Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen monoklonalen
Antikörper, der spezifisch mit Hamster-Immunoglobulinen
reaktiv ist, ein diesen monoklonalen Antikörper bildendes
Hybridom und einen Immunoassay unter Verwendung dieses
monoklonalen Antikörpers
Stand der Technik
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Untersuchungen über das Immunsystem und den Mechanismus der
Entwicklung von immunologisch bedingten Erkrankungen werden
vorwiegend unter Verwendung von Mäuse-Immunozyten und unter
Verwendung von Antikörpern gegen verschiedene
Oberflächenantigene auf den Zellen durchgeführt. Immunozyten
haben verschiedene Antigene auf ihren Oberflächen. Diese
Oberflächenantigene variieren je nach Art, Funktion und
Differenzierungsgrad der Immunozyten. Demzufolge ist es durch
Nachweis der Anwesenheit von speziellen Oberflächenantigenen
auf den Zellen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern
gegen diese einzelnen Oberflächenantigene einfacher geworden,
die Immunozyten zu typisieren. Dies stellt einen wesentlichen
Beitrag für die immunologische Grundlagenforschung dar.
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Bisher werden die meisten Antikörper gegen
Oberflächenantigene von Mäuse-Immunozyten durch Immunisieren
einer Ratte mit Mäuse-Immunozyten als Antigen erhalten.
Kürzlich wurde ein neues Verfahren, bei dern ein Hamster
immunisiert wurde, zur Entwicklung von Antikörpern gegen
Oberflächenantigene von Mäuse-Immunozyten untersucht.
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Für die Untersuchung von Oberflächenantigenen von Mäuse-
Immunozyten unter Verwendung von Antikörpern hierfür wird
bisher ein Immunoassay durchgeführt, bei dem die Antikörper
mit einem Fluorochrom, wie FITC (Fluorescein-isothiocyanat)
und PE (Phycoerythrin), einem Enzym, wie HRPO (Meerrettich-
Peroxidase) und AP (alkalische Phosphatase), oder einem
Radioisotop, wie ¹²&sup5;I, ¹&sup4;C und ³H, markiert werden. Die mit
den Oberflächenantigenen markierten Antikörper werden durch
die geeignete Markierung der Antikörper nachgewiesen
("Menekigaku Jikken Nyuumon", VIII, Labelled Antibody; Gakkai
Shuppan Center, 1981).
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Ein Immunoassay, der sich eines primären Antikörpers gegen
ein Antigen und eines zweiten Antikörpers, d. h. eines anti-
Ig-Antikörpers, der unter Verwendung des primären Antikörpers
als Antigen hergestellt worden ist, bedient, wird auch
herkömmlicherweise gemäß dem Stand der Technik durchgeführt.
J. Immunol., Bd. 145, Nr. 1 (1990), S. 1-7 berichtet über die
Bildung von Hamster-Maus-Hybridomen, die monoklonale
Antikörper sezernieren, die spezifisch mit dem
Lipopolysaccharid-Rezeptor reaktiv sind. Demgemäß werden
Hamster mit gereinigtem 80 kDa Lipopolysaccharid-Protein, das
an Makrophagen und Lymphozyten exprimiert wird, immunisiert.
Hamster-Splenozyten aus so immunisierten Tieren wurden gemäß
standardmäßigen Verfahren zur Fusion mit Myelomzellen unter
Bildung von monoklonale Antikörper sezernierenden Hybridomen
verwendet.
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Nature, Bd. 256 (1975), S. 495-497, Journal of Immunological
Methods, Bd. 130, Nr. 1 (1990), S. 25-31 und Hybridoma,
Bd. 1, Nr. 3 (1982), S. 257-273 beziehen sich auf Antikörper
sezernierende Zellkulturen, auf Verfahren zur Herstellung von
monoklonalen Antikörpern aus Heterohybridom-Zellinien und auf
spezifische monoklonale Antikörper für Ratten-Immunoglobulin-
Unterklassen. Die beiden Literaturstellen J. Immunol., Bd.
145 (1990), S. 1-7 und Journal of Immunological Methods, Bd.
130, Nr. 1 (1990), S. 25-31 beschreiben polyklonale anti-
Hamster-IgG-Antiseren oder -Antikörper.
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Wie vorstehend beschrieben, wurden die meisten der bisher
gegen Oberflächenantigene von Mäuse-Immunozyten gebildeten
Antikörper von der Ratte abgeleitet. Eine Schwierigkeit
besteht jedoch darin, daß es sich bei Ratten und Mäusen um
eng miteinander verwandte Spezies handelt. Ein bestimmtes
Antigen von Mäuse-Immunozyten weist eine signifikant hohe
Homologie zu einem entsprechenden Antigen von Ratten-
Immunozyten auf. Somit besteht die Möglichkeit, daß bei
Immunisierung einer Ratte mit einem derartigen Antigen von
Mäuse-Immunozyten es nicht zur Bildung von Antikörpern kommt.
Aus diesem Grund wurden in letzter Zeit Hamster, eine Spezies
mit geringerer Verwandtschaft zur Maus, zur Herstellung von
Antikörpern gegen Mäuse-Antigene eingesetzt. Wird jedoch der
Hamster-Antikörper als primärer Antikörper eingesetzt, so
gibt es bisher keinen geeigneten sekundären Antikörper. Wurde
somit der Hamster-Antikörper anstelle eines Ratten-
Antikörpers verwendet, so war kein monoklonaler anti-Hamster-
Immunoglobulin-Antikörper verfügbar, der gegenüber sämtlichen
Hamster-Immunoglobulinen reaktiv war, und es stand nur ein
Antiserum (polyklonaler Antikörper) zur Verfügung, der durch
Immunisieren eines Kaninchens oder einer Ziege mit einem
Hamster-Immunoglobulin erhalten worden war. Das Antiserum
wies eine Kreuzreaktivität nicht nur mit Hamster-
Immunoglobulinen, sondern auch mit Ratten- und Mäuse-
Immunoglobulinen und Mäuse-Immunozyten auf. Ferner besteht
eine Schwierigkeit darin, daß man nicht dazu in der Lage ist,
in wirksamer Weise ein Hamster-Immunoglobulin zum Nachweis
eines Oberflächenantigens von Mäuse-Immunozyten herzustellen.
Demgemäß ist es von großer Bedeutung, einen monoklonalen
Antikörper, der mit sämtlichen Hamster-Immunoglobulinen
reaktiv ist, zu erhalten und ein Verfahren zur
großtechnischen Bildung dieses monoklonalen Antikörpers zu
entwickeln, wobei aber bisher ein derartiger monoklonaler
Antikörper nicht mit Erfolg erhalten werden konnte.
Kurze Beschreibung der Erfindung
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Erfindungsgemäß soll somit ein monoklonaler Antikörper gegen
Hamster-Immunoglobuline der vorstehend beschriebenen Art
bereitgestellt werden. Eine wichtige Aufgabe der Erfindung
ist ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur
großtechnischen Bildung dieses monoklonalen Antikörpers und
die Bereitstellung eines Immunoassays unter Verwendung dieses
monoklonalen Antikörpers.
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Das für die Herstellung dieses Antikörpers verwendete
Hybridom wurde beim Fermentation Research Institute Agency of
Industrial Science and Technology unter der
Hinterlegungsnumer FERM BP-3649 hinterlegt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
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Fig. 1 zeigt die Reaktivität des vorliegenden monoklonalen
Antikörpers gegen Hamster-Immunoglobuline und gegen Mäuse-
Immunoglobulin. Die Reaktivität wurde durch ELISA-Technik
geprüft.
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Fig. 2 zeigt die Reaktivität des vorliegenden monoklonalen
Antikörpers gegen BALB/c-Mäuse-Milzzellen. Die Reaktivität
wurde durch FACScan unter Verwendung von mit Biotin
markiertem monoklonalem Antikörper und FITC-Avidin geprüft.
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Fig. 3 zeigt eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese des
durch das Hybridom RHIg-87 gebildeten Antikörpers.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen mit dem Ziel
zur Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen
Hamster-Immunoglobuline mit den vorstehend beschriebenen
Eigenschaften angestellt und dabei festgestellt, daß es
vorteilhaft ist, ein Hybridom zu verwenden, d. h. fusionierte
Zellen aus Antikörper bildenden Zellen eines mit einem
Hamster-Antikörper immunisierten Nagetiers und Myelomzellen
eines Nagetiers. Die Erfindung wurde auf der Grundlage dieser
Befunde fertiggestellt.
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Der monoklonale Antikörper und das diesen monoklonale
Antikörper bildende Hybridom der Erfindung lassen sich auf
folgende Weise herstellen:
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a) Immunisieren eines Nagetiers mit einem Hamster-
Immunoglobulin als Antigen;
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b) Fusionieren der Antikörper bildenden Zellen aus dem
immunisierten Nagetier mit Myelomzellen eines Nagetiers;
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c) Auswählen eines Hybridoms, das einen monoklonalen
Antikörper bildet, der gegenüber sämtlichen in Stufe a)
verwendeten Hamster-Immunoglobulinen und anderen Hamster-
Immunoglobulinen reaktiv ist; und
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d) Züchten des in Stufe c) ausgewählten Hybridoms unter
geeigneten Bedingungen und Gewinnen des monoklonalen
Antikörpers.
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Die Immunisierung eines Nagetiers gemäß Stufe a) kann
durchgeführt werden, indem man als Antigen ein Hamster-
Immunoglobulin, wie einen monoklonalen Antikörper gegen
Mäuse-CD2-Molekül, Mäuse-CD3-Molekül, Mäuse-TCRαβ-Molekül
oder Mäuse-TCRγδ-Molekül, dem Tier verabreicht und ferner das
Tier in geeigneten Zeitabständen mit dem gleichen Antigen
behandelt. Ein bevorzugtes Hamster-Immunoglobulin ist ein
monoklonaler Hamster-Antikörper der gegen Mäuse-CD2-Molekül
reaktiv ist. Zu den zu immunisierenden Säugetieren gehören
Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und dergl. Vorzugsweise werden
Ratten, insbesondere die F344-Ratte (Nihon Charles River)
verwendet. Typischerweise wird das Antigen mit komplettem
Freund-Adjuvans vermischt und dem Tier injiziert.
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Die Zellfusion gemäß Stufe b) kann nach einem herkömmlichen
Verfahren unter Verwendung von Antikörper bildenden Zellen
des in Stufe a) immunisierten Nagetiers und von Myelomzellen
des Nagetiers durchgeführt werden. Zu den Antikörper
bildenden Zellen gehören Milzzellen, Lymphknotenzellen und
periphere Lymphozyten. Vorzugsweise werden Milzzellen oder
Lymphknotenzellen verwendet. Zu den Myelomzellen des
Nagetiers gehören Ratten-Y3-, Mäuse-P3-X63-Ag8.653-, P3-X63-
Ag8-Ul-, NS-1-, SP2/0-Ag14- und PA1-Zellen. Vorzugsweise
werden als Myelomzellen die gegen 8-Azaguanin resistente
Mäuse-Zellinie P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) verwendet.
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Die Zellfusion kann unter Verwendung von Polyethylenglykol
und Elektroporationsverfahren durchgeführt werden.
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Die Auswahl der Hybridome in der Stufe c) kann beispielsweise
durch ELISA-Technik durchgeführt werden. Dabei werden die
Hamster-Immunoglobline in eine Testplatte pipettiert und
immobilisiert. Anschließend wird der Überstand des
konditionierten Hybridom-Mediums auf die Platte pipettiert
und zur Umsetzung mit den immobilisierten Hamster-
Immunoglobulinen gebracht. Sodann wird ein anti-Ig-Antikörper
(mit Biotin markiert), der gegen das Immunoglobulin aus dem
bei der Immunisierung gemäß Stufe a) verwendeten Tier
gebildet worden ist, zugesetzt und eine Bindung mit ihm
herbeigeführt. Anschließend bindet man ein Peroxidase-Enzym
und setzt o-Phenylendiamin und Hydroperoxid zu. Durch die
Farbbildungsreaktion läßt sich feststellen, ob der durch ein
spezielles Hybridom erzeugte Antikörper mit den Hamster-
Immunoglobulinen reagiert.
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Auf diese Weise kann man die Reaktivität des gebildeten
monoklonalen Antikörpers gegenüber verschiedenen Hamster-
Immunoglobulinen bestimmen und die Hybridome auswählen, die
den gewünschten Antikörper bilden.
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Die Gewinnung des monoklonalen Antikörpers in der Stufe d)
kann nach einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden,
beispielsweise indem man die in der Stufe c) ausgewählten
Hybridome in die Peritonealhöhle einer Maus injiziert und
anschließend die Aszitesflüssigkeit der Maus gewinnt.
Alternativ kann der monoklonale Antikörper aus einem
konditionierten Medium von gezüchteten Hybridom-Klonen unter
Verwendung einer im Großmaßstab arbeitenden
Züchtungsvorrichtung gewonnen werden. Der gewonnene
Antikörper kann nach einem herkömmlichen Reinigungsverfahren
gereinigt werden, z. B. durch Ammoniumsulfatfällung,
Molekularsiebchromatographie, Ionenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie oder dergl.
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Da die auf die vorstehende Weise erhaltenen erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper spezifisch mit Hamster-
Immunoglobulinen reagieren, können sie vorteilhafterweise
beim Immunoassay eingesetzt werden. Insbesondere kann der
durch das erfindungsgemäße Hybridom RHIg-87 gebildete
erfindungsgemäße Antikörper, der im nachstehenden Beispiel
näher beschrieben wird, in vorteilhafter Weise bei einem
Immunoassay zum Nachweis von Oberflächenantigenen von Mäuse-
Immunozyten verwendet werden, da dieser Antikörper in
spezifischer Weise mit Hamster-Immunoglobulinen reagiert und
keine Kreuzreaktion mit Mäuse-Immunozyten und Mäuse-
Immunoglobulinen eingeht. Bei einem ersten Test wird der
erfindungsgemäße monoklonale Antikörper mit einem
Fluorochrom, Enzym oder Radioisotop markiert und als ein
sekundärer Antikörper für einen primären Antikörper oder ein
Antiserum, die von einem Hamster stammen, verwendet. Bei
einem alternativen Test unter Verwendung des
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers wird dieser
monoklonale Antikörper an Biotin gebunden und als sekundärer
Antikörper verwendet. Daran wird ein Konjugat, das durch
Bindung einer der vorstehenden Markierungssubstanzen und
Avidin oder Streptoavidin hergestellt worden ist, zugesetzt
und mit Biotin umgesetzt, um einen einfachen Nachweis von
Oberflächenantigenen von Immunozyten durchzuführen. Dieses
Verfahren ist besonders vorteilhaft und zweckmäßig, da der an
Biotin gebundene monoklonale Antikörper auf andere
Immunoassay-Systeme durch Auswahl eines geeigneten Konjugats
einer markierenden Substanz und Avidin oder Streptoavidin
anwendbar ist.
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Der vorstehende Immunoassay kann nach aus dem Stand der
Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Zu den
markierenden Substanzen gehören Fluorochrome, wie
Fluoresceinisothiocyanat, Phycoerythrin und
Tetrarhodaminisothiocyanat, Enzyme, wie Meerrettich-Peroxidase, alkalische
Phosphatase, Glucose-oxidase, β-D-Galactosidase,
Acetylcholin-esterase, Lactat-dehydrogenase, Glucoamylase
oder Telocynase, und Radioisotope, wie ¹²&sup5;I, ¹&sup4;C, ³H, ³²P,
³&sup5;S, &sup4;&sup5;Ca, &sup5;¹Cr oder ¹³¹I.
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Wie vorstehend erwähnt, ermöglicht es der erfindungsgemäße
monoklonale Antikörper, den Aufwand für die Bindung der
markierenden Substanz an verschiedene Hamster-Antikörper
gegen verschiedene Oberflächenantigene zu vermeiden, und
gewährleistet ferner die Durchführung von empfindlicheren und
stabileren Immunoassays.
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Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel näher
erläutert, das jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen ist.
Beispiel
A. Immunisierung von Tieren
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Hamster-Immunoglobulin (100 µg), das aus dem konditionierten
Medium eines Hybridoms, das einen mit Mäuse-CD2-Molekül
reaktiven Hamster-Antikörper bildet, wurde mit komplettem
Freund-Adjuvans (1:1) vermischt und emulgiert. Die Emulsion
wurde in die Pfote von F344-Ratten (Nihon Charles River)
injiziert. Sechs Tage und neun Tage nach der Injektion
erhielten die Tiere eine Auffrischungsimpfung durch Injektion
von Hamster-Immunoglobulin (100 µg) in die Pfote.
B. Zellfusion
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Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde eine der
vorstehenden Ratten getötet und einer Lymphknotenentfernung
unterzogen. Die aus den Leistenbereichen beider Pfoten
entfernten Lymphknoten wurden zerkleinert, durch ein Sieb
filtriert und in RPMI1640-Medium suspendiert. Man erhielt
Lymphknotenzellen (1 × 10&sup8; Zellen). Die Lymphknotenzellen und
die gegen 8-Azaguanin resistente Zellinie (Zellinie mit einem
Defekt an Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase) P3-
X63-Ag8-U1 (P3U1) [Current Topics in Microbiology and
Immunology, Bd. 81 (1978), S. 1-7] (2 × 10&sup7; Zellen) wurden
vermischt (etwa 5:1) und zentrifugiert (1500 U/min, 5 min).
Der erhaltene Niederschlag wurde mit 50% Polyethylenglykol
4000 (Merck, Co., Ltd.)/RPMI1640-Lösung (3 ml) versetzt,
wobei 1 Minute in einem Wasserbad bei 37ºC gerührt wurde. Die
Lösung wurde mit RPMI1640-Lösung (15 ml) unter 6-minütigem
Rühren versetzt, um die Zellfusion herbeizuführen. Nach der
Zellfusion wurde eine große Menge RPMI1640 zugegeben. Der
Überstand wurde durch Zentrifugation (1500 U/min, 5 min)
entfernt. Anschließend wurden die fusionierten Zellen in
einer Konzentration von 1 × 10&sup6; Zellen/ml in HAT-Medium [10%
FCS (fötales Rinderserum) - RPMI1640-Medium, supplementiert
mit Hypoxanthin (100 µm), Aminopterin (0,4 µm) und Thymidin
(10 µm)] suspendiert.
C. Selektion von Hybridomen
C-1. Züchtung von Hybridomen
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Die gemäß vorstehender Stufe B hergestellte Zellsuspension
wurde in 200 µl-Aliquotanteilen auf 5 Platten mit 96
Vertiefungen ausgestrichen und bei 37ºC unter 5% CO&sub2; in einem
CO&sub2;-Inkubator gezüchtet. Sieben Tage später bildeten nur die
Hybridome Kolonien und vermehrten sich.
C-2. Nachweis von Antikörpern
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Nach Bestätigung einer ausreichenden Vermehrung der Hybridome
wurde der Antikörper-Nachweis im Überstand durch
Enzymimmunoassay (ELISA) gemäß den vorstehenden Angaben
durchgeführt. Der monoklonale Hamster-anti-Maus-CD2-
Antikörper, der bei der Immunisierung verwendet worden war,
wurde mit PBS auf 10 µg/ml verdünnt, in 50 µl-Aliquotanteilen
auf eine Testplatte (Dianatec Immulon 2) ausgestrichen, und
das Antigen wurde immobilisiert (4ºC, über Nacht).
Anschließend wurde die Antigenlösung entfernt und durch
Zugabe einer Blockierungslösung blockiert (Blockace; Dai
Nippon Seiyaku Co., Ltd.) (Raumtemperatur/2 Stunden). Nach
Entfernung der Blockierungslösung wurde der Überstand der
Hybridomkultur (50 µl) auf die Platte pipettiert und 1 Stunde
bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Platte wurde 4 mal mit PBS
mit einem Gehalt an 0,05% TweenR 20 gewaschen. Sodann wurde
die Platte mit 50 µl der verdünnten Lösung (1:100) von anti-
Ratten-Ig-Antikörper (Bector Co., Ltd.), markiert mit Biotin,
versetzt und zur Bindung mit dern auf der Platte
immobilisierten Antigen gebracht (Raumtemperatur/2 Stunden).
Sodann wurde die Platte erneut 4 mal mit 0,05% TweenR 20-PBS
gewaschen. Sodann führte man die Bindung mit einem Enzym
(Peroxidase) auf der Platte unter Verwendung von Bectastein
ABC Kit Elete (Bector Co., Ltd.) durch (Raumtemperatur/30
Minuten). Nach erneutem 4-maligem Waschen der Platte mit
0,05% TweenR 20-PBS wurden 100 µl Phosphat-citrat-
Pufferlösung (pH-Wert 5,0) mit einem Gehalt an 0,4 mg/ml o-
Phenylendiamin und 0,012% Wasserstoffperoxid auf die Platte
gegeben. Der Antikörper wurde aufgrund der Farbentwicklung
nachgewiesen. Auf diese Weise wurden die Vertiefungen
ausgewählt, in denen ein Hybridom einen mit monoklonalem
Hamster-anti-Maus-CD2 -Antikörper reaktiven Antikörper bildet.
C-3. Klonierung von Hybridomen
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Hybridome in den gemäß der vorstehenden Stufe C-2
ausgewählten Vertiefungen wurden durch das
Grenzverdünnungsverfahren geklont. Die Kultur in den
Vertiefungen wurde mit 10% FCS-RPMI1640-Medium auf 0,5
Zellen/Vertiefung verdünnt. 200 µl Aliquotanteile wurden auf
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen pipettiert. Die
Züchtung wurde bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; durchgeführt.
Nachdem die Kolonien auf eine entsprechende Größe gewachsen
waren, wurde der Enzymimmunoassay von Stufe C-2 wiederholt,
um festzustellen, ob der Antikörper gegen den vorstehenden
monoklonalen Hamster-anti-Maus-CD2-Antikörper gebildet worden
war oder nicht. Das Hybridom in der Vertiefung, die eine
starke Reaktion mit dem monoklonalen Hamster-anti-Maus-CD2-
Antikörper zeigte, wurde selektiert und erneut durch das
Grenzverdünnungsverfahren geklont.
C-4. Reaktivität gegenüber verschiedenen monoklonalen
Hamster-Antikörpern
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Die Reaktivitäten der durch die vorstehend unter C-3
erhaltenen Hybridome gebildeten Antikörper mit verschiedenen
monoklonalen Hamster-Antikörpern wurden durch den
Enzymimmunoassay gemäß C-2 geprüft. Die Reaktivitäten der
erhaltenen Antikörper mit sieben monoklonalen Hamster-
Antikörpern wurden geprüft, wobei es sich um monoklonale
Antikörper gegen Mäuse-CD3 (145-2C11), monoklonale Antikörper
gegen Mäuse-γδT-Zellrezeptor (GL3), monoklonale Antikörper
gegen Mäuse-γβT-Zellrezeptor (H57) und monoklonale Antikörper
gegen Mäuse-CD2-Moleküle (HM2-17, -30, -31, -1-3) handelte.
Dabei wurde festgestellt, daß ein Hybridom erhalten wurde,
das einen Antikörper bildet, der gegenüber sämtlichen
geprüften monoklonalen Hamster-Antikörpern reaktiv war (Fig.
1). Der Hybridomklon erhielt die Bezeichnung RHIg-87. Dieser
Klon wurde beim Fermentation Research Institute Agency of
Industrial Science and Technology unter der
Hinterlegungsnummer FERM P-11865 (Hinterlegungstag 26.
November 1990) hinterlegt. Eine Umwandlung in eine
Hinterlegung nach dem Vertrag von Budapest wurde unter der
Nummer FERM BP-3649 vorgenommen (Tag der Umwandlung: 8.
November 1991).
C-5. Reaktivität von Mäuse-Immunoglobulinen
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Die Reaktivität des Antikörpers, der von dem in der
vorstehenden Stufe C-4 erhaltenen Hybridom gebildet worden
war, mit verschiedenen Mäuse-Immunoglobulinen wurde unter
Verwendung des vorstehend unter C-2 beschriebenen
Enzymimmunoassays geprüft. Die Reaktivität mit drei der
Antikörper, bei denen es sich um monoklonale Mäuse-Antikörper
gegen monoklonalen Ratten-Antikörper (7C4), monoklonalen
Mäuse-Antikörper gegen Ratten-ICAM-1 Molekül (IA-29) und
Immunoglobulin in Mäuseserum handelte, wurde geprüft (Fig.
1). Die Ergebnisse zeigten, daß der in der vorstehenden Stufe
C-4 erhaltene Antikörper mit keinem dieser drei Antikörper
reagierte.
C-6. Reaktivität gegen Mäuse-Immunozyten
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Die Reaktivität des Antikörpers, der von dem in der
vorstehenden Stufe C-4 erhaltenen Hybridom gebildet worden
war, mit Mäuse-Immunozyten wurde gemäß nachstehenden Angaben
durch FACS geprüft. Milzzellen wurden aus BALB/c-Mäusen
hergestellt, mit dem vorstehenden, mit FITC markierten
Antikörper C-3 umgesetzt und der Fluoreszenzbestimmung durch
FACScan (Becton Dickinson Co., Ltd.) unterzogen. Die
Ergebnisse zeigten, daß der erhaltene Antikörper nicht mit
Mäuse-Milzzellen reagierte (Fig. 2).
D. Herstellung und Reinigung von großen Antikörpermengen
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Der Hybridomklon RHIg-87 wurde nach starker Vermehrung in 10%
FCS-RPMI1640-Medium intraperitoneal nackten Mäusen injiziert
(1 × 10&sup7; Zellen/Maus). Nach Wachsen der Zellen in Mäuse-
Peritonealhöhlen und Bildung von großen Mengen an Aszites-
Flüssigkeit (etwa 10 cm³) wurde die Aszites-Flüssigkeit aus
den Mäuse-Peritonealhöhlen gewonnen, wodurch man große
Antikörpermengen erhielt. Der Antikörper wurde durch Zugabe
an gleichen Mengen gesättigter Ammoniumsulfatlösung (100%
Ammoniumsulfat) zur gewonnenen Aszites-Flüssigkeit
ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde in einer
geringen Menge an PBS (etwa 5 cm³) gelöst und sodann unter
Verwendung von Mab trap GR (Pharmacia Co., Ltd.) gereinigt.
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Der Isotyp des erhaltenen Antikörpers wurde durch einen
Enzymimmunoassay bestimmt, wobei der monoklonale anti-
Hamster-Globulin-Antikörper im Überstand der Hybridomkultur
mit den anti-Ratten-Ig-Antikörpern (anti-IgG&sub1;, IgG2a, IgG2b,
IgG2c, IgM) aus einem Isotypen-Typisierungskit (Zimett Co.,
Ltd.) umgesetzt wurden. Die Ergebnisse zeigten, daß der
erfindungsgemäße Antikörper zum Isotyp IgG2b gehört.
E. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des Antikörpers
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Eine 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde unter
Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Antikörpers (5 µg)
durchgeführt. Proteine wurden mit Coomassie Brilliant Blue
gefärbt, und der erhaltene Antikörper wurde analysiert. Die
Ergebnisse zeigten, daß es sich bei RHIg-87-Antikörper um IgG
mit einer H-Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000
und einer L-Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 25 000
handelte (Fig. 3).
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Wie vorstehend erläutert, eignet sich der erfindungsgemäße
monoklonale Antikörper in einem Immunoassay, da er spezifisch
mit Hamster-Immunoglobulin reagiert. Insbesondere eignet sich
der erfindungsgemäß durch Hybridom RHIg-87 gebildete
Antikörper zum Nachweis von Oberflächenantigenen von Mäuse-
Immunozyten, da er keine Kreuzreaktion mit Mäuse-Immunozyten
oder -Immunoglobulin eingeht. Die Verwendung dieses
monoklonalen Antikörpers als zweiter Antikörper liefert einen
zweckmäßigen Immunoassay, der nicht die Bindung einer
markierenden Substanz an verschiedene vorn Hamster abgeleitete
primäre Antikörper, die mit Oberflächenantigenen von Mäuse-
Immunozyten reaktiv sind, erfordert und der in stabiler Weise
eine hohe Nachweisempfindlichkeit ergibt. Demgemäß stellt die
Erfindung ein wertvolles Mittel für zahlreiche experimentelle
Systeme unter Verwendung der Maus dar.