DE69011583T2

DE69011583T2 - Biologische Herstellung von Cyclohexadiendiolen.

Info

Publication number: DE69011583T2
Application number: DE69011583T
Authority: DE
Inventors: Roger A Mader; Kestutis J Tautvydas
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2010-03-10
Also published as: CA2010773A1; US5284759A; EP0400779B1; DE69011583D1; JPH03117492A; EP0400779A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von meta-substituierten Phenolen unter Anwendung von Prozessen der Biotransformation und umfaßt neuartige Cyclohexadiendiole.

2. Stand der Technik

Mit Acetylen terminierte Kunstharz (AT-Kunstharz) Systeme bestehen aus Molekülen mit endständigen Acetylengruppen, die während einer Reaktion des Warmhärtens stark vernetzte Strukturen bilden. Das Grundgerüst der Kunstharzmoleküle kann auf verschiedene chemische Strukturen und variable Kettenlänge zugeschnitten werden. AT-Kunstharze wurden mit Grundgerüststrukturen hergestellt, die Langzeitanwendungen im Bereich von 121 º bis 288 ºC (250 º bis 550 º F) und Kurzzeitanwendungen von 316 º bis 343 ºC (600 º bis 650 ºF) gewährten. Einige der Grundgerüstmoleküle, die mit guten Ergebnissen eingesetzt wurden, umfassen Isopropylidendiphenol, Diphenylsulfon und Chinoxaline. AT-Kunstharze werden von F. E. Arnold in "Current and Future Chemistry of Aerospace Organic Matrix Resins" ("Moderne und zukünftige Chemie von Weltraum-Kunstharzen als organische Matrix"), Proceedings of the American Society for Composites, (August 1987), beschrieben, auf dessen Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. AT-Kunstharze werden auch von P. M. Hergerrother, American Chem. Soc., Prep. Polymer Division, 25(1) :97 (1984) beschrieben. Die herausragenden Eigenschaften von AT-Kunstharzen sind ihre außerordentlich geringe Feuchtigkeitsaufnahme (weniger als 0,06 %), das Fehlen flüchtiger Stoffe während des Härtens und hervorragende mechanische Stabilität bei hohen Temperaturen.
Ein chemisches Schlüssel-Zwischenprodukt, das zur Herstellung von AT-Kunstharzen benötigt wird, ist m-Hydroxyphenylacetylen (m-HPA). Leider wurde wegen der derzeit hohen Kosten für die chemische Synthese dieses Zwischenprodukts die Weiterentwicklung der AT-Kunstharze verzögert. Dieses Zwischenprodukt war bis zu der vorliegenden Erfindung ledig lich über chemische Prozesse zugänglich. Auf dem Markt umfassen die heute auf chemischem Weg synthetisch dargestellten AT-Kunstharze ein AT-Imid, MC-600, und ein AT- Isoimid, IP-600, die von der National Starch and Chemical Co. hergestellt werden.
Die Anwendung von Reaktionen der Biotransformation zur synthetischen Darstellung ist nicht neu. Fermentationen wurden insbesondere seit Jahrhunderten zur Herstellung von Getränken angewendet. Im Verlaufe der letzten 50 Jahre wurden Mikroorganismen kommerziell zur Herstellung von Verbindungen eingesetzt, wie beispielsweise Antibiotika, Vitamine und Aminosäuren. Weniger verbreitet war jedoch ihre Anwendung zur Herstellung technischer Sonderchemikalien. Erst in letzter Zeit war es möglich, daß Mikroben einen ökonomischen Weg zu bestimmten Verbindungen bieten konnten, deren Herstellung mit konventionellen chemischen Mitteln schwierig oder kostenaufwendig ist.
In etwa den letzten 20 Jahren ist eine Reihe van Veröffentlichungen erschienen, bei denen "Biotransformationen" oder biochemische Umsetzungsreaktionen beschrieben werden, die durch Mikroorganismen ausgeführt werden. Für die vorliegende Arbeit von Interesse sind Veröffentlichungen über die Bio-Oxidation von Kohlenwasserstoffen, insbesondere von Aromaten auf Erdölbasis. D. T. Gibson (in "Fate and Effects of Petroleum Hydrocarbons", Herausg., D. A. Wolf, Pergamon Press, New York, 1977) beschreibt die Oxidation von Benzol und ähnlichen aromatischen Substanzen mit Hilfe von Mikroorganismen. Von besonderem Interesse ist hier die Oxidation bestimmter aromatischer Moleküle zu cis-2,3-Dihydrodiol-Derivaten. Beispielsweise kann Toluol zu einem cis-2,3-Dihydrodiol oxidiert werden, und zwar als ein Zwischenprodukt in einer Reihe von Oxidationsprodukten unter Anwendung bestimmter Stämme der Species Pseudomonas putida. In dem nachfolgenden (Stoffwechsel)Ablauf ist E&sub1; ein Aren-2,3-Dioxygenase-Enzym, das ein substituiertes Benzol zu einem entsprechenden cis- Dihydrodiol umsetzt. Das zweite Enzym, E&sub2;, ist eine Dihydrodiol-Dehydrogenase, die ein Catechin bildet. Das nächste Enzym des Ablaufs, E&sub3;, ist eine Catechin- Dioxygenase, die den aromatischen Ring selbst öffnet und oxidiert, wodurch ein 2-Oxoacid gebildet wird. substituiertes Benzol cis-2,3-Dihydrodiol substituiertes Catechin 2-Hydroxy-6-keto-2,4-heptadiensäure
Gibson et al. haben die oxidative Zersetzung einer Reihe von aromatischen Molekülen mit Hilfe von Mikroorganismen geschrieben (siehe z.B. Biochemistry, 7(7):2653 (1968); idem 9(7):1626 (1970), J. Bacteriol. 119(3):930 (1974)). Gibson et al. beschreiben in Biochemistry, 7(11):3795 (1968), die Bildung von 4-Chlor- 2,3-dihydroxy-1-methylcyclohexa-4,6-dien mit Hilfe von P. putida von dem Substrat p-Chlortoluol und seine nachfolgende säurekatalysierte Dehydrierung zu 3-Chlor-6-methylphenol.
Weitere beispielhafte Veröffentlichungen umfassen T. Hudlicky et al., (J. Am. Chem. Soc., 110:4735 (1988)), worin Synthesen mit Hilfe mikrobieller Oxidationen beschrieben werden; H. L. Holland und B. Munoz (Can. Chem., 66:2299 (1988)), worin die Oxidation von Sulfiden zu Sulfonen mit Hilfe von Pilzen beschrieben wird, und R. Csuk und B. I. Glanzer (Z. Naturforsch. B., 43:1355 (1988)), worin die enzymatische Deacetylierung von Laevoglucosantriacetat zu deacetylierten Derivaten beschrieben wird.
In der Patentliteratur wird von G. S. Fonken (US-P-3 392 171 für The Upjohn Company) die Oxygenierungsaktivität von bestimmten Mikroorganismen veranschaulicht, indem die Oxidation einer großen Reihe von Bicyclohexyl-Verbindungen zu Hydroxy- oder Keto-Derivaten unter Verwendung einer Reihe von Mikroorganismen Phylum III, Subphylum 2, offenbart wird. S. Hagedorn (US-P-4 634 668 für Celanese Corporation) offenbart die Oxidation von p-Xylol zu p-Kresol durch ein mit Hilfe der Biotransformation unter Verwendung von Pseudomonas putida, Biotyp A-Stamm ATCC 39119 hergestelltes Dihydroxy-Zwischenprodukt, gefolgt von einer Säurebehandlung. In den US-P-4 673 646 und 4 666 841 offenbaren der gleiche Erfinder und Rechtsnachfolger die Umsetzung von Toluol oder substituierten Toluolen zu 2-Hydroxymuconsäure- Semialdehyd und seinen substituierten Derivaten und deren Umsetzung zu Picolinsäure und Pyridin-Produkten. P. C. Maxwell (US-P-4 731 328 für Celgene Corporation) offenbart die Oxidation von Substraten, wie beispielsweise Toluol und Catechin, zu Muconsäure, die weiter umgesetzt werden kann, um Adipinsäure zu liefern, die in der Kunststoff industrie verwendbar ist. Darin werden die Mikroorganismenbeschrieben, welche diese Biotransformation (ATCC Nr. 31916, Stamm der Pseudomonas putida, Biotyp A), sowie Kultur- und Nährsubstrate.
Die EP-A-0 268 331 offenbart die Darstellung von Catechinen, ausgehend von Benzolverbindungen über Cyclohexandiol-Zwischenprodukten unter Verwendung von Enzym- Präparaten aus Pseudomonas Dutida.
Ketale und Acetale können mit Hilfe der bekannten Verfahren dargestellt werden, siehe beispielsweise "Survey of Organic Syntheses", C. A. Buehler und D. E. Pearson, Bd. 1, (1970).
Ferner werden zur Verwendung in Sonnenschutzmitteln von Möller et al. in der DE-P-2526312 "cyclische Ketale" der allgemeinen Formel:
beschrieben, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und X festgelegt sind.

Zusammenfassung

Die Anmelder haben entdeckt, daß bestimmte vorgegebene substituierte aromatische Verbindungen, d.h. die Substrate der vorliegenden Erfindung, oxidativ mit mikrobiellen Mitteln umgesetzt werden können, um 1-substituierte cis-2,3- Dihydroxycyclohexa-4,6-dien (nachfolgend bezeichnet als "cis-2,3-Dihydrodiol")-Derivate zu ergeben. Diese cis- Dihydrodiole können chemisch dehydriert werden, um metasubstituierte Phenole zu ergeben, die wiederum zur Herstellung von m-HPA verwendet werden können, - einem Schlüssel-Zwischenprodukt, das zur Herstellung von AT- Kunstharzen benötigt wird.
Die Substrate der vorliegenden Erfindung sind vorgegebene substituierte aromatische Verbindungen, d.h. substituierte Benzole, die in einer solchen Weise substituiert sind, daß (1) mikrobielle Aren-2,3-Dioxygenase an den Stellungen 2 und 3 der Substitution ein cis-Dihydrodiol bilden, (2) chemische Dehydrierung des Diols unabhängig von der Anwesenheit anderer Ring-Substituenten in der 2-Stellung zu Dehydroxylierung führt (d.h. zur Bildung eines "meta- substituierten Phenols") und (3) chemische Umsetzung an der 1-Stellung zu einer Gruppe ermöglicht wird, die eine Ethinyl-Funktionalität enthält.
Die bevorzugten cis-Dihydrodiole der vorliegenden Erfindung liefern wesentlich größere Meta-Hydroxyinengen als das bisher beschriebene Gegenstück. Beispielsweise lieferte dieses von dem Substrat 2-Methyl-2-phenyl-1,3-dioxolan erhaltene cis-Dihydrodiol ausschließlich (d.h. mehr als 99 %) m-Hydroxyacetophenon anstelle des erwarteten o-Phenols. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Substraten 2-Methyl-2- phenyl-4-hydroxymethyl-1,3-dioxolan und 2-Phenyl-1,3-dioxolan erhalten. In den letzten beiden Fällen waren die Produkte nach Dehydrierung m-Hydroxyacetophenon bzw. m- Hydroxybenzaldehyd.
Stämme von Mikroorganismen, die ein Aren-2,3-Dioxygenase-Enzym tragen, sind in der vorliegenden Erfindung verwendbar. Vorzugsweise werden weitere oxidative Enzyme, wie beispielsweise das Catechin erzeugende Enzym (E&sub2; in dem vorgenannten Ablauf) der Mikroorganismen geblockt, d.h. genetisch oder biochemisch unfähig gemacht, das Dihydrodiol zu oxidieren, z.B. indem es zu Catechin umgesetzt wird. Vorzugsweise sollte der ausgewählt Stamm rasch wachsen und eine hohe Toleranz sowohl gegenüber dem Ausgangssubstrat als auch gegenüber dem erzeugten cis-2,3-Dihydrodiol haben. Ebenfalls angestrebt werden gute Ausbeuten und hohe Umsatzraten mit Hilfe des Stamms.
Bevorzugte Substrate ermöglichen das Wachstum des mikrobiellen Stammes in ihrer Gegenwart. Substrate der vorliegenden Erfindung führen zu einer Ausbeute von meta- substituiertem Phenol von mindestens 50 % (Gewichtsprozent bezogen auf die Gesamtmenge des gebildeten substituierten Phenols), was mindestens das zweifache der Ausbeute anderer bekannter Substrate ist. Siehe hierzu z.B. Gibson et al., Biochemistry, 12(8):1520 (1973). Vorzugsweise beträgt die Ausbeute des meta-substituierten Phenols mindestens 90 %. Besonders bevorzugt sind Substrate, die zu einer Ausbeute von im wesentlichen insgesamt meta-substituiertem Phenol führen (d.h. größer als 99 %). Der im Zusammenhang mit der Dehydroxylierung in der 2-Stellung verwendete Ausdruck "wesentlich" bezieht sich auf einen Umfang der Dehydroxylierung in dieser Stellung, welcher der voranstehend beschriebenen Ausbeute des meta-substituierten Phenols entspricht.
Die synthetische Darstellung von m-HPA kann auf dem Wege einer Kombination von Biotransformation und chemischer Synthese erzielt werden. In dem Schritt der Biotransformation wird ein Mikroorganismus zum Transformieren eines vorgegebenen aromatischen Substrats zu dem entsprechenden cis-2,3-Dihydrodiol verwendet, welches wiederum via- Dehydrierung zu dem meta-substituierten Derivat dehydroxyliert werden kann. Der meta-Substituent dieses Phenols ermöglicht die chemische Umsetzung an der meta-Stellung (d.h. an der Stellung des Substituenten) zu einer Gruppe, die eine Ethinyl-Funktionalität enthält. Somit ist die Fähigkeit, ein in der meta-Stellung mit einem geeigneten Substituenten substituiertes Phenol zu erhalten, für den Erfolg dieses Ablaufs entscheidend.
Die unter Verwendung mikrobieller Aren-2,3-Dioxygenasen verwendbaren Substrate für die Biotransformation haben die folgenden Formel:
darin ist Z wie nachfolgend festgelegt und ein Substituent, der (1) einer mikrobiellen Aren-2,3-Dioxygenase die Bildung cis-Dihydrodiols in den Stellungen 2 und 3 ermöglicht, (2) bei Dehydrierung des cis-2,3-Dihydrodiols das Auftreten einer wesentlichen Dehydroxylierung in der 2-Stellung ermöglicht, selbst wenn jedes R&sub1; Wasserstoff ist; und (3) die chemische Umsetzung in der 1-Stellung zu einer Gruppe ermöglicht, die eine Ethinyl-Funktionalität enthält, und worin jedes R&sub1; unabhängig eine Gruppe ist, die nicht die vorgenannte cis-Dihydrodiol-Bildung, die Dehydroxylierung in der 2-Stellung oder die vorstehend beschriebene Umsetzung der Z-Gruppe behindert.
Vorzugsweise ist jedes R&sub1; Wasserstoff.
worin sind Y: -CH&sub2;CH&sub2;-; -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-; OR-CH(CH&sub2;OH)CH&sub2;- und R&sub2; Wasserstoff oder CH&sub3; (entsprechend den vorstehend beschriebenen Eigenschaften von Z nichtstörende Gruppen).
Substrate der vorliegenden Erfindung können mit mikrobiellem Aren-2,3-Dioxygenase zur Erzeugung von cis-2,3- Dihydrodiolen der folgenden Formel biotransformiert werden:
darin sind Y, R&sub1;, R&sub2; und Z wie vorstehend beschrieben. Bei Dehydrierung liefern diese cis-2,3-Dihydrodiole meta- substituierte Phenole, die sodann chemisch zu m- Hydroxyphenylacetylen entsprechend dem folgenden allgemeinen Ablauf umgesetzt werden können.
Es wurden Versuche zur Anwendung biologischer Verfahren zur Erzeugung von meta-substituierten Phenolen durchgeführt, die chemisch kostenaufwendig synthetisch darzustellen sind und die leicht zu m-Hydroxyphenylacetylen umgesetzt werden können. Es ist bekannt, überwiegend aus der Arbeit von Gibson und Mitarbeitern (z.B. Gibson et al., Biochemistry 9:(7):1626(1970)), daß bestimmte Mikroben substituierte Benzole oxidieren, wobei der erste Angriff durch Dioxygenasen katalysiert wird.
Die erste Oxygenierung ist sowohl regio- als auch enantiospezifisch, um wie vorstehend ein cis-2,3-Dihydrodiol zu erzeugen. Ein Stamm der Pseudomonas putida, bezeichnet als Stamm F39/D, katalysiert die cis-Dihydroxylierung einer Vielzahl von substituierten Benzolen. Ferner wird dieser Stamm insofern als "blockiert" betrachtet, daß er das Diol nicht wesentlich weiter oxydiert. Eher wird das cis-2,3- Dihydrodiol im wesentlichen in das Wachstums-Nährsubstrat abgesondert und läßt sich leicht durch Extraktion mit Ethylacetat erhalten.
Die cis-Dihydrodiole gehen leicht eine Dehydrierung in Gegenwart von Säure ein, um Phenol(e) zu liefern.
Die meisten beschriebenen cis-2,3-Dihydrodiole rearomatisieren sich durch Verlust der Hydroxylgruppe in 3- Stellung. Da die Aufgabe darin bestand, meta-substituierte Phenole zu erhalten, wurden cis-Dihydrodiole gesucht, die durch Verlust des Hydroxyls in der zu dem Substituenten benachbarten Stellen dehydrieren. Weiterhin war es notwendig, Substituenten zu finden, welche die chemische Umsetzung zu einer Gruppe ermöglichen, die eine Ethinyl- Funktionalität enthält.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Es kann festgestellt werden, daß die meisten der cis-Dihydrodiole eine Dehydrierung eingehen, um hauptsächlich o-Phenole zu liefern. Bemerkenswerte Ausnahmen sind cis-Dihydrodiole, die durch die Biotransformation von 2-Phenyl-1,3-dioxolan, 2- Methyl-2-phenyl-1,3-dioxolan und 2-Methyl-2-phenyl-4- hydroxymethyl-1,3-dioxolan mit Hilfe von Pseudoinonas putida F39/D erzeugt wurden. Die Säurebehandlung dieser cis-2,3- Dihydrodiole führt zur Dehydroxylierung in 2-Stellung durch Dehydrierung, aber auch Hydrolyse des Dioxolan-Rings, um m- Hydroxyacetophenon oder m-Hydroxybenzaldehyd zu erzeugen. Nachfolgend werden die Substrate, cis-Dihydrodiole und meta- substituierten Phenole als Substrate IA, IIA, IIIA; cis-2,3- Dihydrodiole mit IB, IIB, IIIB bzw. meta-substituierte Phenole mit IC, IIC und IIIC bezeichnet. Tabelle 1 Substrat Biotransformations-Produkt cis-Dihydrodiol überwiegend erzeugte Phenole (%) (überwiegend) Tabelle 1 (Fortsetzung) Substrat Biotransformations-Produkt cis-Dihydrodiol überwiegend erzeugte Phenole (%) (überwiegend)
Wie in Tabelle 1 gezeigt, erzeugten die letzten drei Substrate bei Dehydrierung des entsprechenden cis-Dihydrodiols wesentliche Mengen eines meta-substituierten Phenols. Es ist bemerkenswert, daß das aus Acetophenon dargestellte cis-Dihydrodiol eine Dehydrierung eingeht, um überwiegend o- Hydroxyacetophenon zu liefern. Das cyclische Acetal 2- Phenyl-1,3-dioxolan (IA), das cyclische Ketal 2-Methyl-2- phenyl-1,3-dioxolan (IIA) und das wasserlöslichere Ketal 2- Methyl-2 phenyl-4-hydroxymethyl-1,3-dioxolan (IIIA) führten jeweils zu meta-substituierten Phenolen, die zur Darstellung von AT-Kunstharzen verwendbar sind.

Übersicht über Substrat-Chemikalien

Viele mikrobielle Stämme, wie beispielsweise viele der Bodenbakterien, die zur Gattung der Pseudomonas gehören, besitzen biochemische Abläufe, die es ihnen ermöglichen, aromatische Ringverbindungen auf Energie und Kohlenstoff zu metabolisieren. Eines der Zwischenprodukte dieses abbauenden Stoffwechselablaufs ist ein cis-2,3-Dihydrodiol Diese Dihydrodiole können zu Phenolen dehydriert werden und werden dann chemisch zu den Ethinphenolen umgesetzt. Um jedoch in-HPA zu erhalten, muß zunächst von einem Benzol-Derivat ausgegangen werden, dessen funktionelle Gruppe bei Dehydrierung eine Dehydroxylierung in der C-2-Stellung unterstützt und die chemische Umsetzung zu einer Gruppe ermöglicht, die eine Ethinylfunktionalität enthält.
Das durch Säuredehydrierung von Brombenzoldihydrodiol erzeugte überwiegende Phenol war eine Ortho-Isomer. Eine nachweisbare Menge (5 %) des m-Bromphenols wurde, wie in Tabelle 1 gezeigt, ebenfalls beobachtet.
Zwei signifikante Parameter jedes der getesteten Substrate waren Toxizität und Wasserlöslichkeit. Die kombinierten Wirkungen dieser Parameter beeinflussen die maximale Rate der Biotransformation durch die mikrobielle Kultur. Es wurden Verfahren entwickelt, die Einflüsse der Substratkonzentration auf die Rate der Biotransformation und des Zellwachstums zu untersuchen. Die Raten der Biotransformation waren offensichtlich unabhängig von der Wasserlöslichkeit der Substrate. Beispielsweise betragen die Löslichkeiten von Brombenzol, Acetophenon und 1-Phenyl-1,2- ethandiol in MSB-Puffer (bei 30 ºC) näherungsweise 400 mg/l, 2.000 mg/l bzw. 5.000 mg/l. Brombenzol, eines der am wenigsten löslichen, getesteten Substrate, wurde in sein Dihydrodiol mit Hilfe des Stammes F39/D mit einer mittleren Rate von etwa 20 mg/l/std umgesetzt Die Rate der Brombenzol-Umsetzung war sehr viel größer als die der Umsetzung von Acetophenon oder 1-Phenylethandiol, und zwar auch obgleich die letzteren Verbindungen wesentlich wasserlöslicher sind. Die Substrat-Toxizität wurde durch Untersuchung der Wachstumsrate des Stammes F39/D in Anwesenheit der Testverbindungen untersucht. Obgleich das Wachstum der Mikroben offensichtlich von 400 mg/l (d.h. eine Sättigungskonzentration) Brombenzol unbeeinflußt blieb, wurden sie von 1.000 mg/l (d.h. die Hälfte der Sättigungskonzentration) Acetophenon vollständig inhibiert.

Analytische Methoden

Die durch die Biotransformationsreaktionen erhaltenden Produkte wurden mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ("HPLC") unter Anwendung eines Flussigkeitschromatographen "Hewlett Packard HP1090" (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) analysiert, der mit einem HP3388A-Integratior- Terminal und einer Photodioden-Anordnung für Spektrale Analysen im UV- und sichtbaren Bereich ausgestattet war. Es wurde eine Umkehrphasensäule mit Octadecylsilan (Supelco, Inc., Bellefonte, PA) mit wäßrigen Methanol-Lösemittelmischungen für die HPLC-Analysen verwendet. Die chemischen HPLC-Standards hatten die höchste verfügbare Reinheitsstufe und wurden bei der Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) erhalten.
Dünnshichtchromatographie ("TLC") wurde unter Verwendung von Silicagel-Platten des Whatmann-Typs KF-5 (Whatman International Ltd., Maidstone, England) und unter Verwendung von Methyl-tert.-Butylether als Lösemittel durchgeführt. Die Verbindungen wurden auf den Chromatogrammen anhand ihrer Fähigkeit lokalisiert, den in dem Silicagel befindlichen Fluoreszensindikator zu löschen.
NMR-Spektren wurden mit Hilfe eines Varian XL-400-NMR- Spektrophotometers (Varian Associates, Palo Alto, CA) erhalten, das bei einer Frequenz von 400 MHz für H¹-Spektren und bei 101 MHz für C¹³-Spektren betrieben wurde. Die Proben für die NMR-Analyse wurden in CDCL&sub3; aufgelöst.

Mikroorganismen

In der vorliegende Erfindung verwendbare Mikroorganismen umfassen solche, die eine Aren-2,3-Dioxygenase besitzen, beispielsweise die bekannten Pseudomonas-Species, Alcaligenes-Species und Beijerinckia-Species Bevorzugte Mikroorganismen gewähren eine optimale Kombination solcher Eigenschaften, wie beispielsweise Substratspezifität, Substrat- und Produkttoleranz, Konversionsrate und Ausbeute. Gegenwärtig bevorzugt werden allgemein verfügbaren Stämme NCIB 11767, NCIB 11680 und F39/D der Pseudomonas putida. Besonders verwendbar sind genetisch alterierte, z.b. geblockte, Mutanten, wie beispielsweise F39/D, in denen die Catechin erzeugenden Enzyme fehlen oder inaktiv gemacht wurden.
Weitere geeignete Verfahren umfassen die Verwendung von isolierten Aren-2,3-Dioxygenase-Enzymen, z.B. entweder frei in Lösung oder auf einem geeigneten Träger nach den für den Fachmann bekannten Methoden immobilisiert.

Herstellung der Ausgangssubstrate

Cyclische Acetale und Ketale, die als Ausgangssubstrate verwendbar sind, können nach einer allgemeinen Prozedur erzeugt werden, die Erhitzen eines Aldehyds oder Ketons in Anwesenheit eines geeigneten Diols, wie beispielsweise Ethylenglycol, und einen sauren Katalysator umfaßt. Das bei dieser Reaktion gebildete Wasser wird durch azeotrope Destillation entfernt. Vor der Verwendung wurden alle Verbindungen auf Reinheit getestet und mit Hilfe der Gaschromatographie ein Reinheit von besser als 99 % festgestellt. Einzelheiten über die Herstellung von cyclischen Ketalen finden sich in der westdeutschen A-Schrift 2526312 von Möller et al. vom 30. Dezember 1976.

Einführung von Mikroorganismen

Mikroorganismen, wie beispielsweise viele Bakterien, können zur Optimierung der Transformation des Substrats zu einem cis-Dihydrodiol induziert werden. Zum Induzieren der Zellen für die Synthetische Darstellung des Aren-2,3- Dioxygenase-Enzyms kann jede anerkannte Methode eingesetzt werden, wie beispielsweise ein Vielzahl von aromatischen Verbindungen verwendet werden kann.
Optimale Umsetzung durch P. Putida F39/D von aromatischen Substraten zu ihren entsprechenden cis- Dihydrodiolen wird durch Induzieren der Zellen zur synthetischen Darstellung des Enzyms, Aren-2,3-Dioxygenase, mit verschiedenen aromatischen Verbindungen erleichtert. Die bevorzugte induzierende Verbindung ist Toluol. Die Erzeugung induzierter Zellen kann beispielsweise auf den folgenden Wegen erzielt werden, von denen jeder Weg Mikroorganismen liefert, die eine Vielzahl aromatischer Substrate oxidieren können.
1. Es werden induzierte Zellen in 500 - ml- Schüttelflaschen-Kultur von P. putida F39/D durch Exponieren der Zellsuspension an Toluoldämpfen entsprechend der Beschreibung von Spain und Gibson (Appl. Environ. Microbiol., 54:1399 (1988)) hergestellt.
2. Wenn die Probengrößen kleiner sind als etwa 10 Liter, wird die folgende Prozedur bevorzugt. Es werden induzierte Zellen durch Exponieren von P. putida F39/D- Zellen auf der Oberfläche von mit Agar verfestigtem MSB- Medium entsprechend der Beschreibung von Gibson et al. (Biochemistry, 7:2653 (1968)) mit den folgenden Modifikationen aufgezogen:
1) das Agar-Medium ist in 100 mm x 15 mm-Einweg- Petri-Schalen aus Kunststoff (American Scientific Products, McGaw Park, IL) enthalten;
2) das Agar-Medium enthält geeignete Nährstoffe, wie beispielsweise 3 g/l Dinatriumsuccinat oder 4 g/l L-Arginin;
3) Die induzierende Verbindung ist Toluol anstelle von Ethylbenzol; und
4) die Zellen werden den induzierenden Verbindungen exponiert, indem die Petri-Schalen in eine Kammer gegeben werden, die mit Toluol gesättigte Luft enthält.
Die Zellen werden aus der Agar-Oberfläche mit sterilem MSB-Medium ausgewaschen und in der nachfolgenden Biotransformationsreaktion (Oxidation) verwendet. Diese Variation ist die bevorzugte Methode, da es keine Verzögerung beim Wachstum gibt, wenn die Zellen in das flüssige Medium überführt werden, welches die aromatischen Substrate enthält.

Biotransformation

Die Biotransformation umfaßt vorzugsweise den Zusatz des Ausgangssubstrats zu einer induzierten mikrobiellen Zellensuspension. Die Mikroorganismen läßt man sodann wachsen, so daß das Enzym, Aren-2,3-Dioxygenase, auf dem Substrat wirken kann. Die induzierten Mikroorganismen werden in der vorstehend beschriebenen Weise erzeugt. Eine Suspension der induzierten Zellen wird unverzüglich in ein geeignetes Kulturgefäß überführt, wie beispielsweise ein Multigen-F-2000-Fermentor (New Brunswick Scientific Co. Edison, NJ), der steriles, vorgewärmtes Kulturmedium enthält. Die Mikroorganismen werden routinemäßig bei 30 ºC in einem Standard-Medium einer Mineralbase ("MSB") aufgezogen, das von Stanier, et al., J. General Microbiol., 43:159 (1966), beschrieben wird. Das Medium wird mit geeigneten Nährstoffen ergänzt, wie beispielsweise L- Argininhydrochlorid (4 g/l) oder Dinatriumsuccinat (3 g/l). Die Anfangs-Zellendichte in dem Kulturgefäß beträgt näherungsweise 25 ... 50 g (Naßgewicht) Zellen pro Liter MSB- Medium. Das Substrat wird je nach seiner Löslichkeit zu einer Endkonzentration zwischen 0,4 und 10,0 g/l MSB-Medium zugesetzt.
Die Mikroorganismen werden in dem Kulturgefäß aufgezogen und können das aromatische Substrat für 6 bis 18 Stunden oxidieren. Die Zellen werden sodann aus dem Kulturmedium durch Zentrifugieren oder Filtration entfernt.

Extraktion von Dihydrodiolen

Die Produkte der Transformation, welche die cis-2,3- Dihydrodiole einschließen, können in jeder geeigneten Weise extrahiert werden, z.B. durch Ethylacetat-Extraktion aus der überstehenden Kultur entsprechend der Beschreibung von Gibson et al. (Biochemistry, 12:1520 (1973)), auf dessen Offenbarung hiermit Bezug genommen wird.

Chemische Umsetzung zu Acetylen

Die erzeugten cis-Dihydrodiole werden dehydriert und rearomatisiert, um in einer beliebigen geeigneten Weise meta-substituierte Phenole zu ergeben. Vorzugsweise wird die Dehydrierung mit Hilfe einer Säure- oder Base-katalysierten Reaktion ausgeführt.
Die resultierenden meta-substituierten Phenole können in jeder bekannten Weise zur Bildung von AT-Kunstharzen verwendet werden. Der Meta-Substituent kann nach bekannten Verfahren chemisch zu einer mit Ethinyl terminierten Gruppe umgesetzt werden. Geeignete Verfahren wurden beschrieben von: C. M. Wong und T. L. Ho, "One-step Synthesis of Acetylenes from Ketones" ("Einstufige Synthese von Acetylenen aus Ketonen"), Synthetic Communications, 4(1):25- 27 (1974); Tetrahedron Letters, 36:3769 (1972); J. Organic. Chein., 34(11):3502-3505 (1969) und Synthesis, S. 111 (1973), wobei auf jede der Offenbarungen hiermit Bezug genommen wird. Das so erzeugte m-Hydroxyphenylacetylen kann in bekannter Weise zur Herstellung von AT-Kunstharzen eingesetzt werden.

Beispiel 1

Das hierin genannte cis-2,3-Dihydrodiol IIB ist ein 2- (cis-2,3-Dihydroxycyclohexa-4,6-dienyl) -2-methyl-1,3 dioxolan, das aus dem Ketal 2-Methyl-2-phenyl-1,3-dioxolan (Substrat IIA) biotransformiert wurde. Es fördert die Dehydroxylierung in der 2-Stellung und liefert ohne weiteres das meta-substituierte Phenol (IIC), das wiederum chemisch umgesetzt werden kann zu einem m-Hydroxyphenylacetylen.
Das Substrat IIA wurde durch säurekatalysierte Ketalisierung von Acetophenon mit Ethylenglycol hergestellt. Der Säurekatalysator war p-Toluolsulfonsäure, wobei das Wasser azeotrop mit Toluol entfernt wurde. Substrat IIA wurde durch Umkristallisation in Hexan gereinigt.
Es wurden Pseudomonas Dutida F39/D (Gibson et al., Biochemistry 7(7) :2653 (1968), in einem 1-Liter-Kolben aufgezogen, der MSB-Medium enthielt, das mit 4 g/l L- Argininhydrochlorid enthielt. Der Kolben wurde bei 30 ºC unter Schütteln auf einer Schüttelapparatur mit 250 U/min inkubiert.
Eine 0,2 1-Kultur von P. putida F39/D mit einer Zellendichte von 1,1 ... 1,2 Absorptionseinheiten bei 600 nm (näherungsweise 10 g Naßgewicht Zellen) wurde an Toluoldämpfen exponiert, wie vorstehend unter Verfahren 1 für induzierende Zellen beschrieben wurde. Nach Aufnahme der induzierten Zellen wurden sie sofort in frischem Wachstumsnährsubstrat erneut suspendiert und wie beschrieben in einen Schüttelkolben überführt. Das Volumen des vorgewärmten (30 ºC) Mediums betrug 0,2 Liter. Dem Kolben wurde Substrat IIA (0,4 g aufgelöst in 2 ml Dimethylformamid) zugesetzt. Das System ließ man unter anhaltendem Mischen durch Schütteln in der vorstehend beschriebenen Weise in dem Kolben für 6 Stunden reagieren.
Die Zellen wurden aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren bei 7.600 x g entfernt. Der pH-Wert der überstehenden Kultur wurde mit 6n Natriumhydroxid auf 8,4 eingestellt. Die nicht-dissoziierten organischen Stoffe wurden aus dem Kulturfluid mit zwei Teilmengen von 200 ml Ethylacetat entsprechend der Beschreibung von Gibson et al. (Biochemistry, 12:1520 (1973)) extrahiert. Nach dem Abdampfen des Lösemittels wurde das Produkt als ein klares Öl erhalten, das von der Ausgangssubstanz mit Hilfe von Silicagel-Chromatographie getrennt wurde.
Zum Abtrennen der Dihydrodiole von anderen Materialien in den Ethylacetat-Extrakten wurde eine 3 cm x 8 cm-Säule- Silicagel (60 ... 200 Maschen, J. T. Baker, Philipsburg, NJ) in einem Glasrohr verwendet. Der in Hexan:Ethylacetat (Volumenverhältnis 1:1 ) aufgelöste Extrakt (3,0 ml) wurde sorgfältig auf den Kopf des Silicagels pipettiert. Die Säule wurde sodann mit 5 Säulenvolumina (näherungsweise 200 ml) einer Mischung von Hexan:Ethylacetat (1:1) gewaschen. Sodann wurde das cis-Dihydrodiol (IIB) aus der Säule in 100%igem Ethylacetat eluiert. Es wurden 5 ml-Fraktionen von der Säule aufgenommen und die das Dihydrodiol enthaltenden Fraktionen mit Hilfe der TLC identifiziert.
Das mit Ethylacetat eluierte Produkt wurde anfangs mit Hilfe der Umkehrphasen-HPLC analysiert und auf der Grundlage seiner HPLC-Eluierungs-Charakteristik und anhand des UV- Absorptionsspektrums vorerst als ein Dihydrodiol identifiziert. Das Material wurde mit Hilfe der NMR-Spektroskopie weiter analysiert und festgestellt, daß es die vom Acetophenon und 2-Methyl-2-phenyl-1,3-dioxolan (Substrat IIA) abgeleiteten Dihydrodiole enthielt, die 20 % bzw. 80 % der aufbereiteten Produkte umfaßten.
Die extrahierten cis-Dihydrodiole, die wenig oder kein Wasser enthielten, wurden in CDCl&sub3; aufgelöst und auf 0,1n HCl durch Zusatz von konzentrierter (12n) wäßriger HCl eingestellt. Die Reaktion der Dehydrierung ließ man bei etwa 80 ºC für mindestens 30 Minuten oder bei etwa 23 ºC für 4 bis 24 Stunden ablaufen.
Dieses lieferte eine Mischung von Phenolen in den Anteilen von 20 % 2-Hydroxyacetophenon bzw. 80 % 3-Hydroxyacetophenon (meta-substituiertes Phenol IIC), die anhand der NMR-Spektroskopie identifiziert wurden. Wenn die Verbindung IIB bis zur Homogenität mit Hilfe der TLC gereinigt und in Chloroform mit HCl hydrolysiert wurde, war das ausschließliche Phenol m-Hydroxyacetophenon (IIC), das durch NMR identifiziert wurde.

Beispiel 2

Es wurde Substrat IA, 2-Phenyl-1,3-dioxolan, durch säurekatalysierte Acetalisierung von Benzaldehyd mit Ethylenglycol hergestellt. Der Säurekatalysator war Methansulfonsäure, wobei das Wasser in einem Azeotrop mit Cyclohexan entfernt wurde und das Produkt durch fraktionierte Destillation gereinigt wurde.
Das Substrat IA wurde mit Hilfe P. putida biotransformiert und die Produkte entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden analysiert. Das nach Säurehydrolyse des cis-Dihydrodiols erzeugte ausschließliche Phenol war m- Hydroxybenzaldehyd.

Beispiel 3

Es wurde Substrat IIIA, 2-Methyl-2-phenyl-4-hydroxymethyl-1,3-dioxolan, in ähnlicher Weise hergestellt wie das Substrat IIA mit der Ausnahme, daß anstelle von Ethylenglycol Glycerol verwendet wurde, wobei das Produkt durch fraktionierte Destillation gereinigt wurde.
Das Substrat IIIA wurde mit Hilfe von P. putida biotransformiert und die Produkte entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden analysiert. Das nach Säurehydrolyse des cis-Dihydrodiols erzeugte ausschließliche Phenol war m-Hydroxyacetophenon.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines cis-2,3-Dihydrodiols, das zu einem meta-substituierten Phenol umgesetzt werden kann, umfassend den Schritt des Biotransformierens eines Substrats mit einem Aren-2,3-Dioxygenase-Enzym, um ein cis-2,3-Dihydrodiol zu bilden, welches Substrat die Formel hat:

worin jedes R&sub1; unabhängig eine Gruppe ist, die die Bildung des cis-2,3-Dihydrodiols nicht stört, R&sub2; Wasserstoff oder Methyl ist und Y -CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- oder -CH(CH&sub2;OH)-CH&sub2;- ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Substrat 2-Methyl-2-phenyl-1,3-dioxolan, 2-Phenyl-1,3- dioxolan oder 2-Methyl-2-phenyl-4-hydroxymethyl-1,3-dioxolan ist.

3. Verfahren zur Herstellung eines meta-substituierten Phenols, umfassend die Schritte:

(a) Biotransformieren eines Substrats mit einem Aren- 2,3-Dioxygenase-Enzym zur Bildung eines cis-2,3- Dihydrodiols, welches Substrat die Formel hat:

worin jedes R&sub1; unabhängig eine Gruppe ist, die die Bildung des cis-2,3-Dihydrodiols nicht stört, R&sub2; Wasserstoff oder Methyl ist und Y -CH&sub2;CH&sub2;-, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;- oder -CH(CH&sub2;OH)-CH&sub2;- ist, sowie

(b) Dehydrieren des cis-2,3-Dihydrodiols in Gegenwart von Säure zur Bildung eines meta-substituierten Phenols in einer Ausbeute von 50 Gew.% der Gesamtmenge des erzeugten substituierten Phenols oder mehr.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die Ausbeute von meta-substituiertem Phenol 90 Gew.% oder mehr der Gesamtmenge des erzeugten substituierten Phenols beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Substrat 2-Phenyl-1,3-dioxolan, 2-Methyl-2-phenyl-1,3- dioxolan oder 2-Methyl-2-phenyl-4-hydroxymethyl-1,3-dioxolan ist.

6. Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-(cis-2,3-Dihydroxycyclohexa-4,6-dienyl)-2-methyl-1,3- dioxolan, 2-(cis-2,3-Dihydroxycyclohexa-4,6-dienyl)-1,3- dioxolan und 2-(cis-2,3-Dihydroxycyclohexa-4,6-dienyl)4- hydroxymethyl-2-methyl-1,3-dioxolan.