DE69117761T2

DE69117761T2 - Konfokales abbildungssystem für die mikroskopie

Info

Publication number: DE69117761T2
Application number: DE69117761T
Authority: DE
Inventors: William Amos; James Fordham; John White
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1990-07-28
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2011-07-27
Also published as: EP0541625B1; US5561554A; EP0541625A1; US5452125A; WO1992002838A1; GB9016632D0; CA2088267A1; JPH05509178A; ATE135116T1; DE69117761D1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein konfokales Bilddarstellungssystem für die Mikroskopie und insbesondere auf ein solches System zur Verwendung mit einem optischen Mikroskop und das eine Schlitz-Abtastung verwendet.

Stand der Technik

Das Prinzip der konfokalen Bilddarstellung wurde zuerst von Minsky (siehe US-Patent Nr. 3 013 467) beschrieben. Konfokale Bilddarstellungssysteme mit einem sich bewegenden Schlitz sind von Baer (US-Patent Nr. 3 547 512) und Lichtman (siehe Lichtman, J.W., Sunderland, W.J., und Wilkinson, R.S. (1989) in The New Biologist 1, 75-82) beschrieben worden. Formen eines konfokalen Mikroskops, bei dem ein schlitz- oder strichförmiges Lichtmuster über der Probe hin und her geführt und ein Bild dieses durch Reflexion oder Emission von der Probe gebildeten Musters auf eine ortsfeste schlitzförmige Öffnung fällt, sind beschrieben worden. Diese Anwendung eines ortsfesten Schlitzes ist ein Merkmal der von Koester (Koester, C.J. (1980) Appl. Optics 19, 1749-1757), Burns et al. (Burns, D.H., Hatangadi, R.B. und Spelman, F.A. (1990) Scanning. 12, 156-160) beschriebenen Systeme und der Konstruktion von Brakenhoff und Visscher (Brakenhoff, G.J. & Visscher, K. (1990) Trans. Roy. microsc. Soc. 1, 247-250). Ein reflektierendes, selbstkollimierendes System mit keinen primären Abbildungsfehlern wurde von Offner (siehe A. Offner, Optical Engineering (1975), 14, 131) beschrieben.

Vorgeschichte der Erfindung

Konfokale Bilddarstellungssysteme haben sich in der optischen Mikroskopie als ein wirkungsvolles Mittel zum Ausschalten einer außerhalb des Brennpunktes liegenden Interferenz erwiesen. Bei diesen Systemen wird nur eine sehr kleine Fläche in der Objektebene zu jedem Zeitpunkt beleuchtet. Die Beleuchtung in der Objektebene kann in der Form eines einzelnen Punktes, einer Anordnung von Punkten, einer einzigen Linie oder einer Anordnung von Linien bestehen. Eine Maske mit der gleichen geometrischen Form wie das beleuchtete Muster wird in einer mit der Objektebene konjugierten Ebene eingeschlossen, so daß nur Signale aus der unmittelbaren Nachbarschaft der beleuchteten Gebiete durch die Maske in das Betrachtungssystem eingelassen werden. Auf diese Weise werden von den beleuchteten Gebieten ausgehende interferierende Signale beseitigt. Ein vollständiges Bild wird durch Abtasten des Beleuchtungsmusters in einer solchen Weise aufgebaut, daß die Gesamtheit der Fläche der Objektebene abgedeckt wird, während die Maske mit der Beleuchtung in Deckung gehalten wird.
Die Verwendung eines Schlitzes oder einer Schlitzanordnung statt eines einzelnen Punktes als Beleuchtungsmuster hat Vorteile. Zum Beispiel läßt sich ein vollständiges Bild schneller bilden, und die an einem einzigen Punkt in der Probe erforderliche augenblickliche Beleuchtungsstärke läßt sich herabsetzen. Ein Anstieg in der Geschwindigkeit des Ausbildens der Bilder (Bildgeschwindigkeit) ist von besonderem Wert, da sie unter unmittelbarer visueller Beobachtung mit dem Eindruck einer stetigen Bilddarstellung angewendet werden kann. Bei Verwendung eines Schlitzes ist eine Veränderung von dessen Breite in der Maske gegenüber der der beleuchteten schlitzförmigen Fläche erwünscht. Bei manchem Stand der Technik, wie zum Beispiel dem von Lichtmann, ist dies nicht möglich, da ein und dieselbe Maske zum Ausbilden sowohl der Beleuchtung als auch der Detektionsfläche dient. Der in dieser Hinsicht am nahesten kommende Stand der Technik ist der von Koester, Burns et al. und von Brakenhoff und Visscher, bei denen das System so aufgebaut ist, daß die Detektionsmaske ortsfest ist, so daß sich die Maske während des Betriebes des Mikroskopsystems leicht in einer kontinuierlichen Weise einstellen läßt. Das System von Koester sieht die Verwendung der vollen Öffnung der Objektivlinse des Mikroskops nicht vor und muß daher bei der Bildgüte einen Kompromiß eingehen. Bei seinem Betrieb hängt das System von Baer von einer chromatischen Dispersion ab und eignet sich daher nicht für das Hauptanwendungsgebiet konfokaler Mikroskope, das heißt der Prüfung der Fluoreszenz bei Proben.
Der naheste Stand der Technik (das heißt der von Burns et al. und Visscher und Brakenhoff) erfordert zum Übertragen des Bildes in dem Gerät Linsen. Dies bietet beträchtliche Schwierigkeiten, da das chromatische Verhalten der Linsen außerhalb eines begrenzten Wellenlängenbereiches, für den sie berechnet sind, schwach ist. Um das Gerät annehmbar klein zu gestalten, müssen die Übertragungslinsen eine hohe numerische Öffnung aufweisen. Dies erschwert ihre Berechnung und verteuert ihre Herstellung.

Die Erfindung

Gemäß der Erfindung ist ein konfokales Bilddarstellungssystem zur Verwendung mit einem optischen Mikroskop vorgesehen, umfassend Mittel zum Ausbilden eines schlitz- oder strichförmigen Beleuchtungsstrahles oder einer Anordnung solcher Strahlen, ein stahlzerteilendes Mittel, durch das das Licht des Beleuchtungsstrahls auf ein optisches Abtastmittel gerichtet wird, wodurch der Beleuchtungsstrahl oder die Beleuchtungsstrahlen zum Abtasten ausgerichtet wird oder werden, und zum Lenken des abtastenden Lichtstrahls in die Objektivlinse eines Mikroskops zum Abtasten einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Abtastmittel aus einem vollständig reflektierenden optischen System besteht, um sowohl zum Bündeln des Beleuchtungsstrahles oder der Beleuchtungsstrahlen als auch zum Abtasten der Probe durch den Strahl oder die Strahlen beizutragen, und daß das reflektierende System ein ringförmiges Offner-Feldobjektiv aufweist, das dadurch abgeändert ist, daß sein Innenspiegel rotierend schwingt.
Vorzugsweise bewirkt das gleiche reflektierende optische System, daß der von der Probe emittierte oder reflektierte Strahl angehalten (das heißt in einen ortsfesten Zustand verbracht) und über das strahlzerteilende Mittel auf eine ortsfeste konfokale Maske, wie zum Beispiel einen Schlitz mit veränderlicher Breite oder eine Anordnung solcher Schlitze, gebündelt wird.
Das von der Maske begrenzte ortsfeste Schlitzbild kann dann mit einem zweiten, vollständig reflektierenden optischen system erneut abgetastet und mit einem Okular oder auf der lichtempfindlichen Oberfläche einer Videokamera als ein zweidimensionales Bild gebündelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsforrn besteht das zuerst erwähnte reflektierende System und gleichermaßen das zweite reflektierende System aus einem ringförmigen Offner-Feldobjektiv, das so abgeändert ist, daß das Innenelement des Offner- Systems synchron mit dem Innenspiegel des ersten ringförmigen Offner-Feldobjektivs schwingt. Diese Abänderung wandelt das bekannte Offner-Relay in ein einzigartiges reflektierendes Abtastsystem um.
Die Verwendung von reflektierenden Elementen zum Bündeln an geeigneten Punkten in dem System ist auch eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik, da diese Elemente unaufwendig herzustellen sind und über einem sehr breiten Wellenlängenbereich gut arbeiten können.

Beschreibung der Ausführungsform

Das konfokale Bilddarstellungssystem gemäß der vorliegenden Erfindung wird in der folgenden Beschreibung unter Bezug auf die einzige Figur der Zeichnungen, in der ein bevorzugtes System schematisch dargestellt wird, erläutert.
Das System liegt zwischen dem Objektiv (OBJ) und dem Okular (EYE) eines herkömmlichen Mikroskops. Es enthält zwei abgeänderte ringförmige Offner-Feldobjektive (A1, B1 und A2, B2).
Ein ringförmiges Offner-Feldobjektiv besteht aus zwei Spiegeln mit einem Verhältnis ihrer Kurvenradien von 1:2. Der Spiegel mit dem kleineren Halbmesser ist konvex, der andere konkav. Wie von Offner beschrieben wird, arbeitet dieses System bei Reflexion von Licht in der in der Zeichnung gezeigten Weise wie ein 1:1 optisches Relais. Das aus den Spiegeln A1 und B1 bestehende Objektiv bündelt den Schlitz C in der als gestrichelte Linie gezeigten Ebene im Okular (EYE). Das andere aus den Spiegeln A2 und B2 bestehende Offner-Objektiv bildet konjugierte Brennpunkte in der Ebene OP und auf der Mittelebene MP am Schlitz C und in der Linse L1. Im vorliegenden Zusammenhang liegt der Wert der Offner-Objektive in der Einfachheit der Herstellung, totalem Achromatismus und dem Fehlen von primären Abbildungsfehlern.
Die Beleuchtung erfolgt über einen Strahlzerteiler (BS). Das Licht könnte über einen beleuchteten Schlitz eingeleitet werden. In der bevorzugten Ausführungsforrn wird ein Schlitz jedoch nicht benutzt. Statt dessen wird ein paralleler Laserstrahl durch eine zylinderformige Linse (CL) und dann durch eine herkömmliche sphärische Linse (L2) geleitet unter Ausbildung einer gebündelten Laserlichtlinie in der Ebene OP, die mit der Objektebene konjugiert ist. Der Beleuchtungsstrahl wird proximal zum Mikroskop durch das Offner-Objektiv (B2, A2) geleitet.
Gemäß der Erfindung werden die Offner-Objektive so abgeändert, daß die konvexen Spiegel B1 und B2 beide um eine zu der Ebene des Schaubildes senkrecht verlaufende Achse schwingen, wodurch der Strahl zu einer Abtastung veranlaßt wird. Die beiden in Fig. 1 gezeigten konvexen Spiegel liegen in den Öffnungsebenen im Bezug zum Mikroskop statt in den Bildebenen und sind damit in ihrer Funktion als Abtastelemente ideal placiert.
Aus B2 tritt das Licht in einem Abtastzustand aus und tritt in die Objektivlinse (OBJ) über eine Kupplungslinse L1 ein, die die Öffnung des Objektivs in eine mit der Ebene von B2 konjugierte Ebene zurückführt.
Das von dem beleuchteten Objekt ausgehende Signal durchquert dann diesen Pfad in umgekehrter Richtung und wird von dem Spiegel B2 abgetastet. Dann durchläuft es den Strahlzerteiler BS zu dem eine Maske bildenden Schlitz C, in dem es gebündelt wird und den Schlitz durchläuft. Interferierende Signale, die aus den von der beleuchteten Linie abgelegenen Gebieten ausgehen, werden vom Schlitz abgegeben. In seiner Breite ist dieser einstellbar und ermöglicht das Ausüben von genauen konfokalen Bedingungen (enger Schlitz) oder die Ausbildung eines helleren Bildes mit einer weniger ausgeprägten konfokalen Natur (breiter Schlitz). Der schwingende Spiegel B1 in dem zweiten Offner-Objektiv tastet das Signal erneut ab, erzeugt in der Mittelebene (MP) erneut ein ortsfestes zweidimensionales Bild, das mit dem Okular unmittelbar beobachtet werden oder in einer Kamera aufgezeichnet werden kann.
Die Bewegung der konvexen Spiegel B1 und B2 kann jede das gesamte Feld abtastende Form annehmen, aber Abtastungen mit gleichförmiger Winkelgeschwindigkeit in beiden Richtungen werden vorgezogen, da dies die Totzeit verringert und zu einem Bild mit gleichförmiger Helligkeit führt. In der bevorzugten Ausführungsform arbeitet der Spiegel B2 synchron mit, aber in Gegenphase zu dem oszillierenden Spiegel B1.
Der Strahlzerteiler BS könnte entweder eine ein beliebiges Verhältnis zwischen reflektierten und übertragenen Lichtstärken erzeugende einfache Vorrichtung sein oder alternativ ein dichromatischer Reflektor (dichroitisch), wie er in der Fluoreszenzmikroskopie üblich ist.

Claims

1. Ein konfokales Bilddarstellungssystem zur Verwendung mit einem optischen Mikroskop, umfassend Mittel (CL, L2) zum Ausbilden eines schlitz- oder strichförmigen Beleuchtungsstrahles oder einer Anordnung solcher Strahlen, ein stahlzerteilendes Mittel (BS), durch das das Licht des Beleuchtungsstrahls auf ein optisches Abtastmittel gerichtet wird, wodurch der Beleuchtungsstrahl oder die Beleuchtungsstrahlen zum Abtasten ausgerichtet wird oder werden, und zum Lenken des abtastenden Lichtstrahls in die Objektivlinse (OBJ) eines Mikroskops zum Abtasten einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Abtastmittel aus einem vollständig reflektierenden optischen System besteht, um sowohl zum Bündeln des Beleuchtungsstrahles oder der Beleuchtungsstrahlen als auch zum Abtasten der Probe durch den Strahl oder die Strahlen beizutragen, und daß das reflektierende System ein ringförmiges Offner-Feldobjektiv (A2, B2) aufweist, das dadurch abgeändert ist, daß sein Innenspiegel (B2) rotierend schwingt.

2. Ein System wie in Anspruch 1 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das gleiche reflektierende optische System (A2, B2) bewirkt, daß der von der Probe emittierte oder reflektierte Strahl angehalten und durch das strahlzerteilende Mittel auf eine ortsfeste konfokale Maske (C) gebündelt wird

3. Ein System wie in Anspruch 2 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die Maske (C) ein Schlitz mit veränderlicher Breite ist.

4. Ein System wie in Anspruch 2 oder Anspruch 3 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Maske (C) begrenzte ortsfeste Bild mit einem zweiten vollständig reflektierenden optischen System erneut abgetastet und zum Betrachten oder Aufzeichnen auf einen Brennpunkt gebracht wird.

5. Ein System wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei das zweite reflektierende System ein ringförmiges Offner-Feldobjektiv (A1, B1) ist, das dadurch abgeändert ist, daß sein Innenspiegel (B1) synchron mit dem Innenspiegel (B2) des ersten ringförmigen Offner-Feldobjektivs (A2) rotierend schwingt.

6. Ein System nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen Innenspiegel (B2, B1) der beiden reflektierenden Systeme synchron, aber in Antiphase schwingen.

7. Ein System wie in Anspruch 6 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen Innenspiegel (B2, B1) mit gleichförmiger Winkelgeschwindigkeit in alternierendem Drehsinne schwingen.

8. Ein System wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Ausbilden des schlitz- oder strichförmigen Strahls eine zylinderförmige Linse (CL) enthält, die den Strahl durch Beugung formt.

9. Ein System wie in Anspruch 8 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Ausbilden des schlitz- oder strichförmigen Strahls einen Laser zum Erzeugen des Beleuchtungsstrahls enthält.

10. Ein System wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die volle Öffnung der Objektivlinse (OBJ) verwendet wird.