DE69222948T2

DE69222948T2 - Oligonukleotide und ihre Verwendung in einem Assay für Enzephalopothien.

Info

Publication number: DE69222948T2
Application number: DE69222948T
Authority: DE
Inventors: Harash Narang
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1991-08-20
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1998-03-12
Anticipated expiration: 2012-08-04
Also published as: AU2379692A; CA2115829A1; WO1993004198A1; JPH06510185A; NZ243922A; GB2258867B; GB9216504D0; GB2258867A; EP0613501B1; EP0613501A1; DE69222948D1; GB9117910D0

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet von Assays für Enzephalopathien bei Menschen und Tieren. Der Begriff "Enzephalopathie" wird hier verwendet, um neurodegenerative Erkrankungen zu bezeichnen, an denen Prionen beteiligt sind, wie Scrapie bei Schafen und Ziegen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rind, Nerz und Katzen und Creutzfeld- Jakob-Syndrom (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) und Kuru beim Menschen. Der Begriff "Assay" wird hier verwendet, um den reinen Nachweis (die beabsichtigte wahrscheinliche übliche Verwendung) und ein quantitatives oder halbquantitatives Verfahren, bei denen eine Abschätzung der Menge an in der Probe vorliegender DNA erfolgt, zu umfassen.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Der Wissensstand bezüglich des für Enzephalopathien ursächlichen Mittels ist unlängst von N. Hunter, TINS 14(9), 389-390 (1991) und von S.B. Prusiner, M. Torcha und D. Westaway, Cornell Veterinarian 81(2), 85-101(1991) zusammengefaßt worden.
Das infektiöse Mittel ist ein Partikel, der sich von einem Virion unterscheidet und als ein "Prion" bezeichnet worden ist. Es wird angen6rnmen, daß Prionen wenig oder keine Nukleinsäure enthalten und hauptsächlich aus Protease-resistentem Protein (PrP) zusammengesetzt sind, das von einem zellulären Gen des Wirts kodiert wird. Diese Eigenschaft unterscheidet Prionen drastisch von Virionen. Gegenwartig ist keine Prionen-spezifische Nukleinsäure identifiziert worden, die für eine Kränkheitsübertragung erforderlich ist.
Virus-ähnliche tubulofilamentöse Partikel mit einem Durchmesser von 23-26 nm sind übereinstimmend in den Gehirnen aller bekannter spongiformer Enzephalopathien festgestellt worden. Diese Partikel sind von H.K. Narang, Intervirology 32, 185-192 (1991), und H.K. Narang, D.M. Asher und D.C. Gajdusek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3575-3579 (1988) und 84 7730-7734 (1987), untersucht worden. Sie haben einen Kern aus Prionen in stäbchenartiger Form. Die Prionenstäbchen werden auch als mit Scrapie assoziierte Fibrillen (SAF) bezeichnet. Über dem Kern befindet sich eine Schicht aus DNA, die durch Dnase entfernbar ist, und über dieser liegt eine äußere Proteinhülle, die durch eine Protease verdaubar ist. In der Veröffentlichung in Intervirology wird festgehalten, daß bis dato kein Beweis die Existenz einer Scrapie-spezifischen Nukleinsäure unterstützt, aber daß es wichtig wäre, tubulofilamentöse Partikel aufzureinigen, um die Nukleinsäure zu charakterisieren und ihre Beziehung zu der Krankheit zu bestimmen. Erst unlängst haben H.K. Narang, N.S. Millar, D.M. Asher und D.C. Gajdusek, Intervirology 32, 316-324 (1991) über eine Zunahme multimerer mitochondrialer DNA in dem Gehirn von mit Scrapie infizierten Hamstern berichtet, aber es wurde wieder festgestellt, daß es keinen Beweis für eine Scrapie-spezifische Nukleinsäure gab.
In ihrem Übersichtsartikel mit dem Titel "The Search for Scrapie Agent Nucleic Acid" in Microbiol. Rev. 54 (3), 242-246 (1990) schlossen J.M. Aiken und R.F. Marsh, daß der Mangel an Erfolg bei der Identifizierung einer Scrapie-spezifischen Nukleinsäure nahelegt, daß, wenn es eine derartige Nukleinsäure gibt, diese sich wahrscheinlich als eine sehr seltene oder sehr kleine RNA oder eine RNA- oder DNA-Spezies mit einer signifikanten Ähnlichkeit hinsichtlich der Sequenz zu Nukleinsäuren, die in nicht infiziertem Gewebe vorliegen, erweisen würde. In ähnlicher Weise stellten N. Meyer, V. Rosenbaum, B. Schmidt, K. Gilles, C. Miranda, D. Groth, S.B. Prusiner und D. Riesner in "Search for a putative scrapie genome in purified prion fractions reveals a paucity of nucleic acids", J. Gen Virol. 72, 37-49 (1991) fest, daß Prionen einer Inaktivierung durch drastische Maßnahmen, die Nukleinsäuren spezifisch hydrolysieren oder modifizieren, widerstehen, eine Eigenschaft, die dafür spricht, daß diese wahrscheinlich frei von Polynukleotiden sind; jedoch seien derartige negative Ergebnisse stets anfällig für die Kritik, daß eine mutmaßliche Scrapie-spezifische Nukleinsäure durch irgendeine ungewöhnliche Struktur so gut geschützt sein könnte, daß ihr Vorliegen noch nachzuweisen bleibt. Die Autoren schlossen daraus, daß die Nukleinsäure sehr klein (mit einer Größe von weniger als 100 Nukleotiden), sehr effizient oder hinsichtlich der Größe heterogen sein müßte.
Das verläßlichste Verfahren zum Nachweisen einer Enzephalopathie erfolgt durch Histologie, insbesondere durch Elektronenmikroskopie. Siehe H.K. Narang und R.H. Perry, The Lancet 335, 663-664 (17. März 1990) und H.K. Narang, D.M. Asher und D.C. Gajdusek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 7730-7734 (1987), aber dies erfordert Himgewebe und ist ein langsames und Sorgfalt erforderndes Verfahren.
Es wäre wünschenswert, über ein Diagnoseverfahren auf Basis von Nukleinsäureidentifizierung zu verfügen. Derartige Verfahren sind vorgeschlagen worden. Siehe H. Sorum, B. Hyllseth, R. Krona und O. Olsvik, Abstracts of the Annual Meeting of the American Society of Microbiologists 1988, Seite 363, Abstract Nr. C-188, die eine DNA-Sonde, abgeleitet von der Gensequenz, die Prionprotein kodiert, verwendeten. Da es jedoch wohlbekannt ist, daß Prionprotein von einem normalen chromosomalen Gen kodiert wird, das in sämtlichen Säugetieren, einschließlich jenen, die von Enzephalopathien betroffen sind, gefünden wird, hat die vorstehend aufgeführte Arbeit keine Akzeptanz gefünden Die Veröffentlichung einer PCT-Patentanmeldung Nr. W089/11545 (Institute for Animal Health Ltd.) behauptet, ein Verfahren zum Nachweis von Scrapie mittels der Verwendung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), der mit dem sogenannten Sinc-Gen, das mit kurzen Inkubationszeiten von durch Scrapie infizierten Schafen assoziiert ist, verbunden ist, zu beschreiben. Der RFLP soll in einem nicht kodierenden Abschnitt, der mit dem Gen für Prionen assoziiert ist, lokalisiert sein. Allenfalls würde dieses Verfahren nur Schafe mit der kurzen Inkubationszeit-Charakteristik nachweisen. Bis jetzt sind Diagnoseverfahren auf Basis von Nukleinsäureidentifizierung nicht erfolgreich gewesen oder ihr Erfolg schien nicht einmal wahrscheinlich, da eine für Enzephalopathien spezifische Nukleinsäure sich trotz zahlreicher Versuche einem Nachweis entzogen hat.
Mehrere Zeitungsartikel in 1991 in der englischen Zeitung "The Guardian" (27. April, 22. Juni, 16. August) berichten, daß der Erfinder annimmt, daß er den genetischen Fingerabdruck für BSE und damit verwandte Krankheiten gefünden hat. Es werden keine weiteren Informationen über die Natur des genetischen Fingerabdrucks gegeben.

Zusammenfassung der Erfindung

Durch eine bemerkenswerte Forschungsarbeit hat der Erfinder eine Scrapie-spezifische Nukleinsäure gefünden, von der angenommen wird, daß sie gleichfalls für andere Enzephabpathien spezifisch ist. Die gegenwärtig einzigartige Natur dieser Nukleinsäure bildet die Grundlage eines Diagnoseverfahrens, das typischerweise umfaßt, entweder (a) eine Sequenz von dieser als Grundlage für einen DNA-Amplifikations-, insbesondere Polymerasekettenreaktions- (PCR), Primer zur Herstellung einer ausreichenden Menge davon für einen Nachweis durch ein Restriktionsfragmentlängenverfahren zu verwenden oder (b) sie zu markieren und sie als Oligonukleotidsonde in einem empfindlichen Assay, der einen Schritt einer Hybridisierung der Sonde an Nukleinsäure der Probe umfaßt, zu verwenden. Der Assay kann an Körperflüssigkeiten ausgeführt werden.
Die Scrapie-spezifische Nukleinsäure ist eine einzelsträngige DNA und umfaßt die Sequenz (TACGTA)n, in der n mindestens 6 ist. Die grundlegende 6-Nukleotid-Einheit dieser Wiederholungssequenz ist palindromisch in dem Sinne, daß eine komplementäre DNA die gleiche TACGTA-Sequenz aulweisen würde, wenn sie in 5' T 3'-Richtung gelesen würde. Die Vollängensequenz der DNA ist noch nicht bekannt, aber es wird vermutet, daß n sehr viel größer als 6 ist, vielleicht in der Größenordnung von 20-30, und ferner, daß die DNA wahrscheinlich die folgende allgemeine Form aufweist:
(TACGTA)n1-L&sub1;-(TACGTA)n2-L&sub2;-(TACGTA)n3-L&sub3; ...., wobei n&sub1;, n&sub2;, n&sub3; ..... eine Reihe von ganzen Zahlen ist, die gleich oder verschieden sein können, und L&sub1;, L&sub2;, ..... eine Reihe von DNA-Verbindungselementen ist, die gleich oder verschieden sein können. Der gezeigten allgemeinen Form kann eine andere DNA von unbekannter Sequenz am 3'-Ende vorangehen und/oder am 5'-Ende angefügt sein. Die Anzahl von (TACGTA)n-Blöcken, d.h. das Ausmaß der Reihe n&sub1;, n&sub2;, n&sub3; ... ist noch nicht bekannt und dementsprechend ist auch die Anzahl von Verbindungselementen L&sub1;, L&sub2;, L&sub3; ..... noch nicht bekannt. Nichtsdestoweniger ist es bereits offensichtlich, daß die TACGTA-Sequenz für die Diagnose wertvoll ist. Eine Recherche hat gezeigt, daß sie in der nicht wiederholten Form TACGTA, d.h. n = 1, in 93 Genen, die Doppelsequenz (TACGTA)&sub2;, d.h. n =2, bei bestimmten Drosophila- und Hefegenen bekannt ist, jedoch werden Wiederholungen, bei denen n = 3 oder mehr ist, als einzigartig angesehen.
Die Erfindung stellt Oligonukleotide per se mit einer Länge von 16 bis 200 Nukleotiden mit der Formel
(Xa)-(6N-Palindrom)n-(Y)b (1)
bereit, in der
"6N-Palindrom" für TACGTA, ACGTAT, CGTATA, GTATAC, TATACG oder ATACGT steht (d.h. wobei die palindromische Sequenz an einem beliebigen der sechs Nukleotide desselben beginnt), "n" eine ganze Zahl von mindestens 2 ist; X ein Abschnitt einer geeigneten 5'-End- oder "Heading" -DNA ist und "a" 0 (d.h. kein Vorliegen einer Heading-DNA) oder 1 ist; und Y ein Abschnitt einer geeigneten 3'-End- oder "Tailing"-DNA ist und "b" 0 (d.h. kein Vorliegen einer Tailing-DNA) oder 1 ist, mit der Maßgabe, daß, wenn "n" 2 ist, entweder (1) "a" 1 ist und X mindestens die letzten vier Nukleotide von TACGTA, ACGTAT, CGTATA, GTATAC, TATACG bzw. ATACGT unmittelbar am 5'-Ende der jeweiligen 6N-Palindrom- Sequenz umfaßt oder (2) "b" 1 ist und Y mindestens die ersten vier Nukleotide von TACGTA, ACGTAT, CGTATA, GTATAC, TATACG bzw. ATACGT unmittelbar an dem 3'-Ende der jeweiligen 6N-Palindrom-Sequenz umfaßt, oder jede beliebige markierte Form davon oder Derivat davon, das die Fahigkeit der 6N-Palindrom-Sequenz aufrechterhält, sich an ihre komplementäre Sequenz anzulagem oder mit ihr zu hybridisieren). "Geeignet" bedeutet kompatibel mit einer möglichen Verwendung des Oligonukleotids als DNA-Amplifikations-, z.B. PCR-, Primer oder bei der Hybridisierung, z.B. als markierte Sonde.
Die Erfindung umfaßt auch Oligonukleotide der vorstehend angegebenen Formel (1) mit einer Länge von 12 bis 200 Nukleotiden, jedoch unter Übergehung der Maßgabe, für eine jede Verwendung in oder in Beziehung zu einem Assay für eine Enzephalopathie, an der Prionen beteiligt sind. Hinsichtlich der vollständig gefaßten Definition der Oligonukleotide siehe Anspruch 8.
Es gibt selbstverständlich praktische Grenzen für die Länge des Oligonukleotids abhängig von seiner beabsichtigten Verwendung. Für eine Verwendung als Primer ist "n" normalerweise 2, 3 oder 4. Für eine Verwendung als Sonde wird die Länge 200 Nukleotide insgesamt nicht übersteigen, vorzugsweise nicht mehr als 70. Der Begriff "Markierung" bezieht sich auf jede nachweisbare Substanz oder jeden nachweisbaren Rest einer Substariz. Der Begriff "Oligonukleotid" schließt vollständige Gene oder Kopien von Genen oder von vollständiger cDNA, die zu von Genen transkribierter vollständiger mRNA komplementar ist, aus.
Unter einem dritten Aspekt umfaßt die Erfindung einen Kit zum Ausführen einer Polymerasekettenreaktion, wobei der Kit umfaßt, d.h. daraus besteht oder einschließt, (1) Desoxyribonukleotide, (2) eine für die PCR geeignete Polymerase und (3) mindestens ein geeignetes Oligonukleotid der Erfindung, wie vorstehend definiert, als Primer. Derartige Kit- Bestandteile werden normalerweise innerhalb getrennter Behälter bereitgestellt, die gemeinsam den Kit oder einen Teil des Kits bilden.
Viertens umfaßt die Erfindung speziell ein Assayverfahren für eine Enzephalopathie, das umfaßt, eine Probe, von der vermutet wird, daß sie für die Enzephalopathie spezifische DNA enthält, wobei die DNA mindestens zwei Tandem-Wiederholungen einer TACGTA-, ACGTAT-, CGTATA-, GTATAC-, TATACG- oder ATACGT-Sequenz enthält, zu behandeln, um die DNA zu amplifizieren, das Amplifikationsprodukt, das mindestens zwei der Tandem-Wiederholungen enthält, nachzuweisen und danach das Produkt auf das Vorliegen der für Enzephalopathie spezifischen DNA zu analysieren. Insbesondere kann das Vorliegen mehrerer Kopien der Tandem-Wiederholungssequenz in der Produkt-DNA analysiert werden, indem das Produkt einer enzymatischen Restriktion unterworfen und das der Restriktion unterworfene Produkt mit einem keiner Restriktion unterworfenen Produkt verglichen wird.
Fünftens umfaßt die Erfindung speziell ein Assayverfahren für eine Enzephalopathie, das umfaßt, eine Probe, von der vermutet wird, daß sie für eine Enzephalopathie spezifische DNA enthält, optimalerweise nach Amplifikation der DNA, wobei die DNA mindestens zwei Tandem-Wiederholungen einer TACGTA-, ACGTAT-, CGTATA-, GTATAC-, TATACG- oder ATACCT-Sequenz enthält, mit einer markierten komplementären DNA-Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren und das so erhaltene hybride Produkt zu untersuchen. Es ist beabsichtigt, daß die komplementäre DNA normalerweise eine (6N-Palindrom)n-Sequenz umfaßt, obwohl es nicht ausgeschlossen werden kann, daß sie alternativ eine Verknüpfungssequenz (L&sub1;, L&sub2;, L&sub3;) oder einen Teil davon umfaßt. Eine derartige Verknüpfungssequenz könnte die Formel (A)p(TA)q(T)r aufweisen, in der "p" 0 oder 1 und "q" eine Zahl von 1 bis 20, insbesondere von 3 bis 9 und "r" 0 oder 1 ist. Selbstverständlich könnte sie beide Sequenztypen umfassen.
Sechstens umfaßt die Erfindung ferner Scrapie-spezifische DNA, die mindestens eine Sequenz der Formel (TACGTA)n, in der n mindestens 6 ist, umfaßt. Sie kann gegebenenfalls andere Sequenzbestandteile, wie vorstehend angegeben, enthalten.

Beschreibung der bevorzu2ten Ausführungsformen

(a) Die Oligonukleotide

Obwohl die Erfindung Oligonukleotide per se umfaßt, berücksichtigt die Definition ihrer bevorzugten Eigenschaften deren gegenwartig beabsichtigte Hauptverwendung, nämlich als DNA-Amplifikationsprimer. Zu diesem Zweck ist "n" in der Formel (1) vorzugsweise 2,3 oder 4 und die minimale bevorzugte Länge der palindromischen Sequenz ist 16. Der Begriff "palindromische Sequenz" bedeutet hier jegliche 6 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide, ausgewählt aus SEQ ID Nr.1:
1 TACGTATACG TA 12, was als (TACGTA)&sub2; geschrieben werden kann. In anderen Worten umfaßt sie palindromische Sequenzen innerhalb von "(6N-Palindrom)"-Einheiten und innerhalb von "(X)" und "(Y)" der Formel (1). Die Verwendung eines Oligonukleotids mit weniger als der bevorzugten Minimalanzahl von 12 könnte zu einer Fähigkeit führen, DNA nachzuweisen, die nur einen TACGTA-Block aufweist, was nicht zu ungewöhnlich ist. Sogar mit 12 Basen, z.B. (TACGTA)&sub2;, besteht eine gewisse Möglichkeit, eine zweimal wiederholte Sequenz in einer Hefe nachzuweisen, obwohl es weitere Umstände geben könnte, unter denen diese Möglichkeit gut hingenommen werden könnte. Für diese Verwendung beträgt eine mehr bevorzugte Länge der palindromischen Sequenz insbesondere 16 bis 24, und ganz besonders 17 oder 18. Eine palindromische Sequenz, die länger als 24 ist, z.B. (TACGTA)&sub4;TA, könnte unter bestimmten Umständen hinnehmbar sein, aber es würde wahrscheinlich ein Selbsthybridisierungsproblem bestehen. D.h. das 3'-Ende des Primers könnte mit seinem eigenen 5'- Ende anstelle der für Enzephalopathie spezifischen DNA der Probe hybridisieren. Tatsächlich ist es genau diese Fähigkeit der Selbsthybridisierung der Scrapie-spezifischen DNA, die wahrscheinlich erklärt, warum die DNA früher einem Nachweis entgangen ist.
Die Oligonukleotide könnten auf verschiedene Weise, ausgehend von der grundlegenden wiederholten palindromischen Sequenz, modifiziert werden, um als Primer zu dienen. Eine Verlängerung des Primers erfolgt vom 3'-Ende. Dementsprechend könnten Primer eine "irrelevante" 5'-Endsequenz haben, beispielsweise der Formel (N)m, in der N ein beliebiges einzelnes Nukleotid ist, z.B. A, C, G oder T, und "m" ausreichend groß, um einen poly-N- Schwanz mit sehr geringer Wahrscheinlichkeit eines Vorkommens in natürlichen Sequenzen zu bilden, z.B. 8 oder mehr, insbesondere 10 oder mehr ist. Vorzugsweise besteht eine 5'- Endsequenz aus der oder umfaßt die Sequenz (A)p(TA)q, in der "p" 0 oder 1 und "q" mindestens 1 ist, insbesondere 1 bis 3, unmittelbar an dem 5'-Ende von (TACGTA)n. Es gibt keine definierte Obergrenze für die Länge der 5'-Endsequenz, aber wenn sie zu lang ist, besteht die Wahrscheinlichkeit, daß sie mit der PCR interferiert. Endsequenzen von moderater Länge sind bereits früher für PCR-Primer vorgeschlagen worden, vornehmlich als Mittel, um diese mit einem unlöslichen Träger zu verknüpfen, siehe z.B. U.K.-Patentschrift 2233654A (NRDC). Eine derartige Endsequenz ist nicht notwendigerweise vollständig aus Nukleinsäure zusammengesetzt.
Die vorstehend angegebene Formel (1) eröffhet die Möglichkeit, daß die Primer nicht aus palindromischer Sequenz in einer exakten ganzen Zahl von Wiederholungen bestehen, z.B. aus (TACGTA)n mit keinen anderen Nukleotiden an beiden Enden bestehen. Dementsprechend können die Kopf- und/oder Schwanzelemente Reste der palindromischen Sequenz umfassen, selbstverständlich in der gleichen Reihenfolgen wie in der palindromischen Wiederholungssequenz angeordnet. Beispielsweise könnte ein 17-merer Primer die SEQ ID Nr.2:
1 ATACGTATACGTATACG 17
aufweisen, die der Formel (1) entspricht, in der
"6N-Palindrom" TATACG ist, "n" 2 ist, "a" 0 ist, "b" 1 ist und die 5'-Endsequenz ATACG ist.
Gewöhnlich wird für eine Verwendung in der PCR "b" 0 sein, da es nicht wünschenswert ist, irgendwelche Nukleotide nach dem 3'-Ende der palindromischen Sequenz zu haben, da sie die Primer-Verlängerung hemmen würden. Jedoch könnte die Fehlpaauung eines einzelnen Nukleotids tolerierbar sein, z.B. in dem 18-mer der SEQ ID Nr.3:
1 TATACGTATACGTATACN 18
in dem das Nukleotid N am 3'-Ende A, C oder T und dementsprechend kein Rest des Palindroms ist (G ist für das Palindrom erforderlich).
Wenn das Oligonukleotid in einem Assayverfahren, das einen Hybridisierungsschritt umfaßt, verwendet werden soll, kann es auch vollständig aus palindromischer Sequenz bestehen oder auch nicht-palindromische Nukleotide am 5,- oder 3'-Ende oder beiden Enden der palindromischen Sequenz enthalten. Eine derartige nicht-palindromische Sequenz sollte mit höchster Wahrscheinlichkeit mit dem Assay nicht interferieren. Beispielsweise könnte sie aus einer Sequenz (A)p(TA)q, wie vorstehend angesprochen, am 5'-Ende bestehen oder sie umfassen oder könnte komplementär aus 3' (T)p(AT)q 5' am 3'-Ende einer Sequenz 3' ATGCAT 5' bestehen oder diese umfassen.
Für eine Verwendung in der PCR-Reaktion wird das Oligonukleotid gewöhnlich nicht markiert werden, mit Ausnahme möglicherweise seines 5'-Endes, siehe z.B. A.-C. Syvänen, M. Bengström, 3. Tenhunen und H. Söderlund, Nucleid Acids Research 16, 11327-11338 (1988). Im Prinzip könnte es auf jede beliebige andere Weise markiert werden, die mit der Hybridisierung oder der Primer-Verlängerung nicht interferiert, sofern dies gewünscht wird. Für eine Verwendung in einem Assay, der eine Hybridisierung umfaßt, wird das Oligonukleotid normalerweise in einer markierten Form verwendet, wobei die Markierung durch jedes geeignete Verfahren erfolgt, wie radioaktive Markierung, z.B. durch ³²p, ³&sup5;S, oder durch Biotinylierung (die von einer Umsetzung mit markiertem Avidin oder Streptavidin gefolgt sein kann). Jedoch ist es auch möglich, ein unmarkiertes Oligonukleotid als Sonde zu verwenden, vorausgesetzt, daß es nachfolgend mit einer Markierung verknüpft wird. Beispielsweise könnte das Oligonukleotid mit einer Poly-C-Endsequenz versehen werden, die nachfolgend mit markiertem Poly-G verknüpft werden könnte.
Die Oligonukleotide der Erfindung werden nicht länger als 200 Nukleotide sein, sogar wenn sie als Sonden verwendet werden, und in der Praxis sind sie wahrscheinlich sehr viel kürzer, insbesondere bis zu 70 Nukleotide und ganz besonders bis zu 45 Nukleotide lang. Dementsprechend ist es insbesondere für PCR-Zwecke unwahrscheinlich, daß sie mehr als 24 Nukleotide des Palindroms plus einem gegebenenfalls vorgesehenen 5'-Ende oder -Schwanz von (z.B.) 8-20 Nukleotiden umfassen, was insgesamt 32-44 Nukleotide ergibt.

(b) Das Assayverfahren

In dem bevorzugten Verfahren wird das Oligonukleotid verwendet, um die Proben- DNA zu amplifizieren. Dies wird gegenwärtig in geeigneter Weise durch PCR ausgeführt, jedoch könnte im Prinzip jedes andere Verfahren verwendet werden, das umfaßt, das Oligonukleotid zu verwenden, um als Primer die Synthese zu initiieren oder auf andere Art und Weise einen zweiten Strang von DNA unter Verwendung der einzelsträngigen DNA der Probe als Matrize zu erzeugen.
Die PCR kann sehr leicht unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und eines Oligonukleotids der Erfindung als Primer angewendet werden. Aufgrund der repetitiven Natur der Sequenz der DNA der Probe kann dasselbe Oligonukleotid sowohl als vorwärts gerichteter als auch als rückwärts gerichteter oder reverser Primer verwendet werden. Kommerziell vertriebene Kits bestehen normalerweise aus Desoxynukleotiden (A, C, G und T), einer Polymersase, die den bei der PCR eingesetzten Temperaturen widersteht, wie Taq- Polymerase, Puffern und Kontroll-DNA zum Überprüfen des Kits. Dementsprechend kann der Oligonukleotidprimer allein für eine Verwendung mit dem Kit vertrieben werden. Jedoch ist es auch möglich, einen ergänzten Kit zu vertreiben, der mindestens einen Oligonukleotid- Primer der Erfindung, ein Restriktionsenzym zum Schneiden der palindromischen Sequenz und gegebenenfalls andere Bestandteile, z.B. einen Abschnitt einer Kontroll-DNA ähnlich der Enzephalopathie-spezifischen DNA zum Überprüfen des ergänzten Kits, umfaßt.
Die PCR-Bedingungen können beliebige sein, die für eine Verwendung in dieser Art von Assays bekannt sind, geeigneterweise jene, die für einen Einsatz mit dem Kit empfohlen werden.
Die PCR liefert ein Produkt in Form von DNA variierender Länge, die die palindromische Sequenz enthält. Diese kann aufjede gewünschte Weise analysiert werden, aber ein Verfahren, das auf einer Restriktion durch ein Enzym beruht, ist wahrscheinlich das einfachste. Das PCR-Produkt wird Banden mit verschiedenen Molekulargewichten liefern. In einigen Fällen wird sich der Primer an die Enzephalopathie-spezifische DNA nahe ihres 3'-Endes anlagern, was mehrere Kopien großer Moleküle erzeugt. Das PCR-Produkt wird in zwei Teile geteilt. Der erste wird auf einem Trenngel einer Elektrophorese unterworfen, um eine Bande mit hohem Molekulargewicht, die mit der Enzephalopathie-spezifischen DNA assoziiert ist, zu zeigen. Der zweite Teil wird mit einem Restriktionsenzym, das die palindromische Sequenz schneidet, einer Restriktion unterworfen. Dies wird die Länge der längeren DNA bedeutend verringern und bestimmte andere Banden kürzerer DNA gemeinsam eliminieren. Mehrere Restriktionen von TACGTA werden viele Banden mit für einen Nachweis zu geringem Molekulargewicht erzeugen. Durch Vergleichen der Restriktionsfragmentlängen-Muster, die von den zwei Teilen erhalten werden, kann leicht festgestellt werden, ob die Enzephalopathie-spezifische DNA in der Probe anwesend ist.
Beispiele geeigneter Enyzme sind SnaBI und Acci, die zwischen C und G von TACGTA schneiden, und MaeI und SnaI, die zwischen A und T, d.h. zwischen einer TACGTA-Sequenz und der nächsten, schneiden. Alle diese Enzyme hinterlassen stumpfe Enden und alle erkennen die Sechs-Basen-Sequenz.
Bei dem alternativen Hybridisierungsverfahren könnte die Proben-DNA zuerst amplifiziert werden, z.B. durch ein PCR-Verfahren, oder als solche verwendet werden. Eine Hybridisierungssonde ist vorzugsweise 16 bis 100 Nukleotide, insbesondere 16 bis 45 Nukleotide lang. Der Hybridisierungsassay kann auf jede herkömmliche Weise ausgeführt werden. Southern-Blotting wird wahrscheinlich sehr geeignet sein.

(c) Die Proben

Die Erfindung kann angewendet werden, um Proben aus jedem beliebigen Körpergewebe oder jeder beliebigen Körperflüssigkeit zu untersuchen, in dem bzw. der das infektiöse Mittel und dementsprechend die Enzephalopathie-spezifische DNA wahrscheinlich in einer ausreichenden Konzentration vorliegt, insbesondere in Vollblut, Serum, Plasma, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Niere, Milz, Leber und Placenta. Sofern gewünscht, könnten Hirn und Rückenmark verwendet werden.

(d) Die Enzephalopathien

Obwohl die Erfindung als Pionierarbeit DNA aus den infektiösen Partikeln von Scrapie eingesetzt hat, besteht die gegenwärtige Meinung, daß BSE, Scrapie, CJD und andere Enzephalopathien wahrscheinlich von demselben infektiösen Mittel, das auf eine andere Spezies übertragen wurde, herrühren. Wenn es nicht exakt das gleiche ist, dann ist es wahrscheinlich sehr ahnlich. Es wird dementsprechend angenommen, daß die palindromische TACGTA- Sequenz bei allen bekannten Enzephalopathien und möglicherweise anderen auftritt. Dementsprechend kann die Probe von jedem beliebigen Tier, einschließlich den vorstehend genannten, oder von einem Menschen, von denen angenommen wird, daß es bzw. er an einer Enzephalopathie leidet, abgenommen werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

BEISPIEL 1

Beispiel 1 beschreibt die Isolierung und teilweise Sequenzierung einer Scrapiespezifischen einzelsträngigen DNA.

MATERIALIEN UND METHODEN

(a) Tiere

Insgesamt 200 frisch entwöhnte weibliche Golden Syrian-Hamster wurden intrazerebral mit dem 263 K-Stamm des Scrapie-Mittels unter Verwendung von 0,03 ml einer 10%- igen Suspension von durch Scrapie infiziertem Hamsterhirn inokuliert. Klinisch kranke Tiere (65-90 Tage nach der Inokulation) und eine ähnliche Anzahl von Kontroll-Tieren gleichen Alters wurden in Chargen von 20 Tieren getötet.

(b) Aufreinigung von Nukleinsäure

Die Isolierung von DNA wurde bei 0-4ºC (sofern nicht anders angegeben) in sterilen Lösungen ausgeführt. Die Gehirne der Hamster wurden entfernt und jedes Gehirn in 10 ml 0,32 M Sucrose (0-4ºC), enthaltend 10 mM MgCl&sub2;, in Griffith-Röhrchen homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 0-4ºC 10 min bei 725 g zentrifügiert, um die Zellkerne des Wirts zu entfernen. Der Überstand wurde bei 0-4ºC 1 h bei 40000 g weiter zentrifügiert. Das Pellet von 20 Gehirnen wurde in 5 ml 10 mM MgCl&sub2; in Wasser bei 0-4ºC resuspendiert; dazu wurden Ribonuklease A (RNase) vom Pankreas-Typ III-A aus Rind (Sigma), 20000 Einheiten, und Desoxyribonuklease Typ 1 (Dnase) (Sigma), 20000 Einheiten, zugesetzt. Die Mischung wurde bei 37ºC inkubiert, wobei alle 15 min gemischt wurde. Nach Inkubieren für 1 ½ h mit den Nukleasen wurde TE-Puffer (20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,5) bis zu einem Endvolumen von 30 ml (0-4ºC) zugesetzt. Die Mischung wurde wieder bei 40000 g 1 h zentriffigiert (0- 4ºC), das Pellet in 5 ml Tris-EDTA-Puffer (pH 8,5 bei 0-4ºC) resuspendiert, 10 mg/ml Proteinase K (Boehringer) zugesetzt und 1 ½ h bei 42ºC inkubiert, wobei alle 15 min gemischt wurde. Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugesetzt und Nukleinsäure aus der Mischung unter Verwendung des Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahrens (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989) extrahiert. Die Nukleinsäure wurde in Ethanol präzipitiert und in 25 µl pro Gehirn Tris-EDTA-Puffer (TE), pH 7,4, resuspendiert.

(c) Weitere Aufreinigung von Nukleinsäure

500 µl Aliquots (Nukleinsäure aus 20 Gehirnen, in 10 Aliquots) der resuspendierten Nukleinsäure wurden mit 10 mg/ml Proteinase K erneut behandelt und 1 h bei 42ºC inkubiert. Die Nukleinsäure wurde aus der Mischung unter Verwendung des vorstehend angesprochenen Phenollchloroform-Extraktionsverfahrens erneut extrahiert und in Ethanol präzipitiert und in 500 µl TE-Puffer resuspendiert. Die Präparation wurde erneut durch Inkubieren mit 200 Einheiten RNase (hinsichtlich DNase hitzeinaktiviert) in 10 mM MgCl&sub2;-Puffer 1 h bei 37ºC behandelt. Die Nukleinsäure wurde erneut aus der Mischung unter Verwendung des vorstehend angesprochenen Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahrens extrahiert und in Ethanol präzipitiert, so daß jedes Röhrchen DNA aus 5 Gehirnen enthielt.
Für das alkalische Gel wurde die Nukleinsäure in 500 mM NaOH resuspendiert und 90 min bei 65ºC inkubiert. Die DNA-Proben, die 6 x alkalischen Aufgabepuffer enthielten, wurden in die Vertiefungen des alkalischen Gels eingefüllt. 6 x alkalischer Aufgabepuffer besteht aus 300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% Ficoll (Typ 400; Pharmacia) in Wasser, 0,15% Bromkresolgrün und 0,25% Xylencyanol FF.

(d) Agarose-Gelelektrophorese

Nukleinsäure wurde durch Elektrophorese in 1,0% Agarose (BRL) auf horizontal angeordneten Platten in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, pH 7,6, 1 mM EDTA) aufgetrennt. Gele wurden mit Ethidiumbromid angefärbt, das in das Agarosegel in einer Konzentration von 2 µg/ml eingebracht wurde. Man ließ die Gele bei einem konstanten Strom von 75 mA laufen. Fragmente eines Verdaus von λ-DNA durch HindIII und 1 kb-Größenmarker (BRL) wurden verwendet.

(e) Alkalisches Agarosegel

Um ein alkalisches Agarosegel herzustellen, wurde eine bekannte Menge Agarose (BRL) in destilliertem Wasser geschmolzen und bei 50ºC äquilibriert und 3 M NaOH zugesetzt, um eine Endkonzentration von 50 mM NaOH, 2 mM EDTA zu erhalten. Wenn eine Aufreinigung der Bande aus dem Gel erforderlich war, wurde eine bei niedriger Temperatur erstarrende Agarose (BRL) verwendet. Um dieses Gel herzustellen, wurde zuerst ein normales Agarosebett mit 1% Agarose hergestellt und nach dem Härten des Gels das bei niedriger Temperatur erstarrende alkalische Gel wie üblich daraufgegossen. Es würde normalerweise als lächerlich angesehen werden, Ethidiumbromid zu einem alkalischen Agarosegel für eine Sichtbarmachung von DNA zuzusetzen. Das Ethidiumbromid-Anfärbungsmittel funktioniert durch Interkalieren zwischen Stränge doppelsträngiger DNA, aber auf einem alkalischen Gel wird doppelsträngige DNA einzelsträngig. In diesem Fall wurde es (2 µg/ml) dem alkalischen Gel aufgrund eines Versehens zugesetzt. Es wurde eine Elektrophorese in alkalischem, 50 mM NaOH enthaltendem Elektrophoresepuffer bei einem konstanten Strom von 40 mA ausgeführt, wie detailliert von M.W. Mcdonell, M.N. Simon und W. Studier, J. Mol. Biol. 110, 119-146 (1977) beschrieben.

(f) Aufreinigung von Nukleinsäure aus dem alkalischen Gel

Nach der Elektrophorese auf dem alkalischen Gel aus bei niedriger Temperatur erstarrender Agarose blieb eine diskrete Nukleinsäurebande von unge£ahr 1,2 kb mit Ethidiumbromid angefärbt, aber nur in der Bahn, die mit Nukleinsäure aus dem durch Scrapie infizierten Material beladen war. Diese 1,2 kb-Bande, die unter alkalischen Bedingungen angefärbt blieb, wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wurde durch mehrere Wechsel in 20 Volumen 1,5 M NaCl und 1 M Tris-Puffer (pH 7,6) neutralisiert. Die Konzentration an NaCl und Tris wurde schrittweise aufje 10 mM gesenkt. Zuletzt wurde die Gelscheibe in ein 1,5 ml Mikro-Zentrifiigenröhrchen eingewogen und 3 Volumina destilliertes Wasser zugesetzt. Das Röhrchen wurde in einem Wasserbad bei 60ºC 5 min ihkubiert, bis die Agarose geschmolzen war. Verschiedene erfolglose Versuche wurden unternommen, um die Nukleinsäure weiter aufzureinigen. Die besten Ergebnisse wurden ohne jede weitere Aufreinigung dieser DNA in einer Suspension der bei niedriger Temperatur erstarrenden Agarose erhalten, die für eine Synthese des zweiten Stranges aus cDNA verwendet wurde. Verschiedene Verfahren und Kombinationen, einschließlich des "self-priming"-Verfahrens durch das Klenow- Fragment der E. coli-DNA-Polymerase wurden zur Anknüpfung synthetischer DNA-Linker mittels terminaler Transferase versucht. Es wurde auch ein Versuch unternommen, die Scrapie-spezifische einzelsträngige DNA durch terminale Transferase mit der Plasmid-DNA zu verknüpfen. Alle diese verwendeten Verfahren sind detailliert in ,,Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2. Ausgabe, J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben. Das einzige Verfahren, das erfolgreich war, wird nachfolgend beschrieben.
10 µl Suspension der aufgereinigten DNA aus bei niedriger Temperatur erstarrender Agarose in Wasser und 1 µl synthetischer statistischer 1 4-merer Oligonukleotid-Primer NEP-112X (Du Pont) in Taq-Polymerase-Puffer wurden bei 95-100ºC 5 min erwärmt. Man ließ das Röhrchen langsam auf 37ºC abkühlen, das resultierende Kondensationsprodukt wurde zentrifugiert und die Röhrchen zweimal erneut erwärmt und langsam auf 37ºC abgekühlt (nur mit Puffer). 2 µl von 0,5 mM DNTP-Mischung und eine Einheit "Amplitaq" -DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 3 min bei 80ºC und dann 5 min bei 75ºC erwärmt. Eine zusätzliche Einheit "Amplitaq"-DNA-Polymerase wurde zugesetzt und die Temperatur nach und nach auf 70ºC und dann auf 65ºC, 60ºC, 55ºC und 50ºC abgesenkt, wobei jede Temperatur 5 min beibehalten wurde. An dieser Stufe wurde keine PCR ausgeführt. Die synthetisierte doppelsträngige DNA wurde erneut durch Phenol/Chloroform- Extraktion aufgereinigt und durch Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 20 µl destilliertem Wasser resuspendiert und mit 5 Einheiten S&sub1;-Nuklease (Pharmacia) 15 min bei 37ºC behandelt und erneut durch das Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahren aufgereinigt und durch Ethanol präzipitiert.

(g) Konstruktion eines rekombinanten Plasmids

Die synthetisierte cDNA wurde mit T4-DNA-Ligase in durch SmaI geschnittenen und dephosphorylierten M13mp10 (Amersham) ligiert. Der kompetente E. coli-Stamm DH5a (BRL) wurde mit dem rekombinanten Phagen transformiert und auf LB-Agar-Platten ausplattiert, die über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden, wie im "M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual" (BRL) beschrieben.

(h) DNA-Sequenzanalyse

Einzelsträngige Phagen-DNA wurde aus einer sechsstündigen 1,5 ml-Flüssigkultur, wie im "M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual" (BRL) beschrieben, isoliert und direkt durch das Dideoxynukleotid-Verfahren unter Einsatz von Klenow-Fragment, DNA-Polymerase mit dem M13-Primer SEQ ID Nr.4: 5'-CCCAGTCACGACGTTGT-3' sequenziert. Die Hybridisierungs-Reaktionsmischung, die 1,5 bis 2,0 µg der einzelsträngigen DNA, 3 µl (5x) Sequenzierungspuffer und 1 µl Primer in einem Gesamtvolumen von 15 µl enthielt, wurde 5 min auf 95-100ºC erwärmt und man ließ die Mischung in dem Heizblock ungefähr 45 min auf Raumtemperatur abkühlen; dann wurde kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifügiert. Zu 15 µl hybridisierter/Primer-Mischung wurden 1 µl 0,1 M DTT, 1 µl ³&sup5;S- DATP (Amersham) und eine Einheit Klenow-Fragment-Polymerase (Dupont) zugesetzt und die Röhrchen 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde in vier Röhrchen, die 2 µl 0,1 mM DNTP- und DDNTP-Sequenzierungsmischungen enthielten, verteilt. Die Röhrchen wurden 30 min bei 37ºC inkubiert, dann kurz in einer Mikrozentrifüge zentrifügiert und 2 µl 0,4 mM Sequenzierungsmischung ohne ddnpts, die jedoch auch unmarkiertes DATP enthielt, jedem Röhrchen zugesetzt. Nach einer weiteren 20-minütigen Inkubation bei 37ºC wurden 5 µl Stop-Lösung jedem Röhrchen zugesetzt und durch Zentrifügation gemischt. Proben wurden auf einem 6%-igen Acrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, in Tris-Borat- Elektrophorese (TBE)-Puffer bei 60 W (40 mA) einer Elektrophorese unterworfen. Proben wurden 5 min gekocht und auf nassem Eis vor der Aufgabe abgekühlt.
Eine Probe eines als "Nar 50" bezeichneten Klons wurde auch durch die automatisierten Verfahren der Model 370A-DNA-Sequenziervorrichtung (Applied Bios) an der University of Durham (England) mit Farbstoff-Primer [-21M13] sequenziert. Die Nukleotidsequenzierungsdaten wurden mit der Genbank-Datenbank durch ein Computerprogramm verglichen.

(i) Amplifikation von Klonen durch PCR

Klone von doppelsträngiger M13-DNA und einzelsträngiger DNA mit dem Insert wurden für eine Amplifikation durch Polymerasereaktion (PCR) mit -20- und reversem Primer von M3 eingesetzt. Die Reaktionen wurden in 100 µl Reaktionsmischung in einem Perkin Elmer Cetus PCR-Kit entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Vierzig PCR-Zyklen wurden an sämtlichen Proben, wie folgt, ausgeführt: Denaturierung für 60 s bei 94ºC, Anhybridisierung von Primern für 150 5 bei 45ºC und Verlängerung für 120 s bei 75ºC. PCR-Produkte wurden auf 1,0%-igen Agarosegelen mit Anfärbung durch Ethidiumbromid analysiert.

ERGEBNISSE

Eine Analyse der Nukleinsäurefraktion sowohl von durch Scrapie infiziertem Hirn als auch der äquivalenten Fraktion von nicht infiziertem Hirn, die isoliert und auf einem neutralen Agarosegel mit TAE-Puffer einer Elektrophorese unterworfen worden waren, zeigte signifikante Unterschiede zwischen durch Scrapie infizierten und nicht infizierten Proben, wie detailliert von H.K. Narang, N.S. Millar, D.M. Asher und D.C. Gajdusek, Intervirology 1991, 32, 316-324 (1991) beschrieben. Kurz gesagt war in beiden Proben eine Bande anwesend, die in ihrer Größe jener von mitochondrialer (mt) DNA von Hamster entsprach, ein doppelsträngiges zirkulares Molekül von ungefahr 15,7 kb. Zusätzlich zu dieser Bande wurden mehrere breite Banden mit hohem Molekulargewicht nur bei der durch Scrapie infizierten Probe festgestellt. In der vorstehend angegebenen früheren Studie wurde gezeigt, daß die langsamer wandemden Nukleinsäurebanden multimere Formen zirkulärer mtDNA waren.
Eine Analyse der Nukleinsäurefraktion von durch Scrapie infiziertem Hirn und der äquivalenten Fraktion von nicht infiziertem Hirn, die isoliert und auf dem mit Ethidiumbromid angefärbten, alkalischen Agarosegel mit NaOH einer Elektrophorese unterworfen worden waren, ergab, daß eine Bande von ungefähr 1,2 kb unter den alkalischen Bedingungen in der Bahn mit durch Scrapie infiziertem Hirn sichtbar blieb, obwohl keine DNA-Marker detektiert wurden (da diese unter den alkalischen Bedingungen denaturiert worden sind). Alle diese Nukleinsäurebanden wurden sichtbar gemacht, nachdem das Gel mit NaCl und Tris-Puffer neutralisiert worden war.
Die Scrapie-spezifische 1,2 kb-Bande wurde ausgeschnitten und zu doppelsträngiger cDNA, wie im Abschnitt "METHODEN" beschrieben, synthetisiert. Drei Klone mit Inserts an der Sma1-Schnittstelle wurden untersucht. Einer hatte ein Insert von nur 13 Basen, SEQ ID Nr.5:
1 ATATATATAC GTA 13.
Die anderen zwei Sequenzen lasen sich (TACGTA)n TA und beide waren nach 38 Basen schwer zu lesen. Einer der zwei Klone "Nar 50" (bei dem 38 Basen gelesen wurden) wurde auch durch das automatisierte System sequenziert und es wurde festgestellt, daß die Ergebnisse gleich waren. Die lesbare Sequenz von sechs Basen TACGTA wurde wieder und wieder in der gleichen Reihenfolge wiederholt.
Es gibt eine Restriktionsstelle für einen Schnitt von TACGTA durch SnaB1 in der Mitte. Es gibt auch eine einzelne Stelle in M13 für das Restriktionsenzym Snab 1. Die doppelsträngige DNA des M13-Plasmids mit dem Insert wurde aus E. coli durch ein Präparationsverfahren in kleinem Maßstab präpariert. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SnaB1 geschnitten. Die Gelanalyse ergab zwei Banden, von denen eine über 5000 Basen und die andere ungefähr 2250 Basen enthielt. Aufgrund der großen Größe der zwei erzeugten Fragmente war es schwierig, die Größe des Inserts in diesen zu schätzen.
Eine Analyse von 10 µl des amplifizierten PCR-Produkts von doppelsträngiger M13- DNA und einzelsträngiger DNA, die in dem neutralen Agarosegel mit TAE-Puffer einer Elektrophorese unterworfen wurden, zeigte eine Amplifikation einer einzelnen Bande von ungefähr 250 Basen. Durch Berechnen der Basen von M13 einschließlich der Primer zu ungeführ 100 Basen wurde ein Insert mit einer Größe von ungefähr 150 Basen ermittelt. Das PCR- Produkt wurde mit EcoRI, HindIII_SnaB1 oder einer Kombination von zwei Enzymen oder allen dreien geschnitten. EcoRI oder HindIII bewirkten nur einen sehr geringen Unterschied hinsichtlich der Mobilität der Bande, aber SnaB1 allein oder in Kombination mit den anderen zwei Restriktionsenzymen verringerte deren Größe um ungefahr die Hälfte auf 125 Basen.
Ein Vergleich der Nukleotidsequenz der insertierten DNA mit der Genbank- Nukleotid-Datenbank ergab keine signifikante Homologie.
Bei einer Wiederholung des Präparationsverfahrens des Beispiels 1 wurde eine weitere Sequenz, ATAATA, die der palindromischen Sequenz TAGCTA voranging, nachgewiesen. Es wird angenommen, daß diese zumindest ein Teil einer zwischengeschalteten (Verknüpfungs-) Sequenz ist, die palindromische Sequenzen verbindet.

BEISPIEL 2

Diese Beispiel veranschaulicht ein diagnostisches Assayverfahren unter Einsatz der PCR.
Die Scrapie u.s.w.-Konzentration im Blut wäre 10³ Infektiositätsdosen pro Gramm (oder cm³) Blut. (Eine Infektiositätsdosis ist jene, die bei Verdünnung und Inokulation von Mäusen Erkrankungen bei 50% der Mäuse ergibt). Diese Konzentration ist im Blut ungefähr konstant. Nur 1 µl Blut enthält wahrscheinlich 1 Molekül der DNA, die alles ist, was man für die PCR benötigt, aber in der Praxis wurde man eine viel größere Probe verwenden. Das Blut wird mit Proteinase K behandelt, um unerwünschte Proteine aus einer Assoziierung mit der DNA zu entfernen, und 10 min bei 95ºC erwärmt, um Proteinase K zu zerstören. Die PCR wird unter Verwendung eines (TACGTA)&sub3;-Primers, gemischten Nukleotiden in Taq-Polymerase über 40 Zyklen ausgeführt. Das PCR-Produkt wird dann auf einem Gel in 10 µl- Proben einer Elektrophorese unterworfen. Der erste Zyklus der drei Schritte zur Anhybridisierung des Primers, Verlängerung und Denaturierung wird durchgehend bei 95ºC ausgeführt. Danach werden 40 Zyklen bei 45-50ºC, 72ºC und 92ºC in den drei Schritten ausgeführt.
Eine Probe des PCR-Produkts wird mit dem Restriktionsenzym SnaBI verdaut, eine andere wird unbehandelt gelassen. Wo die Bande aufgrund des PCR-Produkts bei Behandlung mit dem Enzym verschwindet, ist Scrapie-spezifische DNA anwesend. (Die Wirkung von SnaB1 ist, die TACGTA-Sequenz unter Bildung vieler kleiner DNA-Stücke zu schneiden.)
Das folgende Sequenzprotokoll ist mittels des "Patentin"-Programms, das vom U.S.- Patent Office vertrieben wird, hergestellt worden. Das Programm enthält einen Fehler, der dazu führt, daß Nukleotidlängen in "Basenpaaren" ausgedrückt werden, selbst wenn die Nukleinsaure einzelsträngig ist, wie hier. Für "Basenpaare" soll "Nukleotide" gelesen werden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:NARANG, HARASH K BRITISH TECHNOLOGY GROUP LTD,
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: OLIGONUKLEOTIDE UND IHRE VERWENDUNG IN EINEM ASSAY FÜR ENZEPHALOPATHIEN
(iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 4
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: MR. R. KEITH PERCY MA CPA,
(B) STRASSE: BRITISH TECHNOLOGY GROUP LTD., 101 NEWINGTON CAUSEWAY,
(C) STADT: LONDON,
(E) LAND: GB
(F) POSTLEITZAHL: SEL 6BU
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) TYP DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Version #1,25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: WO noch nicht bekannt
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION: C07 H 21/00?
C12N 15/11?
G01N33/53?
(viii) INFORMATION BEZÜGLICH ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: PERCY, RICHARD K
(B) REGISTRIERUNGSNMMMER: UK PATENT ATTORNEY
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: PF 134648 PCT/RKP
(ix) INFORMATION BEZÜGLICH TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: +4471 403 6666 x 2311
(B) TELEFAX: +4471 403 7586

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.1:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LANGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SINN: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Satellit
(B) LOKALISIERUNG: 6.. 12
(D) ANDERE INFORMATION: /rpt_type = "tandem"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID Nr.1:
ATACGTATAC GTATACG

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.2:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LANGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SINN: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Satellit
(B) LOKALISIERUNG: 1 .. 6
(D) ANDERE INFORMATION: /rpt_type = "tandem"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID Nr.2:
TATACGTATA CGTATACN

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.3:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SINN: NEIN
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: M13-Primer
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID Nr.3:
CCCAGTCACG ACGTTGT

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.4:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKEN:
(A) LANGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYL): DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SINN: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID Nr.4:
ATATATATAC GTA

Claims

1. Oligonukleotide mit einer Länge von 16 bis 200 Nukleotiden mit der Formel (Xa)-(6N-Palindrom)n-(Y)b (1),

in der

"6N-Palindrom" für TACGTA, ACGTAT, CGTATA, GTATAC, TATACG oder ATACGT steht (gelesen in der herkömmlichen Schreibweise mit dem 5'-Ende auf der linken Seite),

"n" eine ganze Zahl von mindestens 2 ist;

X ein Abschnitt einer geeigneten 5'-End-DNA ist und "a" 0 oder 1 ist; und

Y ein Abschnitt einer geeigneten 3'-End-DNA ist und "b" 0 oder 1 ist,

mit der Maßgabe, daß, wenn n 2 ist, entweder (1) "a" 1 ist und X mindestens die letzten vier Nukleotide von TACGTA, ACGTAT, CGTATA, GTATAC, TATACG bzw. ATACGT unmittelbar an dem 5'-Ende der jeweiligen 6N-Palindrom-Sequenz umfaßt oder (2) "b" 1 ist und Y mindestens die ersten vier Nukleotide von TACGTA, ACGTAT, CGTATA, GTATAC, TATACG bzw. ATACGT unmittelbar an dem 3'-Ende der jeweiligen "6N-Palindrom"- Sequenz umfaßt,

oder jede beliebige markierte Form davon oder jedes beliebige Derivat davon, das die Fahigkeit der 6N-Palindrom-Sequenz aufrechterhält, sich an ihre komplementäre Sequenz anzulagem oder mit ihr zu hybridisieren.

2. Oligonukleotide nach Anspruch 1, wobei n 2, 3 oder 4 ist.

3. Oligonukleotide nach Anspruch 1 oder 2, wobei

"a" 0 ist oder X für einen Rest aus der 6N-Palindrom-Sequenz steht und "a" 1 ist,

"b" 0 ist oder Y für einen Rest aus der 6N-Palindrom-Sequenz steht und "b" 1 ist, und die Gesamtlänge der palindromischen Sequenz innerhalb des Oligonukleotids 16 bis 24 beträgt.

4. Oligonukleotide nach Anspruch 2, wobei "6N-Palindrom" für TACGTA steht, "a" 1 ist und X eine Sequenz der Formel (A)p(TA)q, in der "p" 0 oder 1 ist und "q" 1 bis 20 ist, unmittelbar an dem 5'-Ende der "6N- Palindrom"-Sequenz umfaßt.

5. Oligonukleotide nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 mit einer Länge von 16 bis 45 Nukleotiden.

6. Oligonukleotide nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 in einer markierten Form, wobei die Markierung an das 5'-Ende angeheftet ist.

7. Verwendung eines Oligonukleotids mit einer Länge von 12 bis 200 Nukleotiden der Formel

(Xa)-(6N-Palindrom)n-(Y)b (1),

in der

"n" eine ganze Zahl von mindestens 2 ist;

X ein Abschnitt einer geeigneten 5'-End- oder Tailing-DNA ist und "a" 0 oder 1 ist; und

Y ein Abschnitt einer geeigneten 3'-End- oder Heading-DNA ist und "b" 0 oder 1 ist, oder jeder beliebigen markierten Form davon oder jedes beliebigen Derivats davon, das die Fähigkeit der 6N-Palindrom-Sequenz aufrechterhält, sich an ihre komplementäre Sequenz anzulagern oder mit ihr zu hybridisieren,

in einem Assay für eine Enzephalopathie, an der Prionen beteiligt sind.

8. Verwendung eines Oligonukleotids mit einer Länge von 12 bis 200 Nukleotiden der Formel

(Xa)-(6N-Palindrom)n-(Y)b (1),

in der

"n" eine ganze Zahl von mindestens 2 ist;

als Primer bei DNA-Amplifikation.

9. Verwendung eines Oligonukleotids mit einer Länge von 12 bis 200 Nukleotiden der Formel

(Xa)-(6N-Palindrom)n-(Y)b (1),

in der

"n" eine ganze Zahl von mindestens 2 ist;

Y ein Abschnitt einer geeigneten 3'-End- oder Heading-DNA ist und "b" 0 oder 1 ist, in einer markierten Form oder jedes beliebigen Derivats davon, das die Fähigkeit der 6N- Palindrom-Sequenz aufrechterhält, mit ihrer komplementären Sequenz zu hybridisieren, als Sonde.

10. Verwendung nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei das Oligonukleotid wie in Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 definiert ist.

11. Kit zum Ausführen einer Polymerasekettenreaktion, wobei der Kit umfaßt:

(1) Desoxyribonukleotide,

(2) eine für die Polymerasekettenreaktion geeignete Polymerase und

(3) mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 9 für eine Verwendung als Primer.

12. Kit nach Anspruch 11, wobei das Oligonukleotid wie in Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 definiert ist.

13. Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei Bestandteil (3) vorwärts und rückwärts gerichtete Primer des Oligonukleotids umfaßt.

14. Kit nach Anspruch 11, 12 oder 13, wobei das Oligonukleotid unmarkiert ist.

15. Kit nach Anspruch 11, 12, 13 oder 14, der ferner ein Restriktionsenzym umfaßt, das das 6N-Palindrom einer Restriktion unterwerfen kann.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei das Restriktionsenzym SnaB1 AccI, MaeI oder SnaI ist.

17. Assayverfahren für eine Enzephalopathie, an der Prionen beteiligt sind, das umfaßt, eine Probe, von der vermutet wird, daß sie für die Enzephalopathie spezifische DNA enthält, wobei die DNA mindestens zwei Tandem-Wiederholungen einer TACGTA-, ACGTAT-, CGTATA-, GTATAC-, TATACG- oder ATACGT-Sequenz enthält, zu behandeln, um die DNA zu amplifizieren, das Amplifikationsprodukt, das mindestens zwei der Tandem- Wiederholungen enthält, nachzuweisen und danach das Produkt hinsichtlich des Vorliegens der Enzephalopathie-spezifischen DNA zu analysieren.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die DNA durch eine Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Ampliflkationsprodukt einer enzymatischen Restriktion unterworfen wird und das der Restriktion unterworfene Produkt mit dem keiner Restriktion unterworfenen Produkt verglichen wird, wobei das Verschwinden größerer DNA-Moleküle infolge der Restriktion das Vorliegen der Enzephalopathiespezifischen DNA anzeigt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Restriktionsenzym SnaBI, AccI, MaeI oder SnaI ist.

21. Assayverfahren für eine Enzephalopathie, an der Prionen beteiligt sind, das umfaßt, eine Probe, von der vermutet wird, daß sie für eine Enzephalopathie spezifische DNA enthält, wobei die DNA mindestens zwei Tandem-Wiederholungen einer TACGTA-, ACGTAT-, CGTATA-, GTATAC-, TATACG- oder ATACGT-Sequenz enthält, mit einer markierten komplementären DNA-Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren und das so erhaltene hybride Produkt zu untersuchen.

22. Scrapie-spezifische DNA, die mindestens eine Sequenz der Formel (TACGTA)n umfaßt, wobei "n" mindestens 6 ist.