DE69433921T2

DE69433921T2 - RECOMBINANT CELLS OF MONOCYTE MACROPHAGES CELL LINE TO GENE THERAPY

Info

Publication number: DE69433921T2
Application number: DE69433921T
Authority: DE
Inventors: Hedi Haddada; Manuel Lopez; Michel Perricaudet
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centelion SAS
Current assignee: CENTELION, VITRY SUR SEINE, FR; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1994-08-22
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2014-08-23
Also published as: FI960855A0; EP0719332B1; AU698043B2; NO960743D0; NO960743L; IL110754A; JP3731035B2; ZA946264B; FI960855A; US6210963B1; WO1995006120A1; IL110754A0; AU7539894A; DE69433921D1; FR2709309A1; ATE272117T1; KR100392984B1; CA2170159A1; EP0719332A1; NO319990B1

Abstract

Cell compositions containing mononuclear phagocyte systems cells, and their use in cell therapy, e.g. adoptive immunotherapy, are disclosed.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zellzusammensetzungen, ihre Herstellung, die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung in der Therapie. Spezieller betrifft sie die Kultur und die Aktivierung von Zellen des mononukleären Phagozytensystems und ihre Verwendung in der Zelltherapie, beispielsweise in der adoptiven Immuntherapie.The The present invention relates to cell compositions, their preparation, the pharmaceutical compositions containing them, and theirs Use in therapy. More specifically, it concerns the culture and the activation of cells of the mononuclear phagocyte system and their Use in cell therapy, for example in the adoptive Immunotherapy.

Die Zellen des mononukleären Phagozytensystems umfassen die Monozyten des peripheren Bluts, ihre Vorläufer im Knochenmark oder Blut und die Gewebemakrophagen. Die Monozyten werden im Knochenmark gebildet, das sie nach Reifung über das periphere Blut zu den Geweben hin verlassen. Die menschlichen Monozyten, die im Blut zirkulieren, haben eine Halbwertszeit von etwa 3 Tagen. Wenn er die Gewebe erreicht, wird der Monozyt Makrophage genannt. Die Gesamtzahl der Gewebemakrophagen übersteigt bei weitem die Anzahl der zirkulierenden Monozyten um einen Faktor von etwa 400. Makrophagen werden überall im Körper gefunden, sind aber besonders zahlreich in der Leber (Kupffer-Zellen), in den Lymphknoten, in der Lunge, im Bauchfell und in der Haut (Langerhans-Zellen). Die exakte Halbwertszeit der Gewebemakrophagen ist nicht bekannt, scheint sich aber eher in Monaten als in Tagen zählen zu lassen. Der Übertritt der Monozyten schließlich vom allgemeinen Kreislauf in die Gewebe ist irreversibel.The Cells of the mononuclear Phagocytic systems include the peripheral blood monocytes, their precursor in the bone marrow or blood and the tissue macrophages. The monocytes are formed in the bone marrow, which they after maturation on the leave peripheral blood to the tissues. The human monocytes, circulating in the blood, have a half-life of about 3 days. When it reaches the tissues, the monocyte is called macrophage. The total number of tissue macrophages far exceeds the number of the circulating monocytes by a factor of about 400. Macrophages be everywhere in the body but are especially abundant in the liver (Kupffer cells), in the lymph nodes, in the lung, in the peritoneum and in the skin (Langerhans cells). The exact half-life of the tissue macrophages is not known but seems to be counting in months rather than days. The transfer the monocytes finally from the general circulation to the tissues is irreversible.

Die Monozyten und die Makrophagen sind dafür bekannt, zahlreiche und wichtige Funktionen zu haben, die die Induktion von Immunantworten in akuten Phasen (Anonymous, Lancet ii (1985) 536-537), die Regulierung der Hämatopoiese (Sieff C.A. J. Clin. Invest. 79 (1987) 1549-1557), die Aktivierung des Immunsystems (Unanue E.R. Annu. Rev. Immunol. 2 (1984) 395-428) und der Koagulation (Prydz H., Allison A.C. Thromb. Haemost. 39 (1978) 582-591), die Zerstörung der Organismen und der Tumorzellen (Sharma S.D., Remington J.S. Lymphokines 3 (1981) 181-212 und Carswell E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 3666-3670) und die Gewebereparatur und die Wundheilung (Korn J.H. et al., J. Clin. Invest. 65 (1980) 543-54) einschließen.The Monocytes and the macrophages are known to be numerous and important To have functions that enhance the induction of immune responses in acute Phases (Anonymous, Lancet ii (1985) 536-537), the regulation of hematopoiesis (Sieff C.A. J. Clin Invest 79 (1987) 1549-1557), activation of the immune system (Unanue E.R. Annu., Rev. Immunol., 2 (1984) 395-428) and coagulation (Prydz H., Allison A. C. Thromb, Haemost (1978) 582-591), the destruction of organisms and tumor cells (Sharma S.D., Remington J.S. Lymphokines 3 (1981) 181-212 and Carswell E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 3666-3670) and tissue repair and wound healing (Korn J.H. et al., J. Biol. Clin. Invest. 65 (1980) 543-54).

In allem, was folgt, ist eine Monozyten-Makrophagen-Linie definiert als eine Linie des mononukleären Systems, die die Monozyten des peripheren Bluts, ihre Vorläufer im Knochenmark oder Blut und die Gewebemakrophagen umfasst. Sie umfasst auch die Monozyten, die durch Kultur der Vorläuferzellen erhalten werden, sowie die Makrophagen, die nach Kultur von monozytären Zellen unter den Bedingungen, die in den Beispielen genauer ausgeführt sind, erhalten werden (siehe auch Andressen R. et al., Cancer Res. 50:7450; Bartholeyns J. et al., Anticancer Res. 11 (1991) 1201-1204; Lopez M. et al., Journal of Immunological Methods 159 (1993) 29-38). Die Vorläufer der Monozyten-Makrophagen umfassen insbesondere die pluripotenten Stammzellen, die myeloischen Stammzellen (CFU-GEMM), die myelomonozytischen Stammzellen (CFU-GM), die CFU-M, die Monoblasten und die Promonozyten.In All that follows is a monocyte-macrophage line as a line of the mononuclear Systems, which are the peripheral blood monocytes, their precursors in the Bone marrow or blood and the tissue macrophages. It includes also the monocytes obtained by culture of progenitor cells, as well as the macrophages, after culture of monocytic cells under the conditions detailed in the Examples See also Andressen R. et al., Cancer Res. 50: 7450; Bartholeyns J. et al., Anticancer Res. 11 (1991) 1201-1204; Lopez M. et al. Journal of Immunological Methods 159 (1993) 29-38). The precursors of monocyte macrophages include in particular the pluripotent stem cells, the myeloid Stem cells (CFU-GEMM), myelomonocytic stem cells (CFU-GM), the CFU-M, the monoblasts and the promonocytes.

Derzeit werden die Monozyten-Makrophagen in der adoptiven Immuntherapie für die Behandlung von bestimmten Krebstypen beim Menschen verwendet. Diese Zellen werden aus dem zirkulierenden Blut der Patienten gereinigt, ex vivo kultiviert und durch Interferon-γ aktiviert, um ihre Differenzierung einzuleiten und ihre tumorizide Kraft zu erhöhen, dann den Patienten wieder injiziert. Jedoch ist diese Behandlung ziemlich schwer für den Kranken, weil die Monozyten-Makrophagen regelmäßig und häufig entnommen werden müssen, die ex vivo Aktivierung erfordert wichtige Fristen und das Interferon-γ ist noch sehr teuer. Aus diesem Grund ist es wichtig, über wirksamere, für den Kranken weniger beanspruchende und weniger kostspielige Behandlungen zu verfügen. Die vorliegende Erfindung liefert eine vorteilhafte Lösung für dieses Problem. Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe von geeigneten Vektoren Gene ex vivo in die Monozyten-Makrophagen-Zellen zu transferieren, die es so ermöglichen, ihnen bessere Eigenschaften, sowohl hinsichtlich der Zytotoxizität als auch der Stimulierung des Immunsystems zu verleihen.Currently become monocyte macrophages in adoptive immunotherapy for the Treatment of certain types of cancer used in humans. These Cells are cleaned from the circulating blood of patients, cultured ex vivo and activated by interferon-γ to initiate their differentiation and to increase their tumoricidal power, then injected the patient again. However, this treatment is pretty hard for the patient because the monocyte macrophages regularly and taken frequently Need to become, the ex vivo activation requires important deadlines and the interferon-γ is still very expensive. Because of this, it's important to be more effective, for the sick less demanding and less expensive treatments. The The present invention provides an advantageous solution for this Problem. Namely, the applicant has shown that it is possible is to transfer genes into the monocyte-macrophage cells ex vivo with the aid of suitable vectors, which make it possible better properties, both in terms of cytotoxicity and to stimulate the immune system.

Ein erster Gegenstand der Erfindung liegt also in einer Zellzusammensetzung, umfassend differenzierte Zellen der Monozyt-Makrophagen-Linie, die eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, welche von einem adenoviralen Vektor getragen wird, der unter der Kontrolle von ihre Expression erlaubenden Regulationselementen ein oder mehrere therapeutische Gene umfasst.One The first object of the invention is thus in a cell composition, comprising differentiated cells of the monocyte-macrophage lineage, comprising a recombinant nucleic acid which is carried by an adenoviral vector which is under the control of their expression permitting regulatory elements includes one or more therapeutic genes.

Die vorliegende Erfindung ermöglich es so, auf einfache und wirksame Weise gesunde und aktive Monozyten-Makrophagen zu erhalten, die in der adoptiven Immuntherapie für die Behandlung von bestimmten Krankheiten wie Krebs ver wendbar sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, den Monozyten-Makrophagen, verglichen mit den Monozyten-Makrophagen des Organismus, neue oder verstärkte therapeutische Eigenschaften zu verleihen, insbesondere auf dem Gebiet der Abwehrkräfte gegen infektiöse Mittel, gegen die Tumorzellen oder bei der Aktivierung des Immunsystems. Solche Zellen sind vorteilhaft verwendbar für die heilende oder vorbeugende Behandlung von Infektionskrankheiten (insbesondere virale), Autoimmunkrankheiten, Immunschwächen oder auch mit dem Ziel des Impfens.The present invention this way, in a simple and effective way, healthy and active monocyte macrophages to get involved in adoptive immunotherapy for treatment of certain diseases such as cancer. The present Invention allows it also, the monocyte macrophages, compared with the monocyte macrophages of the organism, new or strengthened to confer therapeutic properties, in particular on the Area of the defenses against infectious Means, against the tumor cells or in the activation of the immune system. Such cells are advantageously usable for the curative or preventive Treatment of infectious diseases (especially viral), autoimmune diseases, immunodeficiencies or with the aim of vaccination.

Im Sinne der Erfindung bezeichnet der Ausdruck therapeutisches Gen jedes Gen, dessen Transkription und gegebenenfalls dessen Translation in der Zelle ein Produkt mit einer therapeutischen Wirkung erzeugt. Es kann sich insbesondere handeln um das gesamte oder einen Teil eines therapeutischen Proteins (Interleukin, Interferon, Tumornekrosefaktor, Kolonie-Stimulationsfaktoren usw.), ein Antigenpeptid für die Herstellung eines Impfstoffs oder die Stimulierung des Immunsystems oder auch um eine Antisens-RNA, die in der Lage ist, die Expression eines spezifischen Proteins, wie beispielsweise ein Protein viralen Ursprungs, zu regulieren oder auch in den Infektions- und/oder Replikationszyklus eines Virus einzugreifen.For the purposes of the invention, the term therapeutic gene refers to any gene whose trans scripting and, where appropriate, its translation in the cell produces a product with a therapeutic effect. It may in particular be all or part of a therapeutic protein (interleukin, interferon, tumor necrosis factor, colony stimulating factors, etc.), an antigenic peptide for the production of a vaccine or the stimulation of the immune system or also an antisense RNA present in is able to regulate the expression of a specific protein, such as a protein of viral origin, or to intervene in the infection and / or replication cycle of a virus.

Vorteilhafterweise kodiert das Gen für das gesamte Protein oder einen Teil eines Proteins, welches in der Lage ist, den Zellen besagter Linie neue oder verstärkte antiinfektiöse, antikanzeröse oder immunstimulierende Eigenschaften zu verleihen.advantageously, encodes the gene for the entire protein or part of a protein that is in the Location is the cells of said line new or reinforced anti-infective, anti-cancerous or to give immunostimulating properties.

Stärker bevorzugt ist das Gen ausgewählt unter den Genen, die für die Interferone (vorzugsweise gamma), die Tumornekrosefaktoren (vorzugsweise alpha), die Interleukine (IL1-12), die Kolonie-Stimulationsfaktoren (G-CSF, M-CSF, GM-CSF usw.) kodieren, dem MDR-(multi drug resistance)-Gen oder einem Gen, das für ein Antigen eines infektiösen oder spezifischen Teilchens eines Tumors kodiert (beispielsweise ein Oberflächenprotein eines Virus: insbesondere Protein gp160 des HIV-Virus oder Muc-1-Antigen, das für epitheliale Tumoren charakteristisch ist).More preferred the gene is selected under the genes responsible for the interferons (preferably gamma), the tumor necrosis factors (preferably alpha), the interleukins (IL1-12), the colony stimulation factors (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.) encode the MDR (multi drug resistance) gene or a gene for an antigen of an infectious or specific particle of a tumor encoded (for example surface protein a virus: in particular protein gp160 of the HIV virus or Muc-1 antigen, that for epithelial tumors is characteristic).

In einer besonderen Form hat die vorliegende Erfindung wie oben definierte Zellzusammensetzungen zum Gegenstand, in denen die rekombinante Nukleinsäure von einem adenoviralen Vektor getragen wird. Die Verwendung eines erfindungs gemäßen Vektors ermöglicht es insbesondere, die Darreichung der Nukleinsäure in den Zellen zu verbessern und auch ihre Stabilität in besagten Zellen zu erhöhen, was den Erhalt einer dauerhaften Wirkung ermöglicht. Zudem ist es möglich, mehrere Gene in einen gleichen Vektor einzuführen, was ebenfalls die Wirksamkeit der Behandlung erhöht.In a particular form, the present invention as defined above Cell compositions in which the recombinant nucleic acid of an adenoviral vector is carried. The use of a fiction, contemporary vector allows in particular, to improve the administration of the nucleic acid in the cells and also their stability in said cells to increase what the preservation of a permanent effect. It is also possible to have several To introduce genes into a same vector, which also reduces the effectiveness the treatment increases.

Vorteilhafterweise ist das verwendete Adenovirus ein defektives Adenovirus. Der Ausdruck "defektives Adenovirus" bezeichnet ein Adenovirus, das nicht in der Lage ist, sich in der Zielzelle zu replizieren. Im Allgemeinen ist das Genom der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten defektiven Adenoviren also wenigstens frei von den Sequenzen, die für die Replikation besagten Virus in der infizierten Zelle notwendig sind. Diese Regionen können entweder entfernt (ganz oder teilweise) oder nicht funktionell gemacht oder durch andere Sequenzen und insbesondere durch die rekombinante Nukleinsäure substituiert sein. Vorzugsweise behält das defektive Virus trotzdem die Sequenzen seines Genoms, die für die Verpackung der viralen Teilchen notwendig sind.advantageously, the adenovirus used is a defective adenovirus. The term "defective adenovirus" refers to an adenovirus, that is unable to replicate in the target cell. In general, the genome is within the scope of the present invention used defective adenoviruses so at least free of the sequences that for the Replication said virus in the infected cell are necessary. These regions can either removed (in whole or in part) or not made functional or substituted by other sequences and in particular by the recombinant nucleic acid be. Preferably retains the defective virus still uses the sequences of its genome for packaging the viral particles are necessary.

Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass die Adenoviren in der Lage waren, die Zellen der Monozyt-Makrophagen-Linie sehr wirksam zu infizieren, sich dort stabil zu halten und ein therapeutisches Gen zu exprimieren, mag es sich um ein intrazelluläres Produkt oder um ein membranäres oder sekretiertes Produkt handeln.The Applicant has indeed shown that the adenoviruses are capable The cells of the monocyte-macrophage lineage were very effective too infecting, keeping stable there and gaining a therapeutic gene express, may be an intracellular product or a membrane or act secreted product.

Es existieren verschiedene Serotypen von Adenoviren, deren Struktur und Eigenschaften ein wenig variieren, die aber für den Menschen und insbesondere für die nicht immungeschwächten Personen nicht krankmachend sind. Im Übrigen integrieren sich diese Viren nicht in das Genom der Zellen, die sie infizieren, und können große Fragmente von exogener DNA einbauen. Unter den verschiedenen Serotypen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung der Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) bevorzugt. Im Fall der Adenoviren Ad 5 sind die für die Replikation notwendigen Sequenzen die Regionen E1A und E1B.It There are several serotypes of adenoviruses, their structure and properties vary a bit, but for humans and in particular for the non-immunocompromised Persons are not ill. Incidentally, these integrate themselves Viruses do not enter the genome of the cells that infect them, and can have large fragments of exogenous DNA. Among the different serotypes is in the context of the present invention, the use of adenoviruses Type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) preferred. In the case of adenoviruses Ad 5 are the for the replication necessary sequences the regions E1A and E1B.

Die defektiven rekombinanten Adenoviren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch homologe Rekombination zwischen einem defektiven Adenovirus und einem Plasmid, das unter anderem die wie zuvor definierte Nukleinsäurensequenz trägt, hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). Die homologe Rekombination erfolgt nach Cotransfektion besagter Viren und Plasmid in eine geeignete Zelllinie. Die verwendete Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch besagte Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen umfassen, die den Genomteil des defektiven Virus komplementieren können, vorzugsweise in integrierter Form, um die Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie, die für die Herstellung von defektiven rekombinanten Adenoviren verwendbar ist, kann man die humane embryonale Nierenzell-Linie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) anführen, die insbesondere, in ihr Genom integriert, den linken Teil des Genoms eines Adenovirus Ad5 enthält (12 %).The defective recombinant adenoviruses, which are included in the present Invention can be used by homologous recombination between a defective adenovirus and a plasmid containing, inter alia, the nucleic acid sequence as defined above wearing, (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3 (12) (1984) 2917). Homologous recombination occurs after Cotransfection of said viruses and plasmid into a suitable cell line. The cell line used must preferably be (i) transformable by said elements and (ii) the sequences comprising the genome portion of the defective Can complement the virus, preferably in integrated form to the recombination risks to avoid. As an example for a line that for the production of defective recombinant adenoviruses is usable, can be the human embryonic kidney cell line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), in particular, integrated into their genome, the left part of the genome of an adenovirus Ad5 (12%).

Dann werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gemäß den herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie gewonnen und gereinigt.Then become the adenoviruses that have multiplied, according to the conventional ones Techniques of molecular biology gained and purified.

Techniken zur Konstruktion von Vektoren, die von den Adenoviren, HSV, CMV oder AAV abgeleitet sind, die heterologe Nukleinsäurensequenzen einbauen, wurden in der Literatur beschrieben und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573 , Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal Ia Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer und Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088, WO90/09441, WO88/10311].Techniques for constructing vectors derived from the adenoviruses, HSV, CMV or AAV incorporating heterologous nucleic acid sequences have been described in the literature and can be used within the scope of the present invention [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993)]. 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573 , Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal Ia Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer and Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91 / 18088, WO90 / 09441, WO88 / 10311].

Die Infektion der differenzierten Zellen der Monozyt-Makrophagen-Linie kann gemäß verschiedenen Protokollen mit einer Infektionsmultiplizität, die in Abhängigkeit von dem verwendeten Vektor, dem betroffenen Gen usw. anpassbar ist, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, durchgeführt werden.The Infection of the differentiated cells of the monocyte-macrophage line can according to different Protocols with a multiplicity of infection, depending on customizable by the vector used, the gene involved, etc., as described in the following examples.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung liegt in einer Zellzusammensetzung, umfassend Vorläuferzellen von Monozyten-Makrophagen, die ein defektives rekombinantes Adenovirus enthalten, welches unter der Kontrolle von ihre Expression erlaubenden Regulationselementen ein oder mehrere therapeutische Gene umfasst. Spezieller sind die Vorläuferzellen ausgewählt unter den Stammzellen und Vorstufen des hämatopoietischen Systems und umfassen insbesondere die pluripotenten Stammzellen, die myeloischen Stammzellen (CFU-GEMM), die myelomonozytischen Stammzellen (CFU-GM), die CFU-M, die Monoblasten und die Promonozyten.A special embodiment The invention resides in a cell composition comprising progenitor cells of monocyte macrophages that have a defective recombinant adenovirus which allows under the control of their expression Regulatory elements comprises one or more therapeutic genes. More specific are the progenitor cells selected among the stem cells and precursors of the hematopoietic system and include especially the pluripotent stem cells, the myeloid stem cells (CFU-GEMM), the myelomonocytic stem cells (CFU-GM), the CFU-M, the monoblasts and the promonocytes.

Wie oben angegeben, wird das therapeutische Gen unter die Kontrolle von seine Expression erlaubenden Regulationselementen gestellt. Diese Regulationselemente bestehen im Allgemeinen aus Promotor-Sequenzen der Transkription. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des betrachteten therapeutischen Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen in den Monozyten-Makrophagen funktionieren können. Es kann sich auch um Sequenzen anderen Ursprungs handeln (die für die Expression von anderen Proteinen verantwortlich sind, oder selbst synthetische). Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von Eukaryoten- oder Virusgenen handeln. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man infizieren möchte, stammen. Desgleichen kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus, einschließlich des als Vektor verwendeten Adenovirus stammen. Diesbezüglich kann man beispielsweise die Gen-Promotoren E1A, MLP, CMV, RSV usw. anführen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition von Aktivierungs-, Regulationssequenzen usw. modifiziert werden. So ist es in bestimmten Fällen (beispielsweise wenn das therapeutische Gen dasjenige von INF-γ oder TNF-α ist) besonders vorteilhaft, als Regulationselemente konstitutive Promotoren, die eine kontinuierliche und hohe Expression des therapeutischen Gens ermöglichen, zu verwenden. In anderen Fällen kann es vorteilhafter sein, einen regulierten Promotor zu verwenden, dessen Aktivität kontrolliert werden kann. Außerdem kann, wenn das inserierte Gen keine Expressionssequenzen umfasst, es in das Genom des defektiven Virus hinter einer solchen Sequenz inseriert werden.As As stated above, the therapeutic gene is under the control of its expression permitting regulatory elements. These regulatory elements generally consist of promoter sequences the transcription. These can be sequences that are natural for expression of the considered therapeutic gene, if these sequences can function in the monocyte macrophages. It can also be sequences of other origin (the ones for expression are responsible for other proteins, or even synthetic ones). Especially may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes act. For example, they may be promoter sequences that from the genome of the cell that you want to infect. Similarly they may be promoter sequences derived from the genome of a virus, including of the adenovirus vector used. In this regard can For example, the gene promoters E1A, MLP, CMV, RSV, etc. lead. Besides, these can Expression sequences by addition of activation, regulatory sequences etc. are modified. So it is in certain cases (for example if the therapeutic gene is that of INF-γ or TNF-α) is particularly advantageous, as regulatory elements constitutive promoters that provide a continuous and allow high expression of the therapeutic gene to use. In other Cases can it may be more advantageous to use a regulated promoter its activity can be controlled. Furthermore if the inserted gene does not comprise expression sequences, it into the genome of the defective virus behind such a sequence be advertised.

Die erfindungsgemäßen Zellzusammensetzungen umfassen im Allgemeinen eine Zellpopulation, die reich an Monozyten, Makrophagen oder ihren Vorläufern ist. So kann es sich um Monozyten, Makrophagen, ihre Vorläufer oder um ein Gemisch dieser verschiedenen Zelltypen handeln. Vorzugsweise besitzen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mehr als 80 % Monozyten, Makrophagen oder ihrer Vorläufer und noch stärker bevorzugt mehr als 90 %.The Cell compositions according to the invention generally comprise a cell population rich in monocytes, Macrophages or their precursors is. So it can be monocytes, macrophages, their precursors or to act as a mixture of these different cell types. Preferably possess the compositions of the invention more than 80% monocytes, macrophages or their precursors and even stronger preferably more than 90%.

Die gemäß der Erfindung ex vivo durch Verwendung eines rekombinanten adenoviralen Vektors transformierten Monozyten-Makrophagen stellen sich also als ein Werkzeug der Wahl für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung dar, die insbesondere antitumoral, antiinfektiös ist oder zur Stärkung des hämatopoitischen Systems eines Patienten, vor allem seines Immunsystems bestimmt ist.The according to the invention transformed ex vivo by use of a recombinant adenoviral vector Monocyte macrophages thus present themselves as a tool of choice for the Preparation of a pharmaceutical composition, in particular antitumoral, anti-infective is or to strengthen of the hematopoietic System of a patient, especially his immune system is.

Die vorliegende Erfindung hat auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die als Wirkstoff oben beschriebene Zellen der Monozyten-Makrophagen-Zelllinie enthält.The The present invention also has a pharmaceutical composition the subject, the cells of the monocyte-macrophage cell line described above as active ingredient contains.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf systemischem Weg, durch intratumorale Injektion usw., in Abhängigkeit von den angestrebten Anwendungen verabreicht werden. Außerdem können sie allein oder mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen kombiniert verwendet werden.The pharmaceutical compositions of the invention can systemically, by intratumoral injection, etc., depending administered by the intended applications. Besides, they can alone or combined with other pharmaceutical compositions be used.

In dem, was vorhergeht, beinhaltet der Ausdruck "kombiniert" nicht, dass die Monozyten-Makrophagen und die anderen Arzneimittel notwendigerweise im Gemisch oder gleichzeitig verabreicht werden. Er erstreckt sich auch auf jede Verwendung oder Darreichung, die ihre Verabreichungen in Zeitintervallen beinhaltet, die nicht null, aber ausreichend kurz sind, um eine Addition oder eine Synergie bei den hervorgerufenen Effekten zuzulassen.In to what precedes, the term "combined" does not imply that the monocyte macrophages and the other drugs necessarily in admixture or simultaneously be administered. It also covers any use or administration, which does not include their administrations at time intervals zero, but sufficiently short to add or synergy to allow for the evoked effects.

In einer besonderen Durchführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Zellen der Monozyt-Makrophagen-Linie, die eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für das gesamte Protein oder einen Teil eines Proteins kodiert, das dem Makrophagen die Eigenschaft verleiht, sämtliche oder einen Teil der Tumorzellen aus einem Organismus zu eliminieren.In a special implementation the present invention relates to a pharmaceutical composition, comprising cells of the monocyte-macrophage line containing a recombinant nucleic acid, the for encodes the entire protein or part of a protein that the macrophage gives the property, all or part of the To eliminate tumor cells from an organism.

Wie oben angegeben, erfordern es die mononukleären Phagozyten oder Monozyten, zu Makrophagen differenziert, dann aktiviert zu werden im Wesentlichen durch Interferon-gamma (INF-γ), um zu aktivierten Makrophagen zu werden, die eine Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen aufweisen. Bis heute wurden die Reifung des Monozyten zu einem Makrophagen und die Aktivierung durch Interferon-gamma in vitro ausgehend von monozytären Zellen, die durch Zytapheresen am Menschen entnommen, dann nach der Aktivierung wieder injiziert werden, durchgeführt. Jedoch haben die experimentellen Versuche wegen Problemen der Wirksamkeit der Aktivierung, der hohen Anzahl von notwendigen Injektionen (wenigstens eine Injektion pro Woche und folglich eine Zytapherese pro Woche), was sich als sehr schwer für den Patienten erweist, keine zufrieden stellenden Ergebnisse geliefert.As above, it requires the mononuclear phagocytes or monocytes, to differentiate macrophages, then to be activated essentially by interferon-gamma (INF-γ), to become activated macrophages that have cytotoxicity to tumor cells exhibit. To date, the maturation of the monocyte has become a macrophage and activation by interferon-gamma in vitro starting from monocytic Cells taken by cytapheresis in humans, then after the activation to be re-injected. however have the experimental tests because of problems of effectiveness activation, high number of necessary injections (at least one injection per week and consequently one cytapheresis per week), which proved very difficult for the patient does not provide satisfactory results.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, aus zirkulierenden Monozyten-Makrophagen oder ihren Vorläufern Zellpopulationen, die reich an antitumoralen Makrophagen sind, durch Transformation mit einer rekombinanten DNA, die beispielsweise INF-γ exprimiert, ex vivo zu erzeugen.The present invention enables it, from circulating monocyte macrophages or their precursors Cell populations rich in antitumoral macrophages Transformation with a recombinant DNA expressing, for example, INF-γ, to produce ex vivo.

Eine bevorzugte Form der vorliegenden Erfindung liegt also in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff wie zuvor definierte Monozyten-Makrophagen-Zellen umfasst, die ein defektives rekombinantes Adenovirus, das das Gen für Interferon-γ trägt, enthalten. Solche Zellen besitzen in der Tat verstärkte antikanzeröse Eigenschaften in der adoptiven Immuntherapie wegen einer konstanten und fortdauernden Stimulation der Makrophagen durch das Interferon-γ. Die Erfindung ermöglicht so die Herstellung von homogenen Populationen von tumoriziden menschlichen Makrophagen MAK (macrophages activated killers).A Preferred form of the present invention is thus in a pharmaceutical Composition containing as active ingredient as previously defined monocyte-macrophage cells which contains a defective recombinant adenovirus containing the gene for interferon-γ carries. Such cells do indeed possess enhanced anti-cancerous properties in adoptive immunotherapy because of a constant and ongoing Stimulation of macrophages by the interferon-γ. The invention allows so the production of homogeneous populations of tumoricidal human Macrophages MAK (macrophages activated killers).

Unter den Vorteilen dieser erfindungsgemäßen Zusammensetzung, verglichen mit den früheren Behandlungen, kann man ihre Reproduzierbarkeit, die Wirtschaftlichkeit der Behandlung und den dem Kranken verschafften Komfort, der ihm regelmäßige Zytapheresen erspart, anführen.Under the advantages of this composition according to the invention compared with the previous treatments, its reproducibility, cost-effectiveness of treatment and the comfort provided to the patient, which gives him regular cytapheresis spared, lead.

Außerdem spielt unter den Mediatoren der antitumoralen Aktivität der Makrophagen TNF-α (Tumor Necrosis Factor) ebenfalls eine bestimmende Rolle (Feinman et al., J. Immunol. 138 (1987) 635-640). TNF-α (oder Kachektin) ist ein Zytokin, das im Wesentlichen von Makrophagen als Antwort auf eine Gewebezerstörung, ein bakterielles Endotoxin, eine Virusinfektion oder andere Zytokine freigesetzt wird (Quantin B. et al., Human Gene Transfer 219 (1991) 271-272). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, Makrophagen, die ein rekombinantes Gen, das einen solchen Mediator exprimiert, ex vivo herzustellen, um sehr aktive Zellpopulationen zu erzeugen.Also plays Among the mediators of the antitumoral activity of macrophages TNF-α (Tumor Necrosis Factor) (Feinman et al., J. Immunol. 138 (1987) 635-640). TNF-α (or Cachectin) is a cytokine that is essentially derived from macrophages in response to a tissue destruction, a bacterial endotoxin, a viral infection or other cytokines (Quantin B. et al., Human Gene Transfer 219 (1991)). 271-272). In the context of the present invention, it is also possible macrophages, which is a recombinant gene that expresses such a mediator, ex vivo to produce very active cell populations.

Eine weitere bevorzugte Form der vorliegenden Erfindung liegt also in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff wie zuvor definierte Monozyten-Makrophagen-Zellen umfasst, die ein defektives rekombinantes Adenovirus enthalten, das ein für TNF-α kodierendes Gen trägt. Noch stärker bevorzugt umfassen die Zellen der Erfindung ein Gen, das für eine membranäre Form von TNF-α kodiert. Diese membranäre Expression von TNF-α verleiht den transformierten Zellen verstärkte antikanzeröse Eigenschaften, wenn sie in der adoptiven Immuntherapie verwendet werden. Diese Ausführungsform ermöglicht es außerdem, eine Freisetzung von TNF im extrazellulären Milieu zu vermeiden, da eine solche Freisetzung extrem schädliche entzündliche Effekte mit sich bringen kann.A Another preferred form of the present invention is therefore in a pharmaceutical composition used as an active ingredient as before defined monocyte-macrophage cells, which is a defective contain recombinant adenovirus carrying a gene encoding TNF-α. Yet stronger Preferably, the cells of the invention comprise a gene encoding a membranous form encoded by TNF-α. This membranous Expression of TNF-α confers amplified the transformed cells anticancer Properties when used in adoptive immunotherapy become. This embodiment allows it also to avoid a release of TNF in the extracellular milieu, since Such a release will cause extremely damaging inflammatory effects can.

Vorteilhafterweise kodiert die rekombinante Nukleinsäure für ein TNF-α, bei dem die Aminosäuren der N-terminalen Region deletiert sind, wobei besagte Deletion sich mindestens auf 3 Aminosäuren und höchstens auf 20 Aminosäuren und vorzugsweise auf die 12 N-terminalen Aminosäuren erstreckt.advantageously, encodes the recombinant nucleic acid for a TNF-α, in which the amino acids of the N-terminal region are deleted, said deletion itself at least 3 amino acids and at the most to 20 amino acids and preferably extends to the 12 N-terminal amino acids.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Zellen der Monozyt-Makrophagen-Linie umfasst, die eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für das gesamte Protein oder einen Teil eines Proteins kodiert, das dem Makrophagen die Eigenschaft verleiht, Manifestationen einer Infektion durch ein infektiöses Mittel, wie ein Virus, ein Retrovirus, einen Parasit oder eine Bakterie, durch Einleitung oder Regulation der Immunantwort zu verhüten oder zu behandeln.In a further embodiment the present invention relates to a pharmaceutical composition, the cells of the monocyte-macrophage line comprises a recombinant nucleic acid contain that for encodes the entire protein or part of a protein that which gives the macrophage the property of manifestations of infection through an infectious Means, such as a virus, a retrovirus, a parasite or a bacterium To prevent initiation or regulation of the immune response or to treat.

Diese Verwendung nutzt die Eigenschaft der Makrophagen, auf ihrer Oberfläche die Antigene zu präsentieren, dieses Präsentieren der Antigene stimuliert die Immunantwort der immunkompetenten Zellen, insbesondere die B-Lymphozyten und die T-Lymphozyten. Die im Organismus vorhandenen Antigene werden nämlich von den Makrophagen eingefangen, die sie verarbeiten, sie dann auf ihrer Oberfläche in Kombination mit den Histokompatibilitätskomplex-Klasse-II-Molekülen exprimieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, auf vorteilhafte Weise diese Eigenschaft der Makrophagen für eine allgemeine oder spezielle Stimulierung des Immunsystems zu entwickeln.These Use utilizes the property of the macrophages, on their surface the Presenting antigens, this presentation the antigen stimulates the immune response of the immunocompetent cells, in particular the B lymphocytes and the T lymphocytes. The in the organism Namely, existing antigens will become captured by the macrophages that process them, then open them up their surface in combination with the histocompatibility complex class II molecules. The present invention allows it, advantageously this property of the macrophages for a general or to develop special stimulation of the immune system.

Für die allgemeine Stimulierung des Immunsystems kann das therapeutische Gen ein rekombinantes Gen sein, das eine Verbindung exprimiert, die in der Lage ist, die Produktion der MHC-Klasse-II-Moleküle zu stimulieren das es ermöglicht, erfindungsgemäße Zellen mit verstärkten Eigenschaften zur Antigenpräsentation zu erzeugen; und/oder ein rekombinantes Gen, das ein virales oder bakterielles Oberflächenantigen exprimiert, das es ermöglicht, erfindungsgemäße Zellen zu erzeugen, die eine verstärkte Immunabwehr gegen diesen Infektionstyp einleiten. Als Beispiel für solche Antigene kann man insbesondere das Glykoprotein des Tollwutvirus anführen.For general stimulation of the immune system, the therapeutic gene may be a recombinant gene expressing a compound capable of stimulating the production of the MHC class II molecules which allows for cells of the invention having enhanced antigen presenting properties produce; and / or a Recombinant gene expressing a viral or bacterial surface antigen making it possible to produce cells of the invention which induce enhanced immune defense against this type of infection. As an example of such antigens, one can cite, in particular, the glycoprotein of the rabies virus.

Für eine spezifische Stimulierung des Immunsystems können die Makrophagen für die Präsentation von definierten Antigenen mit dem Ziel des Impfens verwendet werden.For a specific Stimulation of the immune system can the macrophages for the presentation be used by defined antigens with the aim of vaccination.

Die rekombinante Nukleinsäure wird vorzugsweise von einem adenoviralen Vektor getragen, der im oben definierten Sinn defektiv ist.The recombinant nucleic acid is preferably carried by an adenoviral vector, which in the Defined above sense is defective.

Die vorliegende Erfindung hat auch ein Verfahren zur Herstellung von wie zuvor definierten Monozyten-Makrophagen zum Gegenstand, das die folgenden Schritte umfasst:

1. die Kultur der Zellen von Monozyten-Makrophagen oder ihren Vorläufern, die aus Blut oder Knochenmark entnommen und isoliert worden sind,
2. die Transformation dieser Zellen mit einer wie zuvor definierten rekombinanten Nukleinsäure und gegebenenfalls
3. die Konditionierung und/oder Lagerung der so erhaltenen Zellen.

The subject of the present invention is also a process for the preparation of monocyte macrophages as defined above comprising the following steps:

1. the culture of the cells of monocyte macrophages or their precursors taken from blood or bone marrow and isolated,
2. the transformation of these cells with a recombinant nucleic acid as defined above and optionally
3. the conditioning and / or storage of the cells thus obtained.

Die Entnahme und Isolierung der Monozyten-Makrophagen-Zellen oder ihrer Vorläufer können durch jede dem Fachmann bekannte Technik ausgeführt werden. Diese verschiedenen Techniken können physikalische Schritte zum Trennen (Zentrifugieren, Zell-Sortierung (FACS) usw.), die Selektion durch immunologische Verbindungen (spezifische Antikörper von Zellmarkern: US 4,965,204 ; EP 17 381 , EP 30 450 usw.) oder biochemische Verbindungen (Liganden von Membranrezeptoren: EP 405 972 ) usw. beinhalten.The removal and isolation of the monocyte-macrophage cells or their precursors may be carried out by any technique known to those skilled in the art. These different techniques may include physical steps of separation (centrifugation, cell sorting (FACS), etc.), selection by immunological compounds (specific antibodies of cell markers: US 4,965,204 ; EP 17 381 . EP 30 450 etc.) or biochemical compounds (ligands of membrane receptors: EP 405 972 ) and so on.

Die Monozyten-Makrophagen können aus dem Blut durch verschiedene Techniken erhalten werden und insbesondere durch Zytapherese (Lopez et al., J. Immunol. Methods, 159 (1992) 29) oder durch Verwendung von Antikörpern, die gegen spezifische Marker der Monozyten-Makrophagen-Zellen gerichtet sind, wie C414, CD64 oder Max1. Sie können auch ex vivo aus Vorläuferzellen durch Kultur unter geeigneten Bedingungen, die ihre Differenzierung ermöglichen, erhalten werden.The Monocyte macrophages can be obtained from the blood by various techniques and in particular by cytapheresis (Lopez et al., J. Immunol. Methods, 159 (1992) 29) or by using antibodies that are specific to Markers of monocyte-macrophage cells, such as C414, CD64 or Max1. You can also ex vivo from progenitor cells by culture under suitable conditions that allow for their differentiation to be obtained.

Die Vorläuferzellen können auch mittels Antikörpern isoliert werden, die spezifische Marker erkennen, wie: Stammzellen: CD33, CD34; CFU-GM- und CFU-M-Zellen: CD13, CD14, CD15, CD33, HLA DR; Monoblasten und Promonozyten: CD13, CD14, CD15, CD33. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare Techniken sind dem Fachmann bekannt: siehe beispielsweise die Anmeldungen EP451 611 , WO93/02182.The progenitor cells can also be isolated by means of antibodies which recognize specific markers, such as: stem cells: CD33, CD34; CFU-GM and CFU-M cells: CD13, CD14, CD15, CD33, HLA DR; Monoblasts and promonocytes: CD13, CD14, CD15, CD33. Techniques which can be used in the context of the present invention are known to the person skilled in the art: see for example the applications EP451 611 , WO93 / 02182.

Die so erhaltenen Zellen können dann unter jeglicher sterilen Bedingung, die ihre Erhaltung, ihre Proliferation und/oder ihre Differenzierung (wenn es sich um Vorläuferzellen handelt) ermöglicht, kultiviert werden. Die Kultur kann also nur ausgeführt werden, um die Zellen während der Transformation zu erhalten. Es ist in der Tat möglich, die Zellen auf der Stufe eines Vorläufers oder von Monozyten zu transformieren, die dann in vivo differenziert und/oder aktiviert werden, nachdem sie dem Patient wieder verabreicht worden sind. Desgleichen kann die Differenzierung/Aktivierung ex vivo nach der Transformation ausgeführt werden. Die Kultur kann auch ausgeführt werden, um eine Proliferation und/oder eine Differenzierung der Zellen zu ermöglichen, bevor die Transformation an den reifen Zellen (Monozyten, Makrophagen, MAK) ausgeführt wird. Insbesondere können die Proliferation der Vorläufer und ihre Differenzierung zu monozytären Zellen ex vivo in Gegenwart von Wachstums- und Differenzierungsfakfioren, wie GM-CSF, M-CSF, die Interleukine IL3, IL4 und IL11 oder auch SCF, ausgeführt werden.The so obtained cells can then under any sterile condition, its preservation, its proliferation and / or their differentiation (if they are precursor cells trades), be cultivated. So the culture can only be done to the cells during to get the transformation. It is indeed possible that Cells at the level of a precursor or from monocytes, which then differentiates in vivo and / or activated after being re-administered to the patient are. Likewise, differentiation / activation may be ex vivo the transformation is executed become. The culture can also be carried out to proliferation and / or to allow differentiation of the cells before the transformation on the mature cells (monocytes, macrophages, MAK). In particular, you can the proliferation of precursors and their differentiation to monocytic cells ex vivo in the presence of Growth and differentiation factors, such as GM-CSF, M-CSF, the Interleukins IL3, IL4 and IL11 or SCF.

Die Kultur der isolierten Zellen kann in verschiedenen Medien ausgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind (Beispiel: RPMI, IMDM), die unter anderem mit Serum und Aminosäuren ergänzt werden. Die Kultur wird unter sterilen Bedingungen vorzugsweise bei 37 °C, wie in den Beispielen erläutert, durchgeführt. Sie kann in Kulturplatten oder vorzugsweise in Teflonbeuteln ausgeführt werden.The Culture of isolated cells can be performed in different media those skilled in the art are known (example: RPMI, IMDM), the under other with serum and amino acids be supplemented. The culture is preferably kept at 37 ° C under sterile conditions, as in explained the examples, carried out. It can be carried out in culture plates or preferably in teflon bags.

Die Kulturbedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der isolierten Zellpopulation, der angestrebten Verwendung usw., angepasst werden.The Culture conditions can by the expert in dependence from the isolated cell population, the intended use, etc., be adjusted.

Desgleichen wird die Transformation der Zellen durch die rekombinante Nukleinsäure in sterilem Medium unter Bedingungen ausgeführt, die vom Fachmann in Abhängigkeit von der Nukleinsäure, der isolierten Zellpopulation usw., angepasst werden.Similarly the transformation of the cells by the recombinant nucleic acid in sterile medium carried out under conditions depending on the specialist from the nucleic acid, the isolated cell population, etc., to be adjusted.

Wenn die Nukleinsäure von einem Adenovirus getragen wird, kann die Infektion der Zellen der Monozyt-Makrophagen-Linie gemäß verschiedenen Protokollen mit einer Infektionsmultiplizität, die in Abhängigkeit von dem verwendeten Vektor und dem betroffenen Gen anpassbar ist, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Monozyten-Makrophagen in Gegenwart von 50 bis 250 pfu gereinigtem Virus pro Zelle und stärker bevorzugt von 80 bis 100 pfu/Zelle inkubiert. Je nach den Transformationsbedingungen kann der Prozentsatz an Zellen, die durch Insertion der rekombinanten Nukleinsäure modifiziert sind, von 30 bis 95 % variieren.If the nucleic acid Carried by an adenovirus, infection of cells can the monocyte-macrophage line according to different protocols with a multiplicity of infections, the dependent customizable by the vector used and the gene involved, as described in the following examples. Preferably, the monocyte macrophages are in the presence of 50 to 250 pfu purified virus per cell, and more preferably from 80 to 100 pfu / cell incubated. Depending on the transformation conditions can the percentage of cells obtained by insertion of the recombinant nucleic acid modified, vary from 30 to 95%.

Die so erhaltenen modifizierten Zellen können dann im Hinblick auf eine sofortige Verwendung konditioniert und/oder im Hinblick auf eine spätere Verwendung gelagert werden.The Thus obtained modified cells can then with regard to Conditioned immediate use and / or with regard to a later use be stored.

Für eine sofortige Wiederverabreichung werden die Zellen im Allgemeinen in einem Phosphatpuffer oder in physiologischem Serum in einer Konzentration, die von 10⁵ bis 10⁹ Zellen pro Dosis variiert, suspendiert.For immediate re-administration, cells are generally suspended in a phosphate buffer or physiological serum at a concentration varying from 10 ⁵ to 10 ⁹ cells per dose.

Für ihre Aufbewahrung können die Zellen eingefroren werden, vorzugsweise in Gegenwart von Konservierungsmitteln, wie Glycerin, DMSO usw.For their storage can the cells are frozen, preferably in the presence of preservatives, like glycerine, DMSO etc.

Die erfindungsgemäßen Zellzusammensetzungen ermöglichen so die Durchführung eines Behandlungsverfahrens, das die Verabreichung von wie zuvor definierten Zellen umfasst. Es kann sich um Zellen handeln, die vom Patienten (autologe) oder von einem Spender (allogene) stammen.The Cell compositions according to the invention enable so the implementation a treatment procedure that allows the administration of as before comprises defined cells. They can be cells that from the patient (autologous) or from a donor (allogeneic).

Die Verabreichung kann auf verschiedene Arten ausgeführt werden. Vorzugsweise werden die Zellen durch Injektion, vorzugsweise intravenöse oder intratumorale, verabreicht Außerdem kann die systemische Injektion durch Perfusion durchgeführt werden.The Administration can be carried out in several ways. Preferably the cells by injection, preferably intravenous or intratumoral, administered in addition the systemic injection can be performed by perfusion.

Ein besonderes Behandlungsverfahren umfasst:

1. die Entnahme und Isolierung der Monozyten-Makrophagen oder ihrer Vorläufer aus Blut oder Knochenmark,
2. die Kultur dieser Zellen,
3. die Transformation dieser Zellen mit einer wie zuvor definierten rekombinanten Nukleinsäure, gegebenenfalls
4. die Konditionierung und/oder Lagerung der so erhaltenen Zellen, dann
5. ihre Verabreichung an den Patienten.

A special treatment method includes:

1. the removal and isolation of monocyte macrophages or their precursors from blood or bone marrow,
2. the culture of these cells,
3. the transformation of these cells with a recombinant nucleic acid as defined above, optionally
4. the conditioning and / or storage of the cells thus obtained, then
5. their administration to the patient.

Die Behandlung der vorliegenden Erfindung bietet zahlreiche Vorteile, verglichen mit den anderen Behandlungen in der adoptiven Immuntherapie durch die LAK, die TIL oder die NK (natural killers), wie beispielsweise die Abwesenheit von toxischen Mediatoren, die von den Zellen freigesetzt werden, die Abwesenheit einer Proliferation von aktivierten Makrophagen, die Tatsache, dass das Verhältnis Effektor zu Zielzellen für die Zytotoxizität niedriger ist als bei den anderen Behandlungen, und die Tatsache, dass sie keine gleichzeitige Injektion eines Zytokins, wie IL2, dessen Nebenwirkungen schlimm sind, erfordert. Zudem ermöglicht sie es, nur eine definierte und kontrollierte Zellpopulation zu infizieren, sie ermöglicht es, die Infektionsmultiplizität (Anzahl an viralen Teilchen pro Zellen) zu wählen, sie ermöglicht es, die Gewebe ausgehend vom Blutkreislauf auf irreversible Weise zu erreichen, und sie ermöglicht es, die zentrale Rolle der Makrophagen im Organismus sowohl über ihre antitumorale oder antiinfektiöse Aktivität als auch in ihrer Aktivität der Stimulierung oder Regulation des Immunsystems, wie oben erklärt, zu nutzen. Berücksichtigt man außerdem die große Lebensdauer der Makrophagen, kann eine für den Kranken behindernde Wiederholung von Behandlungen vermieden werden.The Treatment of the present invention offers numerous advantages, compared to the other treatments in adoptive immunotherapy by the LAK, the TIL or the NK (natural killers), such as the absence of toxic mediators released by the cells the absence of proliferation of activated macrophages, the fact that the ratio Effector to target cells for the cytotoxicity lower than the other treatments, and the fact that they do not receive a simultaneous injection of a cytokine, such as IL2, whose Side effects are bad, requires. In addition, it allows it to infect only a defined and controlled cell population, it makes it possible the multiplicity of infection (Number of viral particles per cell), it allows the tissues from the bloodstream in an irreversible manner reach, and it allows it, the central role of macrophages in the organism both over their anti-tumor or anti-infective activity as well as in their activity stimulation or regulation of the immune system as explained above. Considered one as well the size Life of the macrophages, may be a hindrance to the patient recurrence be avoided by treatments.

Die vorliegende Erfindung bietet folglich neue wirksamere Behandlungsmöglichkeiten, die für den Kranken weniger beanspruchend, weniger kostspielig und reproduzierbarer sind.The present invention thus provides new more effective treatment options, the for the Less demanding, less expensive and more reproducible are.

Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden Beschreibung der Möglichkeiten einer Transformation der Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie und der Expression des therapeutischen Gens sowohl an Zellen in Kultur wie auch an in vivo in Tumore reinjizierten Zellen detaillierter ausgeführt.The The present invention will become apparent in the following description of the possibilities a transformation of the cells of the monocyte-macrophage line and the expression of the therapeutic gene both on cells in culture as well as in vivo in tumors reinjected cells in more detail executed.

Die angegebenen Beispiele sind nicht beschränkend, sondern eine Erläuterung der Durchführbarkeit des Verfahrens und der Erhaltung der Wirksamkeit des Gens und des Proteins, das in dem Makrophagen sowohl in vitro als auch ex vivo als auch in vivo von dem transferierten Gen exprimiert wird.The Examples given are not limiting, but an explanation the feasibility the process and the preservation of the efficacy of the gene and the Protein present in the macrophage both in vitro and ex vivo as well as being expressed in vivo by the transferred gene.

Legende der FigurenLegend of characters

1. Diese Figur stellt Schnitte von Makrophagen dar, die von Monozyten abgeleitet sind, die mit einem defektiven rekombinanten Adenovirus, der das Gen Lac-Z von E.coli (Ad RSV β gal) trägt, infiziert sind, 48 Stunden nach der Infektion (1a), 4 Tage nach der Infektion (1b) und 16 Tage nach der Infektion (1c). 1d: nicht infizierte Kontrollzellen. 1 , This figure represents sections of macrophages derived from monocytes infected with a defective recombinant adenovirus carrying the Lac-Z gene of E. coli (Ad RSV β gal) 48 hours after infection (Fig. 1a ), 4 days after infection ( 1b ) and 16 days after infection ( 1c ). 1d : uninfected control cells.

2. Nachweis der Aktivität der β-Galactosidase, die in den durch das Adenovirus Ad RSV β gal transformierten Monozyten-Makrophagen exprimiert wird, nach intratumoraler Injektion an Nacktmäusen. 2 , Demonstration of the activity of β-galactosidase expressed in monocyte macrophages transformed by the adenovirus Ad RSV β gal after intratumoral injection to nude mice.

Die Mäuse weisen Tumoren auf, die durch subkutane Injektion von Tumorzellen eines menschlichen Mesothelioms induziert worden sind, und werden durch intratumorale Injektion von menschlichen Monozyten-Makrophagen, die mit Ad RVS β gal infiziert sind, behandelt. Drei Tage nach der Behandlung werden die Tumoren extrahiert, fixiert und die Gegenwart von β-Galactosidase-Aktivität wird bestimmt.The Mice show Tumors resulting from subcutaneous injection of tumor cells human mesothelioma have been induced, and are transmitted through intratumoral injection of human monocyte macrophages, those with Ad RVS β gal are infected, treated. Three days after the treatment will be the tumors are extracted, fixed and the presence of β-galactosidase activity is determined.

Allgemeine Techniken der MolekularbiologieGeneral Techniques of molecular biology

Die herkömmlicherweise in der Molekularbiologie verwendeten Verfahren, wie die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchlorid-Gradienten, die Elektrophorese über Agarose- oder Acrylamidgele, die Reinigung von DNA Fragmenten durch Elektroeluierung, die Extraktion von Proteinen mit Phenol oder mit Phenol-Chloroform, die Fällung von DNA in salzhaltigem Medium mit Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw..., sind dem Fachmann gut bekannt und in der Literatur ausgiebig beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].The methods conventionally used in molecular biology, such as the preparative extractions of plasmid DNA, are centrifugation plasmid DNA in a cesium chloride gradient, electrophoresis over agarose or acrylamide gels, purification of DNA fragments by electroelution, extraction of proteins with phenol or with phenol-chloroform, precipitation of DNA in saline medium with ethanol or isopropanol, transformation into Escherichia coli, etc., are well known to those skilled in the art and extensively described in the literature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982 ; Ausubel FM et al. (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, New York, 1987].

Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Reihe M13 sind kommerzieller Herkunft (Bethesda Research Laboratories).The Plasmids of the type pBR322, pUC and the phages of the series M13 are more commercial Origin (Bethesda Research Laboratories).

Für die Ligaturen können die DNA-Fragmente nach ihrer Größe durch Elektrophorese in Agarose- oder Acrylamidgelen getrennt werden, mit Phenol oder mit einem Gemisch Phenol/Chloroform extrahiert werden, mit Ethanol gefällt werden, dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) nach den Empfehlungen des Herstellers inkubiert werden.For the ligatures can the DNA fragments according to their size Electrophoresis in agarose or acrylamide gels, be extracted with phenol or with a mixture of phenol / chloroform, precipitated with ethanol , then in the presence of DNA ligase of phage T4 (Biolabs) be incubated according to the recommendations of the manufacturer.

Das Auffüllen der überhängenden 5'-Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E.coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferanten ausgeführt werden. Der Abbau der überhängenden 3'-Enden wird in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird, ausgeführt. Der Abbau der überhängenden 5-Enden wird durch eine schonende Behandlung mit der Nuclease S1 ausgeführt.The Fill up the overhanging 5'-ends can through the Klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli (Biolabs) according to the specifications of Suppliers executed become. The removal of the overhanging 3 'ends is in Presence of phage T4 DNA polymerase (Biolabs) prepared according to the recommendations used by the manufacturer. The removal of the overhanging 5-ends is carried out by a gentle treatment with nuclease S1.

Die gerichtete in vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynucleotide kann gemäß dem von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits ausgeführt werden.The directed in vitro mutagenesis by synthetic oligodeoxynucleotides can according to the of Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] Procedures using the sold by Amersham kit.

Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die PCR genannte Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. und Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] kann unter Verwendung eines "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers ausgeführt werden.The enzymatic amplification of DNA fragments by PCR Technique [Polymerase-Catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzyme. 155 (1987) 335-350] can be prepared using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the specifications carried out by the manufacturer become.

Die Verifizierung der Nucleotid-Sequenzen kann durch das von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] entwickelte Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits ausgeführt werden.The Verification of nucleotide sequences can be performed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] Procedures using the sold by Amersham kit.

Für die Herstellung von Adenoviren wurde die humane embryonale Nierenzell-Linie 293 verwendet (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Diese Linie enthält insbesondere, in ihr Genom integriert, den linken Teil des Genoms des menschlichen Adenovirus Ad5 (12 %).For the production of adenoviruses, the human embryonic kidney cell line 293 was used (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). In particular, this line contains integrated into their genome, the left part of the genome of the human adenovirus Ad5 (12%).

BeispieleExamples

Beispiel 1: Herstellung der Monozyten und der MakrophagenExample 1: Preparation monocytes and macrophages

Die verwendete Technik zur Herstellung der Makrophagen wurde bereits in der Literatur beschrieben (Lopez et al., 1993 oben zitiert). Kurz, es wurden die mononukleären Zellen (MNC) von den Erythrozyten und Granulozyten über einen Ficoll-Hypaque Gradienten (d = 1,077) unter Verwendung des Blutprozessors Cobe 2991 abgetrennt, dann dreimal mit einem Phosphatpuffer gewaschen. Ein Teil der MNC wurde verwendet, um Monozyten durch Elutriation unter den unten angegebenen Bedingungen herzustellen. Der andere Teil der MNC wurde in einem IMDM-Medium (Gibco, Frankreich), das 3·10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 1 % nicht essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 100 IE Penicillin pro ml, 100 μg Streptomycin pro ml und 2 % AB-Serum enthält, in 600 ml-Teflonbeuteln kultiviert (510⁶ pro ml), dann bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂ 7 Tage lang inkubiert.The technique used to produce the macrophages has already been described in the literature (Lopez et al., Cited above, 1993). Briefly, the mononuclear cells (MNC) were separated from the erythrocytes and granulocytes via a Ficoll-Hypaque gradient (d = 1.077) using the Cobe 2991 blood processor, then washed three times with a phosphate buffer. Part of the MNC was used to produce monocytes by elutriation under the conditions given below. The other part of the MNC was in an IMDM medium (Gibco, France) containing 3 x 10 ^-5 M 2-mercaptoethanol, 1% nonessential amino acids, 2 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate, 100 IU penicillin per ml, Containing 100 μg streptomycin per ml and 2% AB serum, cultured in 600 ml Teflon bags (510 ⁶ per ml), then incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO _{2 for} 7 days.

Die Zellen wurden dann gewonnen und die Monozyten-Makrophagen durch Elutriation unter Verwendung einer Beckman Zentrifuge J6ME, die mit einem Rotor J 5.0 und einer Elutriationskammer von 40 ml ausgestattet ist, auf 95 % gereinigt.The Cells were then recovered and the monocyte macrophages through Elutriation using a Beckman centrifuge J6ME, the equipped with a rotor J 5.0 and an elutriation chamber of 40 ml is cleaned to 95%.

Beispiel 2: Infektion der Monozyten und der Makrophagen mit einem adenoviralen Vektor, der das β-Galactosidase-Gen exprimiert (Ad. RSV β gal).Example 2: Infection of monocytes and macrophages with an adenoviral vector, the β-galactosidase gene expressed (Ad. RSV β gal).

2.1. Herstellung des Vektors: Der in diesem Beispiel verwendete adenovirale Vektor ist der Vektor Ad.RSV.βgal. Dieser Vektor ist frei von Sequenzen, die für seine Replikation notwendig sind, umfasst aber trotzdem die Sequenzen, die notwendig sind, um in die durch ihn infizierbaren Zellen einzudringen, sowie die Gesamtheit der wesentlichen Sequenzen, die für die Verpackung dieses Adenovirus notwendig sind. Er umfasst auch, unter der Kontrolle des RSV-Promotors, das β-Galactosidase-Gen von E. coli. Die Konstruktion des defektiven rekombinanten Adenovirus Ad.RSVβgal wurde in der Literatur beschrieben (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626). Kurz, das Adenovirus Ad.RSVβGal ist ein defektives rekombinantes Adenovirus (die Regionen E1 und E3 sind deletiert), das durch homologe Rekombination in vivo zwischen dem mutanten Adenovirus Ad-d1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) und dem Plasmid pAd.RSVβGal (Akli et al. 1993) erhalten wird.2.1. Preparation of the Vector: The adenoviral vector used in this example is the vector Ad.RSV.βgal. This vector is free of sequences necessary for its replication, but nevertheless includes the sequences necessary to invade the cells infectable by it, as well as all the essential sequences necessary for the packaging of this adenovirus. It also comprises, under the control of the RSV promoter, the E. coli β-galactosidase gene. The construction of the defective recombinant adenovirus Ad.RSVβgal has been described in the literature (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin Invest 90 (1992) 626). Briefly, the adenovirus Ad.RSVβGal is a defective recombinant adenovirus (the E1 and E3 regions are deleted), which are characterized by homologous recombination in vivo between the mutant adenovirus Ad-d1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) and the Plasmid pAd.RSVβGal (Akli et al. 1993).

Das Plasmid pAd. RSVβGal enthält in der Orientierung 5' → 3'

– das Fragment Pvull, das dem linken Ende des Adenovirus Ad5 entspricht, umfassend: die Sequenz ITR, den Replikationsursprung, die Verpackungssignale und den Enhancer E1A;
– das für die β-Galactosidase kodierende Gen unter der Kontrolle des RSV-Promotors (des Rous Sarkom-Virus),
– ein zweites Fragment des Genoms des Adenovirus Ad5, das die homologe Rekombination zwischen dem Plasmid pAd.RSVβGal und dem Adenovirus d1324 ermöglicht.

The plasmid pAd. RSVβGal contains in the orientation 5 '→ 3'

The fragment Pvull, which corresponds to the left end of the adenovirus Ad5, comprising: the sequence ITR, the origin of replication, the packaging signals and the enhancer E1A;
The gene coding for the β-galactosidase under the control of the RSV promoter (the Rous sarcoma virus),
A second fragment of the adenovirus Ad5 genome allowing homologous recombination between the plasmid pAd.RSVβGal and the adenovirus d1324.

Nach Linearisierung durch das Enzym Clal werden das Plasmid pAd.RSVβGal und das Adenovirus d1324 in die Linie 293 in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfektiert, um die homologe Rekombination zu ermöglichen. Die so erzeugten rekombinanten Adenoviren werden durch Reinigung auf einer Platte selektioniert. Nach der Isolierung wird die DNA des rekombinanten Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führt, der das nicht gereinigte rekombinante defektive Adenovirus mit einem Titer von etwa 10¹⁰ pfu/ml enthält.After linearization by the enzyme Clal, the plasmid pAd.RSVβGal and the adenovirus d1324 are cotransfected into the line 293 in the presence of calcium phosphate to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus produced are selected by purification on a plate. After isolation, recombinant adenovirus DNA is amplified in cell line 293, resulting in a culture supernatant containing the uncleaned recombinant defective adenovirus at a titre of about 10 ¹⁰ pfu / ml.

Die viralen Teilchen werden im Allgemeinen durch Zentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten gemäß den bekannten Techniken gereinigt (siehe insbesondere Graham et al., Virology 52 (1973) 456).The Viral particles are generally formed by centrifugation a cesium chloride gradient according to the known Techniques (see, in particular, Graham et al., Virology 52 (1973) 456).

Dieses Adenovirus wurde verwendet, um die Möglichkeit der Transformation der Monozyten-Makrophagen zu demonstrieren und um die Wirksamkeit des Gentransfers in diese Zellen zu zeigen.This Adenovirus was used to the possibility of transformation to demonstrate the monocyte macrophages and the effectiveness of gene transfer into these cells.

2.2. Infektion der Monozyten und Makrophagen: Frische Monozyten oder Makrophagen wurden über Nacht in Gegenwart von 80 bis 100 PFU (Plaque forming unit) gereinigtem Virus (Ad. RSV βgal) pro Zelle in einem vollständigen RPMI-Medium inkubiert (1.10⁶ Zellen pro ml). Die Zellen wurden gewaschen, um die freien Virusteilchen zu entfernen, dann von neuem in frischem vollständigem RPMI-Medium in Teflonbeuteln oder in Kulturplatten mit 12 Vertiefungen inkubiert. Zu verschie denen Zeitpunkten wurden Aliquote von Zellen gewaschen, fixiert und auf die Gegenwart von β-Galactosidase-Aktivität getestet.2.2. Infection of monocytes and macrophages: Fresh monocytes or macrophages were incubated overnight in the presence of 80 to 100 PFU of purified virus (Ad.RSVβgal) per cell in complete RPMI medium (1.10 ⁶ cells per ml). The cells were washed to remove the free virus particles, then incubated anew in fresh complete RPMI medium in teflon bags or in 12-well culture plates. At various times, aliquots of cells were washed, fixed and assayed for the presence of β-galactosidase activity.

Die β-Galactosidase-Aktivität wurde in den Zellen nach Infektion durch das rekombinante Adenovirus unter Verwendung von histochemischen Verfahren, wie in (Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1 (1990) 241) beschrieben, getestet. Kurz, die Zellen werden in Gegenwart von X-gal inkubiert, um die β-gal Aktivität aufzuzeigen, die dann durch Auftreten einer blauen Färbung im Kern der Zellen, die das β-gal-Gen enthalten und mit Hämotoxylin und Eosin gegengefärbt werden, sichtbar gemacht wird.The β-galactosidase activity was in the cells after infection by the recombinant adenovirus Use of histochemical methods as described in (Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1 (1990) 241). Short, the cells are incubated in the presence of X-gal to demonstrate β-gal activity, then by the appearance of a blue staining in the nucleus of the cells, the the β-gal gene contained and with hemotoxylin and eosin counterstained be made visible.

Beispiel 3: Aufzeigen des Gentransfers in den menschlichen Monozyten oder den von menschlichen Monozyten abgeleiteten Makrophagen, die mit dem rekombinanten adenoviralen Vektor, der das β-Galactosidase-Gen trägt, transformiert sind.Example 3: Show of gene transfer in human monocytes or human ones Monocyte-derived macrophages infected with the recombinant adenoviral Vector containing the β-galactosidase gene wearing, are transformed.

3.1. Expression der β-Galactosidase-Aktivität in den Monozyten-Makrophagen in Zellkultur.3.1. Expression of β-galactosidase activity in monocyte macrophages in cell culture.

Die Wirksamkeit des Gentransfers mit den adenoviralen Vektoren wurde in den gereinigten Monozyten und in den von diesen gleichen monozytären Zellen abgeleiteten Makrophagen getestet. Die durch Zytapherese erhaltenen mononukleären Blutzellen wurden über einem Ficoll-Gradienten, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetrennt. Ein Teil der MNC-Suspension wurde einer Elutriation unterzogen und die so erhaltenen Monozyten wurden bei den Infektionsversuchen (Beispiel 2) verwendet. Ein zweiter Teil der MNC-Suspension wurde 6 bis 7 Tage kultiviert, was die Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen, wie in Beispiel 1 beschrieben, ermöglicht. Nach diesem Kulturzeitraum wurden die Makrophagen ebenfalls durch Elutriation gereinigt. Die so gereinigten Makrophagen sind zweimal größer als die Monozyten und exprimieren auf ihrer Oberfläche das spezifische Antigen der Differenzierung Max 1. Die Expression von CD 14, von HLA-DR und von CD 64 ist ebenfalls signifikant erhöht, wenn man mit den Ausgangs-Monozyten vergleicht. Ein Teil der aus den Monozyten in Kultur erhaltenen Makrophagen wurde anschließend durch Zugabe von 250 IE/ml rekombinantem Interferon-gamma etwa 18 Stunden vor dem Ende der Kultur gemäß dem in Lopez et al. (J. Immunotherapy 11 (1992) 209- 217) beschriebenen Protokoll aktiviert. Diese Aktivierung ermöglicht den Erhalt von aktivierten Makrophagen, die in der antiinfektiösen Immuntherapie wirksam sein können.The Effectiveness of gene transfer with the adenoviral vectors was in the purified monocytes and in the same monocytic cells derived macrophages tested. Those obtained by cytapheresis mononuclear Blood cells were over a Ficoll gradient, as described in Example 1, separated. Part of the MNC suspension was subjected to elutriation and the monocytes thus obtained were used in the infection experiments (Example 2) used. A second part of the MNC suspension became 6 to 7 Days cultured, indicating the differentiation of monocytes into macrophages, such as described in Example 1 allows. After this culture period, the macrophages were also by Elutriation purified. The so purified macrophages are twice greater than the monocytes and express on their surface the specific antigen differentiation Max 1. Expression of CD 14, from HLA-DR and CD64 is also significantly elevated when compared with the parent monocytes compares. Part of the obtained from the monocytes in culture Macrophages were subsequently by adding 250 IU / ml of recombinant interferon-gamma about 18 Hours before the end of the culture according to the method described in Lopez et al. (J. Immunotherapy 11 (1992) 209-217) protocol described. This activation allows the Obtaining activated macrophages involved in anti-infective immunotherapy can be effective.

Die gereinigten Monozyten oder die gereinigten Makrophagen wurden entweder nach 6 Tagen Kultur (das heißt vor Aktivierung durch Interferon-gamma) oder nach 7 Tagen Kultur (nach Aktivierung durch Interferon-gamma) mit 80 bis 100 pfu (für plaque forming units) rekombinantem Adenovirus Ad. RSV βgal pro Zelle infiziert.The purified monocytes or the purified macrophages were either after 6 days of culture (ie before activation by interferon-gamma) or after 7 days of culture (after activation by interferon-gamma) with 80 to 100 pfu (for plaque forming units) recombinant adenovirus Ad. RSV βgal infected per cell.

Nach Infektion über Nacht wird das Medium entfernt, die Zellen gewaschen und in einem frischen vollständigen Medium entweder in Teflonbeuteln oder in Platten mit zwölf Vertiefungen wieder inkubiert. Die Zellen wurden dann fixiert und auf die β-Galactosidase-Aktivität zu verschiedenen Zeitintervallen nach der Infektion getestet. Die Expression der β-Galactosidase im Zellkern zeigt die Wirksamkeit des Transfers des Gens und seine Expression.After overnight infection, the medium is removed, the cells are washed and reincubated in a fresh complete medium, either in Teflon bags or in 12-well plates. The cells were then fixed and assayed for β-galactosidase activity at various time intervals after infection. The expression of β-galactosidase in the nucleus shows the effectiveness of the Transfers of the gene and its expression.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 1 dargestellt. Sie zeigen den Nachweis der β-Galactosidase-Aktivität zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion der von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, die mit Interferon behandelt sind. Ähnliche Ergebnisse werden mit Zellen, die nicht mit Interferon-gamma aktiviert sind, erhalten. Je nach der Herstellung exprimieren 40 bis 80 % der Makrophagen die β-Galactosidase-Aktivität in ihrem Kern zwischen 2 und 4 Tage nach der Infektion. Die Expression der β-Galactosidase hält bis zu 3 Wochen nach der Infektion an (1C). Es versteht sich, dass der Prozentsatz an Zellen, die das rekombinante Gen exprimieren, erhöht werden kann, indem man die Infektionsmultiplizität erhöht. Es ist so möglich, Zellzusammensetzungen zu erhalten, in denen 95 % oder mehr der Zellen transformiert sind.The results obtained are in the 1 shown. They show evidence of β-galactosidase activity at various times after infection of monocyte-derived macrophages treated with interferon. Similar results are obtained with cells not activated with interferon-gamma. Depending on the preparation, 40 to 80% of macrophages express β-galactosidase activity in their nucleus between 2 and 4 days after infection. Expression of β-galactosidase persists for up to 3 weeks after infection ( 1C ). It is understood that the percentage of cells expressing the recombinant gene can be increased by increasing the multiplicity of infection. It is thus possible to obtain cell compositions in which 95% or more of the cells are transformed.

3.2. Expression der β-Galactosidase nach intratumoraler Injektion der mit dem rekombinanten Adenovirus infizierten Monozyten-Makrophagen bei Nacktmäusen.3.2. Expression of β-galactosidase after intratumoral injection of the recombinant adenovirus infected monocyte macrophages in nude mice.

Unter dem Gesichtspunkt zu untersuchen, ob die infizierten Monozyten-Makrophagen ein exogenes Gen in Tumoren in vivo exprimieren können, wurden die mit dem rekombinanten Adenovirus infizierten Monozyten-Makrophagen in bei Nacktmäusen induzierte Tumoren injiziert.Under to investigate whether the infected monocyte macrophages are exogenous Gen in tumors can express in vivo, those with the recombinant Adenovirus infected monocyte macrophages in nude mice Tumors injected.

Die Nacktmäuse wurden zuerst einer subkutanen Injektion von 2.10⁶ Tumorzellen eines menschlichen Mesothelioms (HIB Zellen) unterzogen. Die durch diese Injektion induzierten Tumore (mit einem Durchmesser von etwa 4 mm) wurden dann durch intratumorale Injektion von mit Ad. RVS βgal infizierten menschlichen Monozyten-Makrophagen, die in Beispiel 3.1. erhalten wurden, behandelt. Für die Injektion wurden die infizierten menschlichen Monozyten-Makrophagen in Phosphatpuffer suspendiert. Die injizierten Dosen betrugen 2.10⁶ Zellen pro Maus. Drei Tage nach der Behandlung wurden die Tumoren extrahiert, fixiert und die Gegenwart der β-Galactosidase-Aktivität wird aufgezeigt.The nude mice were first subjected to a subcutaneous injection of 2.10 ⁶ tumor cells of a human mesothelioma (HIB cells). The tumors (about 4 mm in diameter) induced by this injection were then injected by intratumoral injection of Ad. RVS βgal infected human monocyte macrophages, which are described in Example 3.1. were treated. For injection, the infected human monocyte macrophages were suspended in phosphate buffer. The injected doses were 2.10 ⁶ cells per mouse. Three days after treatment, the tumors were extracted, fixed and the presence of β-galactosidase activity is demonstrated.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 2 dargestellt. Sie zeigen klar, dass die β-Galactosidase-Aktivität 3 Tage nach der Behandlung in dem Tumor gefunden wird und dass die verabreichten Monozyten-Makrophagen also in der Lage sind, den Tumor auf beträchtliche Weise zu besiedeln und darin ein rekombinantes Gen zu exprimieren.The results obtained are in the 2 shown. They clearly show that the β-galactosidase activity is found in the tumor 3 days after the treatment, and thus the monocyte-macrophages administered are able to colonize the tumor considerably and to express therein a recombinant gene.

Beispiel 4: Transfer eines mutierten TNF-α-Gens in die von menschlichen Blut-Monozyten abgeleiteten Makrophagen.Example 4: Transfer of a mutant TNF-α gene into the macrophages derived from human blood monocytes.

TNF-α oder Kachektin ist ein Zytokin, das im Wesentlichen aus Makrophagen als Antwort auf eine Gewebezerstörung, ein bakterielles Endotoxin, eine virale Erkrankung oder auf andere Zytokine freigesetzt wird. TNF wird in Form eines Prohormons mit 233 Aminosäuren (26 kDa) produziert. Das reife Protein umfasst 157 Aminosäuren (17 kDa) und resultiert aus der Entfernung einer N-terminalen Sequenz von 76 Aminosäuren. Die aktivierten Monozyten-Makrophagen synthetisieren membranäres TNF-α und haben eine zytotoxische Wirkung auf ihr Ziel durch Zell-Zellkontakt (Effekt von membranärem TNF-α mit 26 kDa) sowie durch lokale Freisetzung von löslichem TNF-α (17 kDa). Dies ist verschieden von dem, was bei einem septischen Schock passiert, dieser Schock würde teilweise aus einer akuten oder chronischen Aktivierung der Monozyten resultieren, die die Freisetzung der sekretierten TNF-Form zur Folge hat (Perez et al., Cell 63 (1990) 251). Seit TNF-α kloniert und in E.coli exprimiert wurde (Pennica et al. 1984) sind große Mengen für klinische Versuche verfügbar. Jedoch ist die therapeutische Verwendung von TNF-α beim Menschen durch seine hohe Toxizität und die Nebenwirkungen, die es erzeugt (Kachexie, Fieber, Kopfschmerzen, Müdigkeit, Hochdruck), beschränkt. Beim Kolorektal-Krebs zeigte ein kürzlicher klinischer Versuch, dass bei Dosen, die nicht ausreichen, um eine antitumorale Wirksamkeit zu erzielen, eine hohe Toxizität auftritt (Kemeny et al., 1990).TNF-α or cachectin is a cytokine that is essentially macrophages in response on a tissue destruction, a bacterial endotoxin, a viral disease or others Cytokines is released. TNF is in the form of a prohormone with 233 amino acids (26 kDa) produced. The mature protein comprises 157 amino acids (17 kDa) and results from the removal of an N-terminal sequence of 76 amino acids. The activated monocyte macrophages synthesize and have membrane TNF-α a cytotoxic effect on its target through cell-cell contact (effect of membranous TNF-α with 26 kDa) as well as by local release of soluble TNF-α (17 kDa). This is different from what happens in a septic shock that shock would partly from acute or chronic activation of monocytes result in the release of the secreted TNF form (Perez et al., Cell 63 (1990) 251). Since TNF-α cloned and expressed in E. coli (Pennica et al., 1984), large quantities are available for clinical trials. however is the therapeutic use of TNF-α in humans by its high toxicity and the side effects it produces (cachexia, fever, headache, Fatigue, High pressure), limited. In colorectal cancer, a recent clinical trial that at doses that are insufficient to have an antitumoral efficacy to achieve high toxicity occurs (Kemeny et al., 1990).

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die antitumorale Kraft der Makrophagen zu erhöhen, ohne mit löslichem TNF-α verbundene Toxizität zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es in der Tat, Makrophagen zu erzeugen, die mit der membranären Form von TNF-α transfektiert sind. Außerdem weisen die so erhaltenen Makrophagen der Erfindung einen weiteren bedeutenden Vorteil auf: während nämlich lösliches (sekretiertes) TNF-α eine kurze Halbwertszeit im Plasma von etwa 20 Minuten hat, können die Makrophagen der Erfindung mehrere Tage lang in der Peripherie des Tumors verbleiben, was auf eine dauerhaftere antitumorale Wirksamkeit hoffen lässt, die aus dem Kontakt TNF tragender Makrophage – Tumorzelle resultiert.The present invention enables it to increase the antitumoral power of macrophages without with soluble TNF-α linked toxicity to create. The present invention, in fact, allows macrophages to produce with the membranous Form of TNF-α transfected are. Furthermore the macrophages of the invention thus obtained have another significant advantage on: during namely soluble (secreted) TNF-α a short plasma half-life of about 20 minutes, the Macrophages of the invention for several days in the periphery of the Tumors remain, which hopes for a more durable antitumoral efficacy leaves, the macrophage tumor cell resulting from contact TNF results.

So aktivierte Makrophagen wurden durch Infektion von Makrophagen, die von Monozyten abgeleitet sind, oder von Monozyten durch rekombinante Adenoviren, wie in Beispiel 2 beschrieben, deren therapeutisches Gen aber das eines mutierten TNF-α ist, erhalten.So Activated macrophages were identified by infection of macrophages, the derived from monocytes or from monocytes by recombinant adenoviruses, as described in Example 2, but their therapeutic gene but the a mutant TNF-α, receive.

Genauer wurde das mutierte Gen auf die folgende Weise erhalten. Die membranäre Form von TNF-α besitzt zwei Stellen zum Spalten, die eine zwischen den Aminosäuren –1 und +1 gelegen (die Position +1 stellt den Anfang des reifen Proteins dar), die andere in der Region +13 gelegen (Perez et al., 1990, oben zitiert). Die Deletion der Aminosäuren 1 bis 12 verhindert die Spaltung in der Form 26 kDa, wobei gleichzeitig die Zytotoxizität an den Kontaktzonen Zellen – Zellen erhalten bleibt. Die Mutationen von menschlichem TNF-α wurden durch gerichtete Mutagenese durchgeführt; sie entsprechen den Mutanten Δ+1, Δ1–12, beschrieben von C. Perez et al., 1990, oben zitiert. Die Wirksamkeit der Konstruktionen von mutiertem TNF wird durch vorübergehende Expression in Eukaryotenzellen (cos) ermittelt, indem man nach den membranären, intrazellulären und sekretierten TNF-Formen unter Verwendung von anti-TNF-Antikörpern sucht und seine biologische Aktivität misst. Ein rekombinantes Adenovirus, das das oben hergestellte mutierte Gen umfasst, wird dann konstruiert; und die biologische Aktivität des synthetisierten TNF wird kontrolliert: (a) gegenüber der Linie L 929 durch die Technik der Zytolysezonen in Agar, diese Technik offenbart die Lyse, die vom Kontakt Zellen – Zellen abhängt, und (b) durch die Hemmung des Einbaus von Tritium-Thymidin in die Zellen in Kultur U 937 (histozytäre Zellen eines menschlichen Lymphoms), K 562 (Zellen, die aus einer chronischen myelogenen Leukämie stammen) und LS 174 T (Kolonadenokarzinom) sowie gegenüber Blastzellen, die bei Patienten mit Leukämie entnommen wurden. Die antitumorale Wirksamkeit in vivo wird dann an einem Tiermodell getestet und besteht darin, Nacktmäusen menschliche Tumoren zu implantieren, dann diese Mäuse mit systemischen Injektionen von Makrophagen, die mit dem modifizierten TNF-α-Gen transfektiert sind, und dies wie in Beispiel 3 angegeben, zu behandeln. Die antitumorale Wirkung wird im Vergleich mit Kontrollmäusen, die mit einem Placebo oder mit nicht transfektierten Makrophagen behandelt werden, ermittelt.More specifically, the mutated gene was obtained in the following manner. The membrane form of TNF-α has two sites for cleavage, one located between amino acids -1 and +1 (position +1 represents the beginning of the mature protein), the other located in region +13 (Perez et al , 1990, cited above). The deletion of amino acids 1 to 12 prevents the cleavage in the form 26 kDa, while maintaining the cytotoxicity at the contact zones cells - cells. The mutations of human TNF-α were carried out by site-directed mutagenesis; they correspond to mutants Δ + 1, Δ1-12, described by C. Perez et al., 1990, cited above. The efficiency of mutant TNF constructions is determined by transient expression in eukaryotic cells (cos) by searching for the membrane, intracellular and secreted forms of TNF using anti-TNF antibodies and measuring its biological activity. A recombinant adenovirus comprising the mutant gene prepared above is then constructed; and the biological activity of the synthesized TNF is controlled: (a) against the line L 929 by the technique of cytolysis zones in agar, this technique reveals the lysis that depends on the contact cells cells, and (b) the inhibition of the incorporation of Tritiated thymidine into cells in culture U 937 (human lymphoma histocytic cells), K 562 (cells derived from chronic myelogenous leukemia) and LS 174 T (colonic adenocarcinoma), as well as blast cells harvested in patients with leukemia. The in vivo antitumoral activity is then tested on an animal model and consists of implanting human tumors in nude mice, then injecting these mice with systemic injections of macrophages transfected with the modified TNF-α gene, as indicated in Example 3, to treat. The antitumoral effect is determined in comparison with control mice treated with a placebo or untransfected macrophages.

Beispiel 5: Von Monozyten abgeleitete Makrophagen oder Monozyten, die mit dem rekombinanten Adenovirus, das das Interferon-gamma-Gen enthält und das den Makrophagen eine verstärkte antitumorale Wirksamkeit verleiht, transformiert sind.Example 5: Of monocytes derived macrophages or monocytes infected with the recombinant Adenovirus containing the interferon-gamma gene and the macrophage a reinforced one antitumoral activity, are transformed.

Das Interferon-gamma-Gen wurde in den oben beschriebenen adenoviralen Vektor eingeführt und das rekombinante Adenovirus wurde verwendet, um Zellen von Monozyten oder von Makrophagen, die von Monozyten abgeleitet sind, zu transformieren.The Interferon gamma gene was in the adenoviral adenoviruses described above Vector introduced and The recombinant adenovirus was used to produce cells from monocytes or from macrophages derived from monocytes.

Die nach Differenzierung in dem RPMI-Medium, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, erhaltenen Makrophagen exprimieren das Interferon-gamma konstitutiv, es ist folglich nicht mehr notwendig, die Makrophagen 18 bis 24 Stunden lang zu behandeln, um die erforderliche zytotoxische und antitumorale Wirkung zu erzielen. Die Makrophagen, die das Interferon-gamma konstitutiv exprimieren, können so in der adoptiven antikanzerösen Immuntherapie entweder durch systemische Injektion oder durch direkte Injektion in die Tumoren verwendet werden.The after differentiation in the RPMI medium as in Example 1 above described macrophages express the interferon-gamma constitutively, it is therefore no longer necessary, the macrophages 18 to 24 For hours to treat the required cytotoxic and to achieve antitumor effect. Macrophages containing interferon-gamma can express constitutively so in the adoptive anti-cancer Immunotherapy either by systemic injection or by direct injection be used in the tumors.

Claims

Cell composition comprising differentiated Cells of the monocyte-macrophage lineage, the one recombinant nucleic acid which is carried by an adenoviral vector which is under the control of their expression permitting regulatory elements one or more therapeutic genes.

Cell composition according to claim 1, characterized that the one or more therapeutic genes for the entire protein or encode a part of a protein that is capable of the cells new or reinforced anti-infective, anticancer or confer immunostimulating properties.

Cell composition according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the gene is selected from among the genes code for interferons, tumor necrosis factors, interleukins, Stimulation factors of colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), the MDR gene and a gene for an antigen of an infectious or specific particle of a tumor.

A cell composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the adenoviral vector is a defective recombinant adenovirus.

progenitor cell of the monocyte macrophage containing a defective recombinant Adenovirus, which allows under the control of their expression Regulatory elements comprises one or more therapeutic genes.

progenitor cell according to claim 5, characterized in that it is among the stem cells and progenitors of the hematopoietic Systems selected is.

Pharmaceutical composition comprising as active ingredient One or more cell compositions according to any one of claims 1 to 6th

Pharmaceutical composition according to claim Figure 7, comprising cells of the monocyte-macrophage lineage, which contains a recombinant nucleic acid which for the entire protein or part of a protein that encodes the protein Macrophage confers the property to all or part of the tumor cells to eliminate an organism.

Pharmaceutical composition according to claim 8, characterized in that the gene is under the gene of γ-interferon and the gene of tumor necrosis factor-alpha is selected.

Pharmaceutical composition according to claim Figure 7, comprising cells of the monocyte-macrophage lineage, which contains a defective recombinant adenovirus carrying the gene of γ-INF.

Pharmaceutical composition according to claim Figure 7, comprising cells of the monocyte-macrophage lineage, which contains a defective recombinant adenovirus carrying the α-TNF gene.

Pharmaceutical composition according to claim 7, characterized in that the defective recombinant adenovirus carries a gene, which for a membranous one Form of α-TNF coded.

Pharmaceutical composition according to claim Figure 7, comprising cells of the monocyte-macrophage lineage, which contains a recombinant nucleic acid which for the entire or part of a protein encoded by the macrophage the property lends, utterances infection by an infectious agent, such as a virus, a retrovirus, a parasite or a bacterium to prevent or to treat.

Pharmaceutical composition according to claim 13, characterized in that the recombinant nucleic acid for a viral or bacterial surface antigen coded.

Pharmaceutical composition according to claim Figure 7, comprising cells of the monocyte-macrophage lineage, containing a defective recombinant adenovirus containing an HIV virus surface antigen, as the whole or another part of the protein GP 160 expressed.

Pharmaceutical composition according to one the claims 7 to 15, characterized in that they are in injectable form is present.

Pharmaceutical composition according to claim 16 for intravenous or intratumoral injection.

Pharmaceutical composition according to claim 16, formulated for perfusion.

Pharmaceutical composition according to any one of claims 7 to 18, characterized in that it comprises 10 ⁵ to 10 ⁹ cells per dose.

Process for the preparation of monocyte macrophages according to one the claims 1 to 6, characterized in that one carries out the following steps: - the culture the cells of monocyte macrophages or their precursors, the taken from the blood or bone marrow and isolated are, - the Transformation of these cells with a recombinant nucleic acid, such as as defined above, and optionally - the conditioning and / or Storage of the cells thus obtained.