DE69430992T2

DE69430992T2 - Methode zum testen eines analyten

Info

Publication number: DE69430992T2
Application number: DE69430992T
Authority: DE
Inventors: Ian Philip Hesslewood; Gordon Sydney Anderson Birnie Stewart
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1993-09-08
Filing date: 1994-09-05
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: WO1995007346A1; US5827678A; AU7541894A; EP0717773B1; KR100338319B1; ES2180586T3; DE69430992D1; JPH09502605A; BR9407433A; EP0717773A1

Description

Die britische Patentschrift 2,005,018 beschreibt ein Verfahren für den Nachweis einer toxischen Substanz durch Bilden einer Suspension eines leuchtenden Mikroorganismus in einem wässrigen Medium, Inkontaktbringen der Suspension mit der toxischen Substanz und Erfassen eines Rückgangs der Lichtleistung der leuchtenden Mikroorganismen, der durch die toxische Substanz verursacht wird. Ein Testkit, der dieses Prinzip beinhaltet, wird von Microbics Inc. unter dem Markennamen Microtox vermarktet und routinemäßig in einer Reihe von Umweltlaboratorien eingesetzt.
Es besteht zwar die Annahme, dass der Microtox-Kit ein natürlich vorkommendes Bakterium einsetzt, doch gibt es ein Interesse an der Verwendung genetisch modifizierter leuchtender Mikroorganismen, da sie möglicherweise einen weiteren Anwendungsbereich haben. Verschiedenen Mikroorganismen kann beispielsweise eine Empfindlichkeit für verschiedene Reihen toxischer Substanzen oder sogar für individuelle toxische Substanzen verliehen werden. Die Verwendung genetisch modifizierter Organismen für diesen Zweck ist im US-Patent 4,581,335 beschrieben.
Es besteht zunehmend Bedarf an der Durchführung dieser Tests am Ort potentieller Verschmutzung, und dies kann sehr wohl Tests außerhalb normaler Laboreinrichtungen einschließen. Solche Zellen sind jedoch oft pathogen oder unterliegen einer kontrollierten Verwendung. Ein potentielles Problem bei der Verwendung genetisch modifizierter Organismen besteht darin, dass sie in die Umgebung entweichen und durch unkontrolliertes Wachstum Schäden verursachen können. Gesetzliche Beschränkungen bezüglich der Verwendung genetisch modifizierter Organismen in diesem Bereich sind, oder sind möglicherweise, in verschiedenen Ländern in Kraft.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das obige Problem zu umgehen, indem genetisch modifizierte Organismen verwendet werden, die abgetötet wurden. Wie jedoch nachfolgend erläutert wird, ist die Erfindung weder behalten, wenn auch mit reduzierter Intensität im Vergleich zu nicht bestrahlten Zellen. Noch überraschender ist die Tatsache, dass die funktionelle Stoffwechselaktivität bei diesen abgetöteten Zellen in einer auf die Dosis ansprechenden Weise durch Substanzen geändert wird, die die funktionelle Stoffwechselaktivität in einer auf die Dosis ansprechenden Weise in den entsprechenden lebenden Zellen ändern. Folglich wird beispielsweise die Lumineszenz von abgetöteten biolumineszierenden Organismen in einer auf die Dosis ansprechenden Weise in Anwesenheit einer Substanz geändert, die ein Toxikum für die entsprechenden lebenden Organismen ist.
Vorzugsweise sind die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zellen Mikroorganismen, die genetisch modifizierte Organismen sein können. Oft sind die Mikroorganismen Bakterien. In den folgenden Beispielen wurden E.coli-Bakterien verwendet; allerdings würden andere Bakterien den gleichen Effekt haben. Die Zellen können aufbewahrt und in einem stabilisierten Zustand präsentiert werden. Bei diesem stabilisierten Zustand handelt es sich vorzugsweise um einen lyophilisierten Zustand.
Die Zellen können durch Strahlung, z.B. ionisierende Strahlung, abgetötet worden sein. In den folgenden Beispielen wurde die Gammastrahlung von einer Kobalt-60- Quelle verwendet. Gammastrahlung von anderen Quellen oder Röntgenstrahlen oder ein Elektronenstrahl oder sogar UV- Strahlung hätten aber auch denselben Effekt. Der Strahlungsschaden muss zur Abtötung der Zellen ausreichen, darf jedoch vorzugsweise nicht viel größer sein, als für diesen Zweck nötig ist. Der Grund ist, dass der Strahlungsschaden auch nach und nach die Biolumineszenz oder andere funktionelle Stoffwechselaktivitäten der Organismen reduziert. Die erforderliche Strahlungsdosis ist von der Anzahl der vorhandenen Zellen, z.B. von der Zelldichte, und von der Beschaffenheit der Zellen abhängig und wird recht einfach in Routineexperimenten bestimmt, wie in den folgenden Beispielen demonstriert wird. Das Abtöten der Zellen durch andere Mittel, ohne die gleichzeitige Zerstörung ihrer gesamten funktionellen Stoffwechselaktivität(en), ist möglich, wird aber nicht bevorzugt.
Die Beschaffenheit des Analyten ist für die Erfindung nicht relevant. Es sind viele Analyten, insbesondere Toxika, allgemein bekannt, die eine Reduzierung der Biolumineszenz oder eines anderen von lebenden Zellen erzeugten Signals bewirken. Toxika - von denen die Autoren der Erfindung eine Reihe getestet haben - haben eine entsprechende Wirkung zur Reduzierung der Biolumineszenz oder eines anderen von abgetöteten Zellen dieser Erfindung erzeugten Signals. Andere Analyten haben möglicherweise die Eigenschaft, de novo Genexpression in den abgetöteten Zellen zu induzieren (s. 3. Beispiel).
Es wird auf die Begleitzeichnungen verwiesen. Dabei zeigt:
Fig. 1 eine Kurve, die den Effekt einer Bestrahlung auf die Lebendkeimzahl und die Lichtleistung darstellt;
Fig. 2 eine Kurve, die den Effekt einer Bestrahlung auf die Empfindlichkeit des Lichtreagens auf Bronopol darstellt; und
Fig. 3 eine Kurve, die den Effekt einer Bestrahlung auf die Induktion von Biolumineszenz in nichtinduziertem biolumineszierendem E. coli darstellt.

1. Beispiel

Verfahren

1. Jeder Kasten wurde mit 60 Glasfläschen mit LUX- Lichtreagens bestückt (eine lyophilisierte Probe genetisch modifizierter Bakterien, in der das LUX-Gen, das für Biolumineszenz verantwortlich ist, in einem Plasmid enthalten war, wobei die Suspension einen Ausgangs-OD&sub6;&sub3;&sub0;- Wert von 0,9 in Polypropylenglasfläschen hatte) und ein Dosimeter wurde in die Mitte gesetzt.
2. Die Kästen wurden mit einem Klebeband fest zugeklebt und externen Strahlungsdosen von einer Kobalt-60-Quelle im Bereich von 1-8 kGy ausgesetzt.
3. 2 ml sterile CLPB (kontrollierte 10 g-Phasen-Bouillon (Lab M)) wurden mit einer Spritze und sterilen Nadel aseptisch in drei Glasfläschen aus jedem Kasten und in 3 Glasfläschen, die nicht bestrahlt worden waren, injiziert.
4. Duplikatproben wurden auf Luria-Agarplatten plattiert.
5. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert und anschließend gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, in der die gefüllten Quadrate die Lebendkeimzahlen repräsentieren.
6. Fünf Glasfläschen wurden mit 0,5 ml BAR3-Puffer (25 mM HEPES, pH-Wert 6, 50 mM NaCl, 12,5 mM MgSO&sub4;) rekonstituiert und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen.
7. Die Lichtleistung wurde in einem Luminometer gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, in der die gefüllten Dreiecke Lichtleistungen auf unterschiedlichen Bestrahlungsstufen repräsentieren. Es ist erkennbar, dass eine interne Strahlungsdosis von 3,5 kGy zur Abtötung der Zellen ausreichte, aber keineswegs die Lichtleistung beeinträchtigte.

2. Beispiel

Die Zugabe verschiedener Biozid-Konzentrationen zu biolumineszierendem E.coli RMT1/pBL399 beeinflusst die Biolumineszenz in einer auf die Dosis ansprechenden Weise. Dieses Experiment soll demonstrieren, dass der auf die Dosis ansprechende Effekt selbst dann beibehalten wird, wenn die Organismen bestrahlt werden.

Materialien

RMT1/pBL399 LUX-Biozid-Testlichtreagens Charge A (nicht bestrahlt) und Charge B (bestrahlt).
BAR4 Puffer (25 mM HEPES, pH-Wert 6, 75 mM NaCl, 12,5 mM MgSO&sub4;).
Luminometer
Sarstedt-Eichglasfläschen
Bronopol Aldrich 13, 470-8
Analysewasser BDH

Verfahren

1. 600 Glasfläschen mit dem Lux-Biozid-Lichtreagens wurden in Metalldosen in vier aufrechten Lagen gepackt. Ein Bernstein-Dosimeter wurde in die Mitte jeder Lage gesetzt, um die empfangene Strahlungsdosis aufzuzeichnen.
2. Die Dosen wurden Gammastrahlung von einer Kobalt-60- Quelle ausgesetzt, bis eine Zieldosis von 8 KGy erreicht war.
3. 5% der Glasfläschen wurden zur Lebensfähigkeitsprüfung zufällig aus jeder Dose ausgewählt.
4. 0,5 ml kontrollierte 10 g-Phasen-Bouillon (CLPB [LabM, LAB152]) wurden aseptisch in die jeweiligen unter (3) ausgewählten Glasfläschen durch den Gummistopfen injiziert, wobei für jedes Glasfläschen eine frische sterile Nadel benutzt wurde.
5. Die Glasfläschen wurden umgedreht, um zu gewährleisten, dass der gesamte Inhalt in die CLPB gespült wurde, und 18 Stunden lang bei 30ºC inkubiert.
6. Nach der Inkubation wurde der gesamte Inhalt jedes Glasfläschens auf eine Nähragarplatte gegeben und 18 Stunden lang bei 37ºC inkubiert.
7. Jede Platte wurde auf Bakterienkolonien hin untersucht, die auf ein Überleben der Strahlungsbehandlung hinweisen würden.
8. Es wurden die folgenden Bronopol-Konzentrationen hergestellt: 2, 5, 10, 15 und 20 ug/ml.
9. 15 Glasfläschen von jeder Lichtreagens-Charge wurden mit 0,5 ml BAR4-Puffer rekonstituiert und 10 Minuten lang stehen gelassen, damit das Licht stabilisieren konnte. 10. Nach 10 Minuten wurde das Licht gemessen; sofort wurden 0,5 ml Biozid zugegeben und jede Konzentration wurde dreimal getestet.
11. Nach einer Biozidkontaktzeit von 2,5 Minuten wurde das Licht wieder gemessen.
12. Die d-Werte wurden berechnet und auf einem doppeltlogarithmischen Diagramm gegenüber der Bronopol- Konzentration dargestellt.

Ergebnisse

Die erhaltene Strahlungsdosis lag zwischen 7,22 KGy und 8,12 KGy, und von keinem der getesteten Glasfläschen konnten lebensfähige Zellen gewonnen werden, was ein Hinweis darauf war, dass die Strahlungsdosis alle Bakterienzellen in den Glasfläschen abgetötet hatte.
Ergebnisse siehe Fig. 2.
Geradengleichungen:
nicht bestrahlt: log(y) = -0,386log(x) + 0,605
bestrahlt: log(y) = -0,350log(x) + 0,602
Sowohl lebende als auch tote (bestrahlte) RMT1/pBL399 sprechen auf Bronopol in der gleichen auf die Dosis ansprechenden Weise an.

3. Beispiel

Verfahren

1. Glasfläschen mit gefriergetrockneten lumineszierenden Bakterien wurden bei 8 kGy wie im 1. Beispiel bestrahlt.
2. Alle Glasfläschen mit Bakterien (bestrahlte und nicht bestrahlte) wurden mit 0,5 ml CLPB rekonstituiert. Das nicht bestrahlte sowie das bestrahlte Reagens wurden gepoolt.
3. 100 ul Aliquoten von bestrahltem und nicht bestrahltem Reagens wurden in 2 · 8 Mikrotiter-Mulden abgegeben.
4. 100 ul Aliquoten von 40 ng/ml Induktor wurden dann in die Hälfte der Mulden mit den jeweiligen Reagenstypen gegeben, und 100 ul CLPB wurden zu den restlichen Mulden als Kontrolle gegeben. Der Induktor war N-(β-ketocaproyl)- L-homoserin-lacton, eine Verbindung, die bekanntlich als ein Autoinduktor wirkt, der die Expression von LUX-Genen reguliert.
5. Das Tablett wurde bei 22ºC inkubiert und die Lichtsignale wurden in 15-Minuten-Intervallen gemessen, und eine Ablesung erfolgte nach einem Aufenthalt bei 22ºC über Nacht am nächsten Morgen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Sie zeigen, dass es möglich ist, bestrahlte (nicht lebensfähige), nichtinduzierte biolumineszierende E.coli zu veranlassen, metabolisch auf Induktor zu reagieren und dann Licht zu produzieren.

Claims

1. Verfahren zum Testen eines Analyten unter Verwendung eines Testreagens, das eine flüssige Suspension von Signalerzeugungszellen umfasst, umfassend die folgenden Schritte: Vermischen einer flüssigen Probe, die möglicherweise den Analyten enthält, mit einer Aliquote des Testreagens, um ein Testgemisch zu bilden, und anschließend Beobachten eines von den Zellen erzeugten Signals, wobei das Testreagens Bakterienzellen umfasst, die abgetötet wurden, die jedoch eine funktionelle Stoffwechselaktivität behalten, wobei das Reagens keine entsprechenden Bakterienzellen enthält, die nicht abgetötet wurden, und wobei die funktionelle Stoffwechselaktivität der Zellen Biolumineszenz ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bakterienzellen durch Bestrahlung abgetötet wurden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die funktionelle Stoffwechselaktivität in einer auf die Dosis ansprechenden Weise durch Substanzen geändert wird, die die funktionelle Stoffwechselaktivität in einer auf die Dosis ansprechenden Weise in den entsprechenden nicht bestrahlten Zellen ändern.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Bakterienzellen genetisch modifiziert sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Analyt ein Induktor einer Genexpression in den abgetöteten Zellen ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Bakterienzellen vor der Verwendung als Testreagens lyophilisiert werden.