DE69211953T2

DE69211953T2 - Vorrichtung zur Trennung und Bestimmung der Erythrozyt-Agglutinate in einem Schritt

Info

Publication number: DE69211953T2
Application number: DE69211953T
Authority: DE
Inventors: Marc Majurel
Original assignee: BOY JACQUES INST
Current assignee: BOY JACQUES INST
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2012-11-13
Also published as: EP0542655A1; DE69211953D1; ATE140083T1; EP0542655B1; FR2688311A1; FR2688311B1; ES2091435T3

Description

Die vorliegende Erfindung hat eine Vorrichtung zum Gegenstand, die das Abtrennen von Erythrozyt-Agglutinaten aus freien roten Blutkörperchen bei einem Agglutinationstest erlaubt, und gleichzeitig das Erkennbarmachen der genannten Agglutinate.
Es ist in der Erythrozyt-Immunhämmatologie bekannt, daß die Antigen-Antikörper-Reaktion durch die Anwesenheit von Agglutinaten erkennbar gemacht werden kann. Diese Agglutination, die in salzigem Milieu spontan verläuft, ist im Reagenzglas keineswegs immer beobachtbar, insbesondere in jenem Falle, in welchem die Antikörper sogenannte sensibilisierte Antikörper sind, wobei die sensibilisierten roten Blutkörperchen nicht zu einer Agglutination führen.
Um die Agglutination der sensibilisierten roten Blutkörper hervorzurufen, wurden verschiedene Techniken angewandt, unter denen die geläufigsten darin bestehen, in der Reaktion folgendes zuzuführen:
- entweder Makromoleküle wie Albumin, Dextran oder Polyvinylpyrrolidon:
- oder nach dem Auswaschen sensibilisierter roter Blutkörperchen ein menschliches Antiglobulin (Coombs-Test);
- oder ein polycationisches Molekül wie Hexadimethrinbromid, oder "Polybren", wobei die derart erzielte Agglutinatbehandlung durch eine Citratlösung das Rückführen von nicht-sensibilisierten roten Blutkörperchen in Suspension herbeiführt (Lalezari-Technik).
Eine andere Technik besteht darin, die roten Blutkörperchen zuvor durch ein proteolytisches Enzym wie Papain, Bromelin oder Trypsin zu behandeln.
Alle diese Agglutinationstechniken können von Hand oder automatisch in den verschiedensten Gefäßen durchgeführt werden: Hemolyseröhrchen, Glasplatten, Rhesuskop, Mikroplatten mit 96 Öffnungen.
In jedem Falle verlangen sie ganz allgemein eine Zentrifugierung, und daher stellen die Zeitdauer und die Geschwindigkeiten der Zentrifugierung wie auch die Art der Bewegung zum schließlichen Überführen in Suspension kritische Parameter dar, die die Beherrschung dieser schwierigen Reaktionen erfordern.
Andererseits gibt es wenig Vorrichtungen zum Durchführen dieser Verfahren zum Abtrennen sowie zum Erkennbarmachen der Erythrocyt-Agglutinate.
Graham et. al. hat im Jahre 1982 ein besonderes Kapillarrohr vorgeschlagen, das man mit einer Lösung aus Albumin und Dextran von einer Dichte zwischen Serum und roten Blutkörperchen füllt; diese Technik hat sich jedoch als nicht empfindlicher erwiesen als der klassische Coombs-Test.
Eine andere Technik in sogenannter fester Phase wurde auf dem Symposium von München im Jahre 1984 vorgestellt durch eine französische Gruppe Müller A. et. al.; diese besteht darin, das Serum-Blutkörperchen-Gemisch durch eine Separationsflüssigkeit zu zentrifugieren, nachdem die Öffnungen der verwendeten Mikroplatten mit Antiglobulin bedeckt waren, wobei das Lesen automatisch erfolgte.
FR-PS 2 577 321 beschreibt ein Verfahren, bei welchem das Separationsmilieu aus einem Gel auf Dextranbasis besteht; jedoch verwendet dieses Verfahren wie die meisten zuvor vorgeschlagenen Verfahren eine Zentrifugierung mit dem Nachteil, der mit der Anwendung dieser Technik verbunden ist, nämlich mit der Notwendigkeit eines Gerätes, das nicht aus dem Labor heraustransportiert werden kann.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese verschiedenen Nachteile der bekannten Techniken zu vermeiden, indem sie eine Vorrichtung vorschlägt, die es erlaubt, Erythrocyt-Agglutinate abzutrennen und gleichzeitig erkennbar zu machen, wobei eine Zentrifugierung vermieden wird.
Die vorliegende Erfindung hat somit eine Vorrichtung zum Gegenstand, die das Abtrennen und das Erkennbarmachen von Erythrocyt-Agglutinaten erlaubt, wobei die Vorrichtung das wesentliche Merkmal aufweist, daß sie wenigstens eine an ihrem unteren Ende offene Kapillarröhre umfaßt, die mit einem Filter ausgestattet ist, bestehend aus einer Komposit-Membran, die auf eine Schicht aus Mikro-Glaskugeln von einer Stärke von 2 bis 3 mm aufgesetzt ist.
Gemäß einem weiteren kennzeichnenden Merkmal der Vorrichtung gemäß der Erfindung weisen die verwendeten Mikro-Glaskugeln einen mittleren Durchmesser zwischen 20 und 50 µm auf, während die Komposit-Membran die das Kapillarrohr an seinem unteren Ende abschließt, eine Öffnung aus Maschen mit 5 bis 7 µm aufweist und den Durchgang einzelner, nicht agglutinierter roter Blutkörperchen erlaubt.
Gemäß einem weiteren kennzeichnenden Merkmal der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht die verwendete Komposit-Membran zum Absperren des Kapillarrohres an seinem unteren Ende aus den drei folgenden Schichten:
- eine erste, sehr hydrophile Schicht, die mit dem Mikrokugeln in Kontakt steht;
- eine mäßig hydrophobe Zwischenschicht;
- eine stark hydrophobe äußere Schicht, die in ihrem Zentrum von einer Öffnung von 0,1 mm Durchmesser für das Abführen des Flusses der beweglichen Phase versehen ist.
Die erste Schicht der Kompositmembran der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht aus einem sehr hydrophilen Material wie einem Polyamid 66, das eine Öffnung aus Maschen von 5 bis 7 µm aufweist. Diese erste Schicht bestimmt die Porosität der Kompositmembran.
Die Zwischenschicht der genannten Kompositmembran besteht aus einem mäßig hydrophoben faserigen Material wie einem Polypropylen, das das Abführen von Flüssigkeit während der Inkubationsphase verhindert und andererseits eine Abführfunktion der beweglichen Phase während des Abführens sicherstellt.
Die äußere Schicht der Kompositmembran der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht aus einem stark hydrophoben Material wie einem Tetrafluorethylenpolymer.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Vorrichtung ein Kapillarrohr von etwa 60 mm Höhe und mit einem Innendurchmesser von etwa 2 mm, hergestellt aus einem geeigneten Material wie Glas oder Kristallpolystyren.
In diesem Falle kann die Kompositmembran am Röhrchen mittels einer halbstarren Manschette befestigt sein, die auf das Röhrchen aufgeschoben ist, wie beispielsweise eine Manschette aus Polyvinylchlorid.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Vorrichtung eine Mikroplatte mit 96 Öffnungen, an ihrer Basis mit einer Kompositmembran ausgerüstet wie die oben beschriebene. In diesem Falle wird die Membran durch Thermoschweißen am Umfang einer jeden Öffnung befestigt.
Die beim Agglutinationstest notwendigen Reagenzien können zuvor auf die Oberfläche der Kugeln aufgebracht oder während der Reaktion den roten Blutkörperchen oder dem zu testenden Serum beigefügt werden; diese Reagenzien können irgendein Reagenz sein, das zu diesem Zwecke bei herkömmlichen Verfahren angewandt wird.
Sobald die Inkubationsphase erfolgt ist, wird der Inhalt des Röhrchens an seinem unteren Teil der Einwirkung eines Mittels unterworfen, das es erlaubt, die bewegliche Phase zu verschieben; das genannte Mittel kann entweder aus einem Absorptionsmittel bestehen, umfassend ein Cellulosematerial mit hohem Wasserretentionsvermögen, eingesetzt in Kontakt mit dem Filter, oder aus einer Einsenkung, erzeugt in einer Kammer, die mit dem Filter in Kontakt gebracht wird. Dieses letztgenannte Mittel wird vorzugsweise dann eingesetzt, wenn die Technik automatisiert ist.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung erlaubt es, das Resultat der Oberfläche der Kugeln abzulesen; eine geringe Dicke der Kugeln reicht aus, um die freien roten Blutkörperchen von den gebundenen roten Blutkörperchen abzutrennen. Ein Ablesen von unterhalb der Einheit der Öffnung einer Mikroplatte wird somit ermöglicht, wobei eine gute Sensibilität beibehalten wird.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung hat den Vorteil, daß sie vollkommen autonom ist und keinerlei Zubehör wie eine Zentrifuge notwendig macht, so daß sie leicht außerhalb des Labors eingesetzt werden kann. Sie weist ferner den Vorteil eines weiten Anwendungsfeldes auf und kann sowohl bei der Serologie (Hämmaglutination) als auch für die Blutgruppenbestimmung oder für außergewöhnliche Agglutinationsrecherchen verwendet werden. Sie kann außerdem eingesetzt werden zum Durchführen aller bekannter Agglutinationstechniken, und sie kann leicht automatisiert werden, insbesondere in jenem Falle, in dem sie mit Mikroplatten mit 96 Öffnungen verwendet wird. Zu diesen Vorteilen kommen jene, die der Stabilität des Produktbildes eigen sind; die Reaktionen bleiben während mehrerer Stunden sichtbar.
Das Verfahren gemäß der Erfindung erlaubt es außerdem, die kritischen und langen Phasen zu vermeiden, die das Waschen und Zentrifugieren mit sich bringen, wobei eine große Sensibilität beibehalten wird.
Andererseits ist das Röhrchen oder die Röhrchen, die verwendet werden, offen; das Verfahren gemäß der Erfindung erlaubt es, zwei bekannte Techniken zusammenzuführen, indem die beiden entsprechenden Reagenzien vereinigt werden, die sukzessive eingeführt werden: Auf diese Weise läßt sich eine gemischte Technik durchführen, beispielsweise indem man Polybren und ein menschliches Antigbulin einsetzt.
Schließlich erlaubt die Verwendung von Glas-Mikrokugeln das Herrichten der Vorrichtung zum Gebrauch, beispielsweise in Form von Mikroplatten mit 96 Öffnungen, deren jede eine Lage der genannten Mikrokugeln umschließt, was bei Mikrokugeln aus Polymer bekannt ist, die sich beim Trocknen zusammenziehen.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung wiedergegeben und haben keine beschränkende Wirkung.

BEISPIEL 1:

Durchführung mit einer einsatzbereiten Mikropatte
Es wird eine Mikroplatte mit 96 Öffnungen gemäß der Erfindung angewandt, indem der Boden mit Hilfe einer Kompositmembran abgesperrt wird, befestigt durch Thermoschweißen am Umfang einer jeden Öffnung, umfassend die drei folgenden Schichten:
- Polyamid 66 mit einer Porosität von 5 µm
- Polyproplylen
- Tetrafluorethylenpolymer (PTFE);
die letztgenannte Schicht ist im Zentrum einer jeden Öffnung von einer Öffnung von etwa 0,1 mm durchdrungen.
In jede Öffnung werden 200 µl eines Volumengemisches aus Wasser und Glaskugeln von einem Durchmesser von 37 bis 50 µm plaziert.
Nach dem Ansaugen des Wassers durch die Öffnungen der Membran wird im Ofen bei 37º C eine Stunde lang getrocknet.
Auf diese Weise erhält man eine verwendungsbereite Platte, die sich ohne zeitliche Begrenzung bei Umgebungstemperatur aufbewahren läßt.

BEISPIEL 2:

Gruppierung ABO und Rhesus Standard
In den benachbarten Öffnungen einer Mikroplatte, hergestellt gemäß Beispiel 1, lassen sich die Gruppierung ABO und Rhesus Standard gemäß den Techniken nach Beth-Vincent und Simonin gleichzeitig anwenden.

1. Technik Beth-Vincent (Antigenrecherche vom Typus A und/oder B).

Es werden aufeinander eingeführt:
- 50 µl zu testender roter Blutkörperchen, mit 5 % in eine 0,25 25 %ige Bromelinlösung eingeführt
- 50 µl verdünnten Testserums Anti A oder Anti B oder Anti AB.
Während 5 Minuten läßt man bei 40 C inkubieren, sodann wird unter einem Unterdruck von 10 cm Hg angesaugt, und mit 500 µl des Detergenz "BRIJ 56" von 0,075 % gespült.
Das Ablesen des Ergebnisses erfolgt mühelos an der Oberfläche der Glaskugeln.

2. Technik Simonin (Recherche von Antikörpern vom Typus A und/oder B)

Es werden aufeinanderfolgend zugeführt:
- 50 µl der zu testenden roten Blutkörperchen, mit 5 % in eine 0,25 %ige Bromelinlösung eingeführt
- 100 µl des zu testenden Serums.
Man läßt während 5 Minuten bei 40 C inkubieren, sodann wird bei einem Unterdruck von 10 cm Hg angesaugt, und mit 250 µl 0,075 %igen "BRIJ 56" gespült.
Das Ablesen des Ergebnisses erfolgt ohne Schwierigkeiten an der Oberfläche der Glaskugeln.
3. Bestimmung des Rhesus Standard (Antigen D-Recherche)
- Es werden aufeinanderfolgend eingeführt:
- 50 µl der zu testenden roten Blutkörperchen bei 5 % in einer 0,075 %igen Lösung von "BRIJ S6"
- 100 µl des zu testenden, verdünnten Anti D-Serums.
Man läßt gern 5 Minuten bei 40 C inkubieren, sodann wird unter einem Unterdruck von 10 cm Hg angesaugt, und mit 50 µl 0,075 %igen "BRIJ 56" gespült.
Das Ablesen des Ergebnisses vollzieht sich ohne Schwierigkeiten an der Oberfläche der Glaskugeln.
Ablesen des Ergebnisses für alle angewandten Techniken:
- positives Ergebnis: die agglutinierten roten Blutkörperchen bilden einen roten Teppich an der Oberfläche der Glaskugeln
- negatives Ergebnis: an der Oberfläche der Glaskugeln sind keine roten Blutkörperchen sichtbar.

BEISPIEL 3

Am Boden einer gemäß Beispiel 1 präparierten Mikroplatte werden aufeinanderfolgend aufgebracht:
- zu testende rote Blutkörperchen bei 3 % - 1 Vol (50 µl)
- zu testendes Serum - 1 Vol (50 µl)
- Polybren bei 1 % - 1 Vol (50 µl)
Man läßt während 10 Minuten bi Umgebungstemperatur inkubieren, sodann saugt man bei einem Unterdruck von 10 cm Hg an.
Man erhält cellulare uniforme Teppiche an allen Öffnungen, an welchen man 10 µl polyvalenten Antiglobulins hinzufügt, sodann füllt man die Gesamtheit der Öffnungen mit einer Waschlösung (hypertonisches Citrat) auf, dem man bei 1 % TW20 zugibt (U/U).
Nach dem völligen Auslaufen der Waschlösung nimmt man die Ablesung vor, indem man den oberen Teil der Glaskugelschicht betrachtet.

Claims

1. Vorrichtung zur Trennung und Bestimmung der Erythrozyt-Agglutinate beim Aggutinationstest in einem Schritt, dadurch gekennzeichnet, daß diese wenigstens ein Kapillarrohr aufweist, das an seinem unteren Ende offen ist, und das versehen ist mit einem Filter, bestehend aus einer zusammengesetzten Membran, überlagert von einer Schicht aus Mikrokugeln von einem mittleren Durchmesser zwischen 20 und 50 µm, wobei die zusammengesetzte Membran die drei folgenden,

aufeinanderfolgenden Lagen umfaßt:

eine erste Lage, die sehr hydrophil ist, mit einer Porosität von 5 bis 7 µ, im Kontakt mit den Mikrokugeln aus Glas,

eine zweite Zwischenage, die mäßig hydrophob ist,

eine dritte, äußere, stark hydrophobe Lage, die in ihrem Zentrum von einer Öffnung von etwa 0,1 mm Durchmesser durchbohrt ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht aus Mikrokugeln aus Glas eine Stärke von 2 bis 3 mm hat.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Lage der zusammengesetzten Membran aus sehr hydrophylem Polyamid (66) besteht.

4. Vorrichtung nach einem der vorausgegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Lage der zusammengesetzten Membran aus einem faserigen Material wie Polypropylen besteht.

5. Vorrichtung nach einem der vorausgegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Lage der zusammengesetzten Membran aus einem Tetrafluoroethylenpolymer (PTFE) besteht.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß diese ein Rohr von etwa 60 mm Höhe und ungefähr 2 mm lnnendurchmesser aufweist, an dessen unterem Ende die zusammengesetzte Membran durch geeignete Mittel befestigt ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran um den unteren Teil des Rohres mittels einer halbstarren Manschette aus Polyvinylchlorid befestigt ist.

10

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine Mikroplatte mit 96 Bohrungen aufweist, deren unteres Ende durch die zusammengesetzte Membran abgesperrt ist, fixiert durch Thermoschweißung am Umfang einer jeden Bohrung.