Zeitspanne. Derartige Parameter sollten so angepasst werden, dass eine erhebliche Schädigung des anormen vaskulären Gewebes ohne signifikante Schädigung des umgebenden Gewebes erreicht wird und andererseits die Beobachtung der Blutgefäße des Auges ohne erhebliche Schädigung des umgebenden Gewebes ermöglicht wird. Die verwendete Dosis an Texaphyrin aus dem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. dem Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel liegt typischerweise im Bereich von etwa 0,1 μmol/kg/Behandlung bis etwa 50 μmol/kg/Behandlung und vorzugsweise von etwa 0,10 bis 20 μmol/kg/Behandlung. Weiterhin kann sich der zur Behandlung von neovaskulärem Gewebe erforderliche Strahlungsfluss mit einem Senken der Texaphyrindosis ändern.
Nach Verabreichung des photosensibilisierenden Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. des Komplexes aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel wird das zu behandelnde Gewebe im Auge mit einer Wellenlänge bestrahlt, die der maximalen Extinktion des Texaphyrins entspricht, gewöhnlich entweder etwa 400–500 nm oder etwa 700–800 nm. Bei der Lichtquelle kann es sich um einen Laser, eine Leuchtdiode oder gefiltertes Licht von beispielsweise einer Xenon-Lampe handeln; das Licht kann im Wellenlängenbereich von etwa 400–900 nm liegen, vorzugsweise etwa 400–500 nm oder 700–800 nm, besonders bevorzugt etwa 730–770 nm, und das Licht kann topisch, endoskopisch oder interstitiell (beispielsweise mittels einer Glasfasersonde) abgegeben werden. Vorzugsweise wird das Licht von einem Spaltlampensystem abgegeben. Eine Wellenlänge in diesem Bereich ist insbesondere bevorzugt, da Blut und retinales Pigmentepithel (RPE) bei längeren Wellenlängen relativ durchlässig sind und die Behandlung somit zu weniger Gewebeschädigungen und besserer Lichtdurchdringung führt. Der Strahlungsfluss und die Bestrahlungsstärke während der Strahlentherapie können je nach Gewebeart, Tiefe des Zielgewebes und der Menge darüber befindlicher Fluide oder Blut schwanken.
Der optimale Zeitraum zwischen der Verabreichung des Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. des Komplexes aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel und Lichtbehandlung ist unterschiedlich und hängt von der Art der Verabreichung, der Form der Verabreichung und der Art des Zielgewebes ab. Ein Zeitraum von Minuten bis ungefähr 5 h sollte beispielsweise für vaskuläres Gewebe angemessen sein. Die Dauer der Lichtbestrahlung nach der Verabreichung kann als eine Möglichkeit, die Selektivität der Behandlung zu optimieren und damit die Schädigung von anderen Strukturen als den Zielgeweben zu minimieren, von Bedeutung sein. Beim Menschen wird angenommen, dass das Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. der Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel die Gefäßsysteme der Netzhaut und der Aderhaut Sekunden nach der Verabreichung erreicht und je nach verabreichter Dosis eine Persistenz von Minuten bis Stunden hat. Eine Behandlung innerhalb der ersten fünf Minuten nach der Verabreichung sollte im allgemeinen durch fokussiertes Licht aktiviert werden. Zu späteren Zeitpunkten kann man sowohl eine Bestrahlung mit fokussiertem als auch mit nichtfokussiertem Licht anwenden.
Darüber hinaus kann das Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. der Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel zur Beobachtung des Zustands von Blutgefäßen als alleiniges Mittel oder zusammen mit anderen Farbstoffen wie Fluorescein oder Indocyanin-Grün benutzt werden, um den Fortschritt der Zerstörung von abnormem vaskulärem Gewebe zu verfolgen. In solchen angiographischen Systemen wird eine ausreichende Menge an Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel verabreicht, um bei Erregung durch Licht, vorzugsweise Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 430–480 nm, eine beobachtbare Fluoreszenzemission zu erzeugen. Bilder werden durch Beleuchten des Auges mit Licht im Bereich der Erregungswellenlänge und Erfassen der Menge fluoreszierenden Lichts, das mit der Emissionswellenlänge von ungefähr 730–760 nm, emittiert wird, erfasst. Ein bevorzugtes Gerät, das Licht im Bereich 430–760 nm sowohl aussendet als auch empfängt, ist die TOPCON^TM 50VT-Kamera im Ophthalmic Imaging System (Ophthalmic Imaging System Inc., 221 Lathrop Way, Suite 1, Sacramento CA, USA).
Zum Sammeln des emittierten, fluoreszierenden Lichts, zur Digitalisierung der Daten und zum Speichern zur späteren Darstellung auf einem Bildschirm, als Ausdruck auf Papier oder in Verbindung mit einem anderen bildgebenden System wird eine Kamera verwendet. Wenn zusätzliche Farbstoffe wie Fluorescein in Kombination mit dem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bzw. dem Komplex aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Vesikel eingesetzt werden, kann ein Filmaufnahmegerät verwendet werden; bevorzugt wird eine CCD-Kamera (chargecoupled device), da diese Emissionen höherer Wellenlängen erfassen kann. Auf diese Weise können genauere Informationen über das Muster und das Ausmaß der vaskulären Strukturen in unterschiedlichen okulären Gewebeschichten erhalten werden, was den Nachweis von "Lecks" ermöglicht, die charakteristisch für neue oder entzündete Blutgefäße sind. Außerdem wird die Verwendung einer Kamera bevorzugt, mit der die Erregungsstrahlung erzeugt werden kann, wobei durch passende Filter nur Licht im Bereich der gewünschten Erregungswellenlänge abgegeben wird, und die dann emittiertes, fluoreszierendes Licht mit einem Empfangsgerät erfasst, wobei mittels passender Filter nur Licht im Bereich der gewünschten Emissionswellenlänge erfasst wird.
Für die vorstehend beschriebenen Verwendungen sind die Komplexe aus Texaphyrin, lipophilem Molekül und Zelle bzw. Liposom als pharmazeutische Zubereitungen vorgesehen. Eine pharmazeutische Zubereitung eines solchen Komplexes kann alleine oder in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern entweder in einer einzigen Dosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Als pharmazeutische Träger eignen sich unter anderem inerte feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wässrige Lösungen und verschiedene organische Lösungsmittel. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die durch Kombinieren eines erfindungsgemäßen Komplexes mit den pharmazeutisch verträglichen Trägern gebildet werden, können anschließend problemlos in einer Vielzahl von Dosierformen wie z.B. als Injektionslösungen verabreicht werden.
Zur parenteralen Verabreichung kann man Suspensionen des liposomalen Komplexes in Sesam- oder Erdnussöl wässrigem Propylenglykol oder in steriler wässriger Lösung verwenden. Solche wässrigen Lösungen sollten geeigneterweise falls erforderlich gepuffert sein, und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zuerst mit ausreichend Kochsalzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen eignen sich insbesondere zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen oder intraperitonealen Verabreichung. In diesem Zusammenhang sind dem Fachmann angesichts der vorliegenden Beschreibung sterile, wässrige Medien, die zum Einsatz kommen können, bekannt. Eine intravenöse Verabreichung der erfindungsgemäß beladenen roten oder weißen Blutkörperchenkomplexe wird als am meisten bevorzugte Verabreichungsmethode in Betracht gezogen.
Zur Entnahme von Zellen aus einem Patienten, der Beladung mit einem sterilen Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül und der Wiedereinführung von beladenen Zellen in denselben Patienten werden sterile Verfahren angewendet. Man kann einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger verwenden, bei dem es sich um ein Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium handeln kann, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthält. Die korrekte Fluidität kann beispielsweise durch den Einsatz einer Beschichtung wie Lecithin und durch Einsatz von oberflächenaktiven Mitteln bewahrt werden. Die Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, verhindert werden. In vielen Fällen ist der Zusatz von isotonischen Mitteln, beispielsweise Zuckern, wie Mannitol oder Dextrose, oder Natriumchlorid, bevorzugt. Ein besonders bevorzugtes isotonisches Mittel ist eine Mannitlösung mit einer Konzentration von ungefähr 2–8% und insbesondere bevorzugt einer Konzentration von ungefähr 5%.
Sterile Konjugatlösungen werden durch Einbringen der erforderlichen Menge an aktiven Verbindungen in das geeignete Lösungsmittel zusammen mit, je nach Bedarf, unterschiedlichen vorstehend angegebenen weiteren Bestandteilen und anschließendes steriles Filtrieren hergestellt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in ein steriles Vehikel hergestellt, das das zugrundeliegende Dispersionsmedium und die erforderlichen weiteren Bestandteile gemäß den vorstehenden Angaben enthält. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen Injektionslösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungsverfahren, mit denen ein Pulver des aktiven Bestandteils sowie jedes weiteren gewünschten Bestandteils aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon erzeugt wird.
Der Ausdruck "pharmazeutisch unbedenklicher Träger" schließt, wie er hier verwendet wird, jedes einzelne Lösungsmittel, Dispersionsmedium, Gleitmittel, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische Mittel und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist dem Fachmann gut bekannt. Abgesehen von einer Unverträglichkeit eines herkömmlichen Mediums oder Mittels mit dem aktiven Bestandteil ist dessen Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen denkbar. Es können auch zusätzliche aktive Bestandteile in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Bei den Fluoreszenznachweisverfahren der vorliegenden Erfindung verabreicht man eine Menge an Texaphyrin, die ausreicht, um bei Anregung mit Licht, vorzugsweise Licht einer Wellenlänge im Bereich von 430–480 nm, eine beobachtbare Fluoreszenzemission zu bewirken. Durch Bestrahlen mit Licht im Anregungswellenlängenbereich und Detektion der Menge an bei der Emissionswellenlänge von vorzugsweise etwa 730–760 nm emittiertem Fluoreszenzlicht werden Bilder aufgenommen. Die Dosis lässt sich ohne übermäßigen experimentellen Aufwand durch im Stand der Technik bzw. hier beschriebene Methoden bestimmen.
Die in den erfindungsgemäßen photodynamischen Verfahren zu verwendenden Komplexe werden in einer pharmazeutisch wirksamen Menge verabreicht. "Pharmazeutisch wirksam" bedeutet eine Dosis, die bei Einwirkung von Licht die beladenen Vesikel zum Aufplatzen bringt. Die genaue Dosis schwankt und ist von dem jeweils gewählten Komplex, dem zu befolgenden Dosierschema, der Bestrahlungsdauer und der zeitlichen Bemessung der Verabreichung abhängig. Die Dosis lässt sich ohne übermäßigen experimentellen Aufwand durch im Stand der Technik bzw. hier beschriebene Methoden bestimmen.
In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung geschildert. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die Techniken, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben sind, Techniken darstellen, die von den Erfindern im Hinblick darauf entwickelt wurden, dass sie bei der praktischen Umsetzung der Erfindung erfolgreich sind, weswegen sie als bevorzugte Ausführungsweisen bei der Umsetzung betrachtet werden können.
BEISPIEL 1
Synthese eines Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül
Im vorliegenden Beispiel wird die Synthese eines Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül geschildert, wobei es sich bei dem lipophilen Molekül um Östradiol handelt. Der Syntheseweg ist in Schema A gezeigt.
Penta(ethylenglykol)diiodid (2). Penta(ethylenglykol)ditosylat 1 (25 g, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI), Natriumiodid (17,15 g, 2,5 Äq.) und Aceton (etwa 500 ml) wurden zusammengegeben und 4 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die festen Bestandteile abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Von den vereinigten Filtraten wurde das Aceton abgezogen und durch Rotationsverdampfen gewaschen. Der so erhaltene Feststoff wurde in CHCl₃ (250 ml) gelöst und mit Wasser (250 ml), einer 5%igen wässrigen Na₂S₂O₃-Lösung (2 × 250 ml) und Wasser (250 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, und der so erhaltene Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wodurch man das Diiodid 2 (19,164 g, 91,3%) erhielt.
3-(2-(Ethoxy-2-(ethoxy-2-(ethoxy-(2-iodethoxy))))ethoxy-l7âhydroxy-3-oxy-1,3,5(10)-östratrien (4). Das Diiodid 2 (12,50 g), ß-Östradiol 3 (2,500 g, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI), Kaliumcarbonat (1,500 g) und wasserfreies Acetonitril (250 ml) wurden in einem Kolben zusammengegeben. Die Reaktionsmischung wurde 9 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (125 ml) gelöst und mit Wasser gewaschen, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 0,5 bis 1,0% McOH in CHCl₃ als Laufmittel aufgereinigt. Fraktionen, die ausschließlich Produkt enthielten, wurden vereinigt, das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet, wodurch man das Iodid 4 (2,010 g, 36,4%) erhielt.
Dinitrobenzol-Natriumsalz (5), Verfahren 1. Das Dinitrobenzol-Natriumsalz 5 wurde dargestellt, indem man 4,5-Dinitrokatechol (5 g, 0,025 mol) und Triethylenglykolmonomethylether-monotosylat (11,9 g, 0,037 mol, 1,5 Äq.) in Methanol mit K₂CO₃ (5,18 g, 0,037 mol, 1,5 Äq.) umsetzte, wobei über Nacht unter einer Stickstoffatmosphäre auf Rückfluss erhitzt wurde. Der Ansatz wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde dann in 250 ml 1M NaOH resuspendiert, worauf Chloroform zugegeben wurde. Die untere Chloroformschicht plus Niederschlag wurden abgenommen, und der orangefarbene feste Niederschlag wurde abfiltriert und im Hochvakuum über Nacht vakuumgetrocknet, wodurch man das hellorangefarbene Produkt 5 in einer Ausbeute von 81% erhielt.
Dinitrobenzol-Natriumsalz (5), Verfahren 2. Ein alternatives Verfahren zur Synthese des Dinitrobenzol-Natriumsalzes ist wie folgt. 4,5-Dinitrokatechol (10 g, 0,050 mol) und K₂CO₃ (10,37 g, 0,075 mol) wurden in einem trockenen 250-ml-Rundkolben unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem Methanol (120 ml) zusammengegeben. Die orangefarbene Mischung wurde mit Triethylenglykolmonomethylethertosylat (23,85 g, 0,075 mol) versetzt, und die so erhaltene Suspension wurde auf Rückfluss erhitzt. Die Umsetzung wurde gemäß DC als beendet angesehen, wenn der Ausgangskatechol verschwunden war und sich das leuchtend gelbe monoalkylierte Zwischenprodukt gebildet hatte. Daher wurde die rote Suspension nach 16 h auf 0°C abgekühlt. Die so erhaltene Suspension wurde filtriert und gründlich mit kaltem Isopropylalkohol (50 ml) und Hexan (50 ml) gewaschen. Das monoalkylierte Kaliumsalz wurde dann in 10%iger wässriger NaOH (100 ml) suspendiert, bei Raumtemperatur 15–20 min kräftig gerührt, filtriert und dann gründlich mit kaltem Isopropylalkohol (70 ml) und Hexan (50 ml) gewaschen. (Dieser Schritt dient dazu, überschüssiges K₂CO₃ und Kaliumtosylat zu entfernen). Das leuchtend orangefarbene Salz wurde im Vakuum getrocknet und lieferte 15 g (∼81%). ¹H-NMR (d6-Aceton): ausgewählte Peaks, ä 3,40 (OMe), 6,30 (ArH), 7,42 (ArH); EI-MS (M+Na⁺) 369; EI-HRMS (M+Na⁺) 369,0910 ( berechnet für C₁₃H₁₈N₂O₉Na 369, 0901 ) .
3-(2-(Ethoxy-2-(ethoxy-2-(ethoxy-(2-(1-oxy-2-(2-(ethoxy-2-(ethoxy-(2-methoxy)))ethoxy-4,5-dinitrohenzol)ethoxy))))ethoxy)-17â-hydroxy-3-oxy-1,3,5(10)- östratrien (6). Das Iodid 4 (500 mg) und das Natriumsalz von 1-Hydroxy-2-(2-(ethoxy-2-(ethoxy-(2-methoxy)))ethoxy)-4,5-dinitrobenzol 5 (336 mg, 1,1 Äq.) und Acetonitril (5 ml) wurden in einem Kolben zusammengegeben, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Kaliumcarbonat (126 mg, 1,1 Äq.) wurde zugesetzt, und es wurde weitere etwa 4 Stunden lang erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde mit CHCl₃; (etwa 25 ml) in einen Scheidetrichter überführt und mit Wasser (2 × 15 ml) gewaschen, das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand wurde über Nacht im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 2% McOH in CHCl3 als Laufmittel auf gereinigt. Die ausschließlich Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen abgezogen und der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet, wodurch man 6 als einen gelblichen Feststoff (549 mg, 80,5) erhielt. FAB: MH⁺ 821.
Unter Anwendung bekannter chemischer Verfahren für die Synthese von Texaphyrinen (siehe die hier bereits angeführten Texaphyrin-Patentschriften) wurde die Dinitroverbindung 6 durch Hydrieren bei Normaldruck mit 10% Pd-auf-Aktivkohle und 2 Äq. HCl zum Diamin 7 reduziert. Die Reduktion wurde gewöhnlich innerhalb von 1–2 h abgeschlossen. Anschließend wurde der Katalysator über eine Schicht Celite abfiltriert, die Diaminlösung wurde mit Methanol verdünnt, 1 Äquivalent Diformyltripyrran 8 wurde zugesetzt und der Ansatz wurde unter Stickstoff auf Rückfluss erhitzt. Die Reaktion setzte unmittelbar nach der Zugabe des Diformyltripyrrans ein und war gewöhnlich innerhalb von 1–3 h abgeschlossen. Protonen- und Kohlenstoff-NMR des so erhaltenen nichtaromatischen Makrocyclus 9 stimmten mit der Struktur überein. Der nichtaromatische Makrocyclus 9 wurde mit 1,5 Äq. von entweder Lutetiumacetat oder Gadoliniumacetat und 10 Äq. Triethylamin unter einer Luftatmosphäre oxidativ metallisert, wodurch man den Luteti um-Östradiol-Komplex 10 (in einer Ausbeute von 38% mit einer relativen Reinheit von 89%) bzw. den Gadolinium-Östradiol-Komplex 11 (in einer Ausbeute von 47% mit einer relativen Reinheit von 91%) erhielt.
Die Synthese des Texaphyrin-Cholesterin-Konjugats wird auf ähnliche Weise durchgeführt, wobei man anstelle von Östradiol Cholestrin einsetzt.
BEISPIEL 2
Beladen von roten Blutkörperchen mit dem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül
Im vorliegenden Beispiel werden rote Blutkörperchen mit einem Konjugat aus Texaphyrin und Östradiol beladen. Rote Blutkörperchen.(RBK) wurden nach osmotischer Behandlung erfolgreich mit dem Konjugat 11 aus Gadolinium-Texaphyrin und Östradiol („GTÖ") beladen. UV-Vis-Spektren zeigten anschließend, dass der größte Teil des Konjugats in den Zellwänden der roten Blutkörperchen enthalten war.
Für die Untersuchungen unten wurde das folgende allgemeine Verfahren angewendet: Vollblut aus Kaninchen wurde in Gegenwart von Heparin entnommen und zentrifugiert. Die Serumschicht wurde abgenommen, und die RBK wurden in Kochsalzlösung (138 mM NaCl) resuspendiert und dreimal gewaschen. Nach dem dritten Mal Waschen wurden die pelletierten RBK in hypertoner Kochsalzlösung (268 mM NaCl) resuspendiert. Die Zellen wurden vorsichtig durchmischt, ungefähr 3 Minuten lang bei Raumttemperatur gehalten und zentrifugiert. Die pelletierten RBK wurden in drei Volumina hypotoner Kochsalzlösung (110 mM NaCl) mit GTÖ resuspendiert, wodurch man den Komplex aus Gd-Texaphyrin, Östradiol und roten Blutkörperchen erhielt.

I. Bei einer ersten Untersuchung wurden 300 ml pelletierter RBK in 1,0 ml 110 mM NaCl mit 0,2 oder 0,4 mmol GTÖ resuspendiert. Die Zellen wurden vorsichtig durchmischt und ultraschallbehandelt. Nach dreimaligem Waschen wurde das Pellet des GTÖ-RBK-Komplexes (300 ml) mit Kochsalzlösung auf ein Volumen von 2,0 ml resuspendiert. Zur Bestimmung des GTÖ-Gehalts wurden 750 ml dieser 2,0 ml Lösung abgenommen, 250 ml frische Kochsalzlösung wurden zugesetzt und die optische Dichte wurde in einem Spektrophotometer abgelesen. Eine Kontrollküvette mit entsprechender Masse und Volumen an RBK wurde ähnlich behandelt, jedoch ohne GTÖ. Die O.D. der 2,0 ml Lösung betrug 0,9859, was auf eine Ausbeute von 120 mg an gesamtem GTÖ-Komplex schließen läßt (T2BET2, 732 nm, eine 15,35-mg/ml-Lösung hat eine O.D. von 0,3291).
II. Bei einer zweiten Untersuchung wurden zwei verschiedene Mengen einer Stammlösung von 2 mM GTÖ in 5% Mannit verwendet; 1,6 ml mit 4,0 ml beladenen RBK und 6,6 ml mit 5,5 ml beladenen RBK. Zur Herstellung der jeweiligen Komplexe wurden die RBK wie oben beschrieben gewaschen und die entsprechenden Volumina an RKB wurden mit hypertoner Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 50 ml resuspendiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, und Lösungen von hypotoner Kochsalzlösung mit GTÖ wurden zugesetzt, so dass das Volumen 40 ml blieb. Die Suspensionen wurden wie oben beschrieben behandelt und die letzten gewaschenen RBK wurden in einem Volumen von 15 ml mit normaler Kochsalzlösung suspendiert und für die MRI-Analyse (siehe Beispiel 3) in 100×17-mm-Röhrchen überführt (für den 1,6-ml-Ansatz 11 ml Kochsalzlösung, für den 6,6-ml-Ansatz 9,5 ml Kochsalzlösung; die Kontrolle war 5,0 ml beladene RBK und 10 ml Kochsalzlösung).
III. Bei einer weiteren Untersuchung wurden RBK, die als Injektion in Kaninchen bestimmt waren, mit GTÖ beladen. Die beladenen RBK (5,0 ml, wie beschrieben gewaschen) wurden mit hypertoner Kochsalzlösung und einem Gesamtvolumen von 40 ml an hypotoner Kochsalzlösung mit 6,0 ml GTÖ behandelt. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Zellen dreimal gewaschen und mit 2,5 ml normaler Kochsalzlösung resuspendiert. Der so erhaltene Komplex wurde für die Injektion in Kaninchen verwendet (siehe Beispiel 4).

BEISPIEL 3
In-vitro-Bilddarstellung mit dem Komplex aus GdT2BET, Östradiol und roten Blutkörperchen.
Das vorliegende Beispiel gibt die Ergebnisse der in-vitro-Magnetresonanz-Tomographie (magnetic resonance imaging, MRI) mit GTÖ-RBK-Komplex wieder.
Beladene oder resuspendiert Komplexe von roten Blutkörperchen wurden mit einem GE 0,5T Signa-Magnetic-Resonance-Imager (GE Medical Systems, Milwaukee, WI, USA) und den folgenden Parametern abgebildet: Pulssequenzen, Spinecho 350/15, Aufnahmeparameter, 20FOV, 256×256; Schnittdicke/Raum 5 mm/2,5 mm; und nex 2.
In Tabelle 2 sind die MRI-Werte mit dem GTÖ-RBK-Komplex (aus Beispiel 2, II) wiedergegeben. CuSO₄ ist ein Darstellungsstandard, der es ermöglicht, die Intensität (Helligkeit) des Signals abzuschätzen.
TABELLE 2. MRI-Werte von Komplexen aus GdT2BET, Östradiol und roten Blutkörperchen
Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden ungefähr 8,3 imol GTÖ in 5 ml beladene Zellen eingebaut
BEISPIEL 4
In-vivo-Bilddarstellung mit dem Komplex aus GdT2BET, Östradiol und roten Blutkörperchen.
Das vorliegende Beispiel veranschaulicht die in-vivo-Magnetresonanztomographie eines Tieres mit GTÖ-RBK-Komplexen. MRI-Scans zeigten eine Kontrastverstärkung von Geweben und deutlichere Angiogramme bis zu 30 min nach der Injektion.
Einem weißen New Zealand-Kaninchen (2,72 kg), dem in jeden Oberschenkel ein V2-Karzinom-Tumor eingepflanzt worden war, wurden 7 ml GTÖ-RBK-Komplex injiziert, und einem normalen weißen New Zealand-Kaninchen (3 kg) wurde ebenfalls die gleiche Menge an Komplex als Kontrolle injiziert. Das Kaninchen mit den Tumoren starb nach der Injektion von 2,5 ml Komplex. Das Kaninchen schien durch den Krebs bereits sehr krank zu sein. Das normale Kaninchen wurde vor Verabreichung des Kontrastmittels, unmittelbar nach der Injektion und 30 min nach der Injektion gescannt. Das Kaninchen wurde auf den Rücken in eine Kniespule gelegt und mit den Pfoten zuerst in das Magnetfeld geschoben. Das Kaninchen wurde betäubt und während der MRI mit einem Cocktail aus Ketamin und Rompun betäubt gehalten. Die Scan-Parameter waren wie in Beispiel 3, wobei der Aufnahmeparameter bei diesem Tierversuch 256×160 betrug und die MR-Angiogramm-Scanningmethode für die Aorta 2D TOF war.
Beim normalen Kaninchen wurden Leber und Angiogramm nach der Injektion des GTÖ-RBK-Komplexes wenigstens 30 min gut verdeutlicht.
BEISPIEL 5
Photodynamische Therapie mit mit photosensiblem Texaphyrin und lipophilem Molekül beladenen Vesikeln
Das vorliegende Beispiel veranschaulicht die lichtabhängige Lyse von beladenen Vesikeln wie roten Blutkörperchen oder Liposomen und die darauf folgende Ablagerung des Inhalts an der bestrahlten Stelle. Beim Bestrahlen mit Licht einer geeigneten Wellenlänge brechen die mit einem photosensiblen Texaphyrin beladenen Vesikel auf.
Die Wirkung von PDT mit mit photosensiblen Texaphyrinen beladenen Vesikeln ist vielfältig, da durch die biologische Anreicherung des Vesikels Spezifität gewährt wird, man aufgrund der Toxizität des Singulett-Sauerstoff-Produkts einen PDT-Effekt in der Umgebung der abgelagerten Texaphyrins sieht und, wenn in das Vesikel zusätzlich zum Texaphyrin ein therapeutisches Mittel eingebaut ist, sich das therapeutische Mittel an der Zielstelle ablagert. Auf diese Weise kann man beispielsweise ein chemotherapeutisches Arzneimittel an die Zielstelle transportieren.
Ein bevorzugtes photosensibles Texaphyrin ist Lutetium-Texaphyrin, beispielsweise die hier beschriebene Verbindung 1_B. Bei der lichtabhängigen Lyse der vorliegenden Erfindung kann das Licht eine Wellenlänge im Bereich von etwa 650–900 nm, vorzugsweise 700–800 nm und ganz besonders 730–770 m, haben.
BEISPIEL 6
Ein Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül enthaltenden Liposomen
Das vorliegende Beispiel veranschaulicht den Einbau eines Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül in Liposomen und liposomal-ähnliche Partikel Ein Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül lässt sich beispielsweise wie folgt in kleine unilamellare Liposomen einbauen. Mit Ethylenglykol und Cholesterin (Molverhältnis 8:2) konjugiertes Phosphatidylcholin aus Eiern wird in Chloroform suspendiert, und die Lösung wird mit einer 33%igen molaren Konzentration des Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül versetzt. Das Chloroform wird im Vakuum abgezogen und das getrocknete Material wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate-buffered saline, PBS) resuspendiert. Die Mischung wird in ein Cryovial gegeben und fünfmal in flüssigem Stickstoff schockgefroren und aufgetaut. Das Material wird dann unter Verwendung eines Polycarbonatfilters mit einem Porendurchmessers von 400 nm zehnmal durch einen Extruder (Lipex Biomembranes, Vancouver, B.C., Canada) extrudiert, wodurch man 400-nm-Liposomen erhält. Ein Teil der 400-nm-Liposomen wird zehnmal durch Filter mit einem Durchmesser von 100 nm extrudiert, was 100-nm-Liposomen liefert. Ein Teil der 100-nm-Liposomen wird dann zehnmal durch 15-nm-Filter extrudiert, was Liposomen einer Größe von 30 nm ergibt.
Wie oben beschrieben hergestellte Liposomen können auch mit einem Microfluidizer (Microfluidics, Newton, Mass., USA) behandelt werden. Genauer gesagt kann man die Liposomen bei einem Druck von 16 000 psi und einer Fließgeschwindigkeit von 450 ml/min zehnmal durch den Microfluidizer geben. Die so erhaltenen Liposomen sollten eine mittlere durchschnittliche Größe von 30–40 nm haben, was sich durch quasi-elastische Lichtstreuung überprüfen lässt.
Ein auf diese Weise in Liposomen eingebautes Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül kann sich physisch innerhalb des Liposomen befinden, in die Lipid-Doppelschicht des Liposoms eingebaut sein oder so eingebaut sein, dass sich ein Teil des Konjugats außerhalb des Liposoms befindet. Ein ein Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül enthaltendes Liposom kann mit Ethylenglykol stabilisiert werden, um seine Aufnahme durch phagozytische weiße Blutkörperchen zu verlangsamen.
BEISPIEL 7
Induktion der Antikörperbildung mit mit Texaphyrin und lipophilem Molekül beladenen roten Blutkörperchen oder Liposomen
Zusätzlich zu den herkömmlichen, dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie bekannten Verfahren zur Herstellung von Antikörpern mit bestimmter Bindungsspezifität kann man in einem Wirt, dem mit Texaphyrin und lipophilem Molekül beladene rote Blutkörperchen oder Liposomen verabreicht worden sind, Antikörper mit Bindungsspezifität für ein Texaphyrinmolekül induzieren. Weiterhin können, wenn die beladene Zelle weiterhin ein Immunogen enthält, auch Antikörper mit Bindungsspezifität für das Immunogen erzeugt werden.
Bei Verwendung eines photosensiblen Texaphyrins wird Licht ein solches beladenes rotes Blutkörperchen bzw. Liposom aufbrechen, wodurch dessen Inhalt in einem Wirt freigesetzt wird. Wird daraufhin der Wirt einem darin enthaltenen Immunogen ausgesetzt, so würde hierdurch die Bildung von Antikörpern gegen das Immunogen induziert werden. Geeignete Immunogenkandidaten wären unter anderem HIV-Oberflächenproteine wie beispielsweise gp120, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Dieses Verfahren wäre besonders effektiv, wenn man eine beladene Zelle von einem Tier verwendet, bei dem es sich nicht um das Tier handelt, das die Injektion erhält, beispielsweise wenn man Kaninchen mit beladenen roten Blutkörpchen aus Ziegen injiziert. Die Ziegenzellen können in diesem Fall als Adjuvans dienen.
Alle hier offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren lassen sich in Kenntnis der vorliegenden Offenbarung ohne unmäßiges Experimentieren herstellen bzw. durchführen.

Claims

Vesikelkomplex aus einem Texaphyrin und einem lipophilen Molekül, enthaltend ein mit einem Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül beladenes Vesikel.
Komplex nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Vesikelteil des Komplexes um eine biologische Zelle oder ein Liposom handelt.
Komplex nach Anspruch 2, wobei es sich bei der biologischen Zelle um ein rotes Blutkörperchen handelt.
Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem aus dem lipophilen Molekül bestehenden Teil des Komplexes um Östradiol oder Cholesterin handelt.
Komplex nach Anspruch 1, wobei der Teil des Komplexes aus Texaphyrin und lipophilem Molekül die Struktur I:
oder die Struktur II:
aufweist, wobei M für ein zweiwertiges oder dreiwertiges Metallkation steht; R₁–R₄, R₇ und R₈ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Halogenalkyl, Nitro, Formyl, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Hydroxyalkoxy, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Saccharid, Carboxy, Carboxyalkyl, Carboxyamid, Carboxyamidalkyl, Amino, Aminoalkyl, ein lipophiles Molekül oder ein mit einem lipophilen Molekül gekuppeltes Kupplungsglied stehen; R₆ und R₉ unabhängig voneinander aus den Gruppen von R₁–R₄, R₇ und R₈ ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass es sich bei dem Halogen nicht um Iodid handelt und es sich bei dem Halogenalkyl nicht um Iodalkyl handelt; R₅ und R₁₀–R₁₂ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Hydroxyalkoxy, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkenyl, Carboxyalkyl, Carboxyamid, Carboxyamidalkyl, Amino, Aminoalkyl oder ein an ein Saccharid oder ein lipophiles Molekül gekuppeltes Kupplungsglied stehen; R₁₃ für Alkyl, Alkenyl, Oxyalkyl oder Hydroxyalkyl mit bis zu etwa 3 Kohlenstoffatomen und Rotationsflexibilität um ein erstgebundenes Kohlenstoffatom steht; n für eine ganze Zahl kleiner als oder gleich 5 steht; und wobei wenigstens einer der Reste R₁–R₁₂ für ein lipophiles Molekül oder ein mit einem lipophilen Molekül gekuppeltes Kupplungsglied steht.
Komplex nach Anspruch 5, wobei das Konjugat aus Texaphyrin und lipophilem Molekül die Struktur I aufweist.
Komplex nach Anspruch 6, wobei R₁ für CH₂(CH2)₂OH steht, R₂ und R₃ für CH₂CH₃ stehen, R₄ für CH₃ steht, R₇ für O(CH₂CH₂O)₃CH₃ steht, R₈ für ein mit Östradiol gebundenes Verbindungsglied steht und R₅, R₆ und R₉–R₁₂ für H stehen; oder R₁ für CH₂(CH₂)₂OH steht, R₂ und R₃ für CH₂CH₃ stehen, R₄ für CH₃ steht, R₇ für O(CH₂CH₂O)₃CH₃ steht, R₈ für ein an Cholesterin gebundenes Verbindungsglied steht und R₅, R₆ und R₉–R₁₂ für H stehen.
Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin beladen mit einem diagnostischen Mittel, einem Mittel für die photodynamische Therapie, einem chemotherapeutischen Mittel, strahlensensibilisierenden Mittel, natürlich vorkommenden zellulären Zellinhalten, einem Immunogen oder einem therapeutischen Mittel.
Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Texaphyrin um ein Texaphyrin der Struktur I:
oder der Struktur II:
handelt, wobei M für ein zweiwertiges oder dreiwertiges Metallkation steht; R₁₃ für Alkyl, Alkenyl, Oxyalkyl oder Hydroxyalkyl mit bis zu etwa 3 Kohlenstoffatomen und Rotationsflexibilität um ein erstgebundenes Kohlenstoffatom steht; n für eine ganze Zahl kleiner als oder gleich 5 steht; und das Texaphyrin aus den Texaphyrinen A1 bis A108 ausgewählt ist, wobei R₁ bis R₁₂ wie in den folgenden Tabellen A und B definiert sind:
Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Texaphyrin um ein photosensibles Texaphyrin oder ein nachweisbares Texaphyrin handelt.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Abbildung eines Patienten, indem man dem Patienten die Zusammensetzung verabreicht und den Patienten zum Erhalt einer Abbildung einer Region im Inneren des Patienten scannt.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem nachweisbaren Texaphyrin um ein fluoreszentes Texaphyrin handelt und das Scanning durch die Beobachtung der Fluoreszenz des Texaphyrins erfolgt.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül nach Anspruch 11, wobei das nachweisbare Texaphyrin mit einem paramagnetischen Metallkation komplexiert ist und das Scanning durch Magnetic Resonance Imaging des Texaphyrins erfolgt.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül nach Anspruch 11, wobei die Abbildung von einer Blutansammlung oder einem Blutgefäßsystem ist.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Vesikelteil des Komplexes um ein rotes Blutkörperchen handelt und der Patient der Spender des roten Blutkörperchens ist.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Erzeugung eines Antikörpers mit Bindungsspezifität für ein Texaphyrin in einem Patienten durch Verabreichung der Zusammensetzung an den Patienten und der Bestrahlung der Zusammensetzung mit Licht, wobei das Texaphyrin durch die Bestrahlung mit Licht gegenüber dem Patienten exponiert wird, wodurch die Bildung eines Antikörpers mit Bindungsspezifität für Texaphyrin induziert wird.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus nachweisbarem Texaphyrin und lipophilem Molekül nach Anspruch 16, wobei der Komplex weiter mit einem Immunogen beladen ist und das Immunogen durch Bestrahlen gegenüber dem Patienten exponiert wird, wodurch die Bildung eines Antikörpers mit Bindungsspezifität für das Immunogen induziert wird.
Antikörper mit Bindungsspezifität für ein photosensibles Texaphyrinmolekül, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17.
Verwendung eines Konjugats aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bei der Herstellung eines Vesikelkomplexes aus Texaphyrin und lipophilem Molekül.
Vesikelkomplex aus Texaphyrin und lipophilem Molekül zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Vesikelkomplexes aus Texaphyrin und lipophilem Molekül bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in der Diagnose oder Behandlung eines menschlichen Patienten.
Verwendung nach Anspruch 21 oder ein Komplex nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Komplex um einen Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 10 handelt.