DE69231621T2

DE69231621T2 - Hepatitis-B-Virus-Epitope mit HLA-reduzierte CTL-Respons

Info

Publication number: DE69231621T2
Application number: DE69231621T
Authority: DE
Inventors: Robert W. Chesnut; Maria A. Vitiello
Original assignee: Epimmune Inc
Current assignee: Epimmune Inc
Priority date: 1991-08-26
Filing date: 1992-08-26
Publication date: 2001-05-31
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: NO940660L; IL102964A0; JP3586278B2; NZ270605A; FI940918A; JP2004075693A; EP0534615A3; NO940660D0; BG98523A; CA2115839C; HUT68510A; FI940918A0; CZ42794A3; AU2548792A; WO1993003764A1; JPH06510051A; CA2115839A1; ES2155060T3; DE69231621D1; EP0534615B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Das Hepatitis B-Virus (HBV) ist, so nimmt man an, nicht direkt verantwortlich für die Schädigung von Hepatozyten, obwohl es eine Prädilektion für die Infektion solcher Zellen besitzt. Stattdessen sind nicht-virale Wirtsvektoren an der Pathogenese der Hepatitis beteiligt. Man mutmaßt, dass eine Variation der Immunreaktionsfähigkeit auf HBV-Infektion der Grund für die große Vielzahl an mit der HBV-Infektion assoziierten Syndromen ist.
Nach akuter HBV-Infektion erholen sich etwa 90% der betroffenen Erwachsenen ohne Spätfolgen und entwickeln Immunität gegenüber dem Virus, obwohl der klinische Infektionsverlauf während der akuten Phase selbst recht variabel sein kann. Bei 5-10% der infizierten Erwachsener etabliert sich eine chronische HBV-Infektion. Diese kann vom asymptomatischen Trägerzustand bis zu kontinuierlicher Leberzellennekrose und -entzündung und in einigen Fällen auch zu Leberzellenkarzinom reichen. HBV infizierte Kinder, besonders die weniger als ein Jahr alten, entwickeln oft chronische Infektionen und stellen den Hauptursprung chronischer Infektion dar. Weltweit infizieren sich fast 200 Millionen Menschen mit HBV. Schließlich führt bei einem geringen Prozentsatz von HBV-Infektionen (0,1-0,5%) fulminante Hepatitis zu einem solch extremen Zelltod in der Leber, dass weniger als 1/5 bis 1/3 dieser Patienten überlebt.
Die Immunreaktion auf das Hepatitis B-Virus ist ebenso komplex wie die Krankheit. Eine Vielzahl humoraler und zellulärer Reaktionen wurde auf unterschiedliche Regionen des HBV-Nukleocapsidkerns und auf Oberflächenantigene identifiziert. T-Zellenmediierte Immunität, insbesondere jene, die auf Klasse I-Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) eingeschränkte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) umfasst, spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der Resistenz gegenüber Hepatitis sowie mehreren anderen viralen Infektionen. CTLs erkennen Antigene in Form von kleinen Peptiden in Assoziation mit Klasse I-Histokompatibilitäts-Molekülen. Die antigenspezifischen CTLs können bei Stimulierung Mediatoren sekretieren, welche die virale Replikation inhibieren und infizierte Zellen eliminieren, wodurch sie zu einer Erholung des Patienten von der Infektion beitragen. Obwohl Studien nahe legen, dass das T-Zellen-Repertoire von auf Klasse I eingeschränkten Reaktionen auf eine begrenzte Anzahl diskreter immundominanter Epitope eines viralen Proteins konzentriert ist (Braciale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 277-281 (1981)), wurden für zahlreiche Viren, wie z. B. die Hepatitisviren, insbesondere HBV, wenige Epitope identifiziert. Siehe auch Barnaba et al., Nature 345, 258 (1990), die ein auf A11 eingeschränktes Epitop idenfizierten, während Jin et al., J. Exp. Med. 168, 293 (1988), ein auf A3 eingeschränktes Epitop identifizierten. Aichelo et al., J. Exp. Med. 171, 1815-1820 (1990), veranschaulichten das in vivo-Induzieren einer antiviralen CTL-Reaktion in MHC-Klasse I-abhängiger Weise mit einem Peptid aus dem Nukleoprotein von Lymphozyten-Choriomeningitis-Virus. Kast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2283-2287 (1991), beschrieben die Stimulierung von Sendai-Virus-spezifischen CTLs in vivo unter Einsatz von freiem synthetischem Peptid aus dem Nukleoprotein, um Schutz gegen anschließende Viren-Anregung zu verleihen.
Es wurde vorgeschlagen, dass Hepatozyten-Schädigung während der HBV-Infektion durch eine HLA-Klasse I eingeschränkte CTL-Reaktion auf HBV-Antigen mediiert werden kann. Beim Versuch der Definition der CTL-Reaktion auf HBV wurde gezeigt, dass Peripherblut-Lymphozyten aus Patienten mit akuter und chronischer HBV autologe Hepatozyten in vitro abtöten können, aber die Spezifität der zytolytischen Aktivität, ihre HLA- Restriktionselemente und zellulärer Phenotyp wurden nicht ermittelt. Siehe Mondelli et al., J. Immunol. 129, 2773 (1982), und Mondelli et al., Clin. Exp. Immunol. 6, 311 (1987). Es berichteten Moriyama et al., Science 248, 361-364 (1990), dass das Haupt- HBV-Hüllenantigen an der Hepatozytenoberfläche in einer Form exprimiert wurde, die von auf MHC-Klasse I eingeschränkten, CD8&spplus;-zytotoxischen T-Lymphozyten und von hüllenspezifischen Antikörpern erkennbar ist. Allerdings wurden HBV-Epitop-Regionen, die für HBV-spezifische CTL-Aktivität verantwortlich sind, nicht identifiziert.
Der Bedarf an Lymphokinen wie etwa IL-2 bei der Erzeugung von CD8+ CTLs ist gesichert, obwohl die Notwendigkeit der Aktivierung von CD4-T-Helferzellen zur Bereitstellung dieser Lymphokine noch etwas kontroverstell ist. Während das Konzept der verbundenen T-Helfer-B-Zellen-Erkennung für die Antikörper-Produktion zuverlässig definiert wurde, gibt es keine stichhaltigen Beweise auf die verbundene T-Helfer-CTL-Erkennung für das in vivo-Induzieren von CD8+ CTLs. Siehe z. B. Buller et al., Nature 328, 77-79 (1987); Sarobe et al., Eur. J. Immunol. 21, 1555-1558 (1991); sowie Cassell und Forman, Annals N. Y. Acad. Sci., 51-60 (1991).
Chronisch mit HBV infizierte Individuen laufen Gefahr, Leberzirrhose und/oder Leberzellenkarzinom zu entwickeln, und stellen ein extrem großes Reservoire zur Ausbreitung der Krankheit dar. Es wäre wünschenswert, die Immunsysteme chronisch Infizierter zu stimulieren, um auf geeignete HBV-Antigene zu reagieren und ihre Infektionen zu eliminieren, oder in der Lage zu sein, ihre Entwicklung von akuter HBV-Infektion zum chronischen Zustand zu verhindern. Da die derzeit zugelassenen HBV-Vakzinen nur etwa 90%igen Schutz der Immunisierten bieten, ist es wünschenswert, die existierenden Vakzinen durch Erhöhen oder Diversifizieren ihrer Immunogenität zu verbessern, um eine wirksamere Immunität hervorzurufen. Es sind auch Methoden erforderlich, um vorhersagen zu können, welche Patienten mit akuter HBV-Infektion wahrscheinlich eine chronische HBV-Infektion entwickeln werden, sodass geeignete Behandlungen und prophylaktische Maßnahmen früher durchgeführt bzw. getroffen werden können. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass die vorliegende Erfindung diese und andere ähnliche Anforderungen erfüllt.
Die EP-A-0.433.242 offenbart eine Vakzine, die Lipoproteinmembranen umfasst, die Antigene, wie z. B. HBV-Hüllenproteine, enthält. Auf diese Weise kann Antigen, das normalerweise durch eine Antigen-präsentierende Zelle in Assoziation mit MHC-Klasse II- Molekülen präsentiert wird, zwecks Erkennung durch zytotoxische T-Lymphozyten in Assoziation mit MHC-Klasse I-Molekülen präsentiert werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bietet Peptide, die auf MHC-Klasse I eingeschränkte CTL- Reaktionen gegen HBV-Antigen induzieren. Die Peptide von Interesse rühren von Sequenzen des HBV-Oberflächenantigens oder von Nukleocapsidproteinen her. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Peptide 6 bis etwa 30 Aminosäuren und enthalten zumindest ein Epitop, das in der Lage ist, eine auf MHC-Klasse I eingeschränkte zytotoxische CTL-Reaktion auf HBV zu induzieren, worin sich das oder die Epitop(e) innerhalb der HBV-Hüllenantigen-Sequenz mit der Bezeichnung 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) [Seq.-ID Nr. 2] Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile-Trp-Met-Met-Trp-Tyr-Trp-Gly-Pro- Ser-Leu oder 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;) [Seq.-ID Nr. 7] Ala-Ser-Ala-Arg-Phe-Ser-Trp-Leu-Ser- Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Val-Gln-Trp-Phe-Val-Gly (für die Untertypen ayw und adw) befindet/befinden. Andere Peptid-Ausführungsformen umfassen 6 bis 30 Aminosäuren und weisen zumindest 7 Aminosäuren aus der HBenv-Sequenz 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;) [Seq.- ID Nr. 1] Asn-Cys-Thr-Cys-Ile-Pro-Ile-Pro-Ser-Ser-Trp-Ala-Phe-Gly-Lys-Phe-Leu-Trp-Glu- Trp (für den Untertyp ayw) auf. In anderen Ausführungsformen stammt ein Petpid aus der HBV-Kernantigen-Sequenzregion mit der Bezeichnung 802.03 (HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;) [Seq.-ID Nr. 4] und der Sequenz Thr-Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile- Ser-Cys-Leu-Thr-Phe (Untertyp ayw). Die Peptide der Erfindung können gegebenenfalls an einem oder beiden von N- und C-Terminus flankiert und/oder modifiziert sein, und Substitutionen, Deletionen und Additionen können im Peptid vorgenommen werden, sofern seine Fähigkeit, HBV-CTL-Aktivität zu stimulieren oder als analoger Antagonist zu agieren, nicht stark beeinträchtigt wird.
In den verschiedenen Peptid-Ausführungsformen ist zu beachten, dass die Peptide kovalent, d. h. über Polymerisation oder Konjugation, verbunden sein können, und zwar miteinander, um größere Homopolymere zu bilden, oder mit anderen Peptiden, um Heteropolymere zu bilden. In einigen Fällen sind Peptide in einer Zusammensetzung als Gemisch kombiniert und nicht verbunden. Das CTL-induzierende Peptid kann auch mit einem lipidhältigen Molekül, das eine T-Lymphozyten-Reaktion verstärken kann, mit einem T-Helfer-Peptid, das eine T-Helfer-Zellen-Reaktion induziert, oder sowohl mit einem lipidhaltigen Molekül als auch mit einem T-Helfer-Peptid verbunden sein. Die Bindung an ein Lipid oder ein T-Helfer-Peptid kann entweder am Amino- oder am Carboxyl-Terminus erfolgen.
Es werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein Peptid der Erfindung umfassen, das mit einem zusätzlichen Peptid, einem Liposom, einem Adjuvans und/oder einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert ist. Somit können pharmazeutische Zusammensetzungen in Verfahren zur Behandlung akuter HBV-Infektionen verwendet werden, insbesondere um die Infektion daran zu hindern, sich in einen chronischen oder Trägerzustand weiterzuentwickeln. Verfahren zur Behandlung chronischer HBV-Infektionen und HBV-Trägerzustände werden ebenfalls bereitgestellt, wobei die pharmazeutischen Zusammensetzungen an infizierte Individuen in Mengen verabreicht werden, die zur Stimulierung immunogen wirksamer CTL-Reaktionen gegen HBs- und HBc- Epitope ausreichen. Zur Behandlung dieser Infektionen kann es besonders günstig sein, die Peptide, die auf MHC-Klasse I eingeschränkte CTL-Reaktionen gegen HGV-Antigen induzieren, mit anderen Peptiden oder Proteinen, die Immunreaktion auf andere HBV- Antigene induzieren, zu kombinieren. Zur Behandlung von Individuen mit chronischen oder Trägerzustand-Infektionen können die Zusammensetzungen in einer Anfangsdosis verabreicht werden, gefolgt von einer Auffrischungsdosis im Laufe der Zeit, falls dies notwendig ist, um die Infektion zu beenden oder wesentlich zu lindern.
Vakzinen-Zusammensetzungen zur Prävention von HBV-Infektionen, z. B. zur Prävention der Entwicklung chronischer HBV-Infektionen aus einer akuten Infektion, sind auch Gegenstand der Erfindung. Die Vakzinen-Zusammensetzungen umfassen eine immunogen wirksame Menge eines HBV-Peptids, das eine auf MHC-Klasse I eingeschränkte CTL-Reaktion induziert. Im Fall von HLA-A2-Haplotyp-Individuen kann das Peptid aus jedem der Peptide 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;) [Seq.-ID Nr. 1], 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;) [Seq.-ID Nr. 7], 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub5;) [Seq.-ID Nr. 2] und/oder 802.03 (HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;) [Seq.-ID Nr. 4] abgeleitet sein und umfasst typischerweise ein Adjuvans, z. B. unvollständiges Freund- Adjuvans, Alauniniumhydroxid oder dergleichen. Zur Erreichung von verstärktem Schutz vor HBV kann die Vakzine auch weitere Komponenten umfassen, um protektive Zell- und/oder Antikörperreaktionen gegen HBV-Antigene hervorzurufen. In bevorzugten Ausführungsformen werden die CTL-induzierenden Peptide zusammen mit einem oder mehreren T-Helfer-Peptiden verabreicht, die T-Helfer-Epitope enthalten. Die Selektion des T-Helfer-Peptids hängt davon ab, ob die Vakzine-Zusammensetzung mit einem T-Helfer-Peptid prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht wird. Im Fall prophylaktischer Gabe besteht das T-Helfer-Peptid aus einem oder mehreren HBV- Peptiden aus der HBV-Hülle oder dem Kern oder aus Proteinen anderer Organismen, wie z. B. Tetanustoxoid, Influenza, Parainfluenza, Malaria, Epstein-Barr-Virus, Herpes simplex und dergleichen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Im Fall therapeutischer Verabreichung besteht das T-Helfer-Epitop vorzugsweise aus Peptiden, die von Proteinen aus anderen infektiösen Erregern als HBV abgeleitet sind. Beispiele für das T-Helfer-Peptid sind HBc 128-140, HBc 1-20, HBc 50-69 und HBc 111-125, Tetanus Toxoid 830-843 und Influenza 307-319. Die T-Helfer-Peptide können gleichzeitig oder getrennt vom CTL-induzierenden Peptid verabreicht werden, vorzugsweise sind aber die CTLs und T-Helfer-Peptide verknüpft. Die Verbindung der Peptide kann ein Spacer-Molekül, wie z. B. Aminosäurereste wie etwa Alanin oder andere relativ neutrale Reste, umfassen.
In wiederum anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifikation eines Individuums, das für die Entwicklung chronischer HBV-Infektion anfällig ist, umfassend:
das Inkubieren lymphomononuklearer Zellen aus einem Individuum von Interesse mit einem Hepatitis B-Peptid-Antigen nach einem der Ansprüche 1-9 oder einem, das eine auf HLA-Klasse I eingeschränkte Reaktion von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) auf HBV induziert; und
das darauf folgende Bestimmen der Fähigkeit des Individuums, die CTL-Reaktion auf das Antigen zu zeigen, und somit der Fähigkeit zur Entwicklung einer chronischen HBV-Infektion.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse des Induzierens von HBV-Peptid-spezifischen, auf A2.1 eingeschränkten CTLs durch Primen transgener A2.1/Kb-Mäuse mit syngenetischen Milzzellen, die mit HBV "beladen" waren. Diagramme A-D: Splenozyten aus HBV-geprimten transgenen Mäusen wurden mit 4 Gemischen syngenetischer LPS-Blasten (jeweils mit 1- 13 unterschiedlichen Peptiden beschichtet) in vitro restimuliert. Nach 9 Tagen wurden Effektorzellen auf Lyseaktivität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2.1/Kb-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit der 4 unterschiedlichen zur Induktion verwendeten Petpidgemische untersucht. Diagramme E-M: Gegen die 4 unterschiedlichen Petpidgemische gebildete Effektorzellen wurden in vitro gegen die gleichen Peptidgemische restimuliert und auf Lyseaktivität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2.1/Kb-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit der einzelnen Peptide getestet.
Fig. 2 veranschaulicht die HBV-Peptid-Spezifität transgener A2.1-CTLs. Transgene CTLs aus HBV-geprimten transgenen Mäusen (zweimal in vitro mit einem der 4 unterschiedlichen Peptidgemische restimuliert) wurden mit einzelnen HBV-Peptiden restimuliert und auf &sup5;¹CR-markierten Jurkat-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit der zur Restimulierung verwendeten HBV-Peptide auf Lyseaktivität untersucht.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Induktion HBV-Peptid-spezifischer, auf A2.e eingeschränkter CTLs durch Primen transgener A2.1/Kb-Mäuse mit HBV in IFA. Splenozyten aus HBV-geprimten transgenen Mäusen wurden in vitro mit syngenetischen LPS-Blasten (mit HBV-Peptiden beschichtet) restimuliert. Nach 6 Tagen wurden Effektorzellen auf Lyseaktivität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2.1/Kb-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit des geeigneten HBV-Peptids untersucht. Jedes Diagramm stellt die durch das angegebene Zielpeptid hervorgerufene CTL-Aktivität dar.
Fig. 4: Die Effektor-CTL von Fig. 3 wurden mit mit LPS-Blasten beschichtetem Peptid restimuliert, gefolgt in einem einwöchigen Intervall durch die Restimulierung mit peptidbeschichteten Jurkat A2.1/Kb-Zellen. 6 Tage nach der letzten Restimulierung wurden Effektorzellen in Abwesenheit oder Gegenwart des für die Restimulierung verwendeten Peptids sowie verwandter Peptide auf zytolytische Aktivität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2.1/Kb-Zielzellen getestet. Jedes Diagramm stellt die CTL-Aktivität dar, die durch das im entsprechenden Diagramm aus Fig. 3 angezeigte Peptid induziert wurde. Die Zielpeptide sind in jedem Diagramm angegeben.
Fig. 5 veranschaulicht, dass keine HBc18-27-spezifische CTL-Reaktion in mit dem HBc 875.23 T-Helfer-Epitop alleine geprimten Mäusen detektiert wird. Tiere wurden subkutan mit 100 ug 875.23 (T-Helfer-Epitop) in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) geprimt, gefolgt von IFA alleine 9 Tage später und subkutan. Splenozyten wurden 3 Wochen später entnommen, 6 Tage lang in Gegenwart von LPS-Blasten, die mit dem CTL- Epitop (875.15) inkubiert worden waren, in einer Menge von 100 ug 2 Stunden lang vor dem Waschen kultiviert und der Kultur als Quelle Antigen-präsentierender Zellen zugesetzt. Die Gegenwart von HBc18-27- (875.15-) spezifischen CTLs wurde unter Verwendung eines herkömmlichen 6 Stunden dauernden ¹&sup5;Cr-Freisetzungsassays mit Jurkat A2.1/Kb-Zielzellen bestimmt.
Fig. 6 zeigt, dass keine HBc18-27-spezifische CTL-Raktion detektiert wurde, als Mäuse mit HBc18-27 (875.15) in IFA geprimt wurden. Die Arbeitsvorschrift des Versuchs ähnelte jener von Fig. 5, außer dass Mäuse zum in vivo CTL-Primen 100 ug Peptid 875.15 subkutan in IFA erhielten anstatt IFA alleine.
Fig. 7 veranschaulicht, dass HBc18-27-spezifische CTL-Reaktion bei 50% der Mäuse detektiert wurde, die mit HBc-T-Helfer-Peptid (875.23), vermischt mit HBc-CTL-induzierendem Peptid (875.15) im Verhältnis 1 : 1 geprimt wurden.
Fig. 8 zeigt, dass HBc-spezifische (875.15) CTL-Aktivität bei Mäusen detektiert wurde, die mit Peptid 902.01 geprimt waren, worin das HBc-T-Helfer- und -CTL-induzierende Peptid über eine Peptidbindung miteinander verbunden waren. Die Arbeitsvorschrift des Versuchs ähnelte jener der Fig. 5 und 6.
Fig. 9 veranschaulicht, dass die stärkste HBc18-27- (875.15-) spezifische CTL-Aktivität in Mäusen detektiert wurde, die mit dem Peptid 902.02 geprimt wurden, worin die HBc-T- Helfer- und -CTL-Epitope über Peptidbindungen unter Einsatz eines Spacers, wie z. B. Alanin-Alanin-Alanin, verbunden wurden. Die Arbeitsvorschrift ähnelte jener der Fig. 5 und 6.
Fig. 10 zeigt, dass kein vorheriges Primen von T-Helfer-Zellen zum in vivo-Primen von HBc18-27-spezifischen CTL-Reaktionen unter Einsatz von Peptid 902.01 und 902.02 erforderlich war. CTL-Reaktion zeigte sich bei Tieren, die subkutan mit Peptid 902.01 (Fig. 10A) oder 902.02 (Fig. 10B) alleine ohne vorheriges Primen mit Peptid 875.23 in CFA geprimt wurden.
Fig. 11 veranschaulicht die Induktion von HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;-spezifischer CTL-Reaktion. Transgenen A2.Kb-Mäusen wurden 100 ul einer Emulsion (IFA) von 100 mg HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin; &sub3;&sub6;&sub8; und 100 mg HBc&sub1;&sub2;&sub8;&submin;&sub1;&sub4;&sub0; injiziert. 3 Wochen später wurden Splenozyten mit syngenetischen LPS-Blasten (beschichtet mit dem Peptid HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) restimuliert. Effektorzellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; auf Zytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2/Kb-Zielzellen untersucht.
Fig. 12 zeigt die Induktion einer für HBc18-27 spezifischen CTL-Reaktion durch Primen mit einem Peptid, das HBc18-27 enthält, das mit Tetanustoxoid 830-843 verbunden ist (Human-Helfer-T-Zellen-Epitop). Effektorzellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von HBc18-27 auf &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2-1/Kb-Zielzellen, in Gegenwart oder Abwesenheit von HBc18-27 auf Jy-Zellen, sowie auf Jy-Zellen, die mit HBV-Kern transfiziert worden waren, untersucht.
Fig. 13 veranschaulicht die minimale Sequenz für CTL-Erkennung innerhalb des HBVenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;-Peptids (799.09). Die CTL-Linien 110 und 113 wurden von Splenozyten aus transgenen A2Kb-Mäusen abgeleitet, die subkutan mit HBV-Virus in IFA geprimt und in vitro mit 799.09-beschichteten Stimulatorzellen aktiviert worden waren. Die 799.09- spezifischen CTL-Linien 110 und 113 wurden in einem 6-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungsassay unter Einsatz von Ja2Kb-Zielzellen in Gegenwart von verkürzten 799.09-Peptiden (Diagramm A = am N-Terminus verkürztes 799.09; Diagramm B = überlappende 9- Mere und 10-Mere von 799.09) auf Lyseaktivität untersucht.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung bietet Peptide aus dem HBV-Hüllenantigen (HBenv, auch als Oberflächen-Antigen oder HBs bezeichnet) und Nukleocapsidkern- (HBc-) Proteinsequenzen zur Verwendung in Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung, Prävention und Diagnose von HBV-Infektion. Die Peptide können auf MHC-HLA Klasse-I eingeschränkte CTL-Reaktionen auf HBV infizierte Zellen induzieren. Die stimulierten CTLs, die Lymphokine (z. B. γ-Interferon) sekretieren und Produkte (z. B. proteolytische Enzyme wie etwa Serin-Esterasen) freisetzen, die virale Replikation in infizierten autologen Zellen oder transfizierten Zellen mit oder ohne Zelltötung hemmen, können chronische HBV-Infektion beenden oder im Wesentlichen verhindern. In vielen Fällen ist die Kombination einer wirksamen T-Zellen-Reaktion und einer protektiven Antikörper-Reaktion auf ausgewählte HBV-Antigene am besten dazu geeignet, eine HBV-Infektion zu verhindern oder zu beenden.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Peptide der Erfindung vom HBV-Oberflächenantigen oder Nukleocapsid-Polypeptiden, -Kern und -Vorkern abgeleitet. In noch bevorzugteren der hierin beschriebenen Ausführungsformen sind die CTL-induzierenden Peptide aus der Region von HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8; (Peptid 799.08), HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8; (Peptid 799.09), HBenV&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) (Peptid 799.10) oder der Region HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0; (Peptid 802.03) abgeleitet, worin die Nummerierung von Galibert et al., Nature 281, 646 (1979), welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist, festgelegt wurde.
Unter "CTL-induzierendes Peptid" oder "Oligopeptid" ist hierin eine Kette von zumindest 4, vorzugsweise zumindest 6, noch bevorzugter 8-10, manchmal 11-14, und üblicherweise weniger als etwa 36, noch häufiger weniger als etwa 25, vorzugsweise weniger als 15, z. B. 8-14, Aminosäurereste zu verstehen, die aus ausgewählten Epitop-Regionen der HBenv- oder HBc-Proteine oder aus anderen Epitop-Regionen anderer potenzieller Zielantigene stammen; Beispiele sind u. a. Prostatakrebs-spezifisches Antigen, Hepatitis C-Antigen, Epstein-Barr-Virus-Antigen, HIV-1- und HIV-2-Antigene und Papillomavirus-Antigene. Wie weiter unten ausführlich dargestellt sind üblicherweise zumindest 4, manchmal 6, häufig 7 oder mehr Reste des Peptids oder eine Mehrheit der Aminosäuren dieses Peptids identisch oder homolog mit dem entsprechenden Abschnitt der natürlich vorkommenden HBenv-Sequenz mit der Bezeichnung HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8; (Peptid 799.08), HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub9; (Peptid 799.09), HBenv349368 (Peptid 799.10) oder mit der Region HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0; (Peptid 802.03).
Die Peptide können "synthetisch" (Beschreibung folgt) oder durch DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt werden. Obwohl das Peptid vorzugsweise im Wesentlichen frei von anderen natürlich vorkommenden HBV-Proteinen und Fragmenten davon ist, können in einigen Ausführungsformen die Peptide synthetisch an native Fragmente oder Teilchen konjugiert sein. Der Ausdruck "Peptid" wird hierin austauschbar mit "Polypeptid" verwendet, um eine Reihe von Aminosäuren zu bezeichnen, die durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und α-Carboxylgruppen benachbarter Aminosäuren miteinander verbunden sind. Die Polypeptide oder Peptide können eine Vielzahl an Längen aufweisen (entweder in ihren neutralen, d. h. ungeladenen Formen oder in Formen, die Salze sind) und entweder frei von Modifikationen wie z. B. Glykosylierung, Seitenketten-Oxidation oder Phosphorylierung sein oder diese Modifikationen enthalten, sofern diese nicht die biologische Aktivität der hierin beschriebenen Polypeptide beeinträchtigen.
Günstigerweise ist das Peptid so klein wie möglich, während es aber im Wesentlichen die gesamte biologische Aktivität des großen Peptids aufrechterhält. Falls möglich, ist es mitunter wünschenswert, Peptide der Erfindung auf eine Länge von 8-12 Aminosäureresten zu optimieren, was der Größe endogen verarbeiteter viraler Peptide entspricht, die an MHC-Klasse I-Moleküle an der Zelloberfläche gebunden sind. Für allgemeine Informationen siehe Schumacher et al., Nature 350, 703-706 (1991); Van Bleek et al., Nature 348, 213-216 (1990); Rotzschke et al., Nature 348, 252-254 (1990); und Falk et al., Nature 351, 290-296 (1991), welche Veröffentlichungen hierin durch Verweis aufgenommen sind. Unter "biologischer Aktivität" ist hierin die Fähigkeit zu verstehen, ein geeignetes MHC-Molekül zu binden und - im Falle von Peptiden, die sich zur Stimulierung von CTL-Reaktionen eignen - eine CTL-Reaktion auf HBV-Antigene oder Antigen- Mimetika zu induzieren. Im Fall eines Peptidanalog-Antagonisten besitzt das Analog biologische Aktivität, wenn es mit dem Peptid um die Bindung an das MHC-Molekül konkurriert, und weist gegenüber dem nativen Peptid eine stark verringerte Fähigkeit auf, eine CTL-Reaktion zu induzieren. Unter "CTL-Reaktion" ist hierin eine CD8&spplus; T- Lymphozyten-Reaktion zu verstehen, die für ein HBV-Antigen von Interesse spezifisch ist, worin auf CD8&spplus; MHC-Klasse I eingeschränkte T-Lymphozyten aktiviert werden. Wie oben erwähnt sekretieren T-Lymphozyten eine Vielzahl an Produkten, welche die virale Replikation hemmen und die HBV infizierte (oder transfizierte) Zelle möglicherweise abtöten.
Die Ausdrücke "homolog", "im Wesentlichen homolog" und "substanzielle Homologie" beziehen sich hierin auf eine Sequenz von Aminosäuren mit zumindest 50% Identität, wobei eine Sequenz mit einer Referenzsequenz von Aminosäuren verglichen wird. Der Prozentsatz der Sequenzidentität oder -homologie wird durch gegenseitiges Vergleichen und Zuweisen zu entsprechenden Abschnitten der Referenzsequenz berechnet.
Eine CTL-induzierende HBenv-Peptid-Ausführungsform der Erfindung umfasst 6-30 Aminosäuren und ist von der 799.08-Peptid-Region HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8; abgeleitet, enthält eine oder mehrere CTL-Epitopstelle(n) und weist zumindest 7 Aminosäuren auf, worin die Mehrzahl der Aminosäuren des Peptids im Vergleich zu den Aminosäuren, die den entsprechenden Abschnitt der natürlich vorkommenden HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;-Sequenz bilden, identisch oder im Wesentlichen homolog ist. Ein repräsentatives Peptid für diese Region ist das Peptid HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;, das die folgende Sequenz aufweist (für den HBV-Untertyp ayw):
worin das Peptid gegebenenfalls an einem oder beiden von N- und C-Terminus flankiert und/oder modifiziert sein kann; dies erfolgt, wie hierin beschrieben, durch Aminosäuren aus HBV-Sequenzen, insbesondere HBenv, Aminosäuren, die zur Erleichterung der Bindung zugegeben werden, andere N- und C-terminale Modifikationen, die an Träger gebunden sind, usw. Für ein Peptid des HBV-Untertyps adw ist Gly&sub3;&sub2;&sub2; durch Ala und Phe&sub3;&sub2;&sub4; durch Tyr ersetzt. Das Peptid HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8; induziert eine CTL-Reaktion, die durch zumindest ein MHC-Klasse I-Molekül HLA-A2 mediiert wird.
Eine weitere HBenv-CTL-induzierende Peptid-Ausführungsform der Erfindung umfasst 6- 20 Aminosäuren der 799.10-Peptidregion HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; und enthält Peptide aus HBenV&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; die eine oder mehrere Epitopstelle(n) von zumindest 7 oder mehreren Aminosäuren enthalten, worin eine Mehrzahl von Aminosäuren im Peptid im Vergleich zum entsprechenden Abschnitt der natürlich vorkommenden HBenv-Sequenz mit der Bezeichnung HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;, die wie folgt aufgebaut ist (für die HBV-Untertypen ayw und adw), identisch oder homolog ist:
worin das aus der Region ausgewählte Peptid - wie hierin beschrieben - an einem oder beiden Termini flankiert und/oder modifiziert sein kann. Ein Beispiel für ein weiteres CTL-induzierendes Petpid aus der Region von 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) [Seq.-ID Nr. 2], das zumindest ein Epitop enthält, das eine auf MHC-Klasse I eingeschränkte zytotoxische T- Lymphozyten-Reaktion auf Hepatitis B-Virus induzieren kann, ist:
Zusätzliche CTL-induzierende Peptid-Ausführungsformen der Erfindung sind von der HBenv-Region HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8; abgeleitet. Neben dem Peptid 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;) enthalten diese Ausführungsformen Peptide, die eine oder mehrere Epitopstelle(n) innerhalb der Sequenz von HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8; enthalten, die eine auf MHC-Klasse I eingeschränkte CRL- Reaktion auf HBV induzieren kann. HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8; für HBV-Untertyp ayw besitzt die folgende Sequenz:
In weiteren Ausführungsformen sind Peptide der Erfindung von der HBc-Region HBc&sub9;&sub1;&submin; &sub1;&sub1;&sub0; abgeleitet und umfassen neben Peptid 802.03 (HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;) Peptide, die eine oder mehrere Epitopstelle(n) von zumindest 7, vorzugsweise 9, Aminosäuren enthalten, worin eine Mehrzahl der Aminosäuren des Peptids im Vergleich zu Aminosäuren des entsprechenden Abschnitts der natürlich vorkommenden HBc-Sequenz von HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;, worin die Sequenz für HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0; für HBV-Untertyp ayw die folgende Sequenz aufweist, identisch oder im Wesentlichen homolog ist:
worin das aus der Region ausgewählte Peptid an einem oder beiden Termini - wie hierin beschrieben - flankiert und/oder modifiziert sein kann. Für ein Peptid des HBV-Untertyps adw ist Phe&sub9;&sub7; durch Ile und Leu&sub1;&sub0;&sub1; durch Trp ersetzt. Das CTL-induzierende Peptid 802.03 induziert eine CTL-Reaktion, die von zumindest dem MHC-Klasse I-Molekül HLA-A2.1 mediiert wird. Beispiele von CTL-induzierenden Peptiden aus der Region von 802.03 (HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;) [Seq.-ID Nr. 4], die ein Epitop enthalten, das eine auf MHC-Klasse I eingeschränkte zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf Hepatitis B-Virus induzieren kann, sind die folgenden:
Wie oben erwähnt, können zusätzliche Aminosäuren an die Termini eines Oligopeptids oder Peptids addiert werden, um die gegenseitige Bindung von Peptiden zu vereinfachen, die Bindung an einen Träger oder ein größeres Peptid aus den hierin besprochenen Gründen vorzunehmen, die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids zu modifizieren oder dergleichen. Aminosäuren, wie z. B. Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin oder Asparaginsäure oder dergleichen, können am C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligopeptids eingeführt werden. Außerdem können sich Peptid- oder Oligopeptidsequenzen insofern von der natürlichen Sequenz unterscheiden, als sie durch terminale NH&sub2;-Acylierung, z. B. durch Alkanoyl- (C&sub1;-C&sub2;&sub0;) oder Thioglykolyl-Acetylierung, und terminale Carboxyl-Amidierung, z. B. mit Ammoniak, Methylamin usw., modifiziert sind. In einigen Fällen können diese Modifikationen Stellen zur Bindung an einen Träger oder ein anderes Molekül liefern.
Man beachte, dass die Peptide der Erfindung oder deren Analoge, die CTL-stimulierende Aktivität aufweisen, modifiziert werden können, um andere gewünschte Eigenschaften zu besitzen, z. B. verbesserte pharmakologische Charakteristika, während im Wesentlichen die gesamte biologische Aktivität des unmodifizierten Peptids erhöht oder zumindest beibehalten wird. Beispielsweise können die Peptide durch Verlängerungen, Verkürzungen oder Substitutionen in den Peptid-Aminosäuresequenzen modifiziert werden, z. B. durch Addition oder Deletion von Aminosäuren am aminoterminalen und/oder carboxylterminalen Ende von Peptiden, die aus den hierin geoffenbarten Sequenzen abgeleitet sind. Wie ausführlich weiter unten beschrieben kann die CTL-Aktivität der vorliegenden Peptide durch Bindung an eine Sequenz verstärkt werden, die zumindest ein Epitop enthält, das eine T-Helfer-Zellen-Reaktion hervorrufen kann, wie sie z. B. im T- Helfer-Peptid enthalten ist, das durch die Peptide von Tetanustoxoid 830-843, Influenza 307-319, Malaria-Circumsporozoit 382-398 und 378-389, Eialbumin 323-336 und HBc&sub1;&sub2;&sub8;&submin;&sub1;&sub4;&sub0;, HBc&sub1;&sub2;&sub0;, HBc&sub5;&sub0;&submin;&sub5;&sub9; und HBc&sub1;&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub2;&sub5; bereitgestelltwird.
Die in der Erfindung verwendeten Peptide müssen nicht mit den Peptiden 799.08, 799.09, 799.10 oder 802.03 oder mit einer bestimmten HBV-Oberflächenantigen- oder Nukleocapsidprotein-Sequenz identisch sein, sofern die Verbindungen in der Lage sind, sich an das geeignete MHC-Molekül zu binden und zytotoxische T-Lymphozyten-Aktivität gegen zumindest einen der vier Hauptuntertypen von HBV zu zeigen (außer im Fall von Peptid-Analog-Antagonisten, die das MHC-Molekül binden, aber eine stark verringerte Fähigkeit aufweisen, CTL-Aktivität zu stimulieren, was weiter unten erklärt wird). Deshalb können die Peptide zahlreichen Veränderungen wie etwa Insertionen, Deletionen und Substitutionen konservativer oder nicht-konservativer Art unterzogen werden, wobei solche Veränderungen verschiedene Vorteile während der Verwendung nach sich ziehen können. Unter konservativen Substitutionen ist die Ersetzung eines Aminosäurerests durch einen anderen zu verstehen, der biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, z. B. ein hydrophober Rest oder ein polarer Rest, der an die Stelle eines anderen tritt. Zu Substitutionen zählen Kombinationen wie z. B. Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr. Üblicherweise unterscheidet sich der Abschnitt der Sequenz, der ein HBV-CTL-stimulierendes Epitop im Wesentlichen imitieren soll, nicht um mehr als etwa 20º/0 von der Sequenz zumindest eines Untertyps von HBV, außer wenn zusätzliche Aminosäuren an beiden Termini hinzugefügt werden können, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids zu modifizieren, damit z. B. die Bindung oder Kopplung und dergleichen vereinfacht wird. In Situationen, in denen sich Regionen der Peptidsequenzen unter HBV-Untertypen als polymorph herausstellen, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um unterschiedliche zytotoxische T-Lymphozyten-Epitope unterschiedlicher HBV-Stämme oder -Untertypen wirksamer zu imitieren.
Innerhalb der Peptidsequenz-Regionen, die gemäß der Erfindung als jene identifiziert werden, die CTL-Epitope enthalten, z. B. Peptidregion 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;), Peptidregion 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;), Peptidregion 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) oder Peptidregion 802.03 (HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;) gibt es Reste (oder solche, die im Wesentlichen funktionell gleichwertig sind), die es dem Peptid ermöglichen, seine biologische Aktivität beizubehalten, d. h. die Fähigkeit, eine auf Klasse I eingeschränkte zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf HBV infizierte Zellen oder Zellen, die HBV-Oberflächen- und/oder Nukleocapsid-Antigene exprimieren, zu stimulieren. Diese Reste können durch einzelne Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen identifiziert werden. Außerdem können die Beiträge der Seitenketten der Reste mittels systematischen Scannens mit einer spezifischen Aminosäure (z. B. Ala) sondiert werden. Peptide, die mehrere Substitutionen vertragen, umfassen im Allgemeinen solche Substitutionen als kleine und relativ neutrale Moleküle wie etwa Ala, Gly, Pro oder ähnliche Reste. Die Anzahl und Art der Reste, die substituiert, addiert oder subtrahiert werden können, hängt vom notwendigen Abstand zwischen den wesentlichen Epitop-Punkten und bestimmten wünschenswerten Konformations- und Funktionseigenschaften ab (z. B. Hydrophobie im Gegensatz zu Hydrophilie). Gegebenenfalls kann die Bindungsaffinität von Peptidanalogen an ihr MHC- Molekül zur Präsentation gegenüber einem CTL durch solche Veränderungen erhöht werden. Im Allgemeinen sollten alle Spacer-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen zwischen Epitope betreffenden und/oder konformationell wichtigen Resten Aminosäuren oder andere Gruppen verwenden, die ausgewählt sind, um sterische und auf die Ladung bezogene Beeinträchtigungen zu verhindern, welche die Bindung stören könnten.
Peptide, die Substitutionen unter Beibehaltung der gewünschten biologischen Aktivität vertragen, können auch als D-Aminosäure mit Peptiden synthetisiert werden. Ein derartiges Peptid kann als "inverso"- oder "retro-inverso"-Form synthetisiert werden, d. h. durch Ersetzen von L-Aminosäuren einer Sequenz durch D-Aminosäuren oder durch Umkehrung der Sequenz der Aminosäuren und Ersetzen der L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren. Da die D-Peptide wesentlich resistenter gegenüber Peptidasen und daher in Serum und Geweben stabiler sind als ihre L-Peptid-Gegenstücke, kann die Stabilität von D-Peptiden unter physiologischen Bedingungen den Affinitätsunterschied gegenüber dem entsprechenden L-Peptid mehr als kompensieren. Außerdem können L-Aminosäure enthaltende Peptide mit oder ohne Substitutionen mit einer D-Aminosäure verkappt werden, um Exopeptidase-Zerstörung des antigenen Peptids zu hemmen.
Nach dem Identifizieren unterschiedlicher Peptide der Erfindung, die dazu beitragen, HBV-spezifische CTL-Reaktionen bei einem oder mehreren Patienten oder HLA-Typen zu stimulieren, kann es in bestimmten Fällen wünschenswert sein, zwei oder mehr Peptide in einer Zusammensetzung zu verbinden. Die Peptide in der Zusammensetzung können identisch oder unterschiedlich sein, wobei sie gemeinsam für gleichwertige oder höhere biologische Aktivität sorgen sollten als ihr(e) Ausgangspeptid(e). Unter Einsatz der hierin beschriebenen Verfahren etwa können zwei oder mehr Peptide unterschiedliche oder überlappende CTL-Epitope aus einer bestimmten Region definieren, z. B. die Peptidregion 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;), die Peptidregion 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub8;&submin;&sub3;&sub4;&sub9;) die Peptidregion 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) oder die Peptidregion 802.03 (HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0;), welche Peptide in einem "Cocktail" kombiniert werden können, um für verstärkte Immunogenität für CTL-Reaktionen zu sorgen. Peptide einer Region können auch mit Peptiden kombiniert werden, die unterschiedliche MHC-Restriktionselemente aufweisen. Diese Zusammensetzung kann dazu dienen, den immunologischen Schutz wirksam zu erhöhen, den Therapie-, Vakzinen- oder Diagnoseverfahren und Zusammensetzungen der Erfindung innerhalb einer diversen Population bieten.
Die Peptide der Erfindung können mittels Verknüpfung zur Bildung von Polymeren (Multimeren) kombiniert oder in einer Zusammensetzung ohne Verknüpfung als Gemisch formuliert sein. Wenn das gleiche Peptid mit sich selbst verknüpft wird und dadurch ein Homopolymer bildet, werden mehrere sich wiederholende Epitop-Einheiten präsentiert. Wenn sich die Peptide unterscheiden, z. B. in Form eines Cocktails aus unterschiedlichen HBV-Untertypen, unterschiedlichen Epitopen innerhalb eines Untertyps, unterschiedlichen HLA-Restriktionsspezifitäten oder Peptiden, die T-Helfer-Epitope enthalten, werden Heteropolymere mit wiederkehrenden Einheiten bereitgestellt. Neben kovalenten Bindungen sind auch nicht-kovalente Verknüpfungen möglich, die intermolekulare und intrastrukturelle Bindungen eingehen können.
Verknüpfungen für Homo- oder Heteropolymere oder zur Kopplung an Träger können in unterschiedlicher Weise erzeugt werden. Beispielsweise können Cysteinreste am Amino- und Carboxylterminus hinzugefügt werden, wobei die Peptide mittels kontrollierter Oxidation der Cysteinreste kovalent gebunden werden. Es eignen sich auch viele heterobifunktionelle Mittel, die eine Disulfidbindung an einem Ende mit funktioneller Gruppe und eine Peptidbindung am anderen erzeugen, z. B. N-Succidimidyl-3-(2-pyridyldithio)proprionat (SPDP). Dieses Reagens erzeugt eine Disulfidbindung zwischen sich selbst und einem Cysteinrest in einem Protein und eine Amidbindung durch das Amino auf einem Lysin oder einer anderen freien Aminogruppe im anderen. Es ist eine Vielzahl solcher Disulfid/Amid-bildender Mittel bekannt. Siehe z. B. Immun. Rev. 62, 10&sup5; (1992). Andere bifunktionelle Kopplungsmittel bilden einen Thioether statt einer Disulfidbindung. Viele dieser Thioether bildenden Mittel sind im Handel erhältlich und enthalten reaktive Ester von 6-Maleimidocapronsäure, 2-Bromessigsäure, 2-lodessigsäure, 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure und dergleichen. Die Carboxylgruppen können aktiviert werden, indem sie mit Succinimid oder 1-Hydroxy-2-nitro-4- sulfonsäure-natriumsalz kombiniert werden. Ein besonders bevorzugter Koppler ist Succinimidyl-3-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC). Natürlich ist zu beachten, dass die Verknüpfung die beschriebene Funktion der verbundenen Gruppen nicht nennenswert beeinträchtigen soll, z. B. die Funktion als zytotoxische HBV-T-Zellen-Determinante, Peptidanalog-CTL-Antagonist oder HBV-T-Helfer-Determinante.
In einem weiteren Aspekt können die erfindungsgemäßen Peptide mit anderen Peptiden kombiniert oder gekoppelt werden, die HBV-T-Helferzellen-Epitope präsentieren, d. h. T- Helfer-Peptide, die 6-30 Aminosäuren mit einem T-Helfer-Epitop umfassen, die ausgehend von der Hülle, dem Kern oder einem anderen immunogenen Protein oder dessen Derivat T-Zellen stimulieren, die an der Induktion zytotoxischer T-Zellen gegen HBV mitwirken. Die T-Helferzellen können z. B. entweder der T-Helfer 1- oder der T-Helfer 2- Phenoytp sein. Zusammensetzungen von T-Helfer-Peptiden und CTL-Peptiden verstärken die Immunität eines Individuums durch Bereitstellung zellmediierter Immunität und protektiver Antikörper gegen HBV. T-Helfer-Epitope wurden als HBc&sub1;&submin;&sub2;&sub0; mit der Sequenz Met-Asp-Ile-Asp-Pro-Tyr-Lys-Glu-Phe-Gly-Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro identifiziert. Andere T-Helfer-Epitope werden durch Peptide der Region HBc&sub5;&sub0;&submin;&sub6;&sub9; mit der Sequenz Pro-His-His-Tyr-Ala-Leu-Arg-Gln-Ala-Ile-Leu-Cys-Trp-Giy-Glu-Leu-Met-Tyr-Leu-Ala und aus der Region HBc&sub1;&sub0;&sub0;&submin;&sub1;&sub3;&sub9;, umfassend HBc100119 der Sequenz Leu-Leu-Trp-Phe-His- Ile-Ser-Cys-Leu-Thr-Phe-Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu (worin Ile&sub1;&sub1;&sub6; im HBV adw- Untertyp Leu ist), HBc&sub1;&sub1;&sub7;&submin;&sub1;&sub3;&sub1; der Sequenz Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg- Thr-Pro-Pro-Ala und Peptid HBc&sub1;&sub2;&sub0;&submin;&sub1;&sub3;&sub9; der Sequenz Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr- Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-PPro-Asn-Ala-Pro-Ile bereitgestellt. Siehe Ferrari et al., J. Clin. Invest. 88, 214-222 (1991), und die US-A-4.882.145, die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind. Andere T-Helfer-Epitope werden durch Peptide z. B. von Tetanusto- XOid&sub8;&sub3;&sub0;&submin;&sub8;&sub4;&sub3; der Sequenz Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu; Malaria- Circumsporozoit&sub3;&sub8;&sub2;&submin;&sub3;&sub9;&sub8; der Sequenz Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val- Val-Asn-Ser (KIAKMEKASSVFNVVNS); Malaria-Cirumsporozoit&sub3;&sub7;&sub8;&submin;&sub3;&sub9;&sub8; der Sequenz Asp- Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser (DIEKKIAK- MEKASSVFNVVNS); Eialbumin326336 der Sequenz Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His- Ala-Glu-Ile-Asn-Glu und dem Influenza-Epitop&sub3;&sub0;&sub7;&submin;&sub3;&sub1;&sub9; der Sequenz Pro-Lys-Tyr-Val-Lys- Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr gebildet.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die CTL-induzierenden Peptide der Erfindung kovalent mit den T-Helfer-Peptiden verknüpft. Besonders bevorzugte CTL-induzierende Peptide/T-Helfer-Konjugate sind über ein Spacer-Molekül gebunden. Alternativ dazu kann das CTL-Peptid auch ohne Spacer an das T-Helfer-Peptid gebunden sein. Der Spacer besteht typischerweise aus relativ kleinen neutralen Molekülen, wie z. B. Aminosäuren oder Aminosäure-Mimetika, die unter physiologischen Bedingungen im Wesentlichen ungeladen sind und lineare oder verzweigte Seitenketten aufweisen können. Die Spacer sind typischerweise z. B. aus Ala, Gly oder anderen neutralen Spacern nichtpolarer Aminosäuren oder neutraler polarer Aminosäuren ausgewählt. In bestimmten hierin bevorzugten Ausführungsformen ist der neutrale Spacer Ala. Man beachte, dass der gegebenenfalls vorhandene Spacer nicht aus den gleichen Resten bestehen muss und somit ein Hetero- oder Homooligomer sein kann. Bevorzugte Beispiele für Spacer sind Homooligomere von Ala. Wenn der Spacer vorhanden ist, umfasst er üblicherweise zumindest 1 oder 2 Reste, noch häufiger 3-6 Reste. In anderen Ausführungsformen ist das T-Helfer-Peptid an das CTL-Peptid konjugiert, wobei sich das T-Helfer-Peptid vorzugsweise am Aminoterminus befindet. Die Peptide können über einen neutralen Linker wie etwa Ala-Ala-Ala oder dergleichen verbunden sein und enthalten ferner vorzugsweise einen Lipidrest, wie z. B. Palmitinsäure, (PAM)&sub2; oder dergleichen (Beschreibung folgt), der an α- und &epsi;-Aminogruppen eines Lys-Rests gebunden ist, der am Aminoterminus des Peptidkonjugats gebunden ist, typischerweise über eine Ser-Ser-Bindung oder dergleichen.
Das CTL-induzierende Peptid kann entweder direkt oder über einen Spacer entweder an den Amino- oder an den Carboxylterminus des CTL-Peptids an das T-Helfer-Peptid gebunden sein. Der Aminoterminus des CTL-induzierenden Peptids oder des T-Helfer-Peptids kann auch acyliert sein. Außerdem kann das CTL-Peptid/T-Helfer-Konjugat über einen oder mehrere Linkerreste, wie z. B. Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser, an bestimmte Alkanoyl- (C&sub1;-C&sub2;&sub0;) Lipide gebunden sein wie später beschrieben.
In einer später beschriebenen beispielhaften Ausführungsform zeigte sich, dass ein T- Helfer-Peptid, das im Wesentlichen innerhalb von HBc&sub1;&sub2;&sub8;&submin;&sub1;&sub4;&sub0; (Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg- Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile-Leu) [Seq.-ID Nr. 19] liegt, bei Bindung an ein CTL-Peptid (HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7;) spezifisches CTL-Primen von Tieren bei allen untersuchten Tieren und in einem Ausmaß induziert, das höher war als in Fällen, wo das CTL-Peptid und das T-Helfer-Peptid getrennt verabreicht wurden. Wenn das T-Helfer-Peptid und das CTL-HBV- Peptid über einen Ala-Ala-Ala-Spacer verknüpft waren, wurde eine spezifische CTL-Aktivität verzeichnet, die stärker war als die Induktion spezifischer CTL-Aktivität mit den verbundenen Peptiden ohne Spacer. Diese Ergebnisse deuten auf gesteigerte CTL-Reaktion gegen Zellen hin, die HBV-Antigene zeigen, wenn das ein CTL-Epitop enthaltende Peptid über einen Spacer mit einem ein HBV-T-Helfer-Epitop enthaltenden Peptid verknüpft ist und als Immunogen verwendet wird.
Die Peptide der Erfindung können auf unterschiedliche Weise hergestellt werden. Aufgrund ihrer relativen Kürze können die Peptide in Lösung oder auf einem festen Träger gemäß herkömmlicher Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthesizer sind im Handel erhältlich und können unter Einhaltung bekannter Arbeitsvorschriften verwendet werden. Siehe beispielsweise Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 10&sup5;, 6442 (1983); Merrifield, Science 232, 341-347 (1986); und Barany und Merrifield, "The Peptides", Gross und Meienhofer (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 1-284 (1979), welche Veröffenlichungen alle durch Verweis hierin aufgenommen sind.
Alternativ dazu kann DNA-Rekombinationstechnologie zum Einsatz kommen, wobei eine Nukleotidsequenz, die für ein CTL-Peptid und/oder T-Helfer-Peptid von Interesse kodiert, in einen Expressionsvektor insertiert, transformiert oder in eine geeignete Wirtszelle transfiziert und unter für die Expression geeigneten Bedingungen kultiviert wird.
Diese Techniken sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und von Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), und von Ausubel et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., New York (1987), sowie in den US-A- 4.237.224, 4.273.875, 4.431.739, 4.363.877 und 4.428.941 beschrieben, welche Veröffentlichungen hierin durch Verweis aufgenommen sind. So können Fusionsproteine, die eine oder mehrere Peptidsequenzen der Erfindung umfassen, dazu verwendet werden, die zytotoxischen T-Zellen-Determinanten zu präsentieren. Beispielsweise wird ein rekombinantes HBV-Oberflächenantigen-Protein hergestellt, in dem die HBenv-Aminosäuresequenz so modifiziert ist, dass Epitope von hierin beschriebenen Peptidregionen effizienter präsentiert werden, damit eine CTL-Reaktion stimuliert wird. Auf diese Weise wird ein Polypeptid verwendet, das mehrere T-Zellen-Epitope umfasst.
Da die Kodiersequenz für Peptide der hierin geoffenbarten Länge durch chemische Techniken synthetisiert werden kann, z. B. mittels des Phosphotriester-Verfahrens von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 10³, 3185 (1981), kann die Modifikation erfolgen, indem einfach die geeignete(n) Base(n) für jene substituiert wird/werden, die für die native Peptidsequenz kodiert/kodieren. Die Kodiersequenz kann dann mit geeigneten Linkern versehen und in auf dem Gebiet zur Verfügung stehende Expressionsvektoren ligiert werden; die Vektoren dienen dazu, geeignete Wirte zu transformieren, um das gewünschte Fusionsprotein zu erzeugen. Es stehen heute einige derartige Vektoren und geeignete Wirtsysteme zur Verfügung. Zur Expression der Fusionsproteine wird die Kodiersequenz mit operabel verbundenen Start- und Stopcodons, Promotor- und Terminatorregionen und üblicherweise einem Replikationssystem versehen, um einen Expressionsvektor zur Expression im gewünschten Zeliwirt bereitzustellen. Beispielsweise sind Promotorsequenzen, die mit bakteriellen Wirten verträglich sind, in Plasmiden zu finden, die geeignete Restriktionsstellen zur Insertion der gewünschten Kodiersequenz enthalten. Die resultierenden Expressionsvektoren werden in geeignete bakterielle Wirte transformiert. Natürlich können auch Hefe- oder Säugetierzellenwirte unter Einsatz geeigneter Vektoren und Kontrollsequenzen verwendet werden.
Die Peptide der Erfindung und deren pharmazeutische und Vakzinen-Zusammensetzungen eignen sich zur Verabreichung an Säugetiere, insbesondere Menschen, zur Behandlung und/oder Prävention von HBV-Infektion. Da die Peptide dazu dienen, zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen auf HBV infizierte Zellen zu stimulieren, kann man die Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prävention akuter und/oder chronischer HBV- Infektion heranziehen.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide, d. h. das CTL-Peptid oder das CTL/T-Helfer-Peptid, an ein bereits mit HBV infiziertes Individuum verabreicht. Individuen in der Inkubationsphase oder der akuten Infektionsphase können mit den immunogenen Peptiden je nach Bedarf getrennt oder in Kombination mit anderen Therapien behandelt werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen an einen Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine wirksame CTL-Reaktion auf HBV hervorzurufen und seine Symptome und/oder Komplikationen heilt oder zumindest teilweise stoppt. Eine Menge, mit der dies erreicht wird, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Dafür geeignete Mengen hängen z. B. von folgenden Faktoren ab: der Peptidzusammensetzung, der Verabreichungsart, dem Stadium und der Schwere der behandelten Krankheit, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Urteil des verschreibenden Arztes; im Allgemeinen reichen sie jedoch für die Erstimmunisierung (d. h. die therapeutische oder prophylaktische Verabreichung) von etwa 1,0 bis etwa 500 ug Peptid für einen 70 kg schweren Patienten, gefolgt von Auffrischungsdosen von etwa 1,0 bis etwa 100 ug Peptid gemäß einem Auffrischungsplan, der sich je nach der Reaktion und dem Zustand des Patienten über Wochen bis Monate erstreckt, wobei die spezifische CTL-Aktivität im Patientenblut gemessen wird. Man muss berücksichtigen, dass die Peptide und Zusammensetzungen der Erfindung im Allgemeinen in schweren Krankheitsfällen, d. h. in (potenziell) lebensbedrohlichen Situationen, eingesetzt werden können. In diesen Fällen ist es angesichts der minimal vorhandenen externen Substanzen und der relativen nicht-toxischen Beschaffenheit der Peptide möglich und vom Standpunkt des behandelnden Arztes möglicherweise auch wünschenswert, beträchtliche Überschüsse dieser Peptidzusammensetzungen zu verabreichen.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können solcherart erfolgen, dass die Dosiswerte und das Dosismuster vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Jedenfalls sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge an zytotoxischen, T-Lymphozyten-stimulierenden Peptiden der Erfindung bieten, die zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreicht.
Für die therapeutische Verwendung ist es ratsam, wenn die Verabreichung beim ersten Anzeichen von HBV-Infektion oder kurz nach der Diagnose im Falle akuter Infektion einsetzt, gefolgt von Auffrischungsdosen im Wesentlichen zumindest bis zum Abklingen der Symptome oder über einen längeren Zeitraum. Bei chronischer Infektion sind möglicherweise Belastungsdosen gefolgt von Auffrischungsdosen erforderlich. Die Stimulierung einer wirksamen CTL-Reaktion auf HBV während der Behandlung von akuter Hepatitis schränkt die Möglichkeit der anschließenden Entwicklung chronischer Hepatitis, des HBV-Trägerzustands und von Leberzellenkarzinom stark ein.
Die Behandlung eines infizierten Individuums mit den Zusammensetzungen der Erfindung kann die Auflösung der Infektion bei akut infizierten Individuen beschleunigen. Für jene Individuen, die gegenüber der Entwicklung chronischer Infektion anfällig (prädisponiert) sind, eignen sich die Zusammensetzungen besonders in Verfahren, die verhindern, dass sich eine akute Infektion in eine chronische Infektion weiterentwickelt. Wenn anfällige Individuen vor oder während der Infektion identifiziert werden (wie hierin beschrieben), können die Zusammensetzungen auf sie abgezielt werden, wodurch die Notwendigkeit der Verabreichung an eine größere Population minimiert wird.
Die Peptidzusammensetzungen können auch zur Behandlung chronischer Hepatitis und zur Stimulierung des Immunsystems von Trägern herangezogen werden, um virusinfizierte Zellen zu eliminieren. Patienten mit chronischer Hepatitis können etwa 3-6 Monate nach der Infektion als viruspositiv identifiziert werden. Da Individuen aufgrund einer inadäquaten (oder fehlenden) CTL-Reaktion während der akuten Phase ihrer Infektion eine chronische HBV-Infektion entwickeln können, ist es wichtig, eine Menge des immunpotenzierenden Peptids in einer Formulierung und Verabreichungsweise bereitzustellen, die ausreicht, um eine zytotoxische T-Zellen-Reaktion wirksam zu stimulieren. Bei der Behandlung chronischer Hepatitis liegt daher eine repräsentative Dosis für einen 70 kg schweren Patienten im Bereich von 1,0 bis etwa 500 ug, vorzugsweise etwa 5 bis 100 ug, pro Gabe. Die Verabreichung sollte fortgesetzt werden, bis zumindest klinische Symptome oder Laborindikatoren anzeigen, dass die HBV-Infektion eliminiert wurde oder deutlich abgeklungen ist, oder über einen noch längeren Zeitraum andauern. Es sind möglicherweise Immunisierungsdosen und anschließende Auffrischungsdosen in festgelegten Intervallen, z. B. 1 bis 4 Wochen, eventuell über einen längeren Zeitraum, notwendig, um die Infektion aufzulösen. Bei der Behandlung chronischer und Träger-HBV-lnfektion kann es wünschenswert sein, die CTL-Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen zu kombinieren, die Immunreaktion auf andere HBV-Antigen wie z. B. HBsAg induzieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird chronische aktive Hepatitis unter Einsatz antigener Epitopenanaloge als Antagonisten behandelt. Die Analog-Antagonisten binden sich an das geeignete MHC-Klasse I-Antigen, verhindern aber CTL-Aktivierung und Proliferation, wodurch die Schädigung HBV-infizierter Hepatozyten und T-Zellenmediierte Leberentzündung verringert werden. Die Peptid-Antagonisten umfassen ein CTL-Epitop-Peptid, das solcherart z. B. durch Aminosäure-Substitution modifiziert wurde, dass sich das Peptid wirksam an das Klasse I-MHC-Molekül bindet, wobei aber seine Fähigkeit, Epitop-spezifische T-Zellen zu stimulieren, beträchtlich eingeschränkt ist. Analog-Antagonisten werden identifiziert, indem Modifikationen in einem Peptid vorgenommen werden, das zumindest ein HLA-Klasse I-Epitop enthält. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das zu modifizierende Peptid ein auf Klasse I eingeschränktes CTL-Epitop. Substitutionen oder andere ausgewählte Modifikationen werden in das Peptid eingeführt, welches Peptidanalog dann auf die Fähigkeit gescreent wird, die Präsentation eines nicht verwandten Antigen-Epitops, wie z. B. eines Influenza-Peptids gegenüber einem Influenza-spezifischen T-Zellen-Klon, der durch dasselbe Klasse I-Molekül eingeschränkt ist, zu blockieren. Beispielsweise wird ein hierin beschriebenes auf HLA- A2 eingeschränktes CTL-Peptid z. B. durch eine oder mehrere Punktsubstitutionen modifiziert und dann auf die Fähigkeit getestet, die Präsentation von auf HLA-A2 eingeschränktem Influenza-CTL-Matrix-Peptid (z. B. 56-68) gegenüber einem durch HLA-A2 eingeschränkten Influenza-spezifischen T-Zellen-Klon zu blockieren. Antagonisten-Analoge inhibieren die T-Zellen-Proliferation und/oder zytolytische Aktivität, wenn die Antigen-präsentierende Zelle/Zielzelle nach der Exposition gegenüber einer stimulierenden Dosis des antigenen Peptids dem Antagonisten-Peptid ausgesetzt wird. Antagonisten- Analoge der Erfindung können für eine Vielzahl von HBV-Klasse I-Epitopen identifiziert werden, z. B. für jene, die in der US-A-4.882.145 und von Ferrari et al., J. Clin. Invest., s.o., beschrieben wurden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die therapeutische Behandlung sind für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung geeignet. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, z. B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär. Somit bietet die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung, die eine Lösung der CTL-stimulierenden Peptide umfassen, die in einem annehmbaren Träger, z. B. einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert sind. Es können viele verschiedene wässrige Träger verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, allgemein bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert oder sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können in diesem Zustand zur Verwendung verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Zusatzsubstanzen enthalten, die notwendig sind, um sich physiologische Bedingungen anzunähern, z. B. pH-Regler und Puffer, Tonizitätsregler, Netzmittel und dergleichen, z. B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, in der pharmazeutischen Zusammensetzung zumindest eine CTL primende Komponente vorzusehen. Lipide wurden als Mittel identifiziert, die CTLs in vivo gegen virale Antigene primen können. Beispielsweise können Palmitinsäurereste an die α- und &epsi;-Aminogruppen eines Lys-Rests gebunden und dann z. B. typischerweise mittels eines oder mehrerer Linkerreste wie etwa Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser oder dergleichen an ein synthetisches Peptid gebunden werden, das ein auf Klasse I eingeschränktes CTL-Epitop umfasst. Wie hierin beschrieben kann das lipidierte Peptid dann in ein Liposom eingearbeitet werden, das in einem Adjuvans, wie z. B. unvollständigem Freund-Adjuvans, emulgiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein besonders wirksames Immunogen Palmitinsäure, die an α- und &epsi;-Aminogruppen von Lys gebunden ist, und ist mittels einer Bindung wie z. B. Ser-Ser an den Aminoterminus eines auf Klasse I eingeschränkten Peptids mit T-Zellen- Determinanten gebunden, wie etwa die hierin beschriebenen Peptide sowie andere Peptide, die solche Determinanten besitzen.
Als weiteres Beispiel des Lipid-Primens von CTL-Reaktionen kann E. coli-Lipoprotein, z. B. Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinylserylserin (P&sub3;CSS) dazu verwendet werden, virusspezifische CTLs zu primen (bei kovalenter Bindung an ein geeignetes Peptid). Siehe Deres et al., Nature 342, 561-564 (1989), welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Peptide der Erfindung können beispielsweise an P&sub3;CSS gebunden und das Lipopeptid an ein Individuum verabreicht werden, um spezifisch eine CTL-Reaktion auf HBV zu primen. Da die Induktion neutralisierender Antikörper auch mit P&sub3;CSS geprimt werden kann, das an ein Peptid konjugiert ist, das ein geeignetes Epitop wie etwa HBsAg-Epitope aufweist, können die zwei Zusammensetzungen kombiniert werden, um sowohl humorale als auch zellmediierte Reaktionen auf HBV-Infektion wirksamer hervorzurufen. Ein weiteres Beispiel für das Lipid-Primen von CTL-Reaktionen ist das Konjugieren des CTL/T-Helfer-Peptid-Konjugats mit ungeladenen Fettsäureresten unterschiedlicher Kettenlänge, die von Essigsäure bis hin zu Stearinsäure sowie zu negativ geladenen Succinylresten reichen, über die geeigneten Carbonsäureanhydride.
CTL-Reaktionen auf eine Vielzahl anderer Antigene können durch Kombinieren eines CTL-induzierenden Peptid/T-Helferinduzierenden Peptid-Konjugats mit einem Lipid verstärkt werden. Die CTL-induzierenden Peptide können aus Zielproteinen, z. B. Prostatakrebs-spezifischem Antigen (PSA), Hepatitis C-Antigen, Epstein-Barr-Virus-Antigen, HIV-1- und HIV-2-Antigenen und Papillomavirus-Antigenen, ausgewählt sein. Das Lipid kann an andere Peptide gebunden sein, die T-Helfer-Epitope präsentieren, die dann mit dem Lipid kombiniert werden. Die Anordnung der Komponenten des Konjugats, welches das CTL-induzierende Peptid/T-Helfer-Peptid/Lipid umfasst, kann variieren. In einem Fall kann die Lipidgruppe mit dem aminoterminalen Ende des CTL-induzierenden Peptids verknüpft sein, das seinerseits an seinem Carboxylterminus mit dem T-Helfer-Peptid verbunden ist. In einem anderen Fall ist das Lipid am aminoterminalen Ende des T-Helfer-Peptids verknüpft, das an seinem Carboxyterminal mit dem CTL-induzierenden Peptid verbunden ist. In jedem Fall kann ein Spacer-Molekül selektiv zwischen der Lipidgruppe und dem CTL- oder T-Helfer-Peptid sowie zwischen dem T-Helfer und den CTL-induzierenden Peptiden insertiert sein. Im Fall eines Spacers zwischen dem Lipid und dem T-Helfer- oder CTL-induzierenden Peptid umfasst ein bevorzugtes Beispiel Lys-Ser-Ser, obwohl auch andere Spacer hierin beschrieben werden. Ein Beispiel für einen Spacer zwischen dem T-Helfer- und dem CTL-induzierenden Peptid ist Ala-Ala- Ala, das auch hierin ausführlich beschrieben wird. Das CTL-induzierende Peptid kann aus der HBc- oder HBs-Region oder aus anderen CTL-induzierenden Antigenen stammen, wie zuvor angeführt.
Die Konzentration der CTL-stimulierenden Peptide der Erfindung in den pharmazeutischen Formulierungen kann stark variieren, d. h. von weniger als etwa 1%, üblicherweise von zumindest etwa 10%, bis 20, 50 oder mehr Gew.-%, und wird vor allem in Hinblick auf die Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten usw. entsprechend der jeweiligen Verabreichungsart ausgewählt.
Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intravenöse Infusion 250 ml sterile Ringer-Lösung und 100 mg Peptid enthalten. Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Verbindungen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und ausführlich z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), beschrieben, welche Publikation hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Die Peptide der Erfindung können auch über Liposome verabreicht werden, die dazu dienen, die Peptide auf ein bestimmtes Gewebe, wie z. B. Lymphoidgewebe, abzuzielen, oder selektiv auf HBV infizierte Leberzellen abgezielt werden; ferner können sie die Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung verlängern. Die Liposome umfassen Emulsionen, Schäume, Micellen, unlösliche Monoschichten, Flüssigkristalle, Phospholipid- Dispersionen, lamellare Schichten und dergleichen. In diesen Präparaten ist das abzugebende Peptid als Teil eines Liposoms alleine oder in Kombination mit einem Molekül, das sich z. B. an einen Rezeptor bindet, der unter Lymphoidzellen vorherrscht, z. B. monoklonale Antikörper, die sich an das CD45-Antigen binden, oder zusammen mit anderen therapeutischen oder immunogenen Zusammensetzungen eingearbeitet. Lipsome, die mit einem gewünschten Peptid der Erfindung gefüllt sind, können demnach zur Stelle der Lymphoidzellen geleitet werden, an der die Liposome dann die ausgewählten therapeutischen/immunogenen Peptidzusammensetzungen abgeben. Lipsome, die sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignen, bestehen aus herkömmlichen Bläschen bildenden Lipiden, die im Allgemeinen neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterin wie etwa Chloesterin enthalten. Die Auswahl der Lipide wird im Allgemeinen von Faktoren wie etwa Liposomengröße und Stabilität der Liposome im Blutstrom bestimmt. Eine Vielzahl von Verfahren steht zur Erzeugung von Liposomen zur Verfügung; siehe z. B. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), die US-Patente 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 und 5.019.369, die hierin durch Verweis aufgenommen sind. Zum Abzielen auf die Immunzellen kann ein in das Liposom einzuarbeitender Ligand z. B. Antikörper oder Fragmente davon enthalten, die für Zelloberflächen-Determinanten der gewünschten Immunsystemzellen spezifisch sind. Eine Liposomen-Suspension mit einem Peptid kann intravenös, lokal, topisch usw. in einer Dosis verabreicht werden, die je nach z. B. Verabreichungsweise, dem abzugebenden Peptid und dem Stadium der behandelten Krankheit variiert.
Für feste Zusammensetzungen können konventionelle, nicht-toxische, feste Träger verwendet werden, z. B. pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Für die orale Gabe wird eine pharmazeutisch annehmbare, nichttoxische Zusammensetzung gebildet, indem beliebige der normalerweise verwendeten Exzipienten, wie z. B. die oben angeführten Träger, und im Allgemeinen 10-95% des Wirkstoffs, d. h. ein oder mehrere Peptide der Erfindung, noch bevorzugter in einer Konzentration von 25-75%, eingearbeitet werden.
Bei Aerosol-Verabreichung werden die CTL-stimulierenden Peptide vorzugsweise zusammen mit einem Tensid und einem Treibmittel in feinteiliger Form zugeführt. Typische Prozentsätze der Peptide reichen von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%. Das Tensid muss natürlich nicht-toxisch sein und ist vorzugsweise im Treibmittel löslich. Repräsentative Beispiele für solche Mittel sind die Ester oder partiellen Ester von Fettsäuren mit 6-22 Kohlenstoffatomen, z. B. Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Sterin-, Linol-, Olesterin- und Ölsäure, mit einem aliphatischen mehrwertigen Alkohol oder dessen zyklischem Anhydrid. Gemischte Ester, wie z. B. gemischte oder natürliche Glyceride, kommen auch in Frage. Das Tensid kann 0,1-20 Gew.-%, vorzugsweise 0,25-5 Gew.-%, der Zusammensetzung ausmachen. Der Rest der Zusammensetzung ist üblicherweise Treibmittel. Ein Träger kann gegebenenfalls auch enthalten sein, z. B. bei Lecithin für die intranasale Zufuhr.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Vakzinen, die als Wirkstoff eine immunogen wirksame Menge eines hierin beschriebenen CTL-stimulierenden Peptids enthalten. Das oder die Peptid(e) kann/können in einen Wirt, wie z. B. einen Menschen, eingebracht werden - verbunden mit dem eigenen Träger oder als Homopolymer oder Heteropolymer der aktiven Peptideinheiten. Ein derartiges Polymer besitzt den Vorteil der erhöhten immunologischen Reaktion und - bei Verwendung unterschiedlicher Peptide zur Bildung des Polymers - die zusätzliche Fähigkeit, Antikörper und/oder zytotoxische T-Zellen zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten von HBV reagieren. Geeignete Träger sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und sind z. B. Thyroglobulin, Albumine wie etwa Humanserum-Albumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren wie etwa Poly(D-Lysin : D-Glutaminsäure), Influenza-, Hepatitis B-Virus-Kernprotein, Hepatitis B-Virus-Rekombinationsvakzine und dergleichen. Die Vakzinen können auch einen physiologisch verträglichen (annehmbaren) Verdünner wie etwa Wasser, phosphatgepufferte Salzlösung oder Salzlösung enthalten und umfassen ferner typischerweise ein Adjuvans. Adjuvantien wie etwa unvollständiges Freund-Adjuvans, Alauniniumphosphat, Alauniniumhydroxid oder Alaun sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Wie oben erwähnt, können CTL-Reaktionen durch Binden von Peptiden der Erfindung an Lipide wie etwa P&sub3;CSS geprimt werden. Nach Immunisierung mit einer hierin beschriebenen Peptidzusammensetzung mittels Injektion, Aerosol, orale, transdermale oder eine andere Art der Verabreichung reagiert das Immunsystem des Wirts auf die Vakzine, indem große Mengen an für das HBV-Oberflächen- und/oder das Nukleocapsid-Antigen spezifischen CTLs produziert werden; der Wirt wird gegenüber der HBV- Infektion zumindest teilweise immun oder gegenüber der Entwicklung chronischer HBV-Infektion resistent.
Vakzinen-Zusammensetzungen mit den Peptiden der Erfindung werden an einen Patienten verabreicht, der anfällig ist oder Gefahr läuft, an einer HBV-Infektion zu erkranken, um die patienteneigenen Immunreaktionen zu stärken. Die verabreichte Menge ist als "immunologisch wirksame Dosis" definiert. Bei der Verwendung hängen die genauen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand und dem Gewicht des Patienten, von der Verabreichungsweise, von der Beschaffenheit der Formulierung usw. ab, doch im Allgemeinen reichen sie von etwa 1,0 bis etwa 500 ug pro 70 kg-Patient, noch häufiger von etwa 50 bis etwa 100 ug pro 70 kg Körpergewicht. Die Peptide werden an Individuen eines geeigneten HLA-Typs verabreicht; z. B. werden die Vakzinen-Zusammensetzungen von Peptid HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;, HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; und HBc&sub9;&sub1;&submin;&sub1;&sub1;&sub0; an HLA-A2-lndividuen verabreicht.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Peptidvakzinen der Erfindung mit Vakzinen zu kombinieren, die neutralisierende Antikörperreaktionen auf HBV, insbesondere auf HBV-Hüllenantigene, induzieren, z. B. rekombinante HBVenv-kodierte Antigene oder Vakzinen aus gereinigten Plasmapräparaten, die aus HBV-infizierten Individuen erhalten werden. Eine Vielzahl an HBV-Vakzinenpräparaten wurde beschrieben, die vor allem auf HBsAg und Polypeptidfragmenten davon beruhen. Beispiele für Vakzinen, die mit den Peptiden der Erfindung formuliert werden können, finden sich in den EP-A-154.902 und 291.586 sowie in den US-A-4.565.697, 4.624.918, 4.599.230, 4.599.231, 4.803.164, 4.882.145, 4.977.092, 5 : 017.558 und 5.019.386, die alle durch Verweis hierin aufgenommen sind. Die Vakzinen können kombiniert und gleichzeitig oder als getrennte Präparate verabreicht werden.
Für therapeutische oder Immunisierungszwecke können die Peptide der Erfindung auch durch abgeschwächte virale Wirte wie etwa Vaccinia oder Epithelioma contagiosum exprimiert werden. Diese Vorgangsweise umfasst die Verwendung von Vaccinia-Virus als Vektor zum Exprimieren von Nukleotidsequenzen, die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren. Nach Einsetzen in einen akut oder chronisch HBV-infizierten Wirt oder in einen nicht-infizierten Wirt exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das HBs- und/ oder HBc-Peptid und ruft daher eine Wirt-CTL-Reaktion auf HBV hervor. Vaccinia-Vektoren und Verfahren für Immunisierungs-Arbeitsvorschriften finden sich z. B. in der US- A-4.722.848, die hierin durch Verweis aufgenommen ist. Ein weiterer Vektor ist BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG-Vektoren werden von Stover et al., Nature 351, 456-460 (1991), beschrieben, welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Eine Vielzahl anderer Vektoren, die sich zur therapeutischen Verabreichung oder Immunisierung der erfindungsgemäßen Peptide eignen, z. B. Salmonella typhi-Vektoren und dergleichen, ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet aus der vorliegenden Beschreibung.
Die Peptide können auch als diagnostische Reagenzien verwendet werden. Beispielsweise kann ein Peptid der Erfindung dazu dienen, die Anfälligkeit eines bestimmten Individuums gegenüber einem Behandlungsregime zu bestimmen, bei dem das Peptid oder ähnliche Peptide zum Einsatz kommen, und kann somit dabei helfen, eine bestehende Behandlungsarbeitsvorschrift zu modifizieren oder eine Prognose für ein betroffenes Individuum zu erstellen. Darüber hinaus können die Peptide auch dazu dienen vorherzusagen, welche Individuen ernsthaft Gefahr laufen, eine chronische HBV-Infektion zu entwickeln.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angeführt.

BEISPIEL I

Identifizierung CTL-spezifischer HBV-Epitope

Eine Linie transgener Mäuse, die ein heterozygotes Maus-Mensch-Klasse I-Molekül exprimieren, diente dazu, HBV-Kern- und -Oberflächen-Antigen-Sequenzen zu definieren, die CTL-spezifische Epitope repräsentieren.
Die transgene Mäuse-Linie 66 von der Scripps Clinic and Research Foundation exprimiert ein heterozygotes Klasse I-Molekül, das aus den α1- und α2-Domänen von Human-HLA-A2.1-Antigen und den a3-Transmembran- und Cytoplasma-Domänen von H- 2 Kb besteht. Die transgenen Mäuse wurden gemäß dem Verfahren von Vitiello et al., J. Exp. Med. 173, 1007-1015 (1991), welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist, geschaffen. Wenn diese Mäuse in vivo mit dem Influenzavirus geprimt werden, zeigen sie eine CTL-Reaktion, die praktisch für die gleichen Epitope spezifisch ist wie jene, die durch Influenza-spezifische Human-CTIs erkannt werden. Somit können diese transgenen Tiere dazu dienen, von Human-T-Zellen erkannte HBV-Epitope zu bestimmen.
Um zu definieren, welche Sequenzregionen innerhalb der HBV-Oberfläche und Kernproteine CTL-Epitope repräsentieren, wurden synthetische Peptide aus den zwei Proteinen erzeugt und auf ihre Fähigkeit untersucht, sich an Human-HLA-A2.1 zu binden. Die Bindung wurde anhand der relativen Fähigkeit unterschiedlicher Peptid-Konzentrationen bestimmt, die Erkennung von A2.1-Zielzellen in Gegenwart des Influenza-Matrixpeptids 57-68 durch die CTL-Linie 219 zu hemmen (bestimmt anhand der Hemmung der Freisetzung von Serin-Esterase aus den Zellen). Die 219-Linie stammte von A2.1-transgenen Mäusen und ist spezifisch für das Matrixpeptid 57-68 im Kontext von HLA-A2.1.
Kurz zusammengefasst wurden die auf CTL-Epitope zu untersuchenden Peptide in DMSO in einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. Knapp vor dem Assay wurden die Peptide in RPMI 1640, gepuffert mit 25 um Hepes und umfassend 0,05% BSA (Assaymedium), verdünnt. 50 ul einer 200 ug/ml, 66 ug/ml oder 22 ug/ml Peptidlösung wurden den Näpfen von 96-Napf-Rundbodenplatten zugegeben, die 4 · 10&sup5; Jurkat 12.1/Kb- Zellen in einem Volumen von 50 ul Assaymedium enthielten. Die Platten wurden 30 min lang bei 37ºC inkubiert. 50 ul einer 2,5 ug/ml Lösung des Stammpeptids (Matrixpeptid 57-68 aus PR8-Influenzavirus) wurden dann den Zellen zugegeben, gefolgt von 50 ul 5 · 10&sup4; Linie 219-CTL, wobei die Konzentration des Stammpeptids als jene ausgewählt wurde, die 75% Serin-Esterase-Freisetzung aus CTL 219 induzierte (bestimmt mittels Titration des Peptids). Nach vierstündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Platten 5 min lang bei 1000 U/min zentrifugiert und 20 ul Überstand in 96-Napf-Flachbodenplatten übertragen. Die Esterase-Aktivität im Überstand wurde gemessen, indem 180 ul eines Reaktionsgemischs zugegeben wurden, das aus 0,2 M Tris HCl, pH 8,1, 2,0 · 10&supmin;&sup4; M N-Benzyloxycarbonyl-L-lysinthiobenzylester (BLT) und 2, 2 · 10&sup4; M Dithiobis(nitrobenzoesäure) bestand. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert und das Absorptionsvermögen bei 412 nm abgelesen. Der Prozentsatz an Hemmung wurde aus folgender Formel berechnet:
Jene Peptide, die sich an A2.1 banden und mehr als 25% Hemmung der von den Zellen freigesetzten Serin-Esterase bewirkten, wurden in vitro auf die Fähigkeit untersucht, eine CTL-Reaktion auf Splenozyten aus HBV-geprimten transgenen A2.1-Mäusen zu restimulieren. HBV-Primen erfolgte durch Injizieren von A2.1-Milzzellen, die mit HBV-Virus "beladen" waren (siehe Carbone und Bevan, J. Exp. Med. 171, 377-387 (1990)). Splenozyten ohne rote Blutkörperchen wurden in 0,4 ml einer Lösung, die aus 200 ul HBV-gereinigtem Virus und 200 ul einer 2x hypertonischen Lösung bestand (0,5 M Saccharose, 10% (w/v) Polyethylenglykol 1000, 10 mM Hepes, pH 7,2, in RPMI 1640-Medium), 10 min lang bei 37ºC suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann rasch in vorgewärmtem hypotonischem Medium (60% HBSS und 40% Wasser) verdünnt, 2 min lang bei 37ºC inkubiert, pellettiert, zweimal in HBSS gewaschen und bestrahlt (1000 rad). Mäusen wurden 5,0 · 10&sup6; beladene Zellen in einem Volumen von 200 ul injiziert. Sie erhielten 10 Tage später eine Auffrischung mit HBV-beladenen Milzzellen.
Nach etwa 2 Wochen wurden Milzzellen aus geprimten Mäusen (5 · 10&sup6; Zellen/Napfin 24-Napf-Platten) mit 4 unterschiedlichen Gemischen syngenetischer bestrahlter (3000 rad) LBS-Blasten (2 · 10&sup6; Zellen/Napf) kultiviert, die unabhängig voneinander mit 13 unterschiedlichen Peptiden beschichtet worden waren. Das Beschichten erfolgte durch Inkubieren von Aliquoten von 25 · 10&sup6; LPS-Blasten in Röhrchen mit jeweils 100 ug eines der 13 HBV-synthetischen Peptide in 1 ml 1-2 h lang bei 37ºC. Der Inhalt der Röhrchen wurde dann gesammelt, um 4 Gemische zu ergeben.
Das Zellengemisch wurde einmal gewaschen, auf die erforderliche Konzentration verdünnt und ausplattiert. Das für die Kulturen verwendete Medium war RPMI 1640, ergänzt mit 10% FCS, 50 ug/ml Gentamicin, 2 mM Glutamin und 5 · 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol (R10). Nach 9 Tagen wurden Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen Jurkat A&sub2;/Kb- Zielzellen in Gegenwart unterschiedlicher Peptidgemische untersucht, die jenen in den Kulturen entsprachen. Die erzielten Ergebnisse sind in Fig. 1, Diagramme A bis D dargestellt. Die aus diesen Kulturen erhaltenen Effektorzellen (0,2 · 10&sup6; Zellen/Napf) wurden mit bestrahlten (20.000 rad) und Peptid-beschichteten Jurkat A&sub2;/Kb-Zellen (0,2 · 10&sup6; Zellen/Napf) in Gegenwart von 3 · 10&sup6; Nährzellen/Napf (C57BL/6-bestrahlte Milzzellen) in R10, ergänzt mit 5%-Ratten-ConA-Überstand, restimuliert. Nach 6 Tagen wurden diese Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A&sub2;/Kb-Zielzellen in Gegenwart der 13 einzelnen Peptide getestet. Peptide, die eine CTL-Lyse von Jurkat A&sub2;/Kb-Zielzellen über dem Hintergrund induzierten (Fig. 1, Diagramme E bis H), d. h. HBenv 47-63, HBc 11-27 (Diagramm E), HBenv 141-157, HBenv 194-213, HBc 91-110 (Diagramm F), HBenv 329-348 und 349-368 (Diagramm G) sowie HBenv 309-328 (Diagramm H), wurden unabhängig voneinander verwendet, um die mit den Peptidgemischen erzeugten Effektorzellen zu restimulieren. Nach 6 Tagen in Kultur wurden die Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-Jurkat-A&sub2;/Kb-Zielzellen in Gegenwart des für die Restimulierung verwendeten Peptids (Fig. 1) untersucht. Die in diesem Beispiel beschriebene Versuchsreihe ermöglicht die Bestimmung, dass die HBV-Peptide HBc 11-27 (Fig. 1, Diagramme A, E; Fig. 2, Diagramm J), HBc 91-1 10 (Fig. 1, Diagramme B, F; Fig. 2, Diagramm M), HBenv 329-348 (Fig. 1, Diagramme C, G; Fig. 2, Diagramm N), HBenv 349-368 (Fig. 1, Diagramme C, G; Fig. 2, Diagramm O) und HBenv 309-328 (Fig. 1, Diagramme D, H; Fig. 2, Diagramm P) deutlich CTL-Epitope repräsentieren.

BEISPIEL II

Induktion von auf A2.1 eingeschränkten CTLs durch subkutanes Primen mit gereinigtem HBV in unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA)

Die subkutane Injektion von Eialbumin (OVA) in IFA induziert eine Eialbumin-spezifische CTL-Reaktion bei Mäusen, während die intravenöse oder intraperitoneale Injektion von OVA im Allgemeinen nicht zur Erzeugung von CTLs führt. Diese Technik dient dazu, HBV-spezifische CTLs in transgenen A2.1-Mäusen zu induzieren.
Primen und in vitro-Restimulierung: Transgenen A2.1/Kb-Mäusen wurden 100 ul einer Emulsion von gereinigtem HBV-Virus in unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA) injiziert. Diese Emulsion wurde durch Vermischen von gereinigtem HBV (1 mg Protein/ml), 1 : 5 verdünnt in HBSS, mit einem gleichen Volumen von IFA hergestellt. 7 Tage nach dem Primen wurden aus diesen Tieren erhaltene Splenozyten (5 · 10&sup6; Zellen/Napfin einer 24-Napf-Platte) mit syngenetischen bestrahlten LPS-Blasten (2 · 10&sup6;/Napf) restimuliert, die mit jedem der folgenden Peptide beschichtet waren:
Diese Peptide wurden aus folgenden Gründen ausgewählt: 1) Sie wurden in Beispiel I als Peptide definiert, die CTL-Epitope enthalten (die Peptide 799.10, 799.09, 802.03); 2) sie stellen Verkürzungen von in Beispiel I definierten Peptiden dar, die von den gegen die größeren Epitope gebildeten CTLs erkannt werden (d. h. die Peptide 875.15, 884.02, 883.02, 883.03); oder 3) sie enthalten das A2.1-Bindungsmotiv, das von Falk et al. beschrieben wurde (Nature 351, 290-296 (1991)), d. h. Leucin oder Methionin an Position 2 und entweder Leucin oder Valin an Position 9 oder Valin an Position 10 (d. h. die Peptide 884.01, 875.20, 875.21, 875.18 und 875.19). Das Beschichten erfolgte durch Inkubieren von 50 ug jedes einzelnen Peptids mit 12 · 10&sup6; LPS-Blasten in einem Volumen von 0,4 ml RPMI-Medium, ergänzt mit 10% FCS, über 1 h bei 37ºC. Die Zellen wurden einmal gewaschen. Nach 6 Tagen wurden Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte)urkat A&sub2;/Kb-Zellen in Gegenwart der geeigneten Peptide getestet. Die Ergebnisse sind aus Fig. 3 ersichtlich.
Diese Effektorzellen (0,2 · 10&sup6; Zellen/Napf) wurden in wöchentlichen Intervallen restimuliert. Bei der ersten Restimulierung wurden mit Peptid beschichtete LPS-BLasten verwendet, gefolgt von Peptid-beschichteten Jurkat A2.1/Kb-Zellen. 6 Tage nach der Restimulierung wurden Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte)urkat A2/Kb- Zielzellen in Gegenwart der geeigneten Peptide untersucht. Die erzielten Ergebnisse sind aus Fig. 4 ersichtlich.
Peptide, die offensichtlich in der Lage sind, CTLs aus Splenozyten HBV-geprimter Mäuse zu induzieren, sind HBc 18-27 (Fig. 3 und 4, Diagramm A), HBenv 349-368 (Fig. 3 und 4, Diagramm B); HBenv 349-358 (Fig. 3 und 4, Diagramm D); HBenv 329-348 (Fig. 3 und 4, Diagramm F); HBc 91-110 (Fig. 3 und 4, Diagramm I); HBc 92-102 (Fig. 3 und 4, Diagramm J); und HBc 93-10² (Fig. 3 und 4, Diagramm K). Kürzungspeptide, die von gegen das größere Peptid gebildeten CTLs und als solche erkannt wurden, sollten zumindest einen Teil eines CTL-Epitops enthalten; es handelt sich um HBenv 335-343 und HBenv 338-347 (Fig. 3F, 4F).

BEISPIEL III

Synthese von Peptiden

Peptide wurden auf einem Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 430A-Peptidsynthesizer unter Einsatz von Fmoc-geschützten Aminosäuren und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat-(HBTU-) Estern zwecks Aminosäure-Aktivierung synthetisiert. Jede Aminosäure wurde routinemäßig dreifach gekoppelt. Die Fmoc-geschützten Aminosäuren und das Hydroxybenzotriazol stammten von Burdick und Jackson. Der HBTU stammte von Richelieu Biotechnologies (St. Hyacinthe, Kanada). Piperidin und Trifluoressigsäure, Essigsäureanhydrid und Ethandithiol stammten von der Sigma Chemical Corporation.
a) Peptid Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH
An Sasrin -Harz (Bachem Biosciences) gebundenes L-Valin wurde in das Peptidsynthese- Reaktionsgefäß gefüllt und einmal mit N-Methylpyrolidon (NMP) gewaschen. Die folgenden Arbeitsgänge wurden nacheinander durchgeführt.
1. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch Behandlung der harzgebundenen Aminosäure mit 25% Piperidin in NMP entfernt.
2. Das Harz wurde fünfmal mit NMP gewaschen.
3. Ein Gemisch, das Fmoc-Serin, Diisopropylethylamin, HBTU und NMP enthielt, wurde dem Reaktionsgefäß zugegeben und 30 min lang unter Rühren umgesetzt.
4. Das Lösungsmittel wurde abgelassen und das Harz dreimal mit NMP gewaschen.
5. Die Schritte 3 und 4 wurden zwei weitere Male wiederholt.
6. Das Harz wurde viermal mit NMP gewaschen.
Die Schritte 1-6 wurden für jede Aminosäure des Peptids wiederholt. Nach dem letzten Kopplungszyklus wurde das harzgebundene Peptid durch Reaktion mit 25% Piperidin in NMP von der Schutzgruppe befreit, siebenmal mit NMP gewaschen und zweimal mit Dichlormethan gewaschen. Das Harz wurde 24 h lang in Vakuum getrocknet. Das Peptid wurde aus dem Sasrin®-Harz durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, die 2,5% Ethandithiol und 5% Wasser enthielt, gespalten. Das Polystyrolharz wurde durch Filtration von der Trifluoressigsäure-Lösung abgetrennt. Die Trifluoressigsäure wurde durch Abdampfen in Vakuum entfernt. Das Rohpeptid wurde mit Diethylether zerstoßen und in Wasser gelöst. Das Wasser wurde durch Lyophilisierung entfernt. Das Peptid wurde mittels RP-HPLC auf einer C&sub8;-Säule (VYDAC) unter Verwendung eines Gradienten aus Acetonitril und Wasser (jeweils mit 0,1% TFA als Modifikator) gereinigt.
b) Peptid (Pal)2-Lys-Ser-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH
Das in Abschnitt a) beschriebene harzgebundene Peptid wurde durch Addition von zwei Serinresten nach der oben erläuterten Vorgangsweise verlängert. Die folgenden Arbeitsschritte wurden durchgeführt:
1. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch Behandlung der harzgebundenen Aminosäure mit 25% Piperidin in NMP entfernt.
2. Das Harz wurde fünfmal mit NMP gewaschen.
3. Bis-Fmoc-Lysin wurde durch Behandlung mit Diisopropylcarbodiimid in NMP in das entsprechende symmetrische Anhydrid übergeführt. Das harzgebundene Peptid wurde mit dem resultierenden Anhydrid umgesetzt.
4. Das Harz wurde fünfmal mit NMP gewaschen.
5. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch Behandlung der harzgebundenen Aminosäure mit 25% Piperidin in NMP entfernt.
6. Palmitinsäure wurde mit Hydroxybenzotriazol und Diisopropylcarbodiimid in NMP umgesetzt. Das harzgebundene Peptide wurde mit der resultierenden Lösung umgesetzt.
7. Das Harz wurde fünfmal mit NMP gewaschen.
Schließlich wurde das Peptid wie oben beschrieben vom Harz abgespalten.
c) Peptid Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp- Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH
Das in Abschnitt a) beschriebene harzgebundene Peptid wurde durch Addition von Glu-, Thr-, Ile-, Gly-, Ile-, Phe-, Lys-, Ser-, Asn-, Ala-, Lys-, Ile-, Tyr- und Gln-Resten gemäß dem in Abschnitt a) dargelegten Verfahren kettenverlängert. Die Abspaltung und Reinigung erfolgten wie oben beschrieben.
d) Peptid Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Phe-Leu- Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH
Das in Abschnitt a) beschriebene harzgebundene Peptid wurde durch nacheinander erfolgende Addition von Ala-, Ala-, Ala-, Glu-, Thr-, Ile-, Gly-, Ile-, Phe-, Lys-, Ser-, Asn-, Ala-, Lys-, Ile-, Tyr- und Gln-Resten gemäß der in Abschnitt a) dargelegten Vorgangsweise kettenverlängert. Die Abspaltung und Reinigung erfolgten wie oben beschrieben.
e) Peptid Ac-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ole-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Phe- Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH
Das in Abschnitt d) beschriebene harzgebundene Peptid wurde durch Reaktion mit Essigsäureanhydrid in NMP acetyliert. Die Spaltung und Reinigung erfolgten wie oben beschrieben.

BEISPIEL IV

Induktion von CTLs durch Kombinieren von CTLs und T-Helfer-Epitopen

Dieses Beispiel beschreibt Experimente, welche die relative HBV-spezifische CTL-Priming-Wirksamkeit von Peptiden in vivo definieren, die HBV-CTL-Epitope alleine, CTL- Epitope im Gemisch mit T-Helfer-Epitope enthaltenden Peptiden, oder CTL-Epitope, physikalisch verbunden mit T-Helfer-Epitopen, exprimieren.
Transgene Mäuse (HLA-A2.1/Kb) wurden subkutan (Schwanzbasis) mit 100 ug Peptid 875.23 (auf lab eingeschränktes Helfer-Epitop HBc 128-140 TPPAYRPPNAPIL) in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) geprimt. 9 Tage später wurde jedes der folgenden Peptide subkutan in 2 ungeprimte und 2 Helfer-geprimte Mäuse injiziert (100 ug/Maus in IFA).

BEISPIEL V

Induktion von auf A2.1 eingeschränkten für HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; spezifischen CTLs

Transgenen A2/Kb-Mäusen wurden 100 ul einer Emulsion von 100 ug HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; und 100 ug HBc&sub1;&sub2;&sub8;&submin;&sub1;&sub4;&sub0;-Helfer-Epitop in IFA injiziert. Diese Emulsion war durch Vermischen von 500 ug beider Peptide in PBS mit dem gleichen Volumen an IFA gebildet worden. 21 Tage nach dem Primen wurden aus diesen Tieren erhaltene Splenozyten (5 · 10&sup6; Zellen/Napfin einer 24-Napf-Platte) mit syngenetischen LPS-Blasten (2 · 10&sup6;/Napf), die mit dem Peptid HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; beschichtet waren, restimuliert. Diese Effektorzellen (0,2 · 10&sup6;/Napf) wurden in wöchentlichen Intervallen restimuliert. Bei der ersten und zweiten Restimulierung wurden mit HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; beschichtete LBP-Blasten verwendet, gefolgt von mit HBenV&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; beschichteten Jurkat A2.1/Kb-Zellen. 6 Tage nach der Restimulierung wurden Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2/Kb-Zielzellen in Gegenwart und Abwesenheit von HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8; getestet (siehe Fig. 11).
3 Wochen nach dem Primen mit dem CTL-Epitop wurden Splenozyten in vitro mit LPS- Blasten restimuliert, die mit HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; beschichtet waren (das Beschichten erfolgte durch Inkubieren von 30 · 10&sup6; LPS-Blasten mit 100 u HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; in 1 ml Medium; nach 1-2 h bei 37ºC wurden die Zellen gewaschen). Nach 6 Tagen wurden Effektorzellen auf Lyseaktivität gegen &sup5;¹Cr-markierte Jurkat A2/Kb-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass bei 50% der untersuchten Tiere, in denen die T-Helfer- und CTL-Epitop-Peptide einfach vermischt (d. h. nicht verbunden) und in immunisierender Dosis verarbeicht wurden, eine Induktion detektierbarer Antigen-spezifischer CTL- Aktivität über dem Hintergrundwert der Abtötung festgestellt wurde. Ein Beispiel für die detektierte Reaktion ist in Fig. 7 veranschaulicht. Als Tiere mit dem T-Helfer-Epitop, gebunden an das CTL-Epitop, geprimt wurden, zeigten überraschenderweise 100% Anzeichen von spezifischem CTL-Priming (Fig. 8), dessen Größenordnung über jener lag, die detektiert wurde, als die Epitope nicht gebunden verabreicht wurden (Fig. 7). Wie aus Fig. 9 ersichtlich stellte man etwas unerwarteterweise fest, dass die Bindung des T-Helfer- und CTL-Epitops über einen Alanin-Alanin-Alanin-Spacer (d. h. T-Helfer-AAA-CTL) zur Induktion spezifischer CTL-Aktivität führte, die höher als jene war, die durch Bindung der T-Helfer- und CTL-Determinante alleine detektiert wurde. Das Priming des T- Helfer-Peptids oder CTL-Peptids alleine induzierte keine HBc-spezifischen CTLs (Fig. 5 und 6). Eine vorherige Immunisierung von Tieren zur Induktion von T-Helfer-spezifischer Immunität schien für das Priming für CTLs unter Einsatz des T-Helfer-CTL-Gemisches oder des T-Helfer-CTL-Konjugats richt wesentlich zu sein, da Immunisierung detektiert wurde, als naive Tiere mit dem geeigneten Konjugat geprimt wurden (Fig. 10A und B).

BEISPIEL VI

Testen verbundener Tetanustoxoid-T-Helfer- und zytotoxischer HBc-T-Zellen-Epitope auf in vivo-Priming

Transgene Mäuse (HLA-A2.1/kb) wurden subkutan (Schwanzbasis) mit 200 mg (0,07 mM) Peptid 934.02 geprimt.
3 Wochen nach dem Primen wurden Splenozyten in vitro mit LPS-Blasten restimuliert, die mit HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; beschichtet waren (wie in Beispiel I beschrieben). Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit Jurkat A2/Kb-Zellen restimuliert, die mit HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; beschichtet waren (wie in Beispiel I beschrieben). Nach 6 Tagen wurden diese Effektorzellen auf Zytotoxizität gegen 5'Cr-markierte Jurkat A2/Kb-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7;, Jy-Zielzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; und mit HBV-Kern transfizierte Jy-Zellen untersucht. Die in Fig. 12 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass Peptid 934.02 wirksam für HBc&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub7; spezifische CTLs induziert. Außerdem erkennen und töten diese CTLs endogen präsentiertes Antigen (Jy-Kern).

BEISPIEL VII

Vergleich von durch Peptid-Immunisierung induzierter CTL-Immunität

Verschiedene Modifikationen und Formulierungen eines antigenen CTL-Peptids wurden untersucht, um seine Immunogenität zu verstärken. BALB/c-Mäuse wurden an der Schwanzbasis subkutan mit einem der folgenden Peptide oder Peptidgemische geprimt:
3 Wochen nach der Immunisierung wurden Splenozyten entfernt und in vitro mit dem Flu&sub1;&sub4;&sub7;&submin;&sub1;&sub5;&sub5;-Peptid stimuliert. CTL-Aktivität wurde 1 Woche später unter Einsatz von &sup5;¹Crmarkierten B10.D2-Fibroblasten als Ziele getestet. Zielzellen wurden in Abwesenheit von Antigen, in Gegenwart von Flu&sub1;&sub4;&sub7;&submin;&sub1;&sub5;&sub5;-Peptid oder nach Infektion mit Influenza-PR8- Virus untersucht. Repräsentative Beispiele aus einem bis vier unabhängig durchgeführten Experimenten sind in Tabelle I zusammengefasst. Tabelle I CTL-Immunogenität verschiedener Modifikationen und Formulierungen von PR8-NP 148-155
a = Dosis (pM/Maus)
b = CTL-Immunogenität verschiedener Modifikationen und Formulierungen von NP 148-155 (Nukleoprotein von PR8-Influenzavirus). jedes Symbol stellt das Ergebnis dar, das mit Milzzellen erhalten wurde, die aus einer einzelnen Balb/c-Maus stammten, und gibt das Effektor-Ziel-Verhältnis (E : T) an, das erforderlich ist, um 40% Antigen-spezifische Lyse von &sup5;¹Cr-markierten B10D1-Zielzellen zu induzieren; "+ + +" bedeutet, E : T liegt unter 10 : 1; bei "+ +" liegt E+T zwischen 10 : 1 und 30 : 1; bei "+" liegt E : T über 30 : 1; bei "-" wurde mit keinem untersuchten E : T Immunogenität erzielt.
Die Konstrukte (PAM&sub2;KSS-T-Helfer-CTL und (PAM)&sub2;KSS-T-Helfer-AAA-CTL) waren beim Injizieren in Salzlösung oder Alaun allen anderen Kombinationen überlegen. Die Peptide T-Helfer-CTL und T-Helfer-AAA-CTL waren dem Vermischen von T-Helfer und CTL (d. h. nicht verbunden) überlegen und funktionierten gut in IFA, jedoch nicht in Salzlösung oder Alaun. Somit scheint zur Vakzinen-Entwicklung die Bindung von (PAM)2KSS an ein T-Helfer-PEptid, das an das CTL-Peptid gebunden ist, vorteilhaft zu sein, um CTL- Immunität zu induzieren.

BEISPIEL VIII

Definition der minimalen optimalen Sequenz mit dem CTL-Peptid-Epitop 799.09

Transgene Mäuse (A2.1/Kb) wurden im Wesentlichen wie in Beispiel II mit HBV-Virus in IFA geprimt. 7 Tage nach dem Primen wurden von diesen Tieren erhaltene Splenozyten mit syngenetischen bestrahlten LPS-Blasten restimuliert, die mit Peptid 799.09 beschichtet waren (wie in Beispiel I beschrieben). Nach 6 Restimulierungszyklen mit 799.09-beschichteten Zellen (wie in Beispiel II beschrieben) wurden die Effektorzellen durch Grenzverdünnung unter Einsatz von syngenetischen bestrahlten LPS-Blasten kloniert, die mit Peptid 799.09 beschichtet waren (0,2 · 10&sup6; Zellen/Napfeiner 96-Napf-Platte), und das Medium mit 10% Ratten-Con A-Überstand ergänzt. 2 CTL-Linien wurden erhalten (Linie 110 und 113), die mit Peptid 799.09 beschichtete JA2Kb-Zielzellen abtöteten. Diese Linien wurden mit einer Reihe von am N-Terminus verkürzten 799.09-Peptiden und überlappenden 9-Meren und 10-Meren, die die gesamte 799.09-Sequenz abdeckten, untersucht. Wie aus Fig. 13, Diagramm A ersichtlich, waren die minimalen N-Terminus-verkürzten Peptide, die von Linie 113 und 110 erkannt wurden, die Peptide HBVenV&sub3;&sub3;&sub3;&submin;&sub3;&sub4;&sub8; (923.09) und 335-348 (923.07). Fig. 13, Diagramm B zeigt, dass keines der 9-Mere und 10-Mere von Linie 113 erkannt wurde, was impliziert, dass ein längeres Peptid als die minimale Sequenz für die Erkennung durch diese CTL-Linie erforderlich ist. Die von Linie 110 erkannte minimale Sequenz ist durch die Peptide HBVenv&sub3;&sub3;&sub3;&submin;&sub3;&sub4;&sub1; (923.26) und HBVenv&sub3;&sub3;&sub5;&submin;&sub3;&sub4;&sub3; (923.22) repräsentiert - ein Anzeichen, dass möglicherweise zwei unterschiedliche, jedoch überlappende Peptide als antigene Determinanten für 799.09-spezifische CTLs dienen können.
Es ergibt sich aus der vorliegenden Beschreibung, dass zwar spezifische Ausführungsformen der Erfindung aus Gründen der Veranschaulichung dargelegt wurden, dass aber verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demzufolge ist die Erfindung nur durch die beiliegenden Patentansprüche eingeschränkt.

Claims

1. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTLinduzierenden Peptids zu einem entsprechenden Abschnitt von 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

2. Peptid nach Anspruch 1, das 884.02 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub5;&sub8;) [Seq. ID-Nr. 3]

Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile ist.

3. Peptid nach Anspruch 1, das 917.07 (HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) Trp-Met-Met-Trp-Tyr-Trp-Gly-Pro-Ser-Leu ist.

4. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTLinduzierenden Peptids zu einem entsprechenden 'Abschnitt von 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

5. Peptid nach Anspruch 4 das 923.22 (HBenv&sub3;&sub3;&sub5;&submin;&sub3;&sub4;&sub3;) Trp-Leu-Ser-Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Val ist.

6. Peptid nach Anspruch 4, das 923.27 (HBenv&sub3;&sub3;&sub2;&submin;&sub3;&sub4;&sub1;) Arg-Phe-Ser-Trp-Leu-Ser-Leu-Leu-Val-Pro ist.

7. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTLinduzierenden Peptids zu einem entsprechenden Abschnitt von 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

8. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz mit einer Sequenz mit entsprechender Länge aus der folgenden Sequenz identisch ist:

9. Peptid nach Anspruch 8, das HBc&sub9;&sub2;&submin;&sub1;&sub0;&sub1; (Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu- Leu), HBc&sub9;&sub2;&submin;&sub1;&sub0;&sub0; (Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu) oder HBc&sub9;&sub3;&submin;&sub1;&sub0;&sub2; (Met-Gly-Leu-Lys- Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp) ist.

10. Konjugat, umfassend ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das an ein T-Helfer-Peptid gebunden ist.

11. Konjugat, umfassend ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, das an ein T-Helfer-Peptid gebunden ist, worin das CTL-induzierende Peptid 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;), 799.10 (HBenV&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) 799.08 (HBenV&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;) 923.27 (HBenv&sub3;&sub3;&sub2;&submin;&sub3;&sub4;&sub1;) oder 917.07 (HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) ist.

12. Konjugat nach Anspruch 10 oder 11, worin das T-Helfer-Peptid Hepatitis B-Kernpeptid HBc&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, HBc&sub5;&sub0;&submin;&sub6;&sub9;, HBc&sub1;&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub2;&sub5; oder Tetanustoxoid (TT&sub8;&sub3;&sub0;&submin;&sub8;&sub4;&sub3;) ist.

13. Konjugat nach Anspruch 10 oder 11, worin das Konjugat weiters an ein Lipid gebunden ist.

14. Konjugat nach Anspruch 13, worin das Lipid an den N-Terminus des T-Helfer- Peptids gebunden ist, das an seinem carboxyterminalen Ende an das CTL-induzierende Peptid gebunden ist.

15. Konjugat nach Anspruch 14, worin das Lipid über ein Spacermoleküfan den N- Terminus des T-Helfer-Peptids gebunden ist.

16. Konjugat nach Anspruch 15, worin das Spacermolekül Lys-Ser-Ser ist.

17. Konjugat nach einem der Ansprüche 10 bis 16, worin das CTL-induzierende Peptid über ein Spacermolekül an das T-Helfer-Peptid gebunden ist.

18. Konjugat nach Anspruch 17, worin das Spacermolekül aus 1 bis 10 Aminosäuren besteht.

19. Konjugat nach Anspruch 18, worin der Spacer Ala-Ala-Ala ist.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Hepatitis B-Virusinfektion, welche ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein Konjugat nach einem der Ansprüche 10 bis 19 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin der Träger ein Liposom ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21, worin das Peptid an den Träger gebunden ist.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin der Träger ein Lipid ist.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin das Lipid aus Palmitinsäure besteht, die an &epsi;- und α-Aminogruppen eines Lys-Rests gebunden ist, worin das Lys über einen Ser-Ser-Linker an den Aminoterminus des Peptids gebunden ist.

25. Verfahren zur Identifizierung eines Individuums, das dafür anfällig ist, chronische Hepatitis B-Virusinfektion zu entwickeln, umfassend:

das Inkubieren lymphomonuklearer Zellen eines Individuums von Interesse mit einem Hepatitis B-Peptid-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einem, das eine auf HLA-Klasse I eingeschränkte Reaktion von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf Hepatitis B-Virus induziert; und

das darauf folgende Bestimmen der Fähigkeit des Individuums, die CTL-Reaktion auf das Antigen zu zeigen, und somit der Fähigkeit zur Entwicklung chronischer Hepatitis B-Virusinfektion.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin das Individuum von Interesse an akuter Hepatitis B-Infektion leidet.

27. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das von einem DNA-Konstrukt exprimiert wird, das einen Transkriptions-Promotor, eine DNA-Sequenz, die für das Peptid kodiert, und einen Transkriptionsterminator umfasst, die zur Expression des Peptids jeweils operabel gebunden sind.

PATENTANSPRÜCHE für die Vertragsstaaten Es und GR

2. Peptid nach Anspruch 1, das 884.02 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub5;&sub8;) [Seq. ID-Nr. 3] Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile ist.

3. Peptid nach Anspruch 1, das 917.07 (HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub5;) Trp-Met-Met-Trp-Tyr-Trp-Gly-Pro-Ser-Leu ist.

4. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTLinduzierenden Peptids zu einem entsprechenden Abschnitt von 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

11. Konjugat, umfassend ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, das an ein T-Helfer-Peptid gebunden ist, worin das CTL-induzierende Peptid 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;), 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;), 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;), 923.27 (HbenV&sub3;&sub3;&sub2;&submin;&sub3;&sub4;&sub1;) oder 917.07 (HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) ist.

13. Konjugat nach Anspruch 10 oder 1 l, worin das Konjugat weiters an ein Lipid gebunden ist.

15. Konjugat nach Anspruch 14, worin das Lipid über ein Spacermolekül an den N- Terminus des T-Helfer-Peptids gebunden ist.

16. Konjugat nach Anspruch 15, worin das Spacermolekül Lys-Ser-Ser ist.

19. Konjugat nach Anspruch 18, worin der Spacer Ala-Ala-Ala ist.

28. Verfahren zur Herstellung eines zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierenden Peptids, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTL-induzierenden Peptids zu einem entsprechenden Abschnitt von 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Peptid 884.02 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub5;&sub8;) [Seq. ID-Nr. 3] Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile ist.

30. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Peptid 917.07 (HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) Trp-Met-Met-Trp-Tyr-Trp-Gly-Pro-Ser-Leu ist.

31. Verfahren zur Herstellung eines zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierenden Peptids, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTL-induzierenden Peptids zu einem entsprechenden Abschnitt von 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Peptid 923.22 (HBenv&sub3;&sub3;&sub5;&submin;&sub3;&sub4;&sub3;) Trp-Leu-Ser-Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Val ist.

33. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Peptid 923.27 (HBenv&sub3;&sub3;&sub2;&submin;&sub3;&sub4;&sub1;) Arg-Phe-Ser-Trp-Leu-Ser-Leu-Leu-Val-Pro ist.

34. Verfahren zur Herstellung eines zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierenden Peptids, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz des CTL-induzierenden Peptids zu einem entsprechenden Abschnitt von 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;) mit der folgenden Sequenz homolog ist:

35. Verfahren zur Herstellung eines zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierenden Peptids, umfassend eine Sequenz aus 6 bis 20 Aminosäuren, worin zumindest ein Großteil der Sequenz mit einer Sequenz mit entsprechender Länge aus der folgenden Sequenz identisch ist:

36. Verfahren nach Anspruch 35, worin das Peptid HBc&sub9;&sub2;&submin;&sub1;&sub0;&sub1; (Asn-Met-Gly-Leu-Lys- Phe-Arg-Gln-Leu-Leu), HBc&sub9;&sub2;&submin;&sub1;&sub0;&sub0; (Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu) oder HBc&sub9;&sub3;&submin;&sub1;&sub0;&sub2; (Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp) ist.

37. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, umfassend ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid nach einem der Ansprüche 28 bis 36, umfassend den Schritt des Bindens des Peptids an ein T-Helfer-Peptid.

38. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, umfassend ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid, das an ein T-Helfer-Peptid gebunden ist, worin das CTL-induzierende Peptid 799.09 (HBenv&sub3;&sub2;&sub9;&submin;&sub3;&sub4;&sub8;), 799.10 (HBenv&sub3;&sub4;&sub9;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) 799.08 (HBenv&sub3;&sub0;&sub9;&submin;&sub3;&sub2;&sub8;), 923.27 (Hbenv&sub3;&sub3;&sub2;&submin;&sub3;&sub4;&sub1;) oder 917.07 (HBenv&sub3;&sub6;&sub0;&submin;&sub3;&sub6;&sub8;) ist.

39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin das T-Helfer-Peptid Hepatitis B- Kernpeptid HBc&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, HBc&sub5;&sub0;&submin;&sub6;&sub9;, HBc&sub1;&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub2;&sub5; oder Tetanustoxoid (TT&sub8;&sub3;&sub0;&submin;&sub8;&sub4;&sub3;) ist.

40. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, weiters umfassend den Schritt des Bindens des Konjugats an ein Lipid.

41. Verfahren nach Anspruch 40, worin das Lipid an den N-Terminus des T-Helfer- Peptids gebunden ist, das an seinem carboxyterminalen Ende an das CTL-induzierende Peptid gebunden ist.

42. Verfahren nach Anspruch 41, worin das Lipid über ein Spacermolekül an den N- Terminus des T-Helfer-Peptids gebunden ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, worin das Spacermolekül Lys-Ser-Ser ist.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 43, worin das CTL-induzierende Peptid über ein Spacermolekül an das T-Helfer-Peptid gebunden ist.

45. Verfahren nach Anspruch 44, worin das Spacermolekül aus 1 bis 10 Aminosäuren besteht.

46. Verfahren nach Anspruch 45, worin der Spacer Ala-Ala-Ala ist.

47. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Hepatitis B-Virusinfektion, worin die pharmazeutische Zusammensetzung ein zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzierendes Peptid nach einem der Ansprüche 28 bis 36 oder ein nach einem der Ansprüche 37 bis 46 hergestelltes Konjugat sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

48. Verfahren nach Anspruch 47, worin der Träger ein Liposom ist.

49. Verfahren nach Anspruch 47 oder 48, worin das Peptid an den Träger gebunden ist.

50. Verfahren nach Anspruch 49, worin der Träger ein Lipid ist.

51. Verfahren nach Anspruch 50, worin das Lipid aus Palmitinsäure besteht, die an &epsi;- und α-Aminogruppen eines Lys-Rests gebunden ist, worin das Lys über einen Ser-Ser- Linker an den Aminoterminus des Peptids gebunden ist.

52. Verfahren zur Identifizierung eines Individuums, das dafür anfällig ist, chronische Hepatitis B-Virusinfektion zu entwickeln, umfassend:

53. Verfahren nach Anspruch 52, worin das Individuum von Interesse an akuter Hepatitis B-Infektion leidet.

54. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 28 bis 36, umfassend das Exprimieren des Peptids in einem DNA-Konstrukt, das einen Transkriptions-Promotor, eine DNA-Sequenz, die für das Peptid kodiert, und einen Transkriptionsterminator umfasst, die zur Expression des Peptids jeweils operabel gebunden sind.