DE68926511T2

DE68926511T2 - Verfahren zur diagnostizierung von viralen und genetischen krankheiten

Info

Publication number: DE68926511T2
Application number: DE68926511T
Authority: DE
Inventors: Rene Elkaim; Max Herzberg; Israel Nur
Original assignee: Orgenics Ltd
Current assignee: Orgenics Ltd
Priority date: 1989-10-24
Filing date: 1989-10-24
Publication date: 1996-11-21
Anticipated expiration: 2009-10-25
Also published as: EP0501950A1; WO1991006659A1; EP0501950B1; DE68926511D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Diagnose mindestens einer Erkrankung durch Testen auf die Anwesenheit und/oder Menge einer verdächtigen Zielnucleinsäure. Insbesondere kombiniert und verbessert sie den Assay, der auf der nichtradioaktiven Markierung von DNA- oder RNA-Sonden beruht, die zu ihrer Detektion durch die Hybridisierungstechnik verwendet werden, und die Festphasenimmunoassaytechnik des Tauchstäbchens mit einer flachen Karte mit einer Reihe von longitudinalen Projektionen, an die die bekannte nichtmarkierte Nucleinsäuresequenz, die der verdächtigen Zielnucleinsäuresequenz komplementär ist, selektiv positioniert ist. Die vorliegende Erfindung ist auch zur gleichzeitigen Diagnose unterschiedlicher Erkrankungen in einer Probe nützlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung eignen sich besonders zur Detektion von verdächtigen Zielnucleinsäuren und stellen eine einfache billige, quantitative und zuverlässige Diagnose infektiöser und genetischer Erkrankungen in einer Vielzahl von individuellen Proben, die unterschiedlichen Patienten entnommen wurden, dar.
Es gibt einen offensichtlichen diagnostischen Wert in einer Vorrichtung zum Absuchen von DNA, der leicht, rasch, einfach und mit hoher Genauigkeit von nichtspezialisiertem Personal mit begrenzter Laborerfahrung und Ausstattung durchgeführt werden kann. Zusätzlich stellen das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung ein angepaßtes Reaktionsbehältnis mit einer Vielzahl von einzelnen Kammern und insbesondere einem vorteilhaften mikroprozessorkontrollierten Reflektometer bereit, das/die genaue Messung der Farbdichte des Assays erlaubt.
Die Anmeldung steht im Zusammenhang mit dem Gegenstand der EPO 128 018, EPO 171 150 und FR 85 16533. In den vorstehend genannten Druckschriften gibt es einen ausführlichen Überblick über den Stand der Technik im Zusammenhang mit den Hauptelementen der vorliegenden Erfindung, die wie folgt sind:
1. Nucleinsäuren in einer teilgereinigten oder ungereinigten biologischen Probe werden speziell in Anwesenheit von Natriumbisulfit mit hoher Molarität modifiziert, was zur Addition einer antigenen Sulfongruppe an C-6 der Cytosineinheiten der einzelsträngigen DNA führt. Die so erhaltene Sulfongruppe wird durch Aminierung der Cytosinbasen mit --o-Methylhydroxylamin--, stabilisiert, was zu der Substitution einer Amingruppe am Kohlenstoff 4 führt.
2. Die die modifizierte DNA oder RNA enthaltende Probe wird dann mit einer Hybridisierungslösung vermischt und in die erste Kammer des Reaktionsbehälters überführt. Die flache Kunststoffkarte mit einer Gruppe von Projektionen, die jeweils eine nichtmarkierte Sonde bzw. nichtmarkierte Sonden enthalten, wird in die vorstehende Hybridisierungslösung in der Kammer insertiert. Die Hybridisierung wird für 1 bis 18 h durchgeführt.
3. Nach der Hybridisierung wird die markierte Ziel-DNA oder -RNA sichtbar gemacht, beispielsweise durch immunchemische Reaktionen, die in aufeinanderfolgenden Kammern des Reaktionsbehälters wie folgt durchgeführt werden: 1) Waschen nach der Hybridisierung in der zweiten Kammer; 2) Inkubation mit dem markierten Antikörper gegen die sulfonierte DNA in der nächsten Kammer; 3) Waschkammer und 4) Inkubation mit dem chromogenen Substrat, wodurch ein Farbfleck in der nächsten Kammer gebildet wird. Die Intensität des Farbflecks ist der Menge der spezifischen DNA in der gegebenen Probe proportional. Quantitative Ergebnisse können unter Verwendung von Combscanr, einem speziell angepaßten mikroprozessorkontrollierten Reflektometer erhalten werden, das die Intensität des gefärbten Flecks in numerische Einheiten überträgt.
Während der Hybridisierung von auffesten Trägern immobilisierter DNA oder RNA eine bekannte und fundamentale Technik in der Biochemie und der Molekularbiologie zur Detektion spezifischer Nucleinsäuresequenzen ist, werden bei den üblicherweise verwendeten Verfahren, wie der Dot-Hybridisierung, Southern Blots und Kolonie- und Placquehybrisierung, entweder die Filtration einer behandelten biologischen Probe oder die Immobilisierung der Probe mit anschließendem Verarbeiten verwendet. Bei den vorstehenden Techniken wurden überwiegend Nitrocellulose- oder Nylonmembranen verwendet. Jedoch beschränkt die niedrige Retentionseffizienz und die relative Unzugänglichkeit der immobilisierten Nucleinsäure gegenüber der Sonde infolge der Tatsache, daß nur ein kleiner Teil der Zielnucleinsäure für die Hybridisierung verfügbar ist, in großen Ausmaß die Verwendung dieser Technik für diagnostische Zwecke. Daher haben die genannten Erfinder, um die vorstehenden Nachteile zu überwinden und um die beiden bekannten Assaysysteme zu bestem Nutzen zu vereinigen, eine umgekehrte Hybridisierungsmethode und -vorrichtung bereitgestellt, bei der eine nichtmarkierte bekannte Nucleinsäuresequenz an einen festen Träger gebunden wird und in eine Hybridisierungsreaktion mit einer chemisch modifizierten Zielproben-DNA oder -RNA verwendet wird. Die Visualisierung wird durch immunologische Reaktionen erzielt, die insbesondere so angepaßt sind, daß sie die höchste Empfindlichkeit in der kürzesten Zeitspanne erzielen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Detektion von 10 pg homologer DNA oder RNA in 1 bis 2 h und die Detektion von 1 pg in einer Übernacht-Hybridisierung, wobei alle benötigten Chemikalien in dem Kit bereitgestellt werden.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Mittel, Materialien und Verfahren beschrieben wurde, ist zu verstehen, daß die Erfindung nicht auf die beschriebenen Sonderfälle beschränkt ist und sich auf alle Äquivalente erstreckt, die unter den Umfang der Patentansprüche fallen.
Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere zur Detektion der Anwesenheit und/oder der Menge von Zielnucleinsäuren, wie DNA oder RNA, mit mindestens 50 Basen. Die Zielnucleinsäure kann bevorzugt teilweise aus jeder biologischen Probe extrahiert werden, die vermutlich kontaminiert ist.
Verschiedene bekannte Techniken der Amplifikation von Zielnucleinsäure können verwendet werden. Eine biologische Probe, die mindestens 50 pg Gesamtziel-DNA pro Probe enthält, kann ohne Amplifikation verwendet werden. Alternativ kann für niedrigere Konzentrationen die beschriebene PCR-Amplifikationstechnik (in: Trends in Genetics, Juni 1989, Bd. 5 Nr. 6) zur Amplifikation der spezifischen DNA zum Erzielen der gewünschten Konzentrationen verwendet werden.

Beispiel 1

Markieren einer Zielnucleinsäuresequenz und Transfer in die Hybridisierungskammer des Behälters

Die Zellen wurden behandelt, ihre DNA teilweise extrahiert und vollständig wie folgt sulfoniert:
Biopsien oder Zellkulturen wurden 30 min lang bei 55ºC in Lysepuffer (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 M NaEDTA, 0,5 % SDS und 100 µg/ml Proteinase) inkubiert. Dieses Lysat wurde dann durch Zugabe von vier Volumina Wasser verdünnt, vermischt und 10 min lang zum Sieden erhitzt. Die teilgereinigte, teilweise denaturierte, lysierte Probe wurde auf Eis gekühlt, und die Modifikationslösungen wurden, wie in dem Handbuch von Chemiprobe beschrieben, zugegeben. Die Markierung wird durch Insertieren einer antigenen Sulfongruppe in die Cytosineinheiten der ssDNA erzielt (1). Die Cytosine werden bei Kohlenstoff 6 durch Natriumbisulfit in hoher Molarität (Modifikationslösung A) sulfoniert. Das so erhaltene Sulfon wird durch Aminierung mit --o-Methylhydroxylamin (Modifikationslösung B) stabilisiert, was zu der Substitution der Amingruppe am Kohlenstoff 4 führt. So werden die Cytosine in N-4-Methoxy-5,6-dihydrocytosin-6-sulfonat überführt. Basierend auf HPLC-Untersuchungen wird geschätzt, daß etwa 10 bis 15 % der Cytosinreste des DNA-Moleküls sulfoniert sind. Dies entspricht 2 bis 3 % aller Nucleotidreste in einer DNA mit einem G-C-Gehalt von 47 %.
Nach einer Sulfonierung über Nacht wurden 0,6 Volumina Propanol den Modifikationsiösungen zugesetzt, um die modifizierte DNA zu entsalzen. Dieses Gemisch wurde dann 10 min lang in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann verworfen, und das Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 200 µl Hybridisierungslösung suspendiert, um in das eigentliche Hybridisierungsbehältnis überführt zu werden.

Beispiel 2

Laden der DNA auf aktivierte Stäbchen auf einer festen planaren Trägerkarte

Die folgenden Plasmide: pBR322 und HBV, HPV-DNA-Sequenzen, cloniert in PUC, wurden verwendet. Jedes Plasmid, 40 ng pro 4 µl Tropfen, wurde linearisiert, indem 20 5 pro ml mit 50%igen Intervallen ultrabeschallt wurde, indem die Mikrospitze, Position 5, der Output-Kontrolle verwendet wurde, wobei der Output 120 Watt betrug. (Das Beschallungsgerät war Ultrasonic, Inc., W-385, Farmingdale, N.Y., USA). Alternativ wurde das Plasmid durch Spalten mit dem Restriktionsenzym EcoRI unter Verwendung von 3 Einheiten Enzym pro µg Plasmid- DNA für 3 h linearisiert.
Die Plasmid-DNA wurde zum Sieden erhitzt und auf Eis gekühlt, und 4 ul-Tröpfchen dsdnas wurden auf Stäbchen aus Polystyrol mit hoher Schlagfestigkeit oder Nitrocellulose gegeben. Die Tröpfchen wurden durch Verdampfen getrocknet, wobei man entweder die Karte direkt in einen 80ºC-warmen Ofen für 30 min gab oder indem man zuerst die Probe an der Luft 1 h lang trocknete.
Die Stäbchen wurden dann in einer Lösung aus 2 M Guanidinthiocyanat, 2 x SSC (0,3 M NaCl - 0,075 M Natriumcitrat), 40 mM EDTA, 1 % Sarcosin und 1,5 % Poly(acrylsäure); MG 90.000 (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) für 15 min blockiert/beschichtet und dann 15 min lang luftgetrocknet.
Es wurde gefunden, daß frisch hergestelltes 1 M Ammoniumacetat der beste Beladungspuffer ist, verglichen mit anderen Puffern (PBS, Ammoniumcarbonat, Tris-HCl oder Ammoniumcitrat).

Beispiel 3

Hybridisierung

Die Hybridisierungsreaktion, bei der eine bekannte Nucleinsäuresequenz, die auf die aktivierten Stäbchen positioniert ist, die komplementär zu der Ziel-DNA oder -RNA ist, wird wie folgt in der Kammer des Reaktionsbehälters durchgeführt. Die Hybridisierung wurde 1 bis 16 h lang (Übernacht-Inkubation) in der ersten Kammer des Reaktionsbehälters entweder in Lösung A, die 50 % entionisiertes Formamid, 0,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 % SDS und 1,5 % neutralisierte Polyacrylsäure enthält, oder in Lösung B, die 2 M Guanidinthiocyanat, 2 x SSC (0,3 M NaCl + 0,075 M Natriumcitrat), 0,04 M NaEDTA 1 % Sarcosin und 1,5 % Poly(axcrylsäure) enthält, durchgeführt. Beide Lösungen wurden mit 100 ug beschallter Lachssperma-ssDNA supplementiert.
Die Lösung B ergibt einen niedrigen Hintergrund, verglichen mit der Lösung A und mit anderen herkömmlichen Hybridisierungslösungen. Die Lösung B wurde während der ganzen Hybridisierungsassays, die in den Beispielen 3 bis 6 durchgeführt wurde, verwendet.
In einer Hybridisierung über Nacht kann man klar 1 pg der homologen DNA detektieren (Fig. 1). Eine einfache Berechnung, die die Größe der menschlichen DNA und die Anzahl der Basen, die an der Homologie teilnehmen, berücksichtigt, führt zu der Schlußfolgerung, daß man 1 bis 4 kb mit hoher Homologie bei 1 µg menschlicher DNA benötigt, um ein meßbares Signal zu erhalten.

Beispiel 4

System zur Signalerzeugung

Die Detektion der chemisch modifizierten DNA oder RNA kann durch eine immunenzymatische Sandwich-Reaktion ausgeführt werden. Ein monodonaler Antikörper erkennt spezifisch die Sulfongruppen auf der modifizierten DNA. Ein Enzym-Anti-Immunglubolin-Antikörper-Konjugat bindet dann an den monoclonalen Antikörper. Das Enzym wandelt ein System mit einem löslichen chromogenen Substrat (NBT-BCIP) in einen löslichen Farbstoff um, der an der exakten Stelle der Immunreaktion ausfällt. Das gefärbte Produkt zeigt die Anwesenheit sulfonierter DNA an.
Es gibt mehrere Alternativen für die vorstehend beschriebene Sichtbarmachung und man kann die Verwendung von Fluorescein oder mit kolbidalem Gold markiertem Anti-Maus-Immunglobulin bevorzugen, wodurch eine Interferenz mit Gewebsenzymen umgangen wird. Andere Möglichkeiten sind der Ersatz des mit alkalischer Phosphatase markierten Konjugats mit einem Konjugat aus Peroxidase oder Glucosidase. Die Optimierung des vollständigen Verfahrens (einschließlich Waschungen und Blockierlösungen) sollte vor der Verwendung dieser Alternativen durchgeführt werden.
Ein biotinylierter monodonaler Antikörper gegen sulfonierte DNA und Streptavidin in Konjugation an alkalische Phosphatase wurde erfolgreich verwendet, wobei eine viel stärkere Reaktion erhalten wurde, als mit dem Ziege-Anti-Maus-IGG in Konjugation an alkalische Phosphatase.
Alternative Chromogene. Das bereitgestellte chromogene System kann 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitro- Blue-Tetrazolium (NBT) sein. BCIP kann allein als Chromogen mit verringerter Empfindlichkeit verwendet werden. Eine Kombination aus Naphthol-As-Mx-phosphat und Fast-Red ergibt eine gute Empfindlichkeit und eine rote Farbe, ist aber nicht so stark wie BCIP-NBT.

Beispiel 5

Messung und quantitative Bestimmung der Reaktionen

Combscan ist im Handel erhältlich von Organics Ltd. und ist ein schnelles 8-Bit-mikroprozessorkontrolliertes Reflektometer. Es benötigt etwa 60 Ablesungen jedes Stäbchens und ordnet einen Wert zwischen 0 bis 255 der Lichtmenge zu, die die Diode erreicht. Unter Verwendung des ROM-geätzten Algorithmus wird der Farbfleck von dem Untergrund unterschieden und dessen Wert wird gespeichert. Alle Ablesungen werden durch Vergleich mit der Kontrolle, Berechnung des Verhältnisses und Umwandlung der Farbdichten in tatsächliche Titer gemäß auswählbaren Programmen analysiert.

Beispiel 6

Detektion und Typisierung von Human-Papillomaviren (HPV)
Das squamöse Zellkarzinom des Uteruszervix ist eines der häufigsten Krebsarten bei Frauen. Jüngste Studien, bei denen die Technik der DNA-Hybridisierung und der molekularen Clonierung verwendet wurde, lieferten den Nachweis für die Anwesenheit von DNA-Sequenzen von HPV-Typen 16 und 18 beim Hauptteil der zervikalen Tumorzellinien, wobei im Gegensatz HPV-Typen 68 und 11 üblicherweise in Biopsien gutartiger Kondylome gefunden werden. Die zervikalen Karzinomazelllinien HeLa und Caski stammten aus einer Tumorbiopsie. Es ist daher angebracht, daß diese Zellinien als Modell zur Entwicklung und zum Testen von Protokollen auf HPV verwendet werden.
DNA wurde aus Zervixbiopsien und aus Caski- und HeLa-Zellen extrahiert. (HeLa-ATCC-CCL2-Epitheloid-Karzinom, Zervix, Human, Caski-ATCC-CRL 1550 humanes zervikales epidermoides Karzinom. Die Zellinien wurden in Dulbecco modifizierten Eagle-Medium, das mit 100 % fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 µ/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 0,25 µg/ml Fungizon supplementiert war, gehalten.) Die DNA wurde markiert und an drei verschiedene Sonden hybridisiert, die auf den festen stäbchenförmigen Trägerkunststoffkarten, wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, immobilisiert waren. Nichtspezifische menschliche DNA-Sequenzen wurden an den mittleren Fleck gebunden und eine Sonde mit HPV 6 und 11 wurde an den unteren Fleck gebunden, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die minimale Anzahl der Caski- und HeLa-Zellen, die benötigt werden, um spezifische HPV-Sequenzen zu detektieren, betrug 5 x 10³ und 5 x 10&sup4; Zellen. Im Gegensatz dazu ergaben 10&sup4; menschliche embryologische Zellen keine spezifische Reaktion. Elf klinische Biopsien wurden getestet. Es wurde gefunden, daß vier HPV 6/11 enthielten und eine HPV 16/18. In den anderen wurde eine Reaktion nur mit nichtspezifischen Humansequenzen erhalten (Fig. 2).
5 x 10&sup4; HeLa-Zellen entsprechen 1,5 µg Gesamt-Human-DNA, gemessen während der Präparation der in das Genom integrierten Genom-DNA. Die HPV-Homologieregion beträgt etwa 1 kb. Die verwendete HeLa-Zellinie ergab nur 2 bis 4 Kopien HPV 18 (Pater MM, Pater A (1985) Virology 145: 313-318). So erreicht man schließlich eine Empfindlichkeit von etwa 1 pg spezifischer DNA. Unter Verwendung menschlicher Papillomavirustyp-16 und -18-Sequenzen bei den Karzinomzellinien des Zervix benötigt man etwa 5 x 10&sup5; Zellen, um ein einzelnes Gen von 1 kb in dem Hybridom-System zu detektieren. Diese Ergebnisse wurden auch mit Caski-Zellen bestätigt (mit 50 bis 200 Kopien HPV 16).

Fig. 1.

Korrelation zwischen der Konzentration der markierten DNA und der aus der DNA-DNA-Hybridisierung erhaltenen Farbintensität, 40 ng pBR322 wurden auf jedem Stäbchen immobilisiert und dann 16 h lang mit verschiedenen Konzentrationen sulfonierter pBR322-DNA hybridisiert. Die Intensität des Farbpräzipitats wurde durch Combscanr überwacht. Die Vorrichtung kann 10 pg homologe DNA in 2stündiger Hybridisierung und 1 pg in einem Übernacht-Hybridisierungsassay detektieren.

Fig. 2.

Detektion und Typisierung von menschlichen Papillomaviren (HPV) in Zellkulturen und Patientenbiopsien. Die DNA wurde aus Zervixbiopsien und aus Caski- und HeLa-Zellen extrahiert. Die DNA wurde markiert und mit drei verschiedenen immobilisierten Sonden auf dem Plastikstäbchen hybridisiert. A) Eine Sonde nichtspezifischer Human-DNA-Sequenzen wurde auf den oberen Fleck hybridisiert. B) Eine Sonde der HPV- Typen 16 und 18 wurde an den mittleren Fleck gebunden, und eine Sonde für HPV-Typen 68 und 11 wurde an den unteren Fleck gebunden. Die folgenden Proben und Kontrollen wurden getestet:

Stäbchen 1:

Positivkontrolle; Nr. 2) Negativkontrolle (Human-DNA), Nr. 3) Human-DNA mit einem 2 kb-Fragment HPV 11, 4) 5 x 10&sup4; Caski-Zellen, 5 bis 12) Humanbiopsien.

Beispiel 7

Detektion von Mycoplasmen und Typisierung

Zellkulturen sind oft mit Mycoplasmen infiziert. Da die Zeichen einer Mycoplasmenkontamination typischerweise nicht ausgeprägt sind, sind "saubere" Kulturen von verunreinigten Kulturen nicht leicht unterscheidbar. Unter den Mycoplasmaarten, die Zellkulturen infizieren, wird M. hyorhinis oft nicht nachgewiesen, da es häufig nicht in Kulturmedien wächst. So verließen sich herkömmliche Detektionsverfahren auf indirekte Methoden, wie die DNA-Anfärbung, enzymatische Reaktionen, spezifische Antikörper und die Infektion von Indikatorzellinien. Alle diese Verfahren leiden an einem Grad an Unspezifität, niedriger Empfindlichkeit und hohen Kosten.
Das erfindungsgemäße Verfahren überwindet diese Hindernisse. 40 ng Gesamt-DNA, extrahiert aus sechs Mycoplasmaarten, wurde an zwei getrennte Stäbchen geknüpft. Eine Zentrifugation mit langsamer Geschwindigkeit wurde verwendet, um die Mycoplasmen und die Zellkultur zu trennen. Die Mycoplasmenzellen aus dem Überstand der niedrigen Geschwindigkeit wurden durch Zentrifugation in eine Mikrozentrifuge für 10 min zusammengeballt. Die Mycoplasmazellen wurden 5 min zur DNA- Extraktion erhitzt, und die Sulfonierung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt und über Nacht ausgeführt. Die markierte DNA wurde durch Fällen mit einem gleichen Volumen Propanol entsalzt, und das so erhaltene Pellet wurde in dem Hybridisierungspuffer aufgelöst. Die Hybridisierung wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
Wie aus Fig. 3 hervorgeht, können Mycoplasmen nachgewiesen und mit hoher Empfindlichkeit und hoher Spezifität entweder in der Zellkultur oder in axzenischen Mycoplasmakulturen typisiert werden.

Fig. 3.

Detektion und Typisierung von Mycoplasmen in Gewebskultur. Mycoplasmen-DNA aus entweder axzenischen Mycoplasmakulturen oder aus kontaminierten Zellkulturen wurden extrahiert und modifiziert. Die Hybridisierung wurde in dem Reaktionsbehältnis 16 h lang durchgeführt. Sechs unterschiedliche Mycoplasmen-DNAs wurden auf sechs Sätze zu je zwei Stäbchen aufgetropft. Das Auftropfen wurde entgegen dem Uhrzeigersinn auf den zwei Stäbchen durchgeführt, wobei mit dem obersten Fleck auf dem linken Stäbchen bis zu dem oberen Fleck auf dem rechten Stäbchen begonnen wurde: a) M. pneumoniae; b) M. hyorhinis; c) M. arginini; d) M. capricolium; e) M. oral und f) Acholeplasma laidlawii. Die Stäbchenpaare wurden dann mit der DNA, die aus den folgenden Mycoplasmen extrahiert wurde, hybridisiert: 1) M. arginini-Zellen, 2) M. hyorhinis-Zellen, 3 und 6: kontaminierte Gewebskultur, 4) 110 ng M. pneumoniae-Gesamt-DNA und 5) M. orale-Zellen.
Die Mycoplasmenstämme wurden, wie von Leach, R&sub4;H. (1983) in Preservation of mycoplasma cultures and cultures collection, Methods in Mycoplasmamology, Bd. 1 (Hrgs. Razin und J. G. Tully) Academic Press, NY., 5. 197-204, beschrieben, gezüchtet.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder des Vorhandenseins eines Gens durch Testen auf das Vorhandensein und/oder die Menge mindestens einer Zielnukleinsäuresequenz in mindestens einer teilweise denaturierten, verdächtigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufen

a) die teilweise denaturierte Zielnukleinsäuresequenz durch Sulfonierung unter Verwendung von Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisulfiten, modifiziert und das so erhaltene Sulfon durch Umsetzung mit O-Methylhydroxylamin stabilisiert;

b) die modifizierte Zielnukleinsäuresequenz von (a) mit mindestens einer bekannten Nukleinsäuresequenz, die den Zielnukleinsäuresequenzen komplementär ist und selektiv auf Vorsprüngen eines festen Trägers angebracht sind, in Kontakt bringt, um einen hybridisierten Komplex zu bilden;

c) den hybridisierten Komplex (b) mit einem für den sulfonierten Anteil der Zielnukleinsäuresequenz spezifischen Antikörper in Kontakt bringt, um einen antikörpergebundenen Komplex zu bilden,

wobei man das in Kontakt bringen (b) unter hybridisierenden Bedingungen in einem Reaktionsgefäß mit einer Reihe von einzelnen Kompartmenten, die das Eintreten des hybridisierten Komplexes (b) erlauben, und zusätzlichen einzelnen Kompartmenten zur separaten Durchführung von signalerzeugenden Reaktionen durch aufeinanderfolgendes Eintauchen der Vorsprünge durchführt;

d) die Anwesenheit und/oder die Menge der Zielnukleinsäuresequenz als Indikation der Erkrankung mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste planare Träger eine Karte mit einer Reihe von Vorsprüngen auf der Kante der Karte ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei jeder der Vorsprünge eine oder mehrere komplementäre Nukleinsäuresequenzen trägt, die einen hybridisierten Komplex mit den Zielnukleinsäuresequenzen bilden können.

4. Verfahren nach Anspruch 2, umfassend weiter in (b) mindestens eine nichtkomplementäre säuresequenz auf den Vorsprüngen zur internen Kontrolle des Assays.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der feste Träger durch ein Polystyrol mit hoher Schlagfestigkeit gebildet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Messung mittels Computer durchgeführt wird, wobei die Ergebnisse jeder der Reaktionen, die auf dem festen Träger stattfinden, abgelesen werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper mit einem Mittel markiert ist, das so angepaßt ist, daß es die Anwesenheit des Antikörpers anzeigt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mittel ein markierter Antikörper ist.

10. Kit, umfassend die Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hybridisierungsbedingungen die Verwendung von 2 M Guanidinthiocyanat umfassen.