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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Tiermodell für Hepatitis-Virus (HV)-Infektionen,
insbesondere Hepatitis B-Virus (HBV)- und Hepatitis C-Virus (HCV)-Infektionen,
in Menschen.
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Stand der Technik
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Es
folgt eine Liste von Dokumenten aus dem Stand der Technik und solchen
Dokumenten, die einen Bezug zur nachfolgenden Beschreibung aufweisen:
- 1. Choo, Q-L., Kuo G., Weiner, A.J. Overby L.R., Bradley D.W.,
Houghton, M. 1989. Isolation of cDNA clone derived from a blood-borne
non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244:359–362.
- 2. Kuo G., Choo Q-L., Alter H.J., Gitnick G.L., Redeker A.G.,
Purcell R.H., Miyamura T., Dienstag J.L., Alter H.J. Stevenes C.E.,
Tegtmeier G.E., Bonninn F., Colombo M., Lee W-S., Kuo C., Berger
K., Shuster J.R., Overby L.R., Bradley D.W., Houghton M. 1989. An
essay for circulating antibodies to major etiologic virus of human non-A,
non-B hepatitis. Science 244:362–344.
- 3. Prince A.M., Brotman B., Huima T., Pascual D., Jaffery M.,
Inchauspe G. 1992. Immunity in hepatitis C infection. J.Infec. Dis.
165:438–443.
- 4. Shimizu Y.K., Weiner J., Rosenblatt J., Wong D.C., Shapiro
M., Popkin T., Houghton M., Alter H.J., Purcell R.H., 1990. Early
events in hepatitis C virus infection in chimpanzees. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 87:6441–6444.
- 5. Shimizu Y.K., Iwamoto A., Hijikata M., Purcell R.H., Yoshikura
H. 1992. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus
genome in a human T cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:5477–5481.
- 6. Shimizu Y.K., Purcell R.H., Yoshikura H. 1993. Correlation
between the infectivity of hepatitis C virus in vivo and its infectivity
in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:6037–6041.
- 7. Nakamura T., Good R.A., Yasumizu R:, Inoue S., Co M.M., Hamashima
Y., Ikehara S. 1986. Successful liver allografts in mice by combination
with allogeneic bone marrow transplantation. Proc. Natl. Acad. Sd.
(USA) 83: 4529–4532.
- 8. Bosma M.J., Carroll A.M. 1991. The SCID mouse mutant: Definition,
characterization, and potential uses. Annu. Rev. Immunol. 9:323–350.
- 9. Soriano H.E., Adams, R.M., Darlington G., Finegold M., Steffen
D.L., Ledley F.D. 1992. Retroviral transduction of human hepatocytes
and orthotopic engraftment in SCID mice after hepatocellular transplantation.
Trans. Proc. 24:3020–3021.
- 10. Aldrovandi G.M., Feurer G., Gao L., Jamieson B., Kristeva
M., Chef I.S.Y., Zack J.A., 1993. The SCID-hu mouse as a model for
HIV-1 infektion. Nature 363:732–736.
- 11. EP-A 438053
- 12. EP-A 517199
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Die
Nennung der vorstehend genannten Veröffentlichungen erfolgt, um
eine Einschätzung
des Standes der Technik zu ermöglichen.
Diese Nennung sollte jedoch nicht als Anzeichen dafür missgedeutet
werden, dass dieser Stand der Technik in irgendeiner Art und Weise
relevant für
die Patentfähigkeit
der in den Ansprüchen
definierten Erfindung wären.
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Die
vorgenannten Publikationen werden in dieser Beschreibung durch Nennung
ihrer Nummer aus der vorstehenden Liste gekennzeichnet.
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Hintergrund der Erfindung
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Als
Ursache für
virale Hepatitis sind fünf
verschiedene Viren identifiziert worden. Diese schließen Hepatitis-Virus
A, B, C, D und E ein. Von diesen verursachen Hepatitis B-Virus (HBV)
und Hepatitis C-Virus (HCV) die schwerwiegendsten Infektionen.
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Hepatitis
A-Virus weist einen einzigen Serotyp auf und verursacht eine sich
selbst limitierende akute Infektion. Ein hoher Prozentsatz der Bevölkerung,
fast 50%, weist Antikörper
gegen Hepatitis A im Serum auf und ist vermutlich immun gegenüber der
Krankheit. Eine Infektion mit Hepatitis A entwickelt sich nicht
weiter in eine chronische Erkrankung.
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HBV
wird mit akuter wie auch chronischer Hepatitis in Verbindung gebracht.
Die Krankheit ist in Asien endemisch, in den USA wie auch in Europa
auf dem Vormarsch. Eine chronische Lebererkrankung, die zu einer
signifikanten Erkrankungsziffer und einer ansteigenden Sterblichkeit
führt,
ist eine Folge der Infektion in 1 bis 10% der infizierten Individuen.
HBV-Infektionen werden auch mit dem Entstehen von primärem Leberkrebs korreliert.
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Vor
Kurzem wurde gezeigt, dass HCV die Hauptursache für parenteral übermittelte
non-A, non-B Hepatitis ist (1). Man schätzt, dass 0,5–1 % der
Weltbevölkerung
mit HCV infiziert ist, wobei in einigen Entwicklungsländern die
Rate auf bis zu 40% voranschreitet. Darüber hinaus entwickeln 40–60% der
neu infizierten Patienten persistierende HCV-Infektionen (2) und
sind dem Risiko ausgesetzt, akute, fulminante Hepatitis und verschiedene
chronische Lebererkrankungen (einschließlich Zirrhose, chronische
aktive Hepatitis und in einigen Fällen Leberzellkarzinom) zu
entwickeln.
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Das
Hepatitis D-Virus („Delta
Virus") ist ein
defektes RNA-Virus, das die Leber nur in Gegenwart einer aktiven
HBV-Infektion infizieren kann. Das Hepatitis E-Virus scheint ein
einzelsträngiges
RNA-Virus zu sein. Es gibt keine Erkenntnisse dahin gehend, dass
die Infektion mit Hepatitis E-Virus sich zu einer chronischen Lebererkrankung
entwickelt.
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Obwohl
HBV und HCV identifiziert und charakterisiert sind, ist die Entwicklung
neuer antiviraler Strategien durch den Mangel an geeigneten, einfachen
und niedrigpreisigen tierischen Modellsystemen stark behindert worden.
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Zur
Zeit sind die biologischen Tests auf HBV und HCV auf die experimentelle
Inokulierung von Schimpansen beschränkt (3, 4), die teuer und zahlenmäßig limitiert
sind. Zusätzlich
wurde ein in vitro-System für
die Vermehrung von HCV in mit Maus-Retroviren infizierten menschlichen
T-Zelllinien, HPB-Ma (5) und Molt4-Ma (6) entwickelt, in denen die
Replikation von HCV erreicht wird.
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Kürzlich wurde
in verschiedenen Studien gezeigt, dass feste menschliche Organe
wie fötaler
Thymus oder fötale
Leber wie auch verschiedene Tumorarten erfolgreich unter die Nierenkapsel
von SCID-Mäusen transplantiert
werden können
(7). Darüber
hinaus ist über
die Transplantation anderer Organe wie Lymphknoten und Knochenmarksfortsätze und
die Übertragung
von Organen an andere Stellen (d.h. subkutan und in das Peritoneum)
berichtet worden.
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Es
ist berichtet worden, dass eine SCID-Mausmutante menschliche Zellimplantation,
d.h. die Transplantation einzelner Hepatozyten unterstützt (8,
9) und ferner als Modell für
infektiöse
Krankheiten im Menschen, d.h. HIV-1 Infektion verwendet wurde (10).
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Publiziert
wurde, dass mit einer lethalen Dosis bestrahlte Mäuse, die
mit Knochenmark aus SCID-Mäusen
gegen Strahlung geschützt
wurden, eine ausgeprägte
Immundefizienz entwickelten und die Einpflanzung menschlicher peripherer
Blutlymphozyten (PBL) über
einen langen Zeitraum hinweg unterstützten (11). Ferner wurde offenbart,
dass menschliche Implantate nicht-hämopoetischen (nicht-blutbildenden)
Ursprungs nach Transplantation dieser Chimären unter die Nierenkapseln
angenommen und für
verlängerte
Zeiträume
nicht abgestoßen
wurden (12).
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Allgemeine Beschreibung der Erfindung
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines geeigneten
nicht-menschlichen
Tiermodells für
HV-Infektionen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Evaluierung vorbeugender und therapeutischer Wirkstoffe zur
Behandlung und Prophylaxe von HV-Infektionen unter Verwendung des
vorstehend genannten nicht-menschlichen
Tiermodells.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren
zur Herstellung von xenogenen anti-HV Antikörpern oder T-Zellen und insbesondere
von menschlichen monoklonalen Antikörpern und zytotoxischen T-Zellen,
wobei chimäre
nicht-menschliche Säuger,
transplantiert mit menschlichen hämopoetischen Zellen und menschlichem
Lebergewebe, infiziert mit HV entweder vor oder nach der Transplantation eingesetzt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt in einer ersten Ausführungsform
ein nicht-menschliches
chimäres
Tier bereit, das als Modell für
HV-Infektionen im Menschen dient, umfassend einen nicht-menschlichen
Säuger
M5 mit xenogenen Zellen, wobei der Säuger M5 von einem nicht-menschlichen
Säuger
M1 abgeleitet ist, der behandelt wurde, um seine hämopoetischen
Zellen im wesentlichen zu zerstören
und der dann mit hämopoetischen
Zellen aus einem oder mehreren Säugern
M2 und mit HBV- oder HCV-infiziertem Lebergewebe aus einem Säuger M3
transplantiert wurde, wobei der/die Säuger M2 und der Säuger M3
von derselben oder einer unterschiedlichen Art sind; wobei die transplantierten
hämopoetischen
Zellen aus dem/den Säuger(n)
M2 entweder eine hämopoetische
Zellpräparation
aus einem T-Zell-defizienten
Säuger
und/oder eine T-Zell-abgereicherten Stammzell- oder Knochenmarkspräparation
eines Säugers
darstellen, wobei das transplantierte Lebergewebe aus dem Säuger M3
entweder eine menschliche Lebergewebepräparation oder eine Lebergewebepräparation
aus einem nicht-menschlichen
Säuger
darstellt, der mit HV infiziert werden kann.
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Der
nicht-menschliche Säuger
M1 ist typischerweise eine Maus oder eine Ratte, obwohl der Säuger M1
auch ein nicht-menschlicher Säuger
einer höheren
Ordnung wie ein Primat sein kann, beispielsweise ein Krallenaffe.
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Für den Erhalt
eines nicht-menschlichen Säugers
M5 aus dem nicht-menschlichen Säuger
M1 wird der Säuger
M1 zunächst
so behandelt, dass sein hämopoetisches
System im wesentlichen zerstört
wird. Der Begriff „im
wesentlichen zerstört" sollte mit der Bedeutung
versehen werden, dass die Anzahl an hämopoetischen Zellen, die die
Behandlung überleben
nicht ausreichen, um das Tier ohne das Transplantat aus dem Säuger M2
immunologisch zu schützen.
Nach der Behandlung, die dazu eingesetzt wird, die hämopoetischen
Zellen im wesentlichen zu zerstören, überleben
einige dieser Zellen. Allerdings ist ihre Anzahl so klein, dass
das Tier unter normalen Laborbedingungen nicht überleben könnte.
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Eine
auf die wesentliche Zerstörung
der hämopoetischen
Zellen abzielende Behandlung kann beispielsweise eine geteilte Dosis
einer Ganzkörperbestrahlung
(TBI) sein. Eine für
die Zerstörung
des hämopoetischen
Systems wirksame TBI erfordert üblicherweise
eine sich auf 4–50
Gy (1 Gy = 100 rad) summierende Dosis. Im Falle der Maus kann die
Bestrahlung beispielsweise 4 Gy an Tag 1 betragen und 9–15 Gy drei
Tage später.
Eine ähnliche
Bestrahlungsdosis war ebenfalls wirksam in der Zerstörung der
hämopoetischen
Zellen in Ratten und Krallenaffen.
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Der
Säuger
M2 kann aus derselben Art wie der Säuger M1 stammen oder aus einer
unterschiedlichen Art. Im Prinzip kann jeder Säuger mit einer T-Zelldefizienz
als Spender für
die transplantierten hämopoetischen Zellen
dienen. Ein Beispiel für
einen Spender M2 ist die Maus mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID)
oder ein Tier mit SCID aus einer anderen Säugerart oder -gattung. Die
transplantierte hämopoetische Zellpräparation
ist in diesem Fall geeigneterweise eine Knochenmarkspräparation.
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Die
aus dem Säuger
M2 stammenden transplantierten hämopoetischen
Zellen können
ferner eine T-Zell abgereicherte hämopoetische Stammzellpräparation
aus einem Spendersäuger
M2 darstellen, wie einem Primaten, z.B. einem Affen oder einem Menschen.
Im Falle von Menschen kann die Stammzell-angereicherte Präparation
beispielsweise aus dem peripheren Blut von Spendern erhalten werden, die
zuvor mit einem Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF)
behandelt worden waren oder aus Krebspatienten, die eine Chemotherapie
absolvieren, von der bekannt ist, dass sie die Wanderung von Stammzellen
in die Peripherie verursacht. Nach der Entnahme des Blutpräparates
von diesen Spendern wird das Präparat üblicherweise
so behandelt, dass verschiedene Blutbestandteile entfernt und die
T-Zellen abgereichert werden. Für die
Abreicherung der T-Zellen kann das aus M2 erhaltene Präparat an
hämopoetischen
Zellen einer Behandlung unterworfen werden, die auf die Anreicherung
von Zellen abzielt, welche das CD34 Antigen tragen (CD34+-Zellen). Jede der vorstehenden, Stammzell-angereicherten,
T-Zellabgereicherten Präparationen
kann entweder direkt nach der Entnahme vom Spender eingesetzt werden
oder kann eine Zellpräparation
darstellen, die eine oder mehrere Passagen in vitro durchlaufen
hat.
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Die
transplantierten hämopoetischen
Zellen können
ebenfalls eine T-Zell abgereicherte Knochenmarkspräparation
sein.
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Ferner
kann der Säuger
M1 sowohl mit einer hämopoetischen
Zellpräparation
aus einem T-Zell defizienten Säuger
als auch mit einer T-Zell abgereicherten Säuger-Stammzell-Präparation transplantiert werden. Ein
spezifisches Beispiel ist eine kombinierte Transplantation mit Knochenmark
aus einem SCID-Säuger,
z.B. einer SCID-Maus und einer T-Zell abgereicherten menschlichen
Knochenmarkspräparation.
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Um
den Säuger
M5 zu erhalten, kann der Säuger
M1 mit einem HV-infizierten Lebergewebe transplantiert werden. Ein
derartiges HV-infiziertes Lebergewebe kann man aus einem mit HV
infizierten Säuger
M3 erhalten. Ein Beispiel dafür
ist eine Leberbiopsie aus einem mit HV infizierten Menschen. Darüber hinaus
kann ein mit HV infiziertes Lebergewebepräparat auch durch in vitro Infektion
eines zunächst
nicht mit HV infizierten Lebergewebepräparates erhalten werden, das
aus einem nicht-HV infizierten Säuger
M3 erhalten wurde, der als Spender fungiert.
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Über das
menschliche Lebergewebepräparat
hinaus ist es ferner möglich,
Lebergewebepräparate
aus nicht-menschlichen Säugern
M3 einzusetzen, die mit HV infiziert werden können, wie Schimpansen und anderen
nicht-menschlichen Primaten.
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Das
erfindungsgemäße Tiermodell
ist für
das Studium der Pathologie von Infektionen mit HBV und HCV und die
Entwicklung dagegen gerichteter Therapien besonders geeignet. Erfindungsgemäß sind Modelle sowohl
für HBV
als auch für
HCV besonders bevorzugt, da es gegenwärtig keine einfachen und niedrigpreisigen
Modelle für
diese viralen Infektionen gibt.
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Die
Erfindung betrifft in einer zweiten Ausführungsform ein Verfahren zur
Abschätzung
des Potentials eines Agens oder einer Kombination von Agenzien für die Therapie
einer Infektion mit HV unter Verwendung eines nicht-menschlichen,
vorstehend definierten Säugers
M5, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verabreichung
des Agens oder der Kombination von Agenzien an den Säuger M5;
und
- (b) Abschätzen
der Wirksamkeit des Agens oder der Kombination von Agenzien bei
der Verhinderung der Ausbreitung einer HV-Infektion, bei der Verminderung
ihrer physiologischen Symptome oder bei der Verminderung der Zeichen
für eine
aktive Infektion in dem Säuger
M5.
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Durch
Abwandlung kann das vorstehend beschriebene Verfahren, je nach Sachlage
auch zur Ermittlung der wirksamen Dosis des Agens oder der Kombination
von Agenzien in der Therapie oder Vorbeugung eingesetzt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten von Anti-HV-Immunzellen
oder -Antikörpern
unter Verwendung des wie vorstehend definierten nicht-menschlichen
Säugers M5
bereit, wobei mindestens einer der einen oder mehreren Säuger M2
ein Mensch ist und wobei das Verfahren umfasst:
- (a)
Erhalt von Immunzellen oder Antikörpern aus dem Blut des Säugers M5;
und
- (b) Auswählen
der Immunzellen oder Antikörper
mit einer Anti-HV-Reaktivität.
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Gegebenenfalls
wird der Säuger
M5 gemäß dieser
Ausführungsform
behandelt, um die Immunantwort gegen HV zu erhöhen, beispielsweise durch Impfung.
Die ausgewählten
Immunzellen können
zytotoxische T-Zellen sein, die mit HV-infizierten Leberzellen reagieren. Eine
derartige zytotoxische T-Zellpräparation
kann durch Züchtung
von Zelllinien von aus dem Säuger
M5 erhaltenen T-Zellen und anschließende Auswahl derjenigen Linien
erhalten werden, die eine zytotoxische Zellantwort gegenüber Zellen
entwickeln, die HV-Antigene exprimieren. Eine derartige zytotoxische
T-Zellpräparation
kann im Rahmen einer Anti-HV-Therapie durch Injektion an HV-Patienten
verabreicht werden.
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Die
ausgewählten
Immunzellen können
auch Antikörperproduzierende
B-Zellen sein, die immortalisiert und auf diejenigen hin selektioniert
wurden, die Anti-HV-Antikörper produzieren.
Die von diesen B-Zellen produzierten Antikörper können dann als therapeutische
Wirkstoffe in Anti-HV-Therapien bei Hepatitis-Patienten eingesetzt
werden.
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Die
Art und Weise, mit der zytotosche T-Zelllinien gezüchtet werden,
die Art und Weise der Immortalisierung von B-Zellen zur Herstellung
von B-Zelllinien, wie auch die Art und Weise der Auswahl spezifischer zytotoxischer
T-Zellen oder immortalisierter B-Zelllinien auf jene mit der gewünschten
Reaktivität
ist allgemein per se bekannt und muss daher hier nicht weiter dargestellt
werden.
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Die
Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf einige besondere Ausführungsformen
erläutert,
die in den nachfolgenden Beispielen und den beigefügten Figuren
beschrieben sind.
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Beschreibung der Figuren
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1 zeigt die Histologie von Lebergewebe,
das unter die Nierenkapsel einer SCID-BNX-Chimäre transplantiert wurde und
zwar einen Monat nach der Transplantation von Leberfragmenten aus
der BNX-Maus (A), der Lewis-Ratte (B) oder dem Menschen (C). Alle
transplantierten Tiere, welche die Implantation des Lebergewebes
unter die Nierenkapseln überlebten,
wurden mittels Lichtmikroskopie der Nieren unter Verwendung von
H&E-Färbung auf
Anwachsen analysiert.
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2 zeigt Hepatozyten und Gallengang-ähnliche
Strukturen (gekennzeichnet durch Pfeile) in einem transplantierten
menschlichen Leberfragment 30 Tage nach der Transplantation bei
einer Vergrößerung von 240 × (A); Hepatozyten
und Epithelzellen bei einer Vergrößerung von 1200 × (B), Gallengang-ähnliche
Strukturen bei einer Vergrößerung von
1200 × (C).
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3 zeigt (A) die Histologie eines Lebersegmentes
vor der Transplantation (H&E,
100 ×);
(B) die immunhistologische Färbung
auf HBsAg in menschlicher, mit HBV infizierter Leber (100 ×); (C)
Perjodsäure-Schiff-Färbung auf
Glykogen in einem menschlichen Lebersegment (L), das unter die Nierenkapsel
(K) einer SCID-BNX-Chimäre transplantiert
worden war (50x); und (D) die immunhistologische Färbung auf
HBsAg in menschlicher, mit HBV infizierter Leber, beobachtet 19
Tage nach der Transplantation in den subkapsulären Bereich der Niere der SCID-BNX-Chimäre (50 ×). Die
Färbung
wurde mit Maus-anti-HBsAg (Zymed Lab, San Francisco, CA) als primärem Antikörper durchgeführt.
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4 ist ein Elektrophoretogramm von cDNA
von RNA-Proben, die aus Seren von SCID-BNX-Chimären extrahiert worden waren,
die mit HCV-infizierter menschlicher Leber unter die Nierenkapsel
transplantiert worden waren und mit der eine RT-PCR Amplifizierung
unter Verwendung von zwei Sätzen
an Primern durchgeführt
worden war, wie in Beispiel 3 beschrieben. Jede Spur steht für eine unterschiedliche
Maus, die am Tag der Probenentnahme geopfert worden war. Die ersten
13 Spuren, die im oberen Teil von 4 dargestellt
sind, stammen von Mäusen
am Tage 9 nach der Transplantation. Die verbleibenden Spuren stammen
von den Tagen 14 bis 53 nach der Transplantation (die Tage sind
oberhalb der Spuren gekennzeichnet). Die beiden letzten Spuren stellen
die negative (–)
und die positive (+) Kontrolle dar.
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Beispiele
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Beispiel 1: Anwachsen menschlicher Lebersegmente
aus Nicht-HCV-Patienten
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BNX-Mäuse (6 bis
10 Wochen alt, weiblich) wurden von Harlam Sprague-Dawley (Indianapolis,
IN) kommerziell erworben und CB17/SCID-Mäuse stammten aus dem Animal
Breeding Center, Weizmann Institut, Rehovot, Israel. Die Mäuse wurden
in kleinen Käfigen
gehalten (fünf
Tiere pro Käfig)
und mit sterilem Futter und sauren Wasser enthaltend Cyprofloxacin
(20 mg/ml) versorgt. Vor der Transplantation wurden die BNX-Mäuse mit
12 Gy TBI konditioniert und am nächsten
Tag mit 2–3 × 106 T-Zell abgereicherten SCID Knochenmarkszellen
gegen Strahlung geschützt.
TBI wurde vermittels einer Gammastrahlen 150-A 60Co-Quelle (Atomic
Energy of Canada, Kanata, Ontario) mit F.S.D von 75 cm und einer
Dosisrate von 0,7 Cy/Min. verabreicht. Aus SCID-Mäusen (4
bis 10 Wochen alt) erhaltene Knochenmarkszellen wurden durch differentielle
Agglutination mit Sojabohnenagglutinin, wie früher (11) beschrieben, fraktioniert,
um T-Lymphozyten zu entfernen, die in gelegentlich vorkommenden „leaky" SCID-Mäusen vorhanden
sein können.
Einen Tag nach der Knochenmarkstransplantation wurden menschliche,
Ratten- oder Maus-Leberfragmente
unter die Nierenkapsel verpflanzt.
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Die
Ratten- und Maus-Lebergewebefragmente wurden durch Laparotomie gesammelt,
in der eine keilförmige
Biopsie aus der Tierleber herausgeschnitten wurde und unter sterilen
Bedingungen bei 4°C
in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium enthaltend 10% fötales Kälberserum
oder ViaSpan (Belzer VW-Lösung,
Du Pont Pharmaceuticals; Hertogenbosch, Niederlande) gehalten.
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Menschliche
Lebersegmente wurden während
Lebersegmentektomien entnommen, die bei primären oder sekundären Lebertumoren
durchgeführt
wurden. In allen Fällen
war das Nicht-Tumorgewebe nicht zirrhotisch, was durch Hämatoxylin-
und Eosin (H&E-)Färbung bestätigt wurde.
Die Lebersegmente wurden vor der Transplantation bis zu 2 Stunden
in UW-Lösung
gehalten. Für
die Einpflanzung von Lebergewebe wurden die BNX-Mäuse mit
Nembutol oder Avertin betäubt.
Anschließend
wurde ein Einschnitt von etwa 1 cm in die rechte oder linke Flanke
gesetzt, die Niere wurde freigelegt und das Lebergewebe, in Stücke von
1 mm2 geschnitten, mit einer feinen Pinzette
unter die Nierenkapsel gesetzt. Die Wunde wurde mit einem Faden
verschlossen. Nieren wurden zusammen mit dem daran anhaftenden transplantierten
Gewebe nach verschiedenen Zeitintervallen entfernt (von 8 Tagen
bis 3 Monaten), in Bouin's
Flüssigkeit
fixiert, in Paraffin eingebettet und 4 µm-Sektionen davon wurden mit
H&E gefärbt.
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Eine
Zusammenfassung der Transplantationen von Leberfragmenten in die
chimären SCID-BNX-Mäuse ist
in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
| Anzahl Mäuse | Quelle der
Leber Verlaufskontrolle |
| transplantiert | überlebend | angewachsen | (Wochen) |
| 10 | 9 | 4 | Maus | 10 |
| 20 | 12 | 8 | Maus | 3 |
| 10 | 7 | 4 | Maus | 1,4 |
| 10 | 10 | 8 | Ratte | 10 |
| 20 | 8 | 5 | Ratte | 8 |
| 20 | 7 | 2 | Ratte | 2 |
| 10 | 5 | 2 | Ratte | 1,4 |
| 20 | 11 | 5 | Mensch | 14 |
| 20 | 11 | 5 | Mensch | 14 |
| 20 | 11 | 5 | Mensch | 12 |
| 20 | 10 | 2 | Mensch | 6 |
| 20 | 9 | 3 | Mensch | 4 |
| 20 | 16 | 12 | Mensch | 2 |
| 20 | 15 | 14 | Mensch | 2 |
| 16 | 12 | 9 | Mensch | 2 |
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Wie
aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich, bewegte die Überlebensrate
der chimären
Mäuse,
welche das menschliche Lebertransplantat erhielten, im Bereich von
etwa 50 bis 60%.
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Die
histologische Begutachtung der transplantierten Leberfragmente in
diesem subkapsulären
Bereich der transplantierten SCID-BNX-Chimären zeigte, dass die typische
Leberzellarchitektur nach der Transplantation verschwand und in
den meisten Transplantaten eine zentrale Ischämie auftrat, wohingegen das
periphere Gewebe des Transplantats ausgeprägt fibrotisch war (vgl. 1). In den meisten Fällen wurden neben proliferierenden
Epithelzellen Hepatozyten nachgewiesen (2)
und das verpflanzte Gewebe ähnelte
im wesentlichen den morphologischen Eigenschaften von Gallenepithel
(2B und 2C). Eine
sehr schwache Entzündungsreaktion
wurde gelegentlich beobachtet, die aus wenigen polymorphkernigen
und Plasma-Zellen bestand.
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Die
Bewertung der Anwuchsrate für
die Leber zeigte, dass unter den die menschlichen Lebertransplantate
erhaltenden Mäusen
15 von 33 das Transplantat mehr als 12 Wochen beibehielten, während 40
von 62 das Transplantat sechs Wochen oder weniger stabil trugen
(Tabelle 1).
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Beispiel 2: Transplantation von Lebergewebe
aus einem mit Hepatitis B-Virus (HBV) infizierten Menschen
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Es
wurde eine Leberbiopsie von einem mit Hepatitis B-Virus (HBV) infizierten
Menschen erhalten und unter die Nierenkapsel von chimären SCID/BNX-Mäusen transplantiert,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Immunhistologie des Lebersegmentes
vor der Transplantation zeigte, dass die Hepatozyten positiv hinsichtlich des
HBV-Oberflächenproteins
(HBsAg) färbten
(3B). Nach der Transplantation wurde der Nachweis
für den
menschlichen Ursprung der transplantierten Zellen durch Färbung mit
der Perjodsäure-Schiff-Reaktion
geführt,
die Glykogen in menschlichen Hepatozyten nachweist (3C).
19 Tage nach der Transplantation wurde der subkapsuläre Bereich
der Niere der SCID-BNX-Chimäre
immunhistologisch angefärbt
und HBsAg wurde in bestimmten Bereichen des Zytoplasmas im angewachsenen
Gewebe nachgewiesen, nicht jedoch in beanchbarten Mausnierenzellen
(3D).
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Beispiel 3: Transplantation von in vitro
mit HBV infizierten Leberfragmenten
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Leberfragmente
wurden aus nicht mit HBV infizierten Menschen erhalten, wie in Beispiel
1 beschrieben. Die nicht-infizierten menschlichen Leberfragmente
wurden in vitro mit HBV infiziert, was zu ihrer Infektion mit HBV
führte.
Die in vitro mit HBV infizierten Leberfragmente wurden unter die
Nierenkapsel von SCID-BNX-Mäusen
transplantiert, wie in Beispiel 1 dargestellt. Der Nachweis von
HBV in den transplantierten Mäusen
wurde entweder über
Immunhistologie von Hepatozyten geführt, wie in Beispiel 2 beschrieben
oder durch Testen der Mengen von HBV im Serum der Mäuse durch
PCR (RT-PCR), wie folgt. DNA wurde in 30 µL DNasefreiem H2O
gelöst.
Die PCR wurde in Reaktionsgemischvolumina von 100 µL enthaltend
Taq-Polymerasepuffer (Promega), 2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2,
500 ng jeweils von den Sinn-(Bs) und Antisinn-(Bas) Primern und
2,5 Einheiten Taq-Polymerase
(Promega). Die Reaktion wurde durch 35 PCR-Zyklen mit 94°C für 1,5 Minuten,
55°C für 1,5 Minuten
und 72°C
für 3 Minuten
durchgeführt.
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Die
folgenden Primer wurden eingesetzt:
Bs:1778-1806 5'-GGA-GGC-TGT-AGG-CAT-AAA-TTG-GTC-TGC-GC-
Bas: 2446-2408
5'-CCC-GAG-ATT-GAG-ATC-TTC-TGC-GAC-GCG-GCG-ATT-GAG-ACC-
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Die
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt: Tabelle 2: Transplantationsergebnisse
von in vitro mit dem Hepatitis B-Virus infizierten menschlichen
Lebern in SCID-BNX-Mäusen
| Anzahl
Tiere | Anzahl überlebender
Tiere | Anzahl
Tiere mit angewachsenem Transplantat | Infektionsroute* | Infektionsindikatoren
und Kommentare** |
| 10 | 5 | 5 | Vor
der Transplantation in vitro Inkubation der Leberfragmente mit HBV-DNA,
+ve Seren | PCR
+ve (3/5) |
| 10 | 7 | KD*** | Vor
der Transplantation in vitro Inkubation der Leberfragmente mit HBV-DNA,
+ve Seren | PCR
+ve 1/7 am Tag 11 PCR +ve 4/7 am Tag 30 |
| 10 | 5 | KD | Vor
der Transplantation in vitro Inkubation der Leberfragmente mit HBV-DNA,
+ve Seren | PCR
+ve 1/5 am Tag 11 |
- * +ve Seren = Seren, die positiv für eine Virämie sind
- ** PCR +ve = PCR-Test positiv für Hepatitis-Virus DNA
- *** KD = keine Daten: Die Mäuse
sind noch nicht für
die histologische Begutachtung geopfert worden.
-
Wie
aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich, wurden HBV-Sequenzen in
den Seren einiger transplantierter Mäuse etwa zehn Tage nach der
Transplantation beobachtet und mit fortschreitender Zeit nach der Transplantation
wurden HBV-Sequenzen in einer größeren Anzahl
transplantierter Mäuse
beobachtet.
-
Beispiel 4: Nachweis von HCV in Seren
von Mäusen,
die mit Leberfragmenten aus mit HCV infizierten Patienten transplantiert
wurden
-
Leberfragmente
aus drei Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion wurden erhalten
und unter die Nierenkapsel von SCID-BNX-Mäusen transplantiert, wie in
Beispiel 1 beschrieben. Die Gegenwart und die Menge an HCV im Serum
der transplantierten Mäuse
wurde durch Reverse Transkriptase eingebettete Polymerasekettenreaktion
(RT-PCR) wie folgt ermittelt: RNA wurde in 10 µL RNasefreiem Wasser gelöst. cDNA wurde
unter Verwendung von 50 ng des Antisinn-Primers ASI in einem Reaktionsgemisch
enthaltend 2xTaq-Polymerasepuffer (Promega Corp. Madison, WI), 0,5
mM dNTPs 20 Einheiten RNasin (Promega), 10 mM Dithiotheit und 30
Einheiten Reverser Transkriptase aus Affen-Myoblastosevirus (Life
Sciences, Bethesda, MD) 60 Min. bei 42°C synthetisiert. Die PCR wurde
in einem Reaktionsgemischvolumen von 50 µL enthaltend Taq-Polymerasepuffer
(Promega), 2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 20
ng Sinnprimer SI und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Promega) durchgeführt. Die
Reaktion wurde über
35 PCR-Zyklen mit 94°C
für 1,5
Min., 55°C
für 1,5 Min.
und 72°C
für 3 Min.
durchgeführt.
Die zweite PCR-Reaktion wurde ebenso wie zuvor beschrieben ausgeführt und
zwar mit 5 µL
des ersten PCR-Reaktionsgemisches und dem Satz an eingebetteten
Primern SII (Sinn) und ASII (Antisinn). Die zwei Sätze an eingesetzten
Primern stammen aus der hochkonservierten 5'-nicht-translatierten Region (5'-UTR).
-
Die
folgenden Primer wurden verwendet:
SI 7-26: 5'-CAC-TCC-ACC-ATA-GAT-CAT-CCC-3'
ASI 248-222:
5'-ACC-ACT-ACT-CGG-CTA-GCA-GT-3'
SII 46-65:
5'-TTC-ACG-CAG-AAA-GCG-TCT-AG-3'
ASII 190-171:
5'-GTT-GAT-CCA-AGA-AAG-GAC-CC-3'
-
Die
nach der Transplantation mit den HCV-infizierten Leberfragmenten
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt: Tabelle 3: Transplantationsergebnisse
mit Leberfragmenten aus HCV-infizierten menschlichen Patienten in SCID-BNX-Mäusen
| Anzahl Mäuse |
| Transplantiert
mit HCV–infizierten
Leberfragmenten | Überlebend | Stabil
angewachsen | Positiv
virämisch |
| 20 | 17 | 15 | 8 |
| 17 | 14 | 10 | 7 |
| 13 | 11 | 6 | 5 |
| 12 | 10 | KD* | 6 |
- * KD = keine Daten: Die Mäuse sind
noch nicht für
die histologische Begutachtung geopfert worden.
-
HCV-Sequenzen
wurden erstmals zwei Wochen nach der Transplantation in den transplantierten
Mäusen
beobachtet und wurden fortschreitend periodisch etwa zwei Monate
lang nach der Transplantation nachgewiesen. Zu dieser Zeit wurden
die Tiere geopfert (ein typisches Experiment ist in 4 dargestellt).
Eine ähnliche
Fluktuation beim Nachweis der HCV-RNA ist zuvor in Schimpansen beobachtet
worden, die experimentell mit HCV infiziert wurden und in chronisch
infizierten Patienten, was vermutlich auf die sehr niedrigen Mengen
des Virus im Serum zurückzuführen ist.
-
Beispiel 5: Transplantation von in vitro
mit HCV infizierten Leberfragmenten in C3H-Mäuse
-
C3H-Mäuse, die
nicht zu einem Immundefizienten Stamm gehören, wurden mit einer geteilten
Ganzkörperbestrahlung
(TBI) bestrahlt (einer ersten Dosis mit 400 rad und einer zweiten
Dosis mit 1200 rad) und am folgenden Tag mit 3 × 106 SCID-Knochenmarkszellen
gegen Strahlung geschützt
(wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben).
-
Leberfragmente
wurden aus nicht mit HCV infizierten Menschen, wie in Beispiel 1
beschrieben, erhalten und die nicht-infizierten menschlichen Leberfragmente
wurden in vitro mit HCV inkubiert, was zu ihrer Infektion mit HCV
führte.
Die in vitro mit HCV infizierten Leberfragmente wurden unter die
Nierenkapsel der C3H-Mäuse
transplantiert, wie vorstehend beschrieben und der Nachweis von
HCV in den transplantierten Mäusen
wurde durch Testen der HCV-Werte im Serum der Mäuse mit RT-PCR ermittelt, wie
vorstehend in Beispiel 4 beschrieben.
-
Die
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 beschrieben: Tabelle 4: Transplantationsergebnisse
mit in vitro mit HCV-infizierten menschlichen Lebern in C3H-Mäusen
| Anzahl
Tiere | Anzahl
Oberlebender Tiere | Anzahl
Tiere mit angewachsenem Transplantat | Infektionsroute* | Infektionsindikatoren
und Kommentare*** |
| 10 | 10 | KD* | Vor
der Transplantation in vitro Inkubation der Leberfragmente mit HCV-DNA,
+HCV Seren** | PCR
+HCV 2/10 an Tag 14 |
- * KD = keine Daten: Die Mäuse sind
noch nicht für
die histologische Begutachtung geopfert worden
- ** +HCV-Seren = Seren, die für
HCV positiv sind
- *** PCR +HCV = PCR-Test positiv für Hepatitis C-Virus-DNA
-
Die
in der vorstehenden Tabelle dargestellten Ergebnisse zeigen zum
ersten Mal, dass menschliche Leberfragmente, die in vitro mit HCV
infiziert wurden, nach der Transplantion anwachsen können und
zu einer Infektion der transplantierten Mäuse mit HCV führen können, wie
durch den Nachweis von HCV-Sequenzen in den Seren der transplantierten
Mäuse ermittelt.
-
Darüber hinaus
zeigen die vorstehenden Ergebnisse zum ersten Mal, dass menschliche,
mit HCV infizierte Lebern unter die Nierenkapseln von C3H-Mäusen transplantiert
werden können,
die nicht zu einem immundefizienten Stamm gehören.