DE69000452T2 - COSMETIC PREPARATION CONTAINING ACTIVE INGREDIENTS, OBTAINED FROM CELL CULTURES, IN PARTICULAR FROM FIBROBLASTS OR KERATINOCYTES. - Google Patents
COSMETIC PREPARATION CONTAINING ACTIVE INGREDIENTS, OBTAINED FROM CELL CULTURES, IN PARTICULAR FROM FIBROBLASTS OR KERATINOCYTES.Info
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel, enthaltend Verbindungen, die aus einer Zellkultur erhältlich sind.The present invention relates to an agent containing compounds obtainable from a cell culture.
In der FR-A-2 585 567 wurde bereits ein zur kosmetischen Behandlung geeignetes Mittel beschrieben, bestehend aus einer Zellkultur in einem geeigneten Wachstumsmilieu. Die Zellen sind vorzugsweise Fibroplasten und Keratinocyten. Diese können menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, lebende oder tote Zellen sein.FR-A-2 585 567 has already described a product suitable for cosmetic treatment, consisting of a cell culture in a suitable growth medium. The cells are preferably fibroblasts and keratinocytes. These can be of human, animal or plant origin, living or dead cells.
Aus der EP-A-O 272 920 ist außerdem ein kosmetisches Mittel bekannt, welches ein Kulturmilieu enthält, das durch Abtrennen der kultivierten Zellen erhältlich ist.From EP-A-0 272 920 a cosmetic product is also known which contains a culture medium which is obtainable by separating the cultured cells.
Diese kosmetischen Mittel enthalten kultivierte Zellen zusammen mit ihrem Wachstumsmilieu oder lediglich das Wachstumsmilieu der Zellen und ermöglichen die Übertragung von zellulären Vektoren in einer wachstumsfördernden Umgebung auf die Haut und folglich die Stimulation der Wachstumsvorgänge der Haut, besitzen jedoch keinerlei Schutzfunktion für die Haut.These cosmetic products contain cultured cells together with their growth environment or only the growth environment of the cells and enable the transfer of cellular vectors to the skin in a growth-promoting environment and consequently the stimulation of the growth processes of the skin, but do not have any protective function for the skin.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein kosmetisches Mittel zum Schutz der Haut oder der Haare vor natürlichen Reizungen aller Art, wie ultravioletten Strahlungen, Temperaturschwankungen, Trockenheit der Luft und Verunreinigung.The present invention relates to a cosmetic product for protecting the skin or hair from natural irritations of all kinds, such as ultraviolet radiation, temperature fluctuations, dry air and pollution.
Erfindungsgemäß führt man in ein kosmetisches Mittel, das für den Schutz bestimmt ist, Schutzsubstanzen ein, welche durch kultivierte Zellen in vitro synthetisiert werden, die während der Kultur in vitro einer Reizung ausgesetzt waren.According to the invention, protective substances are introduced into a cosmetic product intended for protection, which are synthesized by cultured cells in vitro which have been subjected to irritation during the in vitro culture.
Es ist bekannt, daß bei allen Reizzuständen, welche beispielsweise die Haut betreffen, diese ihr biologisches Gleichgewicht bewahren muß. Sie synthetisiert dann Substanzen, welche zu ihrer Adaptation dienen, so daß sie ihre Schutzfunktion beibehalten kann. Häufig reichen diese Substanzen selbst nicht aus, um die Haut zu schützen und die Reizung führt häufig zu negativen Effekten, insbesondere während der Latenz zeit zwischen der Reizung und der Synthese der Schutzsubstanzen durch die Haut. Die gleichen Phänomene sind beim Haar zu beobachten. Die Auftragung eines erfindungsgemäßen kosmetischen Mittels ermöglicht der Haut und/oder dem Haar im Augenblick der in vivo-Reizung den Kontakt mit Schutzsubstanzen, welche in vitro von einer Zellkultur erzeugt wurden. Es wurde festgestellt, daß die in vitrosynthetisierten Substanzen von der Haut oder dem Haar durch äußere Applikation in vivo genutzt werden können. Unter anderem wurde festgestellt, daß die in vitro-synthetisierten Substanzen eine ausreichende Lebensdauer besitzen, um in kosmetischen Mitteln verwendet werden zu können und daß sie außerdem mit den verschiedenen, üblicherweise in den kosmetischen Mitteln verwendeten Verbindungen kompatibel sind.It is known that in all irritations, for example those affecting the skin, the skin must maintain its biological balance. It then synthesizes substances that serve to adapt it so that it can maintain its protective function. Often these substances themselves are not sufficient to protect the skin and the irritation often leads to negative effects, especially during the latency period between the irritation and the synthesis of the protective substances by the skin. The same phenomena can be observed in hair. The application of a The cosmetic composition according to the invention enables the skin and/or hair, at the moment of in vivo irritation, to come into contact with protective substances produced in vitro by a cell culture. It has been found that the in vitro-synthesized substances can be used in vivo by the skin or hair by external application. It has been found, among other things, that the in vitro-synthesized substances have a sufficient lifespan to be used in cosmetic compositions and that they are also compatible with the various compounds commonly used in cosmetic compositions.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein kosmetisches Mittel, welches in einem kosmetisch verträglichen Träger wenigstens eine Verbindung enthält, die erhältlich ist aus einer Kultur tierischer Zellen, insbesondere Fibroblasten oder Keratinocyten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß diese Verbindung eine Schutzsubstanz der Haut oder der Haare ist, welche durch diese Zellen während ihrer in vitro-Kultivierung als Antwort auf mindestens eine Reizung synthetisiert wird.The invention therefore relates to a cosmetic product which contains, in a cosmetically acceptable carrier, at least one compound which is obtainable from a culture of animal cells, in particular fibroblasts or keratinocytes, characterized in that this compound is a protective substance of the skin or hair which is synthesized by these cells during their in vitro cultivation in response to at least one irritation.
Die Schutzsubstanzen werden vorzugsweise ohne vorhergehende Trennung oder Reinigung verwendet, in Form eines aktiven Bestandteils, bestehend aus dem Kulturmilieu und/oder den kultivierten Zellen und/oder der nach Öffnung der kultivierten Zellen erhaltenen Lösung. Das Kulturmilieu und/oder die nach der Öffnung der Zellen erhaltene Lösung werden vorteilhafterweise aufkonzentriert um ihren Gehalt an Schutzsubstanzen zu verbessern.The protective substances are preferably used without prior separation or purification, in the form of an active ingredient consisting of the culture medium and/or the cultured cells and/or the solution obtained after opening the cultured cells. The culture medium and/or the solution obtained after opening the cells are advantageously concentrated in order to improve their content of protective substances.
Das Mittel kann vorteilhafterweise ein Gemisch aktiver Bestandteile enthalten, welche als Antwort auf mehrere Reizungen erhalten wurden. Man kann beispielsweise in das Mittel ein Gemisch aus aktiven Bestandteilen einführen, die aus einer Zellkultur durch Reizung mit ultravioletten Strahlen und aus einer Zellkultur nach Reizung mit Thermoschocks erhalten wurden.The composition may advantageously contain a mixture of active ingredients obtained in response to several stimuli. For example, a mixture of active ingredients obtained from a cell culture after stimulation with ultraviolet rays and from a cell culture after stimulation with thermal shocks may be introduced into the composition.
Vorzugsweise besteht die Reizung in der Einwirkung einer ultravioletten Strahlung, in Temperaturveränderungen, in einem elektromagnetischen Feld, in einem chemischen Mittel und/oder in dem Mangel an einem normalerweise in dem Kulturmilieu vorkommenden Element. Erfindungsgemäß kann man die Zellen in vitro mehreren aufeinanderfolgenden Reizungen aussetzen. Es ist außerdem möglich, die Zellen gleichzeitigen Reizungen auszusetzen (beispielsweise einer chemischen Reizung und einer thermischen Reizung). Bei Mehrfachreizungen enthält der erhaltene aktive Bestandteil direkt, ohne die Anfertigung einer Mischung zu erfordern, die aufgrund der verschiedenen Reizungen anfallenden Substanzen.Preferably, the irritation consists in the action of ultraviolet radiation, temperature changes, an electromagnetic field, a chemical agent and/or the lack of a substance normally present in the culture medium. According to the invention, the cells can be subjected in vitro to several successive irritations. It is also possible to subject the cells to simultaneous irritations (for example, chemical irritation and thermal irritation). In the case of multiple irritations, the active ingredient obtained contains directly, without the need to prepare a mixture, the substances resulting from the various irritations.
Je nach Reiz dem die Zellen ausgesetzt sind, werden verschiedene Schutzsubstanzen oder Gemische von Schutzsubstanzen synthetisiert. Diese Substanzen oder Substanzgemische wurden niemals isoliert und sind bis heute nicht genau bekannt. Die Schutzsubstanzen werden entweder in das Kulturmilieu ausgeschieden oder befinden sich in der Zelle. Diese Schutzsubstanzen können energiereiche Moleküle, immunoregulatorische Substanzen, Substanzen zur Stimulation des Zellwachstums und/oder Reparaturmoleküle sein.Depending on the stimulus to which the cells are exposed, various protective substances or mixtures of protective substances are synthesized. These substances or mixtures of substances have never been isolated and are not yet precisely known. The protective substances are either secreted into the culture environment or are located in the cell. These protective substances can be energy-rich molecules, immunoregulatory substances, substances for stimulating cell growth and/or repair molecules.
Es ist bekannt, daß Kulturen von Epidermiszellen, die dem Einfluß ultravioletter Strahlen ausgesetzt sind, unter anderem einen "hormonähnlichen" Faktor synthetisieren, nämlich E.T.A.F. (Epidermal cell-derived Thymocyte Activating Factor), der mit Interleukin-1 verglichen werden kann (vgl. die Artikel "The Journal of Investigative Dermatology", Band 81, Nr 6, 1983 "British Journal of Dermatology", 1985, 113, Supplement 28; und "Arch. Dermatol. Res.", 1988, 280, 71-76). Außerdem werden von Epidermiszellen Cytokine, insbesondere Interleukin-3 und ENKAF (Epidermal cell-derived Natural Killer cell Augmenting Factor) ebenfalls synthetisiert.It is known that cultures of epidermal cells exposed to ultraviolet rays synthesize, among other things, a "hormone-like" factor, namely E.T.A.F. (Epidermal cell-derived Thymocyte Activating Factor), which can be compared to interleukin-1 (see the articles "The Journal of Investigative Dermatology", Volume 81, No. 6, 1983, "British Journal of Dermatology", 1985, 113, Supplement 28; and "Arch. Dermatol. Res.", 1988, 280, 71-76). In addition, cytokines, particularly interleukin-3 and ENKAF (Epidermal cell-derived Natural Killer cell Augmenting Factor), are also synthesized by epidermal cells.
Die thermische Reizung führt in bekannter Weise zur Synthese von bestimmten "Thermoschock"-Proteinen. Werden die Zellen in Kultur einer kräftigen Temperaturerhöhung ausgesetzt, so werden zahlreiche zelluläre Proteine denaturiert. Es kommt dann zu einer Intervention der "Thermoschock"-Protein um diese Denaturierung zu begrenzen, sie bauen gegebenenfalls die anormalen Proteine ab und schützen die zellulären Strukturen, wie beispielsweise das Cytoskelett.Thermal stimulation is known to lead to the synthesis of certain "thermo-shock" proteins. If cells in culture are exposed to a strong increase in temperature, numerous cellular proteins are denatured. The "thermo-shock" proteins then intervene to limit this denaturation, breaking down the abnormal proteins if necessary and protecting the cellular structures, such as the cytoskeleton.
Die elektromagnetische Reizung erzeugt Schutzsubtanzen, welche die Membranpermeabilität vergrößern und gleichzeitig bestimmte Metabolismen, wie die Synthese von Adenosintriphosphat stimulieren.The electromagnetic stimulation produces protective substances that increase the membrane permeability and at the same time stimulate certain metabolisms, such as the synthesis of adenosine triphosphate.
Je nach Reiz, der auf die Zellen einwirkt, können verschiedene andere Substanzen synthetisiert werden.Depending on the stimulus acting on the cells, various other substances can be synthesized.
Erfindungsgemäß kultiviert man vorzugsweise Zellen, welche aus der menschlichen Haut, aus der Hülle eines menschlichen Haars oder eines Wimpernhaars extrahiert wurden und insbesondere Keratinocyten oder Fibroblasten. Die Zellen werden vorteilhafterweise derjenigen Person entnommen, welche das kosmetische Mittel verwenden soll. Auf diese Weise kann man individuelle Mittel erhalten, deren Anwendung große Sicherheit und ausgeprägte Unschädlichkeit bietet und das Allergierisiko verringert. Erfindungsgemäß kann es von Vorteil sein, die Entnahmen bei jungen Individuen durchzuführen, die Zellen nach ihrer Vermehrung dann einzufrieren und über mehrere Jahre zu konservieren. Nach dem Auftauen können sie unter den gleichen Bedingungen wie frisch entnommene Zellen wieder in Kultur gebracht werden.According to the invention, cells extracted from human skin, from the sheath of a human hair or from an eyelash hair, and in particular keratinocytes or fibroblasts, are preferably cultivated. The cells are advantageously taken from the person who is to use the cosmetic product. In this way, individual products can be obtained whose use is very safe and harmless and reduces the risk of allergy. According to the invention, it can be advantageous to carry out the sampling from young individuals, then freeze the cells after they have multiplied and preserve them for several years. After thawing, they can be cultured again under the same conditions as freshly taken cells.
Erfindungsgemäß werden die Zellen kultiviert, anschließend der gewählten Reizung (oder den Reizungen) ausgesetzt, und zwar vorzugsweise dann, wenn sie einen konfluenten Zustand erreichen. Die Kultivierung kann in Gegenwart von Vorläufern der Substanzen durchgeführt werden, die infolge der Reizung synthetisiert werden. Beispiele für Vorläufer sind Aminosäuren, Nukleinbasen und Natriumpyruvat.According to the invention, the cells are cultured, then exposed to the chosen stimulus (or stimuli), preferably when they reach a confluent state. The culture can be carried out in the presence of precursors of the substances that are synthesized as a result of the stimulus. Examples of precursors are amino acids, nucleic bases and sodium pyruvate.
Als Beispiel ist im folgenden ein Kulturprotokoll für menschliche Keratinocyten und menschliche Fibroblasten beschrieben. a) Kulturprotokoll für menschliche Keratinocyten Wenn man aus der Epidermis der Haut stammende Keratinocyten kultiviert, erhält man die Haut beispielsweise mit Hilfe einer herkömmlichen Technik aus der Schönheitschirurgie. Nach dem Entfetten isoliert man die Epidermis durch Trypsinisierung und die Zellen werden in einem Medium in Kultur gebracht, wie zum Beispiel in 10%igem fetalem Kälberserum, welches Antibiotika, Pyruvat und Glutamin enthält.As an example, a culture protocol for human keratinocytes and human fibroblasts is described below. a) Culture protocol for human keratinocytes When culturing keratinocytes derived from the epidermis of the skin, the skin is obtained, for example, using a conventional technique used in cosmetic surgery. After defatting, the epidermis is isolated by trypsinization and the cells are cultured in a medium such as 10% fetal calf serum containing antibiotics, pyruvate and glutamine.
Kultiviert man Keratinocyten aus der Haartasche, so isoliert man Haarbälge in der Anagenphase durch Ausreißen oder mit Hilfe der Schönheitschirurgie. Diese werden entweder auf einer Membran aus der Linse eines Rindes, oder auf Kollagen in modifiziertem Eagle's Medium oder Mac Coy-Medium, supplementiert mit fetalem Kälberserum (10%), Glutamin, Antibiotika, Fungiciden, Insulin, Choleratoxin und EGF (Epidermis-Wachstumsfaktor), kultiviert.If keratinocytes are cultivated from the hair follicle, hair follicles in the anagen phase are isolated by plucking or with the help of cosmetic surgery. These are cultivated either on a membrane from the lens of a cow, or on collagen in modified Eagle's medium or Mac Coy medium, supplemented with fetal calf serum (10%), glutamine, antibiotics, fungicides, insulin, cholera toxin and EGF (epidermal growth factor).
Die Keratinocyten können auch aus der Wimperntasche stammen. b) Kulturprotokoll für Humanfibroblasten. Die Fibroblasten isoliert man aus der unbehaarten Kopfhaut. Nach Eliminierung der Hypodermis und der Epidermis inkubiert man die Dermis in einer Antibiotikalösung, wäscht anschließend mit "phosphatgepufferter Kochsalzlösung" (PBS) und behandelt bei 37&sup0;c mit Kollagenase. Nach Filtrieren und Zentrifugieren der Zellsuspension bringt man den Rückstand in einem kompletten Kulturmedium in Kultur, wobei man 2·10&sup4;- Zellen/cm² verwendet.The keratinocytes can also come from the cilia. b) Culture protocol for human fibroblasts. The fibroblasts are isolated from the hairless scalp. After eliminating the hypodermis and epidermis, the dermis is incubated in an antibiotic solution, then washed with "phosphate buffered saline" (PBS) and treated with collagenase at 37°C. After filtering and centrifuging the cell suspension, the residue is cultured in a complete culture medium using 2·10⁴ cells/cm².
Das Kulturmedium besteht vorzugsweise aus modifiziertem Eagle's Medium, Dulbecco, ergänzt durch fetales Kälberserum (10%), Penicillin, Streptomycin, Fungizon und Glutamin.The culture medium preferably consists of modified Eagle's medium, Dulbecco, supplemented with fetal calf serum (10%), penicillin, streptomycin, fungizone and glutamine.
Es besteht die Möglichkeit, Fibroblasten und Keratinocyten gleichzeitig zu kultivieren.It is possible to cultivate fibroblasts and keratinocytes simultaneously.
Unter Befolgung der oben beschriebenen Protokolle werden die Zellen anschließend in einem Brutschrank bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 5% CO&sub2; und bei 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.Following the protocols described above, the cells are then incubated in an incubator at 37ºC in an atmosphere of 5% CO₂ and 95% relative humidity.
Die verschiedenen Protokolle für die Anwendung verschiedener Reizungen sind im folgenden beispielhaft angegeben:The different protocols for the application of different stimuli are given below as examples:
1) Reizung durch ultraviolette Strahlung.1) Irritation from ultraviolet radiation.
Nach Erreichen der Konfluenz eliminiert man das Kulturmedium, wäscht die Zellschicht mit einer gepufferten Kochsalzlösung und setzt die Zellen anschließend ultravioletter Strahlung aus. Die Dosis der im allgemeinen angewendeten ultravioletten Strahlung variiert zwischen 0,2 mJ/cm² und 75 kJ/cm². Insbesondere verwendet man folgende Dosen für Keratinocyten:Once confluence is reached, the culture medium is removed, the cell layer is washed with a buffered saline solution and the cells are then exposed to ultraviolet radiation. The dose of ultraviolet radiation generally used varies between 0.2 mJ/cm² and 75 kJ/cm². In particular, the following doses are used for keratinocytes:
U.V.B.: 1 bis 100 mJ/cm²U.V.B.: 1 to 100 mJ/cm²
und für Fibroblastenand for fibroblasts
U.V.A.: 2 bis 75 kJ/cm²U.V.A.: 2 to 75 kJ/cm²
U.V.B.: 5 bis 30 mJ/cm²U.V.B.: 5 to 30 mJ/cm²
U.V.C.: 0,2 bis 0,5 mJ/cm²U.V.C.: 0.2 to 0.5 mJ/cm²
Nach Bestrahlung gibt man ein Kulturmedium, welches gegebenenfalls fetales Kälberserum, Wachstumsfaktoren und/oder Antibiotika enthält, auf die Zellen und läßt diese über einen Zeitraum in Kontakt, der von 12 bis 48 Stunden variieren kann. Während dieses Zeitraums antworten die Zellen durch die Synthese neuer Moleküle auf die Reizung.After irradiation, a culture medium, which optionally contains fetal calf serum, growth factors and/or antibiotics, is added to the cells and left in contact for a period that can vary from 12 to 48 hours. During this period, the cells respond to the stimulus by synthesizing new molecules.
2) Reizung durch Temperatur.2) Irritation due to temperature.
Die Temperatur stellt eine Reizung dar, die man in einfacher Weise auf die Zellkultur einwirken lassen kann. Die folgende Prozedur wurde beschrieben von Nancy C. COLLIER und Milton J. SCHLESINGER in "The Journal of Cell Biology", Bd. 103, Oktober 1986.Temperature is a stimulus that can be easily applied to the cell culture. The following procedure was described by Nancy C. COLLIER and Milton J. SCHLESINGER in "The Journal of Cell Biology", Vol. 103, October 1986.
Nach Erreichen der Konfluenz wird das Startmedium, welches sich bei 37ºC befindet, durch ein anderes Medium ersetzt, das HEPES (N'-2-Hydroxyethylpiperazin-N-ethansulfonsäure) enthält. Die Fibroblasten bringt man in ein auf 45ºC thermostatisiertes Bad und rührt über einen Zeitraum von 30 Minuten bis 3 Stunden. Anschließend ersetzt man das Medium durch modifiziertes Eagle's Medium, welches gegebenenfalls fetales Kälberserum enthält und läßt die Zellen damit anschließend 12 bis 48 Stunden in Kontakt.Once confluence is reached, the starting medium, which is at 37ºC, is replaced by another medium containing HEPES (N'-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid). The fibroblasts are placed in a bath thermostatted at 45ºC and stirred for a period of 30 minutes to 3 hours. The medium is then replaced by modified Eagle's medium, which may contain fetal calf serum, and the cells are then left in contact with it for 12 to 48 hours.
Die Zellen können mehreren aufeinanderfolgenden thermischen Schocks ausgesetzt werden.The cells can be exposed to several consecutive thermal shocks.
3) Elektromagnetische Reizung.3) Electromagnetic stimulation.
Man setzt das Kulturmedium einem homogenen Magnetfeld von weniger als 20 Gauss aus, mit einer Peakdauer von 5 Millisekunden und einer Frequenz von weniger als 100 Hertz. Das Magnetfeld wird mit Hilfe eines Helmholtzspulenpaars erzeugt, das die konfluente Zellkultur umgibt. Das Kulturmedium wird vor der Einführung in das Magnetfeld gewechselt. Die Einwirkungsdauer des Feldes kann 1 bis 4 Tage betragen. Ein Verfahren dieses Typs wurde beschrieben von BERG in "Studia Biophysica", Bd. 119, 1987, Nr. 1-3.The culture medium is exposed to a homogeneous magnetic field of less than 20 gauss, with a peak duration of 5 milliseconds and a frequency of less than 100 hertz. The magnetic field is generated using a pair of Helmholtz coils surrounding the confluent cell culture. The culture medium is changed before being introduced into the magnetic field. The duration of exposure to the field can be 1 to 4 days. A procedure of this type was described by BERG in "Studia Biophysica", vol. 119, 1987, no. 1-3.
4) Chemische Reizung.4) Chemical irritation.
Die chemische Reizung kann mit Hilfe von Detergentien, Schwermetallen oder Salzen erreicht werden.Chemical irritation can be achieved with the help of detergents, heavy metals or salts.
5) Mangelreizung.5) Deficiency of irritation.
Sie wird dadurch erzeugt, daß man aus dem Kulturmedium Elemente eliminiert, welche normalerweise enthalten sind, wie Aminosäuren, Vitamine, Zucker, Nukleinbasen, Wachstumsfaktoren, Lipide aus dem fetalen Kälberserum und das Serum selbst.It is produced by eliminating from the culture medium elements that are normally present, such as amino acids, vitamins, sugars, nucleic bases, growth factors, lipids from fetal calf serum and the serum itself.
Wenn die Kulturen der gewünschten Reizung oder den gewünschten Reizungen ausgesetzt werden, werden die Schutzsubstanzen, die als Antwort auf die Reizung(en) synthetisiert wurden, gewonnen: Sie sind in den Zellen selbst enthalten (dies ist beispielsweise der Fall bei den "Thermoschock"-Proteinen) und/oder im Kulturmedium (dies ist beispielsweise der Fall bei Cytokinen und Wachstumsfaktoren).When the cultures are subjected to the desired stimulus(s), the protective substances synthesized in response to the stimulus(s) are recovered: they are contained in the cells themselves (this is the case, for example, of the "thermo-shock" proteins) and/or in the culture medium (this is the case, for example, of cytokines and growth factors).
Will man die Zellen isolieren, so eliminiert man das Kulturmilieu durch Absaugen. Die Zellen werden gespült, anschließend von ihrem Träger abgekratzt und in "phosphatgepufferter Kochsalzlösung" aufgenommen. Anschließend werden sie zerkleinert oder lyophilisiert und in das kosmetische Mittel eingebracht. Wenn man aus den Zellen die synthetisierten Schutzsubstanzen isolieren will, so öffnet man diese mit Hilfe verschiedener bekannter Techniken, wie Beschallung, osmotischem Schock, Potterbehandlung. Die erhaltene Suspension wird anschließend zentrifugiert und dann wird je nachdem der Überstand und/oder der Bodensatz als aktiver Bestandteil isoliert, um in das erfindungsgemäße kosmetische Mittel eingeführt zu werden.If it is desired to isolate the cells, the culture medium is eliminated by suction. The cells are rinsed, then scraped off their support and placed in "phosphate buffered saline". They are then crushed or lyophilized and introduced into the cosmetic product. If it is desired to isolate the protective substances synthesized from the cells, they are opened using various known techniques such as sonication, osmotic shock, Potter treatment. The suspension obtained is then centrifuged and then, depending on the case, the supernatant and/or the sediment is isolated as the active ingredient to be introduced into the cosmetic product according to the invention.
Will man das Kulturmilieu isolieren, so führt man eine Zentrifugation nach Absaugen des Milieus durch, um die darin vorliegenden Zellen zu eliminieren. Anschließend besteht die Möglichkeit, den Überstand durch Eindampfen aufzukonzentrieren, um die Wirkungen der darin vorliegenden Substanzen zu potenzieren.If you want to isolate the culture medium, you should carry out centrifugation after aspirating the medium in order to eliminate the cells present in it. It is then possible to concentrate the supernatant by evaporation in order to potentiate the effects of the substances present in it.
Erfindungsgemäß kann der kosmetisch verträgliche Träger außer dem (den) oben beschriebenen aktiven Bestandteil(en) wenigstens eine kosmetisch aktive Verbindung enthalten, die in bekannter Weise als Bestandteil eines kosmetischen Mittels brauchbar ist. Das kosmetische Mittel kann in Form einer Creme, als Milch, Lotion oder als Serum vorliegen. Für den Fall, daß man eine Creme herstellt, kann man 0,1 bis 30 Gew.-% von dem (den) aktiven Bestandteil(en) in das kosmetische Mittel einführen. Liegt das kosmetische Mittel als Serum vor, so können die Mengen des (der) eingeführten aktiven Bestandteils (Bestandteile) deutlich darüber liegen, nämlich im Bereich von 30 bis 100%.According to the invention, the cosmetically acceptable carrier may contain, in addition to the active ingredient(s) described above, at least one cosmetically active compound which is useful in a known manner as a component of a cosmetic composition. The cosmetic composition may be in the form of a cream, as a milk, lotion or serum. If a cream is prepared, 0.1 to 30% by weight of the active ingredient(s) can be introduced into the cosmetic product. If the cosmetic product is in the form of a serum, the amounts of the active ingredient(s) introduced can be significantly higher, namely in the range of 30 to 100%.
Im allgemeinen trägt man am Morgen oder am Abend durchschnittlich 1 bis 2 mg/cm² der Zusammensetzung auf. Diese Menge ist deutlich geringer (etwa 0,02 mg/cm²) wenn man ein Serum oder eine Milch verwendet.In general, an average of 1 to 2 mg/cm² of the composition is applied in the morning or evening. This amount is significantly lower (about 0.02 mg/cm²) if a serum or milk is used.
Die im folgenden aufgeführten, illustrativen und nicht limitierenden Beispiele ermöglichen ein besseres Verständnis der Erfindung.The following illustrative and non-limiting examples enable a better understanding of the invention.
Im folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung eines aktiven Bestandteils beschrieben, der schutzsubstanzen enthält.The following describes a process for preparing an active ingredient containing protective substances.
In einem ersten Schritt kultiviert man Keratinocyten, welche aus einer Brustplastik einer 40-jährigen Frau stammen.In a first step, keratinocytes are cultivated, which come from a breastplasty of a 40-year-old woman.
Nach Zerschneiden mit einem Elektrokeratotom (0,3 mm) wird die Epidermis von der oberen Dermis durch Eintauchen in eine Trypsinlösung mit einer Konzentration von 0,20% abgetrennt. Epidermis und Trypsinisat werden anschließend isoliert, eine Minute gerührt und dann über zwei sterile Gazeschichten filtiert.After cutting with an electrokeratotome (0.3 mm), the epidermis is separated from the upper dermis by immersion in a trypsin solution with a concentration of 0.20%. The epidermis and trypsin are then isolated, stirred for one minute and then filtered through two sterile gauze layers.
Die Keratinocyten werden dann in Dulbecco modifiziertes Eagle's Medium ausgebracht, welches 10% fetales Kälberserum, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Natriumpyrovat und Antibiotika (Penicillin : 75 U.I./ml, Streptomycin : 75 ug/ml und Fungizid : 8,7 ug/ml) enthält.The keratinocytes are then plated in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal calf serum, 1% non-essential amino acids, 1% sodium pyrovate and antibiotics (penicillin: 75 U.I./ml, streptomycin: 75 ug/ml and fungicide: 8.7 ug/ml).
In einem zweiten Schritt setzt man die Zellen der Wirkung ultravioletter Strahlung aus. Hierzu eliminiert man nach 5 Tagen das unter 1 definierte Kulturmilieu, wäscht die Zellschicht mit einer gepufferten Kochsalzlösung und bestrahlt die Zellen anschließend mit UVA in einer Größenordnung von 300 mJ/cm². Anschließend entnimmt man über einen Zeitraum von 5 Tagen jeden Tag das Kulturmilieu. Es wird anschließend 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, um die im Kulturmedium enthaltenen Zellen abzutrennen.In a second step, the cells are exposed to ultraviolet radiation. To do this, the culture medium defined under 1 is eliminated after 5 days, the cell layer is washed with a buffered saline solution and the cells are then irradiated with UVA at a magnitude of 300 mJ/cm². The culture medium is then removed every day for a period of 5 days. It is then centrifuged for 10 minutes at 1000 g to separate the cells contained in the culture medium.
Das Milieu oder der Überstand wird durch Eindampfung aufkonzentriert und man erhält einen ersten aktiven Bestandteil.The medium or supernatant is concentrated by evaporation and a first active component is obtained.
Die durch Zentrifugation abgetrennten Zellen werden gespült, von ihrem Träger abgestrichen und anschließend in destilliertem Wasser suspendiert, so daß sie zerplatzen. Die nach dem Aufplatzen erhaltene Lösung bildet einen zweiten aktiven Bestandteil.The cells separated by centrifugation are rinsed, scraped from their carrier and then suspended in distilled water so that they burst. The solution obtained after bursting forms a second active ingredient.
Man mischt die beiden aktiven Bestandteile zu gleichen Teilen und verwendet das Gemisch in den folgenden Beispielen 2 bis 9, welche das erfindungsgemäße Mittel veranschaulichen.The two active ingredients are mixed in equal parts and the mixture is used in the following examples 2 to 9, which illustrate the composition according to the invention.
Die Formulierung ist in Gew. -% angegeben:The formulation is given in wt.%:
Aktiver Bestandteil gemäß Beispiel 1 12Active ingredient according to Example 1 12
Vaselinöl 34Vaseline oil 34
Kakaobutter 2Cocoa butter 2
Isopropylmyristat 10Isopropyl myristate 10
Bienenwachs 3Beeswax 3
Magnesiumlanolat 2,4Magnesium lanolate 2.4
Lanolinalkohol 0,6Lanolin alcohol 0.6
Polyethylenpulver 10Polyethylene powder 10
Antioxidans (Butylhydroxyanisol + Butylhydroxytoluol) 0,01 Sonnenfilter, vertrieben unter der Bezeichnung "Parsol Ultra" von der Firma "Givaudan" 5Antioxidant (butylhydroxyanisole + butylhydroxytoluene) 0.01 Sunscreen sold under the name "Parsol Ultra" by the company "Givaudan" 5
Parfum 1Perfume 1
Konservierungsmittel 0,3Preservative 0.3
entmineralisiertes Wasser q.s.p. 100demineralized water q.s.p. 100
Dieses Mittel schützt die Haut vor Reizung durch UV- Strahlung. Sie trägt dazu bei, daß die Bildung freier Radikale und die daraus resultierenden Folgen in kutanen Bereichen begrenzt werden und dämpft die Stärkung des mikrodepressionären Netzes (reseau microdepressionnaire).This product protects the skin from irritation caused by UV radiation. It helps to limit the formation of free radicals and the resulting consequences in cutaneous areas and attenuates the strengthening of the microdepressant network (reseau microdepressionnaire).
Die Formulierung ist in Gew. -% angegeben Aktiver Bestandteil gemäß Beispiel 1 30The formulation is given in % by weight Active ingredient according to Example 1 30
Glycerinstearat 2Glyceryl stearate 2
Sorbitanmonostearat mit 20 Mol Ethylenoxid, vertrieben unter der Bezeichnung "Tween 60" 1Sorbitan monostearate with 20 moles of ethylene oxide, sold under the name "Tween 60" 1
Cetylalkohol 0,5Cetyl alcohol 0.5
Stearinsäure 1,4Stearic acid 1.4
Triethanolamin 1,1Triethanolamine 1,1
Gemisch aus Vinylcarbonsäuren, vertrieben unter der Bezeichnung "Carbopol 940" 0,4Mixture of vinylcarboxylic acids, sold under the name "Carbopol 940" 0.4
Flüssige Fraktion aus Karitefett 8Liquid fraction of shea fat 8
Öl aus Maiskeimlingen 6Oil from corn germs 6
Perhydrosqualen zur Synthese 10Perhydrosqualene for synthesis 10
Antioxidans (Butylhydroxyanisol + Butylhydroxytoluol) 0,015Antioxidant (butylhydroxyanisole + butylhydroxytoluene) 0.015
Parfum 1Perfume 1
Konservierungsmittel 0,3Preservative 0.3
Entmineralisiertes Wasser q.s.p. 100Demineralized water q.s.p. 100
Dieses Mittel verwendet man insbesondere bei Personen, deren Haut zum Austrocknen neigt, und es bewirkt eine zufriedenstellende Hydratisierung der Stratum Corneum und schützt die Haut vor deutlichen Veränderungen der Feuchtigkeit. Das Mittel verbessert auf diese Weise die Hautelastizität.This product is used especially for people whose skin tends to dry out and it ensures a satisfactory hydration of the stratum corneum and protects the skin from significant changes in moisture. The product thus improves skin elasticity.
Die Formulierung ist in Gew. -% angegeben:The formulation is given in wt.%:
Aktiver Bestandteil (a) 25Active ingredient (a) 25
Sorbitanmonoisostearat 5Sorbitan monoisostearate 5
Mikrokristallines Wachs 1Microcrystalline wax 1
Vaselinöl 5Vaseline oil 5
Öl aus Maiskeimlingen 7Oil from corn germs 7
Sojaöl 7Soybean oil 7
Ester aus C&sub8;-C&sub1;&sub8; Fettsäuren und C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8; Fettalkoholen 1Esters of C₈-C₁₈ fatty acids and C₁₂-C₁₈ fatty alcohols 1
Montmorillonitgel, organisch modifiziert, und Neutralöl (Triglyceride von Capryl- und Caprinsäure) 5Montmorillonite gel, organically modified, and neutral oil (triglycerides of caprylic and capric acid) 5
Propylenglycol 3Propylene glycol 3
Antioxidans (Butylhydroxyanisol + Butylhydroxytoluol) 0,01Antioxidant (butylhydroxyanisole + butylhydroxytoluene) 0.01
Konservierungsmitte 1 0,3Preservative 1 0.3
Entmineralisiertes Wasser q.s.p. 100Demineralized water q.s.p. 100
Die Formulierung ist in Gew.-% angegeben:The formulation is given in wt.%:
Aktiver Bestandteil (a) 15Active ingredient (a) 15
Magnesiumlanolat 14,4Magnesium lanolate 14.4
Lanolinalkohol 3,6Lanolin alcohol 3.6
Isopropylmyristat 8Isopropyl myristate 8
Paraffinöl 18Paraffin oil 18
Sonnenblumenöl 22Sunflower oil 22
Antioxidans (Butylhydroxyanisol + Butylhydroxytoluol) 0,01Antioxidant (butylhydroxyanisole + butylhydroxytoluene) 0.01
Ozokerit 4Ozokerite 4
Konservierungsmittel 0,3Preservative 0.3
Entmineralisiertes Wasser q.s.p. 100Demineralized water q.s.p. 100
(a) Den aktiven Bestandteil dieser beiden Emulsionen erhält man aus einer Keratinocytenkultur, die einer Temperaturreizung gemäß folgender Prozedur unterzogen wurde: Die Keratinocyten kultiviert man bei 37ºC und ersetzt nach Erreichen des konfluenten Zustandes das Kulturmilieu durch ein Milieu, welches N'-2-Hydroxyethylpiperazin-N-ethansulfonsäure enthält; anschließend überführt man sie in ein auf 45ºC thermostatisiertes Bad und rührt 2 Stunden; das Medium wird anschließend durch ein modifiziertes Eagle's Medium, welches fetales Kälberserum enthält, ersetzt, und läßt dieses mit den Zellen 36 Stunden in Kontakt verweilen.(a) The active ingredient of these two emulsions is obtained from a culture of keratinocytes which has been subjected to thermal stimulation according to the following procedure: the keratinocytes are cultured at 37ºC and, once they have reached confluent status, the culture medium is replaced by a medium containing N'-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid; they are then transferred to a bath thermostatted at 45ºC and stirred for 2 hours; the medium is then replaced by a modified Eagle's medium containing fetal calf serum and this is left in contact with the cells for 36 hours.
Die beiden Öl-in-Wasser-Emulsionen gemäß den Beispielen 4 und 5 schützen die Haut vor Trockenheit, insbesondere indem sie die bei Temperaturveränderungen veränderte zelluläre Kohäsion begünstigen.The two oil-in-water emulsions according to Examples 4 and 5 protect the skin against dryness, in particular by promoting the cellular cohesion that is altered by temperature changes.
Die Formulierung ist in Gew.-% angegeben:The formulation is given in wt.%:
Aktiver Bestandteil (b) 7Active ingredient (b) 7
Partielle Glyceride von Fettsäuren 8Partial glycerides of fatty acids 8
Cetylalkohol 0,5Cetyl alcohol 0.5
Ölsäuredecylester 8Oleic acid decyl ester 8
Vaselinöl 4Vaseline oil 4
Perhydrosqualen 16Perhydrosqualene 16
Polyglycolether von gesättigtem Fettalkohol 4Polyglycol ether of saturated fatty alcohol 4
Magnesiumaluminiumsilikat 0,7Magnesium aluminium silicate 0.7
Polyethylenpulver, vertrieben unter der Bezeichnung "Polymist B6" von der Firma > Allied Chemicals" 4Polyethylene powder, sold under the name "Polymist B6" by the company > Allied Chemicals" 4
Eisenoxide 2,2Iron oxides 2.2
Konservierungsmittel 0,3Preservative 0.3
Entmineralisiertes Wasser q.s.p. 100Demineralized water q.s.p. 100
(b) Den aktiven Bestandteil dieser Creme erhält man aus einer Keratinocytenkultur, die einer Reizung mit einem Detergens ausgesetzt war.(b) The active ingredient of this cream is obtained from a culture of keratinocytes that has been subjected to irritation with a detergent.
Die regelmäßige Auftragung dieser Creme führt zu einer Verbesserung des Teints, der sich mit zunehmendem Alter abschwächt, und das um so mehr, als die Haut einer verschmutzten Umwelt ausgesetzt ist.Regular application of this cream leads to an improvement in the complexion, which tends to fade with age, even more so as the skin is exposed to a polluted environment.
Die Formulierung ist in Gew.-% angegeben:The formulation is given in wt.%:
Aktiver Bestandteil (c) 10Active ingredient (c) 10
Glycerinstearat 2Glyceryl stearate 2
Sorbitanmonostearat mit 20 Mol Ethylenoxid 1Sorbitan monostearate with 20 moles ethylene oxide 1
Stearinsäure 1,4Stearic acid 1.4
Triethanolamin 0,9Triethanolamine 0.9
Gemisch aus Vinylcarbonsäuren, vertrieben unter der Handelsbezeichnung "Carbopol 940" 0,2Mixture of vinylcarboxylic acids, sold under the trade name "Carbopol 940" 0.2
Jojobaöl 3Jojoba oil 3
Vaselinöl 8Vaseline oil 8
Antioxidans (Butylhydroxyanisol + Butylhydroxytoluol) 0,01Antioxidant (butylhydroxyanisole + butylhydroxytoluene) 0.01
Parfum 1Perfume 1
Konservierungsmittel 0,3Preservative 0.3
Entmineralisiertes Wasser q.s.p. 100Demineralized water q.s.p. 100
(c) Den aktiven Bestandteil der Milch erhält man aus einer Fibroblastenkultur, die einer Reizung durch Vitaminmangel ausgesetzt war.(c) The active ingredient in milk is obtained from a fibroblast culture that has been exposed to vitamin deficiency irritation.
Die auf den gesamten Körper aufgetragene Milch begrenzt die Mangel- oder Sub-Mangel-Erscheinungen, die sich im Laufe des Alterns manifestieren.Milk applied to the entire body limits the deficiency or sub-deficiency symptoms that manifest with aging.
Man stellt eine wäßrige Lipidvesikel-Dispersion mit Hilfe des in dem französischen Patent 2 315 991 beschriebenen Verfahrens aus den folgenden Substanzen her:An aqueous dispersion of lipid vesicles is prepared using the process described in French patent 2 315 991 from the following substances:
Amphiphiles, nicht-ionisches Lipid der allgemeinen Formel: Amphiphilic, non-ionic lipid of the general formula:
worin R für einen Hexadecylrest und für einen statistischen Mittelwert von 3 steht 3,8 gwhere R is a hexadecyl residue and is a statistical mean of 3 3.8 g
β-Sitosterol 3,8 gβ-Sitosterol 3.8 g
Dicetylphosphat 0,4 gDicetyl phosphate 0.4 g
Konservierungsmittel 0,3 gPreservative 0.3 g
Entmineralisiertes Wasser 27,6 gDemineralized water 27.6 g
Aktiver Bestandteil (d) 20 gActive ingredient (d) 20 g
Zu der im ersten Schritt erhaltenen Vesikeldispersion gibt man die folgenden Substanzen hinzu:The following substances are added to the vesicle dispersion obtained in the first step:
Sonnenblumenöl 35 gSunflower oil 35 g
Parfum 0,6 gPerfume 0.6 g
Gemisch aus Vinylcarbonsäuren, vertrieben unter der Handelsbezeichnung "Carbopol 940" 0,2 gMixture of vinylcarboxylic acids, sold under the trade name "Carbopol 940" 0.2 g
Triethanolamin 0,2 gTriethanolamine 0.2 g
Entmineralisiertes Wasser 8,1 gDemineralized water 8.1 g
(d) Den aktiven Bestandteil dieser Creme erhält man aus einer Fibroblastenkultur, die einer elekromagnetischer Reizung ausgesetzt war. Das Kulturmilieu behandelt man mit einem Magnetfeld von 15 Gauss mit einer Frequenz von 50 Hertz mit einer Peakdauer von 5 Millisekunden, erzeugt mit Hilfe eines Helmholtz-Spulenpaars. Die Applikationsdauer beträgt 3 Tage.(d) The active ingredient of this cream is obtained from a fibroblast culture that was subjected to electromagnetic stimulation. The culture medium is treated with a magnetic field of 15 Gauss at a frequency of 50 Hertz with a peak duration of 5 milliseconds, generated using a pair of Helmholtz coils. The application period is 3 days.
Die restrukturierenden Eigenschaften dieser Creme ermöglichen eine Abschwächung von Alterserscheinungen, wie Falten.The restructuring properties of this cream allow the signs of aging, such as wrinkles, to be reduced.
Die Formulierung ist in Gew. -% angegeben:The formulation is given in wt.%:
Hydroxypropylmethylcellulose 0,3Hydroxypropylmethylcellulose 0.3
Xanthangummi 0,2Xanthan gum 0.2
Polyethylenglykolether von Methylglucose mit der Bezeichnung Methyl gluceth-20 im "CTFA Cosmetic Dictionary" 1982, herausgegeben von "The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association" 1Polyethylene glycol ether of methyl glucose, designated Methyl gluceth-20 in the "CTFA Cosmetic Dictionary" 1982, published by "The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association" 1
Parahydroxymethylbenzoat 0,15Parahydroxymethylbenzoate 0.15
Parahydroxypropylbenzoat 0,05Parahydroxypropyl benzoate 0.05
Parfum q.s.Perfume q.s.
Aktiver Bestandteil (e) q.s.p. 100Active ingredient (s) q.s.p. 100
(e) Den aktiven Bestandteil dieses Serums erhält man aus einer Kultur von Keratinocyten und Fibroblasten, die gleichzeitig einer Reizung durch Vitaminmangel und UV- Strahlung ausgesetzt waren.(e) The active ingredient of this serum is obtained from a culture of keratinocytes and fibroblasts that were simultaneously exposed to irritation by vitamin deficiency and UV radiation.
Dieses Mittel verbessert die Spannkraft der Haut. In all diesen Formulierungsbeispielen kann der verwendete aktive Bestandteil durch einen aktiven Bestandteil ersetzt werden, den man aus einer Zellkultur nach einer anderen Reizung erhält.This agent improves the elasticity of the skin. In all these formulation examples, the active ingredient used can be replaced by an active ingredient obtained from a cell culture after another irritation.
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