JP5546107B2 - RNA virus BmMLV negative silkworm cultured cell line - Google Patents
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Description
本発明は、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株およびその利用に関する。また、本発明は、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株の製造方法に関する。 The present invention relates to a BmMLV-negative silkworm cultured cell line and use thereof. The present invention also relates to a method for producing a BmMLV-negative silkworm cultured cell line.
Bombyx mori マキュラ様潜在ウイルス（BmMLV）は2005年に本発明の発明者の一人である勝間らによってカイコ由来細胞株BmNにおいて発見された慢性感染性RNAウイルスである（非特許文献１）。このウイルスはRNA replicase, coat protein(CP), p15を有する+鎖RNAをゲノムとして有し、そのゲノム配列は植物ウイルスであるマキュラウイルスに近い。また、カイコ由来培養細胞においてのみ、非常に高い増殖レベルで慢性感染する。BmMLVは当初、数種類のカイコ由来培養細胞から検出されていたが、後に供試した全てのカイコ由来培養細胞で慢性感染していることが明らかとなり、これまでBmMLV非感染のカイコ由来培養細胞の報告はない。一方で、他の昆虫種由来のSpodoptera frugiperda（ツマジロクサヨトウ）由来のSf9細胞やTrichoplusia ni（イラクサキンウワバ）由来のHigh Five細胞からは検出されていない。 Bombyx mori Macular-like latent virus (BmMLV) is a chronic infectious RNA virus discovered in the silkworm-derived cell line BmN in 2005 by Katsuma et al., One of the inventors of the present invention (Non-patent Document 1). This virus has a + strand RNA having RNA replicase, coat protein (CP), p15 as its genome, and its genome sequence is close to that of the plant virus Macula virus. Moreover, only in cultured silkworm-derived cultured cells, chronic infection occurs at a very high proliferation level. BmMLV was initially detected in several types of silkworm-derived cultured cells, but it was revealed that all of the silkworm-derived cultured cells tested later were chronically infected, and so far, BmMLV-uninfected silkworm-derived cultured cells have been reported. There is no. On the other hand, it has not been detected from Sf9 cells derived from Spodoptera frugiperda derived from other insect species or High Five cells derived from Trichoplusia ni.
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
本発明者らの、BmMLVのカイコへの感染実験によれば、カイコ幼虫へのインジェクション実験においてはRT-PCR解析でBmMLVが検出されたが、経口感染実験においてはRT-PCR解析でBmMLVは検出されなかった（図６）。また、カイコが唯一摂食するクワ葉への摂食試験においては、RT-PCR解析、ウェスタンブロット解析どちらにおいてもBmMLVの感染は認められず（図６）、単独では感染性を有さないことが明らかになった。 According to the inventors' BmMLV infection experiments with silkworms, BmMLV was detected by RT-PCR analysis in silkworm larva injection experiments, but BmMLV was detected by RT-PCR analysis in oral infection experiments. Not (FIG. 6). In addition, in the feeding test on mulberry leaves that are only fed by silkworms, no BmMLV infection was observed in either RT-PCR analysis or Western blot analysis (Fig. 6), and there was no infectivity by itself. Became clear.
カイコ由来培養細胞株はこれまでBmN、SES-BoMo-15A、SES-BoMo-C129、NIAS-Bm-aff3、SES-BoMo-J125そしてこのクローン培養細胞株SES-BoMo-J125K5、などが作出されている。しかしこれらの培養細胞株はすべてBmMLVが細胞質内に感染していることが確認されている（図７）。また、Sf-9細胞にBmMLV感染実験を行ったところ、BmMLVの感染が見られた（図８）。 Silkworm-derived cultured cell lines have been created so far, including BmN, SES-BoMo-15A, SES-BoMo-C129, NIAS-Bm-aff3, SES-BoMo-J125 and this cloned cultured cell line SES-BoMo-J125K5. Yes. However, all of these cultured cell lines have been confirmed to be infected with BmMLV in the cytoplasm (FIG. 7). Further, when BmMLV infection experiment was performed on Sf-9 cells, BmMLV infection was observed (FIG. 8).
さらに、BmMLVは、BmN細胞に致死性のバキュロウイルス（BmNPV）との共感染においてBmNPVによるシャットオフを受けず、BmNPVと異なる独自の増殖機構を有していると考えられる（図９、１０）。 Furthermore, BmMLV is considered not to be shut off by BmNPV in co-infection with BmN cells lethal baculovirus (BmNPV), and has a unique proliferation mechanism different from BmNPV (FIGS. 9 and 10). .
カイコ培養細胞は組み換えカイコバキュロウイルス（BmNPV）の宿主として獣医薬の産生系としても利用されており、BmMLVの慢性感染は、医薬品等健康に安全な遺伝子産物を作出する際には問題となる可能性がある。 Silkworm cultured cells are also used as a veterinary drug production system as a host of recombinant silkworm baculovirus (BmNPV), and chronic infection with BmMLV can be a problem when producing gene products that are safe for health such as pharmaceuticals. There is sex.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株を提供することにある。また、本発明は、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株の製造方法の提供を課題とする。さらに、本発明は、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株を用いたBmMLV発現産物を含まない、目的遺伝子産物の製造方法の提供についても課題とする。 The present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to provide a BmMLV-negative silkworm cultured cell line. Another object of the present invention is to provide a method for producing a BmMLV-negative silkworm cultured cell line. Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for producing a target gene product that does not contain a BmMLV expression product using a BmMLV-negative silkworm cultured cell line.
本発明者らは、上記の課題を解決するために、日１４７号および支１４５号の交配により得られるカイコ品種の胚子組織を牛胎児血清30％を含むMX培地で初代培養することにより、BmMLVが慢性的に感染していないカイコ由来培養細胞株（NIAS-Bm-VF）をはじめて作出した。今回作出したNIAS-Bm-VF細胞はウェスタン解析、RT-PCR解析によってBmMLVが検出されない。 In order to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention performed primary culture of embryonic tissues of silkworm cultivars obtained by crossing between day 147 and branch 145 in MX medium containing 30% fetal bovine serum, thereby obtaining BmMLV. Was the first to produce a silkworm-derived cultured cell line (NIAS-Bm-VF) that was not chronically infected. The NIAS-Bm-VF cells produced this time cannot detect BmMLV by Western analysis or RT-PCR analysis.
また、本発明の細胞株に新たにBmMLVを感染させると明瞭なシグナルが得られることから、本発明の細胞株がBmMLVへの感受性を有することを確認した。 In addition, since a clear signal was obtained when the cell line of the present invention was newly infected with BmMLV, it was confirmed that the cell line of the present invention has sensitivity to BmMLV.
さらに、BmVF細胞へのBmMLV感染は細胞同士を吸着させ、さらに細胞増殖を遅延させること、BmNPVにも感受性を有することを明らかにした。 Furthermore, it was revealed that BmMLV infection of BmVF cells adsorbed cells, delayed cell growth, and was also sensitive to BmNPV.
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
〔１〕 Bombyx mori マキュラ様潜在ウイルス（BmMLV）陰性のカイコ培養細胞株。
〔２〕 受領番号：FERM AP-21565として寄託されているBmMLV陰性のカイコ培養細胞株。
〔３〕 〔１〕または〔２〕に記載の細胞株に、BmMLVを感染させた細胞。
〔４〕 〔１〕または〔２〕に記載の細胞株に、組換えバキュロウイルスを感染させた細胞。
〔５〕 下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株の製造方法。
（ａ）日147号および支145号の交配により得られるカイコ品種の組織を得る工程
（ｂ）工程（ａ）により得られた組織をMX培地で初代培養する工程
（ｃ）BmMLV陰性の細胞株を選択する工程
〔６〕 下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、BmMLV発現産物を含まない、目的遺伝子産物の製造方法。
（ｉ）〔１〕または〔２〕に記載のカイコ培養細胞株に、目的遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを感染させる工程
（ｉｉ）組換えバキュロウイルスが感染したカイコ培養細胞株で目的遺伝子を発現させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で発現した目的遺伝子産物を回収する工程
〔７〕 〔６〕に記載の方法により製造された目的遺伝子産物を含む医薬組成物。
More specifically, the present invention provides the following [1] to [5].
[1] Bombyx mori Silkworm-cultured cell line negative for Macula-like latent virus (BmMLV).
[2] Receipt number: BmMLV-negative silkworm cultured cell line deposited as FERM AP-21565.
[3] A cell obtained by infecting the cell line of [1] or [2] with BmMLV.
[4] A cell obtained by infecting the cell line according to [1] or [2] with a recombinant baculovirus.
[5] A method for producing a BmMLV-negative silkworm cultured cell line, comprising the following steps (a) to (c):
(A) Step of obtaining silkworm cultivar tissue obtained by crossing day 147 and branch 145 (b) Step of primary culture of tissue obtained in step (a) in MX medium (c) BmMLV negative cell line [6] A method for producing a target gene product that does not include a BmMLV expression product, comprising the following steps (i) to (iii):
(I) Infecting the silkworm cultured cell line of [1] or [2] with a recombinant baculovirus containing the target gene (ii) expressing the target gene in a silkworm cultured cell line infected with the recombinant baculovirus Step (iii) Step of recovering the target gene product expressed in the step (ii) [7] A pharmaceutical composition comprising the target gene product produced by the method according to [6].
本発明により、BmMLV陰性のカイコ培養細胞株が提供された。 According to the present invention, a BmMLV-negative silkworm cultured cell line was provided.
昆虫細胞は、組み換えバキュロウイルス発現系の宿主として、遺伝子工学分野で頻繁に利用されており、獣医薬の産生系にも応用されている。本発明のBmMLV陰性のカイコ培養細胞株はバキュロウイルス感受性であることから、組み換えバキュロウイルスの宿主として利用可能である。 Insect cells are frequently used in the field of genetic engineering as hosts for recombinant baculovirus expression systems, and are also applied to veterinary drug production systems. Since the BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present invention is sensitive to baculovirus, it can be used as a host for recombinant baculovirus.
一方で、BmMLVについては哺乳類等への感染や、カイコ培養細胞内でのタンパク質生産への影響を含め、未だ解明されていない機能が多い。したがって本発明の培養細胞株により、BmMLVフリーの組み換えバキュロウイルス発現系を構築することができ、BmMLVの膜タンパク質等が混在しない医薬品等健康に安全な遺伝子産物の作出に利用することができる。 On the other hand, BmMLV has many functions that have not yet been elucidated, including infection of mammals and the like, and effects on protein production in silkworm cultured cells. Therefore, the cultured cell line of the present invention can construct a BmMLV-free recombinant baculovirus expression system, and can be used for the production of health-safe gene products such as pharmaceuticals that do not contain BmMLV membrane proteins.
また、ウイルスの構造タンパク質を強制発現させたウイルスの中空粒子をワクチン抗原などに利用する技術が知られているが、作成した目的の中空粒子と慢性感染しているBmMLVとの区別がつかない場合も考えられる。このような問題を解決するために、BmMLVを排除した本願の培養細胞株を利用することができる。 In addition, there are known technologies that use virus hollow particles in which viral structural proteins are forcibly expressed as vaccine antigens, but it is not possible to distinguish the intended hollow particles from chronically infected BmMLV. Is also possible. In order to solve such a problem, the cultured cell line of the present application in which BmMLV is excluded can be used.
さらに、本培養細胞株は、BmMLVとカイコバキュロウイルスのBmNPVの細胞内における相互の役割の解析や、このBmMLVの感染機構や作用機構の解析、また、なぜ植物性RNAウイルスがカイコ培養細胞株に存在しているのか、培養細胞内におけるBmMLVの存在役割等の研究資料として使用することができる。 Furthermore, this cultured cell line analyzed the mutual role of BmMLV and silkworm baculovirus BmNPV in cells, analyzed the infection mechanism and action mechanism of this BmMLV, and why plant RNA viruses became silkworm cultured cell lines. Whether it exists, it can be used as research data such as the role of BmMLV in cultured cells.
〔発明の実施の形態〕
本発明のカイコ培養細胞株は、Bombyx mori マキュラ様潜在ウイルス（BmMLV）陰性であることを特徴とする。このような細胞は、例えば、適当なカイコ品種の組織を無菌的に摘出し、長期継代培養することにより得ることができる。本発明の細胞株の由来となるカイコ品種、組織は特に限定されず、当業者に公知の品種を交配した結果得られる卵もしくはその子孫から得られる卵、およびこれらの卵からふ化した幼虫および蛹のあらゆる組織を用いることができる。
[Embodiment of the Invention]
The silkworm cultured cell line of the present invention is characterized by being negative for Bombyx mori macula-like latent virus (BmMLV). Such cells can be obtained, for example, by aseptically removing tissue of an appropriate silkworm variety and culturing for a long period. Silkworm varieties and tissues from which the cell lines of the present invention are derived are not particularly limited, eggs obtained as a result of mating varieties known to those skilled in the art or eggs obtained from their progeny, and larvae and pupae hatched from these eggs Any organization can be used.
組織の初代培養には、MX培地（米国特許6,943,023、米国特許7,074,612）等が用いられる。MX培地は牛胎児血清30％を含んでいてもよい。細胞は、25℃〜26℃に調節された定温機内で維持する。 MX medium (US Pat. No. 6,943,023, US Pat. No. 7,074,612) or the like is used for primary culture of tissues. The MX medium may contain 30% fetal calf serum. Cells are maintained in an incubator adjusted to 25 ° C to 26 ° C.
本発明の細胞株の作製において、該細胞株を連続継代性培養細胞株と認定するための継代培養の条件は制限されない。1回の培養は約１週間を要する。培養回数としては例えば、10回以上、20回以上、50回以上、100回以上あるいは200回以上であるが、好ましくは約50回以上の連続継代培養を要する。 In the production of the cell line of the present invention, the conditions for subculture for qualifying the cell line as a continuous subculture cell line are not limited. One culture takes about one week. The number of times of culturing is, for example, 10 times or more, 20 times or more, 50 times or more, 100 times or more, or 200 times or more, preferably about 50 times or more of continuous subculture.
本発明の培養株においては、次いでBmMLVの存在を確認する。BmMLVの存在は例えばゲノムの検出によって確認することができる。より具体的には、例えば、RT-PCRによってゲノムRNAの検出を行うことができる。またBmMLVの存在は構造タンパク質（CPなど）の検出によっても確認することができる。タンパク質の確認にはタンパク質特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングや酵素免疫測定法（ELISA）など公知の方法を用いることができる。 In the culture strain of the present invention, the presence of BmMLV is then confirmed. The presence of BmMLV can be confirmed, for example, by genome detection. More specifically, genomic RNA can be detected by RT-PCR, for example. The presence of BmMLV can also be confirmed by detection of structural proteins (such as CP). For protein confirmation, a known method such as Western blotting using a protein-specific antibody or enzyme immunoassay (ELISA) can be used.
本発明のカイコ培養細胞株として、FERM AP-21565としてブダペスト条約に基づいて国際寄託されたBmMLV陰性カイコ培養細胞株NIAS-Bm-VFを示すことができる。
寄託の情報：
（１）寄託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（２）連絡先：郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（３）受領番号：FERM AP-21565
（４）識別のための表示：NIAS-Bm-VF
As a silkworm cultured cell line of the present invention, a BmMLV-negative silkworm cultured cell line NIAS-Bm-VF deposited internationally based on the Budapest Treaty as FERM AP-21565 can be shown.
Deposit information:
(1) Name of depositary institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (2) Contact: Postal code 305-8566 1-1-1 Higashi 1-chome Tsukuba, Ibaraki, Japan
(3) Receipt number: FERM AP-21565
(4) Display for identification: NIAS-Bm-VF
NIAS-Bm-VF細胞株は、日１４７号および支１４５号を交配した結果得られた胚子組織を、牛胎児血清30％を含むMX培地で初代培養し、次いで長期継代培養することによって、本発明者らが樹立したBmMLV陰性のカイコ培養細胞株である。 The NIAS-Bm-VF cell line is obtained by first culturing embryo tissues obtained as a result of mating day 147 and branch 145 in MX medium containing fetal bovine serum 30%, and then subcultured for a long time. This is a BmMLV-negative silkworm cultured cell line established by the present inventors.
本発明の細胞株の培養条件は、特に限定されない。したがって、細胞が死滅せずに生存または増殖できるような任意の条件下で培養することができる。例えば、培養温度は、一般的には２０℃〜３０℃、好ましくは２５℃〜２６℃である。培養培地は、ウシ胎児血清を３〜３０％（好ましくは１０％）含むMX培地、および市販品のIPL４１培地（GIBCOカタログNo.11405-081、ニチレイバイオサイエンスカタログNo.56923-10L, No.56923-50L, No.56923-100L）、TC-100培地（GIBCOカタログNo.11600-061、ニチレイバイオサイエンスカタログNo.56941-10L, 56941-50L, 56941-100L）、EX-CELL420培地（ニチレイバイオサイエンスカタログNo.14420-500M, No.14420-1000M, No.24420-10L,No.24420-50L, No.24420-100L）を用いることができるが、好ましくはウシ胎児血清を３〜３０％（好ましくは１０％）含むMX培地である。 The culture conditions for the cell line of the present invention are not particularly limited. Thus, the cells can be cultured under any conditions that allow the cells to survive or grow without dying. For example, the culture temperature is generally 20 ° C to 30 ° C, preferably 25 ° C to 26 ° C. The culture medium includes MX medium containing 3-30% (preferably 10%) fetal bovine serum, and commercially available IPL41 medium (GIBCO catalog No. 11405-081, Nichirei Bioscience catalog No. 56923-10L, No. 56923). -50L, No.56923-100L), TC-100 medium (GIBCO catalog No.11600-061, Nichirei Bioscience catalog No.56941-10L, 56941-50L, 56941-100L), EX-CELL420 medium (Nichirei Bioscience) Catalog No. 14420-500M, No. 14420-1000M, No. 24420-10L, No. 24420-50L, No. 24420-100L), preferably 3-30% (preferably fetal bovine serum) Is MX medium containing 10%).
本細胞株の保存条件もまた、特に限定されない。例えば、市販品のセルバンカーまたはセルバンカー１プラス（日本全薬工業株式会社製）、もしくはグリセロールまたはジメチルスルフォキシド（DMSO）を無血清の培地に５〜１５％添加した凍結保存液中で凍結保存することができる。凍結の方法の一例としては、凍結保存チューブに細胞と凍結保存液を加えたのち、チューブを発泡スチロール製の箱に入れ、−８５℃のフリーザーに入れ、徐々に細胞を凍結する。―８５℃のフリーザーに１日間置いたのち、液体窒素液または−１５２℃の超低温フリーザー中で、長期間の凍結を行う。凍結時の細胞濃度は、５×１０５〜５×１０６個/ｍｌ培地が望ましい。 The storage conditions for this cell line are also not particularly limited. For example, it is frozen in a commercially available cell banker or cell banker 1 plus (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) or in a cryopreservation solution in which 5 to 15% of glycerol or dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to a serum-free medium. Can be saved. As an example of the freezing method, after adding cells and a cryopreservation solution to a cryopreservation tube, the tube is put in a box made of polystyrene foam, put in a freezer at -85 ° C, and the cells are gradually frozen. -Place in a freezer at 85 ° C for 1 day, then freeze for a long time in liquid nitrogen solution or in a cryogenic freezer at -152 ° C. The cell concentration during freezing is preferably 5 × 10 5 to 5 × 10 6 cells / ml medium.
上記のように保存された細胞株の再培養の方法としては、例えば細胞が凍結されたチューブを３７℃の温湯に浸漬し、急速に凍結保存液を解凍する。次いで、凍結保存液を新たなディスポーザブル遠心チューブに移し、1000rpmの回転速度で１〜２分間遠心し、沈殿した細胞を残して静かに凍結保存液を除去する。細胞に無血清の培地を加えて、軽く細胞を洗浄し、再度遠心して凍結保存液を含む無血清培地を除去する。最後に１０％牛胎児血清が添加された培地を加え、培養フラスコに移して、培養を再開することができる。 As a method of reculturing the cell line preserved as described above, for example, a tube in which cells are frozen is immersed in hot water at 37 ° C., and the cryopreservation solution is rapidly thawed. The cryopreservation solution is then transferred to a new disposable centrifuge tube and centrifuged at 1000 rpm for 1-2 minutes, and the cryopreservation solution is gently removed leaving the precipitated cells. Add serum-free medium to the cells, gently wash the cells, and centrifuge again to remove the serum-free medium containing the cryopreservation solution. Finally, a medium supplemented with 10% fetal bovine serum can be added and transferred to a culture flask to resume the culture.
本発明のBmMLV陰性カイコ培養細胞株は、組み換えバキュロウイルス発現系の宿主として有用である。バキュロウイルスベクターは、バキュロウイルス科に属する核多角体病ウイルス（Nucleopolyhedrovirus, NPV）が持つ多角体タンパク質（ポリヘドリン）遺伝子のプロモーターを利用した、有用タンパク質の高発現系ベクターである。バキュロウイルスベクター発現系は、NPVが昆虫細胞に感染すると、ウイルス増殖後期にポリヘドリンが大量に合成され、最終的には細胞の全タンパク質の50％近くにまで達することから、ポリヘドリンプロモーターの下流に有用タンパク質の遺伝子を挿入することにより、該有用タンパク質の大量生産が可能なように設計されている。既に、カイコや昆虫細胞を宿主として、バキュロウイルスベクター発現系によっていくつかのタンパク質が生産されている。 The BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present invention is useful as a host for a recombinant baculovirus expression system. The baculovirus vector is a high expression vector for useful proteins using the promoter of the polyhedron protein (polyhedrin) gene possessed by the nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to the family Baculoviridae. In baculovirus vector expression systems, when NPV infects insect cells, polyhedrin is synthesized in large quantities in the late stage of virus growth, and eventually reaches nearly 50% of the total protein in the cell, so downstream of the polyhedrin promoter. It is designed so that mass production of the useful protein is possible by inserting the gene of the useful protein into. Some proteins have already been produced by baculovirus vector expression systems using silkworms and insect cells as hosts.
本発明のBmMLV陰性カイコ培養細胞株は、カイコバキュロウイルスであるBmNPVを感染した結果、ウイルス粒子の形成が認められた。このことは、本願の細胞株が組み換えバキュロウイルスの宿主として利用可能であることを示す。また、実施例に記載のように、本発明の細胞株は、これまでに公知の培養細胞株に比べて相対的に優れたウイルス増殖能を示す。従って、本発明の細胞株は、バキュロウイルスベクター発現系による目的遺伝子産物を発現するための宿主として有用である。 The BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present invention was infected with BmNPV, a silkworm baculovirus, and as a result, formation of virus particles was observed. This indicates that the cell line of the present application can be used as a host for recombinant baculovirus. In addition, as described in the Examples, the cell line of the present invention exhibits a relatively superior virus growth ability as compared with conventionally known cultured cell lines. Therefore, the cell line of the present invention is useful as a host for expressing the target gene product by the baculovirus vector expression system.
本発明の細胞株への組換えバキュロウイルスの感染方法は、特に限定されない。当業者であれば、公知のカイコ培養細胞を宿主細胞として用いる場合の条件に準じて、適宜条件を設定しうる。
組換えバキュロウイルスによって、発現させる遺伝子としては特に限定されないが、例えばインターフェロン、インターロイキン、ワクチン用ウイルス構成タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。また、このような遺伝子のより具体的な例としては、human interferon-α、Chicken Interferon-γ、Chicken interleukin-2、Porcine Interferon-γ、Porcine interleukin-4、Bovine Interferon-β、Bovine Interferon-τ、Feline Interferon-ω、Canine Interferon-α、Canine Interferon-γ、加えてInfluenza virus HA、Influenza virus NA、Severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein、Porcine circovirus capsid proteinなどをコードする遺伝子を挙げることができる。
The method for infecting the cell line of the present invention with the recombinant baculovirus is not particularly limited. A person skilled in the art can appropriately set conditions according to the conditions in the case of using a known silkworm cultured cell as a host cell.
The gene to be expressed by the recombinant baculovirus is not particularly limited, and examples thereof include interferon, interleukin, and a gene encoding a virus constituent protein for vaccine. As more specific examples of such genes, human interferon-α, Chicken Interferon-γ, Chicken interleukin-2, Porcine Interferon-γ, Porcine interleukin-4, Bovine Interferon-β, Bovine Interferon-τ, Examples include genes encoding Feline Interferon-ω, Canine Interferon-α, Canine Interferon-γ, Influenza virus HA, Influenza virus NA, Severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein, Porcine circovirus capsid protein, and the like.
また、BmMLVは哺乳類等への感染や、カイコ培養細胞内でのタンパク質生産への影響を含め、未だ解明されていない機能が多いウイルスである。本発明の培養細胞株により、BmMLVフリーの組み換えバキュロウイルス発現系を構築することで、BmMLVの膜タンパク質等が混在しない遺伝子産物の作出に利用することができる。このような遺伝子産物もまた本発明に含まれる。 In addition, BmMLV is a virus with many functions that have not been elucidated, including infection of mammals and the like, and effects on protein production in silkworm cultured cells. By constructing a BmMLV-free recombinant baculovirus expression system using the cultured cell line of the present invention, it can be used to produce gene products that do not contain BmMLV membrane proteins and the like. Such gene products are also included in the present invention.
また、本発明は、医薬組成物の製造方法を提供する。該方法においては、回収された任意の遺伝子産物と医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。 The present invention also provides a method for producing a pharmaceutical composition. In the method, any recovered gene product and a pharmaceutically acceptable carrier are mixed. Examples of the carrier include surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, isotonic agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity. Although an accelerator, a corrigent, etc. are mentioned, it is not restrict | limited to these, Other usual support | carriers can be used suitably. Specifically, light anhydrous silicic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride, Examples thereof include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, and inorganic salts.
本発明の医薬組成物の投与を行う対象は特に制限はないが、例えば、ヒト、愛玩動物、家畜、野外動物、鳥類を挙げることができる。 The subject to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered is not particularly limited, and examples thereof include humans, pets, domestic animals, outdoor animals, and birds.
したがって、本発明は、（ｉ）BmMLV陰性カイコ培養細胞株に、目的遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを感染させる工程、（ｉｉ）組換えバキュロウイルスが感染したカイコ培養細胞株で目的遺伝子を発現させる工程、および（ｉｉｉ）前記工程で発現した目的遺伝子産物を回収する工程、を含むBmMLV発現産物を含まない、目的遺伝子産物の製造方法もまた提供する。 Therefore, the present invention includes (i) a step of infecting a BmMLV-negative silkworm cultured cell line with a recombinant baculovirus containing the target gene, and (ii) expressing the target gene in a silkworm cultured cell line infected with the recombinant baculovirus. There is also provided a method for producing a target gene product, which does not include a BmMLV expression product, comprising the steps of: (iii) recovering the target gene product expressed in the step.
また、本願のBmMLV陰性カイコ培養細胞株は、ワクチン抗原として用いるウイルスの構造タンパク質を強制発現させる際の宿主としても用いることができる。ウイルスの構造タンパク質を含む中空粒子は、他のウイルス粒子が感染していない細胞で発現させることが好ましいが、公知のカイコ培養細胞株はすべてBmMLV感染していることが確認されており、ワクチン抗原として用いる中空粒子とBmMLVとの区別がつかない可能性がある。本発明の細胞株を用いることにより、目的のワクチン抗原として用いる中空粒子のみを効率的に発現させることが可能である。 The BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present application can also be used as a host for forced expression of the viral structural proteins used as vaccine antigens. Hollow particles containing viral structural proteins are preferably expressed in cells that are not infected with other viral particles, but all known silkworm cell lines have been confirmed to be infected with BmMLV, and vaccine antigens There is a possibility that the hollow particles and BmMLV used as can not be distinguished. By using the cell line of the present invention, it is possible to efficiently express only the hollow particles used as the target vaccine antigen.
また、本発明のBmMLV陰性カイコ培養細胞株は、BmMLVの機能を解明するための研究材料としても有用である。本発明の細胞株を用いることにより、BmMLVの感染機構や作用機構、さらに、なぜ植物性RNAウイルスがカイコ培養細胞株に存在しているのか、また培養細胞内におけるBmMLVの存在役割の研究に使用することができる。さらに、種々の遺伝子に欠損や変異を導入したBmMLVの変異体を構築し、本発明の細胞に対する感染能や感染後の形質の変化を観察することによって、BmMLVの個々の遺伝子の働きを明らかにすることもできる。 The BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present invention is also useful as a research material for elucidating the function of BmMLV. By using the cell line of the present invention, it is used to study the infection mechanism and action mechanism of BmMLV, why plant RNA viruses exist in silkworm cultured cell lines, and the role of BmMLV in cultured cells. can do. Furthermore, by constructing mutants of BmMLV in which deletions and mutations have been introduced into various genes, and observing changes in the infectivity and traits after infection of the cells of the present invention, the functions of individual genes of BmMLV are revealed. You can also
さらに、本発明のBmMLV陰性カイコ培養細胞株には、BmMLVを感染させることができる。後述の実施例のように、BmVF細胞（BmMLV陰性カイコ培養細胞株）および該細胞株にBmMLVを感染させたBmVF-BmMLV細胞にバキュロウイルスを感染させた場合には、BmVF-MLV細胞に比べてBmVF細胞で多角体の形成が遅延する様子が観察された。このことからバキュロウイルスの感染・増殖にはBmMLVとの相互作用があることが示された。したがって、本発明のBmMLV陰性カイコ培養細胞株にBmMLVを感染させた細胞株（BmVF-BmMLV）は、バキュロウイルスによる遺伝子産物の大量生産のための宿主として使用することができる。 Furthermore, the BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present invention can be infected with BmMLV. As in the examples described later, when BmVF cells (BmMLV-negative silkworm cultured cell lines) and BmVF-BmMLV cells infected with BmMLV were infected with baculovirus, BmVF cells were compared with BmVF-MLV cells. It was observed that polyhedron formation was delayed in BmVF cells. This indicates that baculovirus infection and proliferation interact with BmMLV. Therefore, the cell line (BmVF-BmMLV) obtained by infecting the BmMLV-negative silkworm cultured cell line of the present invention with BmMLV can be used as a host for mass production of gene products by baculovirus.
また、BmVF-BmMLV細胞株によって、BmMLVの感染にともなうカイコ培養細胞の細胞形質の変化を解析することができ、このような解析はBmMLVの機能を明らかにする上で重要な情報を与える。 In addition, the BmVF-BmMLV cell line can analyze changes in the cytoplasm of silkworm cultured cells associated with BmMLV infection, and such analysis provides important information for clarifying the functions of BmMLV.
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。 In addition, all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕 BmMLV陰性細胞株の樹立
日１４７号および支１４５号の交配により得られたカイコ品種の胚子組織を、牛胎児血清30％を含むMX培地で初代培養することにより、従来の作出されたすべてのカイコ培養細胞株に発見されている植物性RNAウイルスBmMLVが存在しない細胞株（NIAS-Bm-VF）を作出した（図１）。BmVF細胞はRound Cellの割合が高いことが観察された。
[Example 1] Establishment of BmMLV-negative cell line Conventional production of embryonic tissues of silkworm cultivars obtained by crossing day 147 and branch 145 by primary culture in MX medium containing 30% fetal calf serum A cell line (NIAS-Bm-VF) in which the plant RNA virus BmMLV, which has been found in all the silkworm cultured cell lines, does not exist was created (FIG. 1). BmVF cells were observed to have a high percentage of round cells.
具体的には、以下の手順により、BmMLV陰性細胞を得た。
(1) 細胞外マトリックスのフィブロネクチンを培養フラスコ表面の１cm２当たり、0.5μLの濃度で塗布した培養フラスコ（ファルコン製No.3018）に、２ｍｌのMX培地を加える
(2) 日147号×支145号のカイコ品種の反転期胚子組織を約５０卵から無菌的に摘出し、ナイフで胚全長を３分の１に切断
(3) 新鮮培地の中に入れる
(4) ２５℃に調節の定温機内で培養（初代培養）
(5) 新鮮培地と培養中の培地との比率が半々の混合培地で２週間おきに培地の交換
(6) 細胞が組織から遊出し、培養フラスコ面にコンフルエント（confluent）に増殖した時点でピペッティングにより細胞を培養フラスコ面から剥離し、新しい培養フラスコに移住させる。（継代培養に移行）
(7) 約100回の継代培養の繰り返しにより、連続継代性培養細胞株と認定する。
Specifically, BmMLV negative cells were obtained by the following procedure.
(1) Add 2 ml of MX medium to a culture flask (No. 3018 manufactured by Falcon) coated with 0.5 μL of extracellular matrix fibronectin per 1 cm 2 of the surface of the culture flask.
(2) Inverted embryonic tissues of silkworm varieties of day 147 × branch 145 are aseptically removed from about 50 eggs, and the entire embryo length is cut into one third with a knife.
(3) Place in fresh medium
(4) Cultivation in a thermostat controlled at 25 ° C (primary culture)
(5) Change the medium every two weeks with a mixed medium that is half the ratio of fresh medium and medium during culture.
(6) When the cells have migrated from the tissue and proliferated confluently on the surface of the culture flask, the cells are detached from the surface of the culture flask by pipetting and transferred to a new culture flask. (Transition to subculture)
(7) Recognize as a continuous passage cell line by repeating about 100 passages.
〔実施例２〕 BmVF細胞へのBmMLV感染実験
(1) BmMLVの調製
まず、1x109のBmN4細胞を超音波破砕機によって破砕した後、破砕産物を12000gにて30分間、4度で遠心分離した。次にその上清におけるBmMLV粒子を、ミリポア社製セントリプラスYM100を用いて濃縮した。濃縮されたBmMLV粗生成物を0.2ミクロンのフィルターで滅菌濾過した後、ウイルス液として以後の実験に用いた。また、BmMLVの量については、抗BmMLV CP抗体を用いたウェスタンブロットの結果を、デンシトメトリーによって解析することによって定量した。コントロールとして、GEヘルスケア社製 pGEX-6P3ベクターによって発現した組み換えBmMLV CPタンパク質を用いた。
[Example 2] BmMLV infection experiment to BmVF cells
(1) Preparation of BmMLV First, 1 × 10 9 BmN4 cells were crushed with an ultrasonic crusher, and then the crushed product was centrifuged at 12000 g for 30 minutes at 4 degrees. Next, BmMLV particles in the supernatant were concentrated using Centriplus YM100 manufactured by Millipore. The concentrated BmMLV crude product was sterilized by filtration through a 0.2 micron filter, and then used as a virus solution in subsequent experiments. The amount of BmMLV was quantified by analyzing the results of Western blotting using an anti-BmMLV CP antibody by densitometry. As a control, recombinant BmMLV CP protein expressed by pGEX-6P3 vector manufactured by GE Healthcare was used.
(2) BmVF細胞へのBmMLVの感染
ファルコン社製60mm細胞培養シャーレへBmVF細胞を4x106播種し、28μgのBmMLVを無菌的にシャーレへ加え、1時間26℃にてゆっくりと振盪することで、ウイルスの感染を行った。感染後、900rpm、10分間、26℃で遠心分離することにより、細胞を沈殿させ、ウイルス液を除去した後、新鮮培地を4ml加え、ファルコン社製60mm細胞培養シャーレへ播種した。新鮮培地を加えた時間をウイルス接種後0時間とした。
(2) Infection of BmVF cells to BmVF cells 4x10 6 seeds of BmVF cells in a Falcon 60 mm cell culture petri dish, 28 μg of BmMLV was aseptically added to the petri dish, and gently shaken at 26 ° C for 1 hour, Virus infection was performed. After infection, the cells were precipitated by centrifugation at 900 rpm for 10 minutes at 26 ° C., and after removing the virus solution, 4 ml of fresh medium was added and seeded in a 60 mm cell culture dish manufactured by Falcon. The time when the fresh medium was added was defined as 0 hours after virus inoculation.
(3) BmMLVの検出
BmMLVの検出の為のウェスタンブロッティングでは、BmMLV感染BmVF細胞8×105を用い、抗BmMLV CP抗体、及び抗Actin抗体（サンタクルズ社製）を使用した。シグナルの検出には、GEヘルスケア社製ECL Plus Western Blotting Detection Reagentsを用い、シグナル強度はアトー社製Light-Capture II Cooled CCD Camera Systemを用いて検出、定量を行った。
(3) BmMLV detection
In Western blotting for detection of BmMLV, BmMLV-infected BmVF cells 8 × 10 5 were used, and anti-BmMLV CP antibody and anti-Actin antibody (manufactured by Santa Cruz) were used. For signal detection, ECL Plus Western Blotting Detection Reagents manufactured by GE Healthcare was used, and signal intensity was detected and quantified using a Light-Capture II Cooled CCD Camera System manufactured by Ato.
BmVF細胞へのBmMLVの感染実験、細胞内外におけるCPタンパク質の検出の結果、BmMLVは感染後36時間でBmVF細胞内でCPを産生し、感染後72時間では感染性を有するウイルス粒子を放出することが明らかとなった（図２）。
また、BmVF細胞へ新たにBmMLVを慢性感染させたBmVF-MLV細胞の性状を観察した。その結果、BmVF-MLV細胞は、細胞同士が吸着し巨大な塊が観察され、細胞増殖に遅延が認められた（図３）。
As a result of BmMLV infection experiments on BmVF cells and detection of CP protein inside and outside the cells, BmMLV produces CP in BmVF cells 36 hours after infection, and releases infectious virus particles 72 hours after infection. Became clear (FIG. 2).
In addition, the properties of BmVF-MLV cells that were newly infected with BmMLV chronically were observed. As a result, the BmVF-MLV cells adsorbed each other and a large mass was observed, and a delay in cell proliferation was observed (FIG. 3).
〔実施例３〕 BmVF細胞およびBmVF-MLV細胞へのバキュロウイルス感染実験
(1) ウイルス調製
カイコ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)野生株(T3株)はBmN4細胞を用いたプラーク法によって力価を調製した。
[Example 3] Baculovirus infection experiment on BmVF cells and BmVF-MLV cells
(1) Virus preparation The titer of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus wild strain (T3 strain) was prepared by the plaque method using BmN4 cells.
(2) ウイルス接種
ファルコン社製60mm細胞培養シャーレへBmVF細胞、及びBmVF-MLV細胞を4x106播種し、moi=10となるように、4x107PFUのBmNPVを無菌的にシャーレへ加え、1時間26℃にてゆっくりと振盪することで、ウイルスの感染を行った。感染後、900rpm、10分間、26℃で遠心分離することにより、細胞を沈殿させ、ウイルス液を除去した後、新鮮培地を4ml加え、ファルコン社製60mm細胞培養シャーレへ播種した。新鮮培地を加えた時間をウイルス接種後0時間とした。
(2) Virus inoculation 4x10 6 BmVF cells and BmVF-MLV cells were seeded in a Falcon 60mm cell culture dish, and 4x10 7 PFU of BmNPV was aseptically added to the dish so that moi = 10. The virus was infected by gently shaking at 26 ° C. After infection, the cells were precipitated by centrifugation at 900 rpm for 10 minutes at 26 ° C., and after removing the virus solution, 4 ml of fresh medium was added and seeded in a 60 mm cell culture dish manufactured by Falcon. The time when the fresh medium was added was defined as 0 hours after virus inoculation.
(3) プラークアッセイ
BmNPV接種後120時間のBmVF、及びBmVF-MLV細胞におけるBmNPVの力価をプラークアッセイによって測定した。プラークアッセイには、BmN4細胞を用い、常法に従って行った。
(3) Plaque assay
The BmNPV titers in BmVF and BmVF-MLV cells 120 hours after BmNPV inoculation were measured by plaque assay. The plaque assay was performed according to a conventional method using BmN4 cells.
(4) BmNPV ORF68タンパク質の検出
BmNPV ORF68タンパク質の検出の為のウェスタンブロッティングでは、BmNPV感染BmVF細胞、及びBmVF-MLV細胞をそれぞれ8×105を用い、抗BmNPV ORF68抗体、及び抗Actin抗体（サンタクルズ社製）を使用した。シグナルの検出には、GEヘルスケア社製ECL Plus Western Blotting Detection Reagentsを用い、シグナル強度はアトー社製Light-Capture II Cooled CCD Camera Systemを用いて検出、定量を行った。
(4) Detection of BmNPV ORF68 protein
In Western blotting for detection of BmNPV ORF68 protein, 8 × 10 5 BmNPV-infected BmVF cells and BmVF-MLV cells were used, and anti-BmNPV ORF68 antibody and anti-Actin antibody (manufactured by Santa Cruz) were used. For signal detection, ECL Plus Western Blotting Detection Reagents manufactured by GE Healthcare was used, and signal intensity was detected and quantified using a Light-Capture II Cooled CCD Camera System manufactured by Ato.
バキュロウイルスをBmVF細胞、BmVF-BmMLV細胞のそれぞれの培養細胞へ接種し、120時間後に観察した結果、ウイルス量はBmVF細胞では5×108、BmVF-MLV細胞では1×109となった。BmVF細胞では多角体の形成はBmVF-MLV細胞に比べて遅延する様子が観察された（図４）。また、バキュロウイルスを感染させたBmVF細胞およびBmVF-MLV細胞の細胞内におけるバキュロウイルス構造タンパク質ORF68の検出を行った結果、MLV存在下では感染後18時間でORF68が検出された（図５）。したがって、バキュロウイルスの感染・増殖には、BmMLVとの相互作用が働いていることが示唆された。
以上の結果から、BmVF細胞は一般に使用されているBmN細胞と同等のウイルス感染・増殖能を保持していることが示された。また、BmVF-BmMLVは一般のBmN細胞よりも優れたウイルス増殖能を示した。
Baculovirus was inoculated into each cultured cell of BmVF cells and BmVF-BmMLV cells and observed 120 hours later. As a result, the viral load was 5 × 10 8 for BmVF cells and 1 × 10 9 for BmVF-MLV cells. It was observed that polyhedron formation was delayed in BmVF cells compared to BmVF-MLV cells (FIG. 4). In addition, as a result of detecting baculovirus structural protein ORF68 in BmVF cells and BmVF-MLV cells infected with baculovirus, ORF68 was detected 18 hours after infection in the presence of MLV (FIG. 5). Therefore, it was suggested that the interaction with BmMLV is acting on the infection and proliferation of baculovirus.
From the above results, it was shown that BmVF cells retain the same viral infection / proliferation ability as commonly used BmN cells. Moreover, BmVF-BmMLV showed a virus growth ability superior to that of general BmN cells.
〔試験例１〕 BmMLVのクワ葉への感染実験およびカイコ幼虫への経口感染実験
(1) ウイルス調製
BmMLVの調製は〔実施例２〕に記載の通り行った。
[Test Example 1] BmMLV infection experiment on mulberry leaves and oral infection experiment on silkworm larvae
(1) Virus preparation
BmMLV was prepared as described in [Example 2].
(2) クワ葉へのウイルス接種
カーボンランダムにより微小の傷を付けたクワ葉へ、28μgのBmMLVを塗布し人為的接種試験を行った。ネガティブコントロールとして、BmMLVの代わりにPBSを塗布したものをmock接種とし、接種後6日間病徴の観察、及び実施例2と同様にウェスタンブロッティングによるBmMLV CPタンパク質の検出を試みた。
(2) Inoculation of virus into mulberry leaves 28 ml of BmMLV was applied to mulberry leaves that were slightly damaged by carbon random, and an artificial inoculation test was conducted. As a negative control, mock inoculation was performed with PBS applied instead of BmMLV, and symptom was observed for 6 days after inoculation, and BmMLV CP protein was detected by Western blotting in the same manner as in Example 2.
(3) カイコ幼虫へのBmMLVの経口接種
25℃に設定した恒温器内において人工飼料育を行っている試供蚕(C124号×N124号)へ、BmMLVの経口接種試験を行った。経口接種は、1・2・3・4・5齢期のカイコ幼虫の人口飼料へ〔実施例２〕に記載のBmMLVのウイルス液1.4μgを塗布し、ウイルス付着人工飼料を摂食させることで行った。カイコ幼虫が完全に摂食したのを確認した後、人工飼料による飼育を終齢まで行った。またこの時、ウイルス液の代わりにPBSを与えたものをmock接種とした。接種試験を行ったカイコ幼虫は、5齢3日目に達したものから、70%エタノールで麻酔及び体表面消毒を施した後、中腸・脂肪体を摘出し、ニッポンジーン社製Isogen、及び、キアゲン社製RNeasy Mini Kit、Dnase I setを用いてRNAを抽出しRT-PCR解析を行った。
(3) BmMLV oral inoculation to silkworm larvae
An oral inoculation test of BmMLV was performed on a test jar (C124 × N124) that was raising artificial feed in a thermostat set at 25 ° C. Oral inoculation is performed by applying 1.4 µg of the virus solution of BmMLV described in [Example 2] to the artificial feed of silkworm larvae at the 1st, 2nd, 3rd, 4th and 5th ages, and feeding the artificial feed with virus attachment. went. After confirming that the silkworm larvae were completely consumed, they were reared with artificial feed until the end of their ages. At this time, a mock inoculation was given with PBS instead of the virus solution. Silkworm larvae that underwent inoculation tests were those who reached the third day of age 5 after anesthesia and body surface disinfection with 70% ethanol, then the midgut and fat pad were removed, Nippon Gene's Isogen, and RNA was extracted using Qiagen RNeasy Mini Kit and Dnase I set, and RT-PCR analysis was performed.
(4) RT-PCR解析
クワ葉、及びカイコ幼虫由来RNAを用いたRT-PCRは、インビトロジェン社製SuperScript III one step RT-PCR kitを用いて添付のプロトコール通りに行った。BmMLV CP遺伝子の検出の為のプライマーには、N0071-7 (5'-GTCTCCTCCATCATCAAAGG-3')（配列番号：１）、N0071-10 (5'-GGATCGAAGACGTAGACTCG-3')（配列番号：２）を用い、宿主アクチン遺伝子の検出にはBA3F1 (5'-AGATGACCCAGATCATGTTCG-3')（配列番号：３）、BA3R1 (5'-GAGATCCACATCTGTTGGAAG-3')（配列番号：４）を用いた。
(4) RT-PCR analysis RT-PCR using RNA derived from mulberry leaves and silkworm larvae was performed according to the attached protocol using SuperScript III one step RT-PCR kit manufactured by Invitrogen. N0071-7 (5'-GTCTCCTCCATCATCAAAGG-3 ') (SEQ ID NO: 1) and N0071-10 (5'-GGATCGAAGACGTAGACTCG-3') (SEQ ID NO: 2) are used as primers for detection of the BmMLV CP gene. For the detection of the host actin gene, BA3F1 (5′-AGATGACCCAGATCATGTTCG-3 ′) (SEQ ID NO: 3) and BA3R1 (5′-GAGATCCACATCTGTTGGAAG-3 ′) (SEQ ID NO: 4) were used.
上記の試験の結果、クワ葉における接種ではウェスタンブロッティングによってシグナルが得られず、加えて、カイコ幼虫ではRT-PCRによってもBmMLV CPに対するシグナルが得られなかった（図６）。よって、BmMLVが単独ではクワ葉へ感染性を有さないことが示され、また、カイコ幼虫へ経口感染しないことも示された。 As a result of the above test, no signal was obtained by Western blotting in the inoculation in mulberry leaves, and in addition, no signal for BmMLV CP was obtained by RT-PCR in silkworm larvae (FIG. 6). Therefore, it was shown that BmMLV alone has no infectivity to mulberry leaves, and it was also shown that it does not orally infect silkworm larvae.
〔試験例２〕 各種昆虫培養細胞におけるBmMLV慢性感染の有無
(1) 供試培養細胞株
供試培養細胞株として、カイコ由来の培養細胞であるBmN4細胞・J125K5細胞・Oyanagi細胞・15A細胞ao1細胞・Cam1細胞・aff3細胞・Bem5細胞と、Spodoptera frugiperda由来のSf-9細胞とSf-21細胞を用いた。
[Test Example 2] Chronic BmMLV infection in various insect cultured cells
(1) Test cultured cell lines Test cultured cell lines include silkworm-derived cultured cells such as BmN4 cells, J125K5 cells, Oyanagi cells, 15A cells, ao1 cells, Cam1 cells, aff3 cells, and Bem5 cells, Sf-9 cells and Sf-21 cells were used.
(2) BmMLVの検出
BmMLVの検出の為のウェスタンブロッティングは、それぞれの培養細胞8×105を用い、抗BmMLV CP抗体、及び抗Actin抗体（サンタクルズ社製）を使用し、実施例2に記載の手法によって行った。
(2) BmMLV detection
Western blotting for detection of BmMLV was carried out by the method described in Example 2 using 8 × 10 5 cultured cells and using anti-BmMLV CP antibody and anti-Actin antibody (manufactured by Santa Cruz).
上記の試験の結果、BmN4、J125K5、Cam1、oyanagi、15A、ao1、aff3、Bem5細胞へ、既にBmMLVが慢性感染していることが明らかとなった。一方でBmVF、及びSpodoptera frugiperda由来のSf-9細胞とSf-21細胞へはBmMLVの慢性感染が認められなかった（図７）。 As a result of the above test, it was revealed that BmMLV was already chronically infected with BmN4, J125K5, Cam1, oyanagi, 15A, ao1, aff3, and Bem5 cells. On the other hand, BmMLV and Sf-9 cells derived from Spodoptera frugiperda and Sf-21 cells were not chronically infected with BmMLV (FIG. 7).
〔試験例３〕 Sf-9細胞へのBmMLV感染実験
(1) ウイルス調製
BmMLVの調製は〔実施例２〕に記載の通り行った。
[Test Example 3] BmMLV infection experiment on Sf-9 cells
(1) Virus preparation
BmMLV was prepared as described in [Example 2].
(2) Sf9細胞へのウイルス接種
1x108に調製したSf9細胞へ140μgのBmMLVを〔実施例２〕に記載の通り接種した。接種後1時間でウイルス液を除去した後、新鮮培地を10ml加え、ファルコン社製250ml細胞培養フラスコへ播種した。新鮮培地を加えた時間をウイルス接種後0時間とし、接種後1週間、2週間、4ヶ月後の細胞をサンプルとした。
(2) Inoculation of virus into Sf9 cells
Sf9 cells prepared at 1 × 10 8 were inoculated with 140 μg of BmMLV as described in [Example 2]. After removing the virus solution 1 hour after inoculation, 10 ml of fresh medium was added and seeded in a Falcon 250 ml cell culture flask. The time when the fresh medium was added was 0 hour after the virus inoculation, and the cells after 1 week, 2 weeks and 4 months after the inoculation were used as samples.
(3) ウェスタンブロッティング
Sf9細胞(8×105)をサンプルとし、抗BmMLV CP抗体、及び抗Actin抗体（サンタクルズ社製）を使用し、実施例2に記載の手法によってBmMLV CP、及び宿主actinタンパク質の検出を行った。
(3) Western blotting
Using Sf9 cells (8 × 10 5 ) as a sample, anti-BmMLV CP antibody and anti-Actin antibody (manufactured by Santa Cruz) were used, and BmMLV CP and host actin protein were detected by the method described in Example 2. .
(4) RT-PCR
Sf9細胞(1x106)をサンプルとし、キアゲン社製Rneasy mini kitを用いてRNAを抽出し、抽出したRNAを用いて実施例2に記載の通りにRT-PCRを行った。実施例2と同様に、BmMLV CP遺伝子の検出の為のプライマーには、N0071-7 (5'-GTCTCCTCCATCATCAAAGG-3')（配列番号：１）、N0071-10 (5'-GGATCGAAGACGTAGACTCG-3')（配列番号：２）を用い、宿主アクチン遺伝子の検出にはBA3F1 (5'-AGATGACCCAGATCATGTTCG-3')（配列番号：３）、BA3R1 (5'-GAGATCCACATCTGTTGGAAG-3')（配列番号：４）を用いた。
(4) RT-PCR
Using Sf9 cells (1 × 10 6 ) as a sample, RNA was extracted using an Rneasy mini kit manufactured by Qiagen, and RT-PCR was performed using the extracted RNA as described in Example 2. As in Example 2, N0071-7 (5′-GTCTCCTCCATCATCAAAGG-3 ′) (SEQ ID NO: 1), N0071-10 (5′-GGATCGAAGACGTAGACTCG-3 ′) was used as a primer for detection of the BmMLV CP gene. (SEQ ID NO: 2) and BA3F1 (5′-AGATGACCCAGATCATGTTCG-3 ′) (SEQ ID NO: 3) and BA3R1 (5′-GAGATCCACATCTGTTGGAAG-3 ′) (SEQ ID NO: 4) are used for detection of the host actin gene. Using.
上記の試験の結果、Sf9細胞へBmMLVの接種試験では、接種後1週間、2週間でRT-PCRによる増幅産物が認められたことから、BmMLVはSf9細胞へ侵入し、増殖していることが示された（図８）。しかしながら、ウェスタンブロッティングにおいてシグナルが得られなかったこと、及び、接種後4ヶ月のサンプルを用いたRT-PCRでは増幅産物を得ることが出来なかったことから、Sf9細胞におけるBmMLVの増殖は非常に微量であることが示唆された。 As a result of the above test, in the inoculation test of BmMLV to Sf9 cells, amplification products by RT-PCR were observed 1 week and 2 weeks after inoculation, so that BmMLV invaded Sf9 cells and proliferated. (Figure 8). However, the growth of BmMLV in Sf9 cells was very small because no signal was obtained in Western blotting, and RT-PCR using a sample 4 months after inoculation failed to obtain an amplification product. It was suggested that
〔試験例４〕 BmN細胞へのバキュロウイルス共感染実験
(1) ウイルス調製
BmNPVの調製は〔実施例３〕に記載の通り行った。一方で、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcNPV)の調製は、Sf9細胞を用いたプラーク法にて行った。
[Test Example 4] Baculovirus co-infection experiment on BmN cells
(1) Virus preparation
BmNPV was prepared as described in [Example 3]. On the other hand, autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) was prepared by a plaque method using Sf9 cells.
(2) ウイルス接種
BmN細胞へのBmNPV、及びAcNPV接種は、〔実施例３〕に記載の方法によってmoi=10にて行った。接種後1時間で、ウイルス液を除去した後、新鮮培地を4ml加え、ファルコン社製60mm細胞培養シャーレへ播種した。新鮮培地を加えた時間をウイルス接種後0時間とした。
(2) Virus inoculation
BmNPV and AcNPV inoculation into BmN cells was performed at moi = 10 by the method described in [Example 3]. One hour after inoculation, the virus solution was removed, 4 ml of fresh medium was added, and seeded in a Falcon 60 mm cell culture dish. The time when the fresh medium was added was defined as 0 hours after virus inoculation.
(3) ウェスタンブロッティング
BmNPV、及びAcNPVにそれぞれ感染させたBmN細胞(8×105)をサンプルとし、抗BmMLV CP抗体、及び抗Actin抗体（サンタクルズ社製）を使用し、〔実施例２〕に記載の手法によってBmMLV CP、及び宿主Actinタンパク質の検出を行った。
(3) Western blotting
Using BmNV cells (8 × 10 5 ) respectively infected with BmNPV and AcNPV as samples, anti-BmMLV CP antibody and anti-Actin antibody (manufactured by Santa Cruz) were used, and BmMLV was prepared by the method described in [Example 2]. CP and host Actin protein were detected.
(4) 免疫染色
BmNPV、及びAcNPVにそれぞれ感染させたBmN細胞を用い、抗BmMLV CP抗体を用いた細胞免疫染色を行った。二次抗体にはFITC標識抗ウサギIgG抗体（molecular probe社製）を用い、Okano et al (J. virol. 1999 73: 110-119.)の手法に従って行った。
(4) Immunostaining
Cell immunostaining using anti-BmMLV CP antibody was performed using BmN cells infected with BmNPV and AcNPV, respectively. As the secondary antibody, a FITC-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Molecular Probe) was used according to the method of Okano et al (J. virol. 1999 73: 110-119.).
上記の試験の結果、先ずウェスタンブロッティングにおいて、BmN細胞へ慢性感染しているBmMLV CPタンパク質のシグナルは、宿主actinシグナルがBmNPV感染によるシャットダウンを受けて感染後48時間で検出出来なくなるのに対し、消失することなく存在することが示された。一方で、本来BmN細胞へ感受性を有さないAcNPVの感染では、宿主actin、BmMLV CPの両者とも、シグナルが消失することはなかった（図９）。更に、免疫染色による試験の結果、BmMLV CPタンパク質は細胞質へ局在し、ウェスタンブロッティングの結果と同様に、BmNPV感染によるタンパク質合成のシャットダウンを受けていないことが示された（図１０）。 As a result of the above test, in Western blotting, the signal of BmMLV CP protein that chronically infects BmN cells disappears while the host actin signal cannot be detected 48 hours after infection due to shutdown due to BmNPV infection. It was shown to exist without. On the other hand, in the case of AcNPV infection, which originally has no sensitivity to BmN cells, neither the host actin nor the BmMLV CP lost the signal (FIG. 9). Furthermore, as a result of the immunostaining test, it was shown that the BmMLV CP protein was localized in the cytoplasm and was not subjected to protein synthesis shutdown due to BmNPV infection as in the case of Western blotting (FIG. 10).
現在、遺伝子工学分野において外来タンパク質の発現は欠かせない技術となっている。特に昆虫細胞と昆虫バキュロウイルスを利用した発現系は、その高い発現レベルに加えて翻訳後修飾やフォールディングの点で優れており、世界中で汎用されている。中でも、カイコ培養細胞は組み換えカイコバキュロウイルスの宿主として獣医薬の産生系としても利用されており、BmMLVの慢性感染は、医薬品等健康に安全な遺伝子産物を作出する際には問題となる可能性がある。この課題は、本カイコ培養細胞株を用いることにより解決される。そのため、外来遺伝子発現系として用いられてきたBmNPVの宿主細胞が、これまで利用されてきた全てのカイコ由来培養細胞から、本NIAS-Bm-VF細胞へ移行する可能性があり、本発明は国内外のBmNPVを利用した産業で利用されるものと考えられる。 Currently, the expression of foreign proteins has become an indispensable technique in the field of genetic engineering. In particular, expression systems using insect cells and insect baculoviruses are excellent in terms of post-translational modification and folding in addition to their high expression levels, and are widely used throughout the world. In particular, cultured silkworm cells are also used as a veterinary drug production system as a host for recombinant silkworm baculovirus, and chronic infection with BmMLV can be a problem when producing gene products that are safe for health such as pharmaceuticals. There is. This problem is solved by using this silkworm cultured cell line. Therefore, there is a possibility that the host cell of BmNPV that has been used as a foreign gene expression system may be transferred from all silkworm-derived cultured cells that have been used so far to the present NIAS-Bm-VF cell. It is considered to be used in industries using BmNPV outside.
Claims (5)
（ａ）日147号および支145号の交配により得られるカイコ品種の組織を得る工程
（ｂ）工程（ａ）により得られた組織をMX培地で初代培養する工程
（ｃ）BmMLV陰性の細胞株を選択する工程 A method for producing a BmMLV-negative silkworm cultured cell line, comprising the following steps (a) to (c):
(A) Step of obtaining silkworm cultivar tissue obtained by crossing day 147 and branch 145 (b) Step of primary culture of tissue obtained in step (a) in MX medium (c) BmMLV negative cell line The process of selecting
（ｉ）請求項１または２に記載のカイコ培養細胞株に、目的遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを感染させる工程
（ｉｉ）組換えバキュロウイルスが感染したカイコ培養細胞株で目的遺伝子を発現させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で発現した目的遺伝子産物を回収する工程 The manufacturing method of the target gene product which does not contain a BmMLV expression product including the process of following (i)-(iii).
(I) a step of infecting a silkworm cultured cell line according to claim 1 or 2 with a recombinant baculovirus containing the target gene (ii) a step of expressing the target gene in a silkworm cultured cell line infected with the recombinant baculovirus (Iii) recovering the target gene product expressed in the step (ii)
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