DE68905633T2 - Markierer der t-zelle aktivierung. - Google Patents
Markierer der t-zelle aktivierung.Info
- Publication number
- DE68905633T2 DE68905633T2 DE8989301341T DE68905633T DE68905633T2 DE 68905633 T2 DE68905633 T2 DE 68905633T2 DE 8989301341 T DE8989301341 T DE 8989301341T DE 68905633 T DE68905633 T DE 68905633T DE 68905633 T2 DE68905633 T2 DE 68905633T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- vol
- cells
- peptide
- nucleic acid
- polypeptide according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 title description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 24
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 16
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract description 8
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N [[4-(4-diazonioiminocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]hydrazinylidene]azanide Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 206010011953 Decreased activity Diseases 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- -1 dinitrophenyl Chemical group 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000005147 toluenesulfonyl group Chemical group C=1(C(=CC=CC1)S(=O)(=O)*)C 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ONOURAAVVKGJNM-SCZZXKLOSA-N (2s,3r)-2-azaniumyl-3-phenylmethoxybutanoate Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)OCC1=CC=CC=C1 ONOURAAVVKGJNM-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical compound [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRYXYRQPMWQIDM-UHFFFAOYSA-N 3-benzoyl-3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1(C(=O)C=1C=CC=CC=1)N1C(=O)C=CC1=O QRYXYRQPMWQIDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100031102 C-C motif chemokine 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710155855 C-C motif chemokine 4 Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VGALFAWDSNRXJK-VIFPVBQESA-N L-aspartic acid beta-benzyl ester Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 VGALFAWDSNRXJK-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;n,n-dimethylformamide Chemical compound ClCCl.CN(C)C=O MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007193 modulation by symbiont of host erythrocyte aggregation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Electrochromic Elements, Electrophoresis, Or Variable Reflection Or Absorption Elements (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
- Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Zusammensetzungen zur Überwachung des Zustands des Immunsystems; insbesondere stellt die Erfindung Zusammensetzungen zum Nachweis aktivierter T-Zellen durch Nucleinsäurehybridisierungs-Sonden und/oder immunochemische Assays zur Verfügung.
- Die Regulierung normaler immunologischer Reaktivität steht in enger Beziehung zum Gleichgewicht zwischen positiven und negativen Einflüssen, die durch verschiedene Subpopulationen der T-Zellen ausgeübt werden. Abnorm hyperaktive und hypoaktive T-Zellen sollen mit mehreren Immunerkrankungen, einschließlich AIDS (Hypoaktivität und Zerstörung der Helfer T-Zell Subpopulation) und einer Vielfalt von Autoimmunerkrankungen, wie z.B. MHC-verbundene Autoimmunerkrankung (z.B. Lupus erythematodes), die durch übermäßige Produktion von γ-Interferon durch T-Zellen verursacht zu werden scheint, im Zusammenhang stehen.
- T-Zellen sind durch bestimmte phänotypische Zelloberflächen-Marker identifiziert worden. Das Oberflächenmolekül T8 z.B., das auf menschlichen T-Zellen der cytotoxischen Subpopulation vorhanden ist, kann durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung muriner anti-humaner monoclonaler Antikörper, wie z.B. OKT8 (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) oder Leu-2 (Becton Dickinson, Mountain View, CA), nachgewiesen werden. Solche Marker sind jedoch bestenfalls nur für Messungen der Größe von Subpopulationen nützlich; sie verlangen nicht zwingend, daß die Zellen Produkte abscheiden, die mit einem aktivierten Zustand verbunden sind.
- Viele Assays sind entwickelt worden, die entweder auf immunochemischem Nachweis von Proteinen: z.B. US-Patente 4 562 003, 4 474 892 und 4 427 782; oder auf dem Nachweis von Nucleinsäuren basieren, entweder RNA oder DNA, die in Zielzellen vorhanden sind, oder von diesen erzeugt werden: z.B. Petterssen et al., Immunology Today, Bd. 6 S. 268-272 (1985), Falkow et al., US-Patent 4 358 535 und Gillespie et al., US-Patent 4 483 920. Die letzteren Assays verwenden Nucleinsäure-Sonden, im allgemeinen fluoreszenz-markierte oder radioaktiv-markierte DNAs oder RNAs, die vorzugsweise mit komplementären Ziel-Nucleinsäuren in passend vorbereiteten Proben oder Geweben hybridisiert werden können. Die Assays können eine Vielfalt von Formen annehmen: z.B. RNA-Blotting: Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 77, S. 5201-5205 (1980); Dot-Hybridisierung: White et al., J. Biol. Chem., Bd. 257, S. 8569-8572 (1982); Southern-Blotting: Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98, S. 503-517; und in-situ- Hybridisierung: Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 83, S. 2934-2938 (1986); und Angerer et al., Genetic Engineering, Bd. 7, S. 43-65, (1985).
- Im Hinblick auf den gegenwärtigen Mangel geeigneter direkter Meßmethoden für abnorme T-Zellaktivierung, würden empfindliche immunochemische Assays oder Nucleinsäure-Sonden zum Nachweis aktivierter T-Zellen wertvolle diagnostische Arbeitsmittel darstellen, wenn sie verfügbar wären.
- Die Erfindung umfaßt ein ausgereiftes humanes Protein, das durch aktivierte T-Zellen erzeugt ist, hier als H400 bezeichnet und immunogene Peptidfragmente davon, die alle für die Erzeugung von Antikörpern nützlich sind, die in immunochemischen Assays für aktivierte T-Zellen verwendet werden. Die Aminosäuresequenz, die dem offenen Leseraster, das H400 codiert, entspricht, ist in Formel 1 wiedergegeben:
- Die Erfindung umfaßt weiterhin monoclonale Antikörper, die für das ausgereifte H400 Protein und seine immunogenen Peptidfragmente spezifisch sind und Nucleinsäuren, die H400 und Peptidfragmente davon codieren, die beim Aufbau von Nucleinsäure-Sonden für H400 Messenger-RNA (mRNA) nützlich sind. Die bevorzugte Nucleotidsequenz des offenen Leserasters, das H400 codiert, wird in Formel II wiedergegeben:
- Der hier verwendete Ausdruck "ausgereift" in Bezug auf Protein H400 bedeutet die abgesonderte Form von H400, d.h. die Form von H400, die durch proteolytische Abspaltung des Signalpeptids entsteht.
- Die hier verwendete Bezeichnung "immunogenes Peptid" in Bezug auf H400 bedeutet ein Peptid (1), das aus 6 bis 40 Aminosäuren besteht, mit einer Sequenz, die mit einem gleich langen Anteil des ausgereiften H400 identisch ist und (2) das in Konjugation mit einem Trägerprotein in der Lage ist, Antikörper, die mit ausgereiftem H400 kreuzreagieren, hervortreten zu lassen.
- Die hier verwendete Bezeichnung "Nucleinsäurefragment" bedeutet eine Nucleinsäure, die aus etwa 18 bis 264 Nucleotiden besteht, mit einer Sequenz, die zu einem gleich langen Anteil einer durch Formel II definierten Nucleinsäure komplementär ist.
- Ein Plasmid, hier als pcD(SRα)-H400 bezeichnet, das eine cDNA-Insertion enthält, die H400 codieren kann, wurde (in seinem E. coli JM101 Wirt) im American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Zugangs-Nr. 67614 hinterlegt.
- Figur 1 beschreibt diagrammartig das Plasmid pcD(SRα))-H400 und ausgewählte Restriktions-Schnittstellen.
- Figur 2 listet die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion des pcD(SRα)-H400 auf und gibt die Aminosäuresequenz an, die dem größten offenen Leseraster entspricht.
- Die Erfindung beruht auf der Entdeckung eines neuen Proteins, H400, das spezifisch von aktivierten T-Zellen gebildet wird. Das Protein H400 wird von dem größten offenen Leseraster der cDNA-Insertion des pcD(SRα)-H400 codiert. Die Erfindung zielt auf Verbindungen ab, die beim Nachweis von Zellen, die entweder das H400-Protein oder mRNA-Transcripte, die das H400-Protein codieren können, erzeugen, nützlich sind. Diese Verbindungen schließen das ausgereifte Protein H400, seine immunogenen Peptidfragmente, monoclonale, für ausgereiftes H400 oder dessen immunogene Peptidfragmente spezifische Antikörper, Nucleinsäuren, die H400 codieren können und Nucleinsäurefragmente zum Aufbau von Nucleinsäuresonden, die für mRNA, die H400 codiert, spezifisch sind, ein.
- H400 kann durch Expression einer es codierenden Nucleotidsequenz in einem geeigneten Expressionssystem hergestellt werden. Mögliche Typen von Wirtszellen schließen Bakterien, Hefen, Insekten, Säuger und dergleichen ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Das Auswählen eines Expressionssystems und das Optimieren der Proteinbildung durch das System, erfordert das In-Betracht-ziehen und Ausbalancieren vieler Faktoren, einschließlich
- (1) der Natur des zu exprimierenden Proteins, z.B. kann das Protein für manche Wirtsorganismen giftig sein, es kann für den Abbau durch Wirts-Proteasen anfällig sein oder es kann in inaktiven Konformationen oder in einer unlöslichen Form in manchen Wirten exprimiert sein,
- (2) der Natur der Messenger-RNA (mRNA), die dem interessierenden Protein entspricht, z.B. kann die mRNA Sequenzen haben, die besonders anfällig für Wirts-Endonucleasen sind, die die funktionelle Lebensdauer der mRNA drastisch verkürzen, oder die mRNA kann Sekundärstrukturen bilden, die Startcodon oder Ribosomenbindungsstelle maskieren, wodurch der Beginn der Translation in einigen Wirten gehemmt wird,
- (3) der Auswahl, Verfügbarkeit und Anordnung wirtsverträglicher Expressions-Kontroll-Sequenzen in den die codierende Region flankierenden 3'- und 5'-Regionen - diese schließen Promotoren, 5'- und 3'-Schutzsequenzen, Ribosomenbindungsstellen, Transcriptionsterminatoren, Enhancer, Polyadenylat-Additionsstellen, Cap-Strukturstellen, Intron-Spleißstellen und dergleichen ein,
- (4) ob das Protein eine Sekretions-Signalsequenz, die durch einen Wirt verstümmelt sein kann, besitzt oder ob eine Expressions-Kontrollsequenz, die eine dem Wirt eigene Signalsequenz codiert, auf die Region gespleißt werden muß, die das ausgereifte Protein codiert,
- (5) der verfügbaren Formen und Wirksamkeiten der Transfektion oder Tranformation des Wirts und ob vorübergehende oder stabile Expression gewünscht ist,
- (6) des Umfangs und der Kosten des für die Expression des Proteins gewünschten Wirtskultursystems,
- (7) ob und welcher Typ posttranslationeller Modifikationen gewünscht ist, z.B. kann der Umfang und die Art einer gewünschten Glycosylierung die Wahl des Wirts beeinflussen,
- (8) der Einfachheit, mit der das exprimierte Protein von Proteinen und anderen Materialien der Wirtszellen und/oder des Kulturmediums abgetrennt werden kann, z.B. kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, ein Fusionsprotein mit einer speziellen Signalsequenz zu exprimieren, die bei späteren Reinigungsschritten behilflich ist (z.B. Sassenfeld et al., Biotechnology, Januar 1984),
- (9) der Stabilität und Anzahl der Kopien eines bestimmten Vektors in einem ausgewählten Wirt, z.B. Hofschneider et al., Hrsg., Gene Cloning in Organisms Other than E. Coli (Springer Verlag, Berlin 1982) und
- (10) ähnlicher, dem Fachmann bekannter Faktoren.
- Viele Veröffentlichungen, die einen Leitfaden für die Auswahl und/oder Modifikationen spezifischer Expressionssysteme im Licht der angesprochenen Faktoren anbieten, sind verfügbar: z.B. de Boer und Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", S. 205-247, in Kroon, Hrsg., Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), verschiedene E. coli Expressionssysteme; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Bd. 16, 4. Auflage, S. 349-379 (1984) und Banerji et al., Genetic Engineering, Bd. 5, S. 19-31 (1983) geben einen Überblick über Methoden zur Transfektion und Transformation von Säugerzellen; Reznikoff und Gold, Hrsg., Maximizing Gene Expression (Butterworth, Boston, 1986) geben einen Überblick über ausgewählte Themen der Genexpression in E. coli, Hefen und Säugerzellen; und Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworth, Boston 1986) gibt einen Überblick über Expressionssysteme der Säuger.
- In ähnlicher Weise stehen viele Veröffentlichungen zur Verfügung, die Techniken und Bedingungen zum Verknüpfen und/oder Manipulieren spezifischer cDNAs und Expressions- Kontrollsequenzen beschreiben, um Expressionsvektoren passend für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung zu erzeugen und/oder zu modifizieren: z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982); Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. I und II (IRL Press, Oxford, 1985); und Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (John Wiley & Sons, N. Y., 1984). Im allgemeinen können innerhalb eines Expressionsvektors verschiedene Stellen für die Insertion der cDNA der Erfindung ausgewählt werden. Diese Stellen sind für gewöhnlich durch die Restriktions-Endonuklease gekennzeichnet, die sie abschneidet und werden vom Fachmann leicht erkannt. Verschiedene Methoden zur Insertion von DNA Sequenzen in diese Stellen, um rekombinante DNA-Moleküle zu bilden, sind auch wohl bekannt. Diese schließen z.B. das Schwanzbilden von dG-dC oder dA-dT, direkte Ligasierung, synthetische Linker, Exonuklease und Polymerase-gekoppelte Reparatur-Reaktionen, gefolgt von Ligasierung, oder Erweiterung des DNA-Stranges mit DNA-Polymerase und einer passenden Einstrang-Matritze, gefolgt von Ligasierung ein.
- Oft muß ein Vektor, der die cDNA der Erfindung enthält, in großer Menge vorliegen, bevor Transfektion und/oder Transformation der Zellen in eine Wirtskultur stattfinden kann. Zu diesem Zweck wird der Vektor häufig ohne signifikante Expression in einem Oragnismus (dem clonenden Wirt), der ein anderer, als der für die Expression endgültig benutzte ist, repliziert. In solchen Fällen werden die Vektoren nach der Vermehrung von dem clonenden Wirt unter Verwendung von Standardtechniken, wie sie z.B. von Maniatis et al., (oben zitiert) offenbart sind, abgetrennt.
- Vorzugsweise wird H400 durch Exprimieren der H400-cDNA, die von pcD(SRα)-H400 in einer für pcD Vektoren geeigneten Wirtszelle getragen wird, z.B. COS Affenzellen (von ATCC unter den Zugangs-Nr. CRL 1650 oder CRL 1651) C127 Maus-Milchdrüsen-Tumorzellen (von ATCC unter der Zugangs-Nr. CRL 1616), oder Maus L Zellen gebildet. Eukaryotische Wirte können das Signalpeptid von dem frisch translatierten H400 Polypeptid abspalten, um das ausgereifte H400 Polypeptid zu bilden. Eukaryotische Wirte können auch andere posttranslationelle Modifikationen erzeugen, wie z.B. Glycosylierung, die als Antigene von Bedeutung sein können.
- Die Erzeugung von H400 in einem bakteriellen Expressionssystem verlangt, daß die Spaltstelle des Signalpeptids vorbestimmt ist, entweder für direkte Expression einer Nucleinsäure, die das ausgereifte H400 codiert, oder zur Kopplung solch einer Nucleinsäure mit einer bakteriellen Sequenz, die ein endogenes Signalpeptid codiert. Um solche Vorhersagen mit einem hohen Genauigkeitsgrad zu machen, sind empirische Regeln entwickelt worden: z.B. von Heijne, Eur. J. Biochem., Bd. 133, S. 17-21 (1983); J. Mol. Biol., Bd. 184, S. 99-105 (1985); Nucleic Acids Research, Bd. 14, S. 4683-4690 (1986); und Perlman et al., J. Mol. Biol., Bd. 167, S. 391-409 (1983). Von Heijnes Regeln geben an, daß ausgereiftes H400 mit Alanin in Position 23 unter Berücksichtigung der N-terminalen Aminosäure der Formel I beginnt; die vorhergesagte ausgereifte Sequenz ist unten in Formel III dargestellt.
- Ausgereiftes H400 wird wie folgt durch COS 7 Zellen, die vorübergehend mit pcD(SRα)-H400 transfiziert sind, gebildet. Einen Tag vor der Transfektion werden etwa 10&sup6; COS 7 Affenzellen auf einzelnen 100 mm Platten in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DME), das 10% fötales Kälberserum und 2 mM Glutamin enthält, ausgesät. Um die Transfektion durchzuführen, wird das Medium von jeder Platte abgesaugt und durch 4 ml DME, das 50 mM Tris HCl pH 7,4, 400 ug/ml DEAE- Dextran und 50 ug der zu testenden Plasmid-DNA enthält, ersetzt. Die Platten werden 4 Stunden bei 37 ºC inkubiert, dann wird das DNA-enthaltende Medium entfernt, und die Platten werden zweimal mit 5 ml serumfreiem DME gewaschen. DME wird den Platten wiederum zugefügt, die dann weitere 3 Stunden bei 37 ºC inkubiert werden. Die Platten werden einmal mit DME gewaschen, dann wird DME, das 4% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, Penicillin und Streptomycin enthält, zugegeben. Dann werden die Zellen 72 Stunden bei 37 ºC inkubiert. Das Wachstumsmedium wird gewonnen und H400 daraus mit Standardmethoden gereinigt.
- Die vorliegende Erfindung schließt Peptide ein, die von ausgereiftem H400 abstammen, die Immunogene bilden, wenn sie mit einem Träger konjugiert sind. Der Begriff Immunogen, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Substanz, die in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Der Begriff Träger, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine beliebige Substanz, die, wenn sie chemisch mit einem Peptid der Erfindung konjugiert ist, einem Wirtsorganismus, der mit dem entstandenen Konjugat immunisiert ist erlaubt, für das konjugierte Peptid spezifische Antikörper zu erzeugen. Träger schließen rote Blutkörperchen, Bakteriophagen, Proteine und synthetische Teilchen, wie Agarosekugeln ein. Bevorzugte Träger sind Proteine, wie z.B. Serumalbumin, γ-Globulin, Hämocyanin der Lochschnecke, Thyreoglobulin, Ovalbumin, Fibrinogen oder dergleichen.
- Peptide der Erfindung werden hinsichtlich ihrer Positionen innerhalb der folgenden Aminosäuresequenz des ausgereiften H400 definiert:
- Aminosäuren der Formel III werden nach dem endständigen N des ausgereiften H400-Polypeptids numeriert. So ist Ser&sub5; Serin in Position 5. Peptide werden als Fragmente des ausgereiften H400-Polypeptids definiert. Daher ist das hier bezeichnete Peptid Ser&sub5; - Cys&sub1;&sub1; das Peptid Ser-Asp-Pro-Pro- Thr-Ala-Cys. Peptidgruppen der Erfindung werden auch in Fragmentabschnitten des ausgereiften H400-Polypeptids definiert. So besteht die hier als [Ser&sub5; - Cys&sub1;&sub1;]&sub5;&submin;&sub6; bezeichnete Gruppe aus allen 5- und 6-Aminosäurepeptiden, (z.B. alle 5- und 6-meren), deren Sequenzen identisch mit allen Ser&sub5; - Cys&sub1;&sub1; Peptiden oder Teilen sind. Das heißt, daß die Gruppe aus den folgenden fünf Peptiden besteht: Ser-Asp-Pro-Pro- Thr-Ala, Asp-Pro-Pro-Thr-Ala-Cys, Ser-Asp-Pro-Pro-Thr, Asp-Pro-Pro-Thr-Ala und Pro-Pro-Thr-Ala-Cys.
- Im allgemeinen schließt die Erfindung alle 6- bis 24-meren Peptidfragmente ausgereifter H400, z.B. [Ala&sub1; - Asn&sub6;&sub8;]&sub6;&submin;&sub2;&sub4; ein. Vorzugsweise schließt die Erfindung alle 6- bis 24-meren Peptidfragmente, die die N-terminalen oder C-terminalen Sequenzen des ausgereiften H400-Polypeptids umfassen, oder die Sequenzen des ausgereiften H400-Polypeptids entsprechen, die eine höhere als mittlere Hydrophilie besitzen, ein, wie durch Hopp-Woods-Analyse oder verwandte Analysetechniken z.B. Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 3824-3828 (1981) nachgewiesen ist; oder Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., Bd. 157, S. 105-132 (1982). Der letztere Satz an bevorzugten Peptiden der Erfindung (jene mit höherer als mittlerer Hydrophilie) schließt folgende Gruppen ein: [Ala&sub1; - Ser&sub2;&sub0;]&sub6;&submin;&sub2;&sub0; und [Thr&sub4;&sub3; - Asn&sub6;&sub8;]&sub6;&submin;&sub2;&sub4;.
- Für Aminosäuren werden überall Standardsymbole verwendet: z.B. Cohen, "Nomenclature and Symbolism of alpha-Amino Acids", Methods in Enzymology, Bd. 106, S. 3-17 (Academic Press, N.Y., 1984). Dementsprechend wird auf Tabelle I dieser Literaturangabe ausdrücklich Bezug genommen.
- Peptide der Erfindung können mit Standardtechniken synthetisiert werden, z.B. Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984). Vorzugsweise wird ein kommerzieller automatischer Synthesizer verwendet, z.B. Vega Biochemicals (Tucson, AZ) Modell 296A oder B oder Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) Modell 430A.
- Peptide der Erfindung können durch Festphasen-Synthese auf einem vernetztem Polystyrolträger von dem carboxylterminalen Rest ausgehend und die Aminosäuren schrittweise anfügend, bis die gesamte Kette gebildet ist, aufgebaut werden. Wir führten die Synthese auf einem voll automatischen Peptid- Synthesizer (Applied Biosystms, Inc. model 430A) durch. Folgende Veröffentlichungen führen durch die Chemie, die sich während der Synthese abspielt: Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Bd. 85, S. 2149 (1963); Kent et al., S. 185, in Peptides 1984, Ragnarsson, Hrsg. (Almquist and Weksell, Stockholm, 1984); Kent et al., S. 217 in Peptide Chemistry 84, Izumiya, Hrsg., (Protein Research Foundation, B. H. Osaka, 1985); Merrifield, Science, Bd.232, S. 341-347 (1986); und Literaturstellen, die in dieser letzten Literaturstelle angegeben sind.
- Bei der Festphasen-Synthese ist es von höchster Wichtigkeit, synthetische Nebenprodukte, die in erster Linie Terminations-, Deletions- oder Modifikationspeptide sind, zu entfernen. Die meisten Nebenreaktionen können durch Verwendung reiner, gut charakterisierter Harze, reiner Aminosäurederivate, reiner Lösungsmittel und die Auswahl sauberer Kupplungs- und Spaltungsmethoden und Reaktionsbedingungen ausgeschaltet oder auf ein Mindestmaß herabgesetzt werden: z.B. Barany and Merrifield, The Peptides, Cross and Meienhofer, Hrsg., Bd. 2, S. 1-284 (Academic Press, New York, 1979). Es ist wichtig, die Kupplungsreaktionen zu überwachen, um den vollständigen Reaktionsablauf nachzuweisen, so daß Deletionspeptide, denen ein oder mehrere Reste fehlen, vermieden werden. Die quantitative Ninhydrinreaktion ist für diesen Zweck nützlich, Sarin et al., Anal. Biochem., Bd. 117, S. 147 (1981). N-α-t-butyloxycarbonylaminosäuren wurden mit geeigneten Seitenkettenschutzgruppen, die bei den Bedingungen zum Kettenaufbau stabil, aber gegen starke Säuren labil sind, eingesetzt. Nach dem Aufbau der geschützten Peptidkette, wurden die Schutzgruppen entfernt, und die Peptid- Ankerbindung wurde mit niedrigen und dann hohen Konzentrationen wasserfreien Hydrogenfluorids in Gegenwart eines Thioester-Spülmittels gespalten: Tam et al., J. Amer. Chem. Soc., Vol. 105, S. 6442 (1983).
- Die verwendeten Seitengruppenschutzgruppen waren Asp(OBzl), Glu(OBzl), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Lys(Cl-Z), Tyr(Br-Z), Arg(NGTos), Cys(4-MeBzl) und His(ImDNP). (Bzl = Benzyl; Tos = Toluolsulfonyl; DNP = Dinitrophenyl; Im = Imidazol; Z = Benzyloxycarbonyl). Die verbleibenden Aminosäuren hatten keine Schutzgruppen an ihren Seitenketten. Alle Aminosäuren stammten von Peninsula Laboratories, außer tBoc-His(ImDNP), das von Chemical Dynamics war und vor Verwendung aus Ethanol umkristallisiert wurde. [tBoc = N-α-t-butyloxycarbonyl]. Bei jedem Cyclus wurde das tBoc-N-α-geschützte Peptidharz 65%-iger Trifluoressigsäure (von Eastman Kodak) (vor Verwendung destilliert) in Dichlormethan (DCM) (Mallinckrodt) ausgesetzt: Zuerst 1 Minute und dann 13 Minuten, um die N-α-Schutzgruppe zu entfernen. Das Peptidharz wurde mit DCM gewaschen und dann zweimal mit 10%-igem Diisopropylethylamin (DIEA) (Aldrich) in Dimethylformamid (DMF) (Applied Biosystems), jeweils 1 Minute neutralisiert. Der Neutralisation folgte Waschen mit DMF. Das Kuppeln wurde mit einem vorher hergestellten symmetrischen Anhydrid der Aminosäure in DMF während 16 Minuten durchgeführt. Das vorher hergestellte symmetrische Anhydrid wurde mit dem Synthesizer durch Auflösen von 2 mMol Aminosäure in 6 ml DCM und Zufügen von 1 mMol Dicyclohexylcarbodiimid (Aldrich) in 2 ml DCM hergestellt. Nach 5 Minuten wurde die aktivierte Aminosäure in ein separates Gläschen überführt und DCM wurde durch Spülen mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom abgedampft. DCM wurde in verschiedenen Stufen während des Spülen durch DMF (insgesamt 6 ml) ersetzt. Nach dem ersten Kuppeln wurde das Peptidharz mit DCM, 10% DIEA in DCM und dann mit DCM gewaschen. Für das erneute Kuppeln wurde die gleiche Aminosäure und das Aktivierungsmittel, Dicyclohexylcarbodiimid nacheinander in das Reaktionsgefäß überführt. Nach der in situ Aktivierung und 10 Minuten Kuppeln, wurde ausreichend DMF zugefügt, um ein 50%-iges DMF-DCM Gemisch zu erhalten, und das Kuppeln wurde 15 Minuten fortgesetzt. Arginin wurde als ein vorher mit Hydroxybenzotriazol (Aldrich) gebildeter Ester in DMF 60 Minuten gekuppelt und dann in der gleichen Art wie die anderen Aminosäuren erneut gekuppelt. Asparagin und Glutamin wurden zweimal als vorher gebildete Hydroxybenzotriazolester in DNF jeweils 40 Minuten gekuppelt. Bei jedem Rest wurde das Harz nach dem zweiten Kuppeln gewaschen, und eine Probe wurde automatisch zur Überwachung verbliebener ungekuppelter α-Amin-Reste mittels der quantitativen Ninhydrinreaktion, entnommen: Sarin et al., (oben zitiert).
- Die allgemeine Technik, synthetische Peptide an einen Träger zu knüpfen, wird in mehreren Veröffentlichungen beschrieben: z.B. Walter and Doolittle, "Antibodies Against Synthetic Peptides", in Genetic Engineering, (Setlow et al., Hrsg.), Bd. 5, S. 61-91 (Plenum Press, N.Y., 1983); Green et al., Cell, Bd. 28, S. 477-487 (1982); Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 3403-3407 (1981); Shimizu et al., US-Patent 4 474 754; und Ganfield et al., US-Patent 4 311 639. Entsprechend wird auf diese Literaturangaben ausdrücklich Bezug genommen. Auch die Techniken, die verwendet werden, um Haptene an Träger zu binden, sind im wesentlichen die gleichen, wie die oben erwähnten Techniken, z.B. Kapitel 20 in Tijssens Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, New York, 1985).
- Die vier gebräuchlichsten Methoden, ein Peptid an einen Träger zu binden, verwenden (1) Glutaraldehyd zur Aminokupplung, z.B. wie bei Kagan and Glick, in Jaffe and Behrman, Hrsg., Methods of Hormone Radioimmunoassay, S. 328-329 (Academic Press, N. Y., 1979) und Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 77, S. 5195-5200 (1980) offenbart; (2) wasserlösliche Carbodiimide zur Carboxyl-an-Amino-Kupplung, z.B. wie bei Hoare et al., J. Biol. Chem., Bd. 242, S. 2447-2453 (1967) offenbart; (3) Bis-diazobenzidin (BDB) für die Tyrosin-an-Tyrosin Seitenketten-Kupplung, z.B. wie bei Bassiri et al., S. 46-47, in Methods of Hormone Radioimmunoassay, Jaffe and Behrman Hrsg., (oben zitiert) und bei Walter et al., (oben zitiert) offenbart; und (4) Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) zur Kupplung von Cystein (oder anderen Sulfhydrylen) an Aminogruppen, wie z.B. bei Kitagawa et al., J. Biochem. (Zokyo), Bd. 79, S. 233-239 (1976) und bei Lerner et al., (oben zitiert) offenbart ist.
- Eine allgemeine Regel zur Auswahl einer geeigneten Methode für das Kuppeln eines gegebenen Peptids an einen Träger, kann wie folgt festgesetzt werden: Die für das Kuppeln ausgewählte Aminosäure soll in der Sequenz nur einmal vorkommen, vorzugsweise am passenden Ende des Segments. Z.B. sollte BDB nicht verwendet werden, wenn ein Tyrosinrest in dem Hauptteil einer Sequenz, die wegen ihres potentiellen Antigencharakters ausgewahlt wurde, vorkommt. In ähnlicher Weise schließen auf zentralen Stellen befindliche Lysine die Glutaraldehydmethode aus, und das Vorkommen von Asparagin- -oder Glutaminsäure schließt häufig die Carbodiimidmethode aus. Andererseits können geignete Aminosäurereste an irgendeinem Ende eines gewählten Sequenzsegments als Befestigungsstellen angebracht werden, ob sie natürlicherweise an diesen Stellen in der gewählten Proteinsequenz vorkommen, oder nicht.
- Ein Segment, das das eigentliche Amino- oder Carboxylende des ausgereiften H400 einschließt, wird vorzugsweise am anderen Ende des Segments an den Träger gebunden, wobei es das Ende freiläßt. Ein Segment, dem beide eigentlichen Enden fehlen, kann dadurch ein Problem verursachen, daß sein freies Ende kein natürliches Ende des ausgereiften H400 darstellt. Das Problem kann bis zu einem gewissen Umfang durch Acetylieren der α-Aminogruppe und anschließendem Binden des Peptids über sein Carboxylende beseitigt werden.
- Die Kupplungsausbeute eines gegebenen Peptids an einen Proteinträger wird üblicherweise unter Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids gemessen, das entweder mit einer radioaktiven Aminosäure, die für einen der Syntheseschritte verwendet wird, hergestellt wird, oder durch Markieren des vollständigen Peptids durch die Jodierung eines Tyrosinrestes. Die Gegenwart von Thyrosin in dem Peptid erlaubt auch, falls gewünscht, einen empfindlichen Radioimmunoassay einzusetzen. Deshalb kann es wünschenswert sein, Tyrosin als Endrest einzuführen, wenn es nicht Teil der Peptidsequenz ist, die durch das native H400-Polypeptid definiert ist.
- Bevorzugte Träger sind Proteine, und bevorzugte Proteinträger schließen bovines serumalbumin, Nyoglobulin, Ovalbumin (OVA), Lochschneckenhämocyanin (KLH) oder dergleichen ein.
- Peptide können an KLH über Cysteine mit MBS gebunden sein, wie durch Liu et al., Biochemistry, Bd. 18, S. 690-697 (1979) offenbart ist. Die Peptide werden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5), 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 9,0) oder 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Der pH zur Lösung des Peptids wird ausgewählt, um die Peptidlöslichkeit zu optimieren. Der Gehalt an freiem Cystein bei löslichen Peptiden, wird durch die Methode von Ellman, Arch. Biochem. Biophys., Bd. 82, S. 7077 (1959) nachgewiesen.
- Für jedes Peptid werden 4 mg KLH in 0,25 ml eines 10 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,2) mit 0,7 mg MBS (gelöst in Dimethylformamid) zur Reaktion gebracht und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. MBS wird tropfenweise zugefügt, um dafür zu sorgen, daß die lokale Formamidkonzentration nicht zu hoch ist, da KLH in Formamid < 30% unlöslich ist. Das Reaktionsprodukt, KLH-MB, wird dann, um freies MBS zu entfernen, über Sephadex G-25 geschickt, das mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert ist; die Wiedergewinnung von KLH aus den Peakfraktionen des Säuleneluats (überwacht bei o.D.&sub2;&sub8;&sub0;) wird auf etwa 80% geschätzt.
- KLH-MB wird dann mit 5 mg Peptid, das in 1 ml des ausgewählten Puffers gelöst ist, zur Reaktion gebracht. Der pH wird auf 7 bis 7,5 eingestellt und die Reaktion 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Kupplungsausbeute wird mit radioaktivem Peptid durch Dialyse einer Probe des Konjugats gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung überwacht und reicht von 8 bis 60%.
- Monoclonale Antikörper gegen ausgereiftes H400 oder Peptidträger-Konjugate werden mit Standardtechniken gebildet: z.B. wie von Campbell in Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, New York, 1984); Hurrell, Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); Schreier et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); US-Patent 4 562 003; oder dergleichen offenbart ist. Insbesondere wird auf US-Patent 4 562 003 ausdrücklich Bezug genommen. Zur monoclonalen Antikörperbildung ist der erste Schritt, ein Wirtstier zu immunisieren, um eine Quelle für B-Lymphozyten zu erhalten. Die B-Lymphozyten werden mit einer geeigneten immortalisierenden Zell-Linie zur Bildung von Hybridomen, die monoclonale Antikörper abscheiden, fusioniert. Immortalisierende Zell-Linien sind im allgemeinen Tumor Zell-Linien, wie z. B. Myelome. Vorzugsweise sind die Wirtstiere Nager, und die immortalisierende Zell-Linie ist auch vorzugsweise aus Nagerzellen entnommen, insbesondere von der selben Nagerspezies. Nach der Bildung werden die Hybridome auf solche durchgemustert, die gegen die Peptide der Erfindung Antikörper machen. Immunisieren, Ernten der Lymphozyten und Zellfusion sind in der Fachwelt alles wohl bekannte Techniken. Immunisierung wird nach einem Plan wiederholter Injektionen von gereinigtem Peptidträger Konjugat, das für gewöhnlich mit einem geeigneten Adjuvans gemischt ist, in ein Wirtstier durchgeführt. Die Immunisierung kann durch Variieren mehrerer Faktoren optimiert werden, einschließlich der Menge Antigen, die für die erste Injektion und die nachfolgenden Zugaben verwendet wird, des Injektionsweges, des Zeitplanes für die Injektionen und Blutabnahmen und der Adjuvansverwendung, z.B. dem vollständigen oder unvollständigem Freund'schen Adjuvans. Techniken für die Fusion sind der Fachwelt auch wohl bekannt und befassen sich im allgemeinen mit dem Mischen der Zellen mit einem Fusionsmittel, wie z.B. dem gebräuchlichsten, Polyethylenglycol.
- Erfolgreiche Hybridombildung wird durch Standardverfahren abgeschätzt und ausgewählt, wie z.B. HAT Auswahl. Unter erfolgreichen Hybridomen werden diejeigen, die den gewünschten Antikörper erfolgreich abscheiden, ausgewählt, indem das Kulturmedium auf ihr Vorhandensein hin untersucht wird. Für gewöhnlich geschieht das mit einem auf Immunreaktionen basierenden Assay, z.B. Western-Blot, ELISA oder RIA. Die Antikörper können aus dem Medium mit Standard-Proteinreinigungstechniken wiedergewonnen werden.
- "Doppelseitige" oder "Sandwich" Immunoassays sind die in der Erfindung bevorzugten Immunoassays, z.B. wie im US-Patent 4 486 530 offenbart. Dementsprechend wird auf dieses Patent ausdrücklich Bezug genommen. Solche Assays erfordern die Verwendung zweier verschiedener Sätze von anti-H400 Antikörpern, von denen wenigstens einer aus einem monoclonalen Antikörper der Erfindung besteht. Antikörper aus einem der beiden Sätze werden an der Oberfläche eines Festphasen-Trägers gebunden. Dann werden die gebundenen Antikörper einer Probe, die wahrscheinlich H400 enthält, ausgesetzt. Die H400-Moleküle binden an die gebundenen Antikörper. Als nächstes wird der zweite Satz Antikörper auf das gebundene H400 einwirken gelassen und bindet an eine oder mehrere antigene Determinanten, die sich von der (oder denen) unterscheidet (unterscheiden), an die der erste Satz Antikörper gebunden ist. Das H400 wird dann über ein indirektes oder direktes signalerzeugendes Mittel, das an dem zweiten Satz Antikörper gebunden ist, nachgewiesen. Die Antikörper können z.B. direkt mit einer signalerzeugenden Einheit konjugiert sein, wie z.B. ein Enzym, seltene Erden-Chelatbildner, oder einen organischen Farbstoff. Oder sie können indirekt mit einer oder mehreren signalerzeugenden Einheiten durch zusätzliche Antikörper oder Komplexe hoher Affinität, wie z.B. Avidin-Biotin-Komplexe, verbunden sein. Quantitative Messungen der H400 Konzentrationen werden durch Vergleich des durch die Probe erzeugten Signals mit dem durch H400-Standards, die bekannte Konzentrationen an H400 enthalten, erzeugten Signal durchgeführt.
- Die Erfindung schließt Reagenzienkits für die Verwendung in Immunoassays, inbesondere Sandwich-Immunoassays, ein. Solche Kits schließen (1) einen Festphasenträger, (2) einen ersten Antikörper, der monoclonal ist und der eine erste antigene Determinante des H400 binden kann, (3) einen zweiten Antikörper, der aus einem monoclonalen Antikörper ausgewählt ist, der an eine zweite antigene Determinante des H400 binden kann und einen polyclonalen Antikörper, der für H400 spezifisch ist (hier als "polyclonale Antikörper-Zusammensetzung" bezeichnet) und (4) ein signalerzeugendes Mittel, das an einen der drei Antikörper gebunden ist, vorzugsweise an den zweiten Antikörper, ein. In Abhängigkeit von der besonderen Ausführungsform, können die Kits eine Auswahl von zwei der drei anti-H400 Antikörper-Typen enthalten, entweder einen monoclonalen Antikörper, der für eine erste antigene Determinante spezifisch ist oder einem monoclonalen Antikörper, der für eine zweite antigene Determinante spezifisch ist oder einem monoclonalen Antikörper, der für eine erste oder zweite antigene Determinante und eine polyclonale Antikörper-Zusammensetzung spezifisch ist. Die Antikörper können in Lösung oder in lyophilisierter Form vorliegen. Einer der Antikörpersätze kann vorher an den festen Träger gebunden sein oder kann erst bei Verwendung des Kits an die Oberfläche des festen Trägers gebunden werden. Die signalerzeugenden Mittel können vorher an einen der beiden Antikörper-Typen gebunden sein oder können die Kombination mit einem oder mehreren Bestandteilen, z.B. Puffer, Antikörper- Enzymkonjugaten, Enzymsubstraten oder dergleichen vor der Verwendung erfordern. Viele Typen von signalerzeugenden Mitteln sind verfügbar und könnten einen oder mehrere Bestandteile eines Kits ausmachen. Verschiedene signalerzeugende Mittel sind bei Tijssen Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) offenbart. Die Kits der Erfindung können auch zusätzliche Stoffe einschließen, z.B. Blocker zur Verringerung unspezifischer Bindung an die Festphasen-Oberfläche, Waschreagenzien, Enzymsubstrate und dergleichen. Die Festphasen-Oberfläche kann in Form von Mikrotiterplatten, Mikrokugeln oder dergleichen vorliegen, die aus Polyvinylchlorid, Polystyrol oder ähnlichen für die Immobilisierung von Proteinen geeigneten Materialien zusammengesetzt sind. Vorzugsweise ist ein Enzym, das die Bildung eines fluoreszierenden oder gefärbten Produktes katalysiert, ein Bestandteil des signalerzeugenden Mittels. Mehr bevorzugt wird das Enzym aus Peroxidase, alkalischer Phosphatase und β-Galactosidase ausgewählt. Substrate und Reaktionsbedingungen für diese Enzyme sind in der Fachwelt wohl bekannt, z.B. Tijssen (oben zitiert).
- Die Nucleinsäure-Sonden der Erfindung werden aus Nucleotidsequenzen, die durch die Nucleinsäure der Formel II bestimmt sind, konstruiert. Die Natur der Sonde und ihrer gebundenen Nucleinsäure kann in Abhängigkeit von dem besonderen verwendeten Hybridisierungsassay variieren. Eine Meßmethode von H400-mRNA besteht in cytoplasmatischer Dot-Hybridisierung, wie durch White et al., J. Biol. Chem., Bd. 257, S. 8569-8572 (1982) und durch Gillespie et al., US-Patent 4 483 920 beschrieben. Dementsprechend wird auf diese Literaturangaben ausdrücklich Bezug genommen. Andere Verfahren schließen in situ Hybridisierung, z.B. Angerer et al., Genetic Engineering, Bd. 7, S. 43-65 (1985) und Dot-Blotten mit gereinigter RNA ein, z.B. in Hames et al., Hrsg., Kapitel 6 Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985). Im allgemeinen beinhaltet die cytoplastische Dot-Hybridisierung das Verankern von mRNA aus einer Zelle oder Gewebeprobe auf einem Festphasenträger, z.B. Nitrocellulose, das Hybridisieren einer DNA-Sonde an der verankerten mRNA und das Entfernen unspezifisch an den Festphasen-Träger gebundener Sondensequenzen oder fehlgepaarter Hybridbildungen mit der mRNA, so daß nur Sondensequenzen, die im wesentlichen vollkommene Hybride mit der Ziel-mRNA bilden, übrig bleiben. Die Menge an verbleibender DNA-Sonde ist ein Maß für die Menge der Ziel-mRNA, die auf dem Festphasen- Träger verankert ist. Die Menge der verbleibenden DNA-Sonde wird durch das durch seine Markierung erzeugte Signal nachgewiesen.
- Mehrere Standardtechniken sind für die Markierung von Einzel- und Doppelstrang-Nucleinsäurefragmenten verfügbar. Sie schließen das Aufnehmen radioaktiver Marker, z.B. Harper et al., Chromosoma, Bd. 83, S. 431-439 (1984); direktes Binden von Fluoreszenz-Markern, z.B. Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 2399-2412 (1985) und Connolly et al.,
- Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 4485-4502 (1985); und verschiedene chemische Modifikationen der Nucleinsäurefragmente, die diese immunochemisch oder durch andere Affinitätsreaktionen nachweisbar machen, ein: z.B. Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , Bd. 81, S. 3466-3470 (1984); Richardson et al., Nucleic Acids Research, Bd. 11, S. 6167- 6184 (1983); Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 6633-6637 (1981); Brigati et al., Virology, Bd. 126, S. 32-50 (1983); Broker et al., Nucleic Acids Research, Bd. 5, S. 363-384 (1978); und Bayer et al., Methods of Biochemical Analysis, Bd. 26, S. 1-45 (1980).
- Vorzugsweise werden Sonden durch Nick-Translation eines Fragments des pcD(SRα)-H400, das alle oder den hauptsächlichen Anteil der H400 codierenden Region enthält, hergestellt. Z.B. wird pcD(SRα)-H400 in JM101 amplifiziert, mit Ethidiumbromid gemischt, durch Gleichgewichts-Dichte- Gradienten-Zentrifugation in Cäsiumchlorid isoliert und mit BamHI verdaut; das Restriktionsfragment, das die gesamte für H400 codierende Region trägt, wird dann durch Gelelektrophorese getrennt. Das Fragment, das die codierende Region enthält, (die leicht über einen Größen-Marker identifiziert werden kann), wird von dem Gel extrahiert und der Nick- Translation in Gegenwart einer oder mehrerer Arten markierter Nucleotide unterzogen: z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); oder Brigati et al., (oben zitiert). Nach dem Entfernen von nicht aufgenommener Nucleotide, wird die Sonde an die verankerte mRNA in einer Konzentration im Bereich zwischen etwa 1 und 50 ng/ml (mit einer spezifischen Aktivität in dem Bereich von etwa 1 bis 2 x 10&sup8; cpm/ug Sonde) gebunden.
- Periphere Blut-Lymphozyten (PBLs) (die etwa 80% T-Zellen enthalten) werden als eine T-Zellen Quelle für den Assay verwendet. PBLs werden durch Standardtechniken, z.B. Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Bd. 21, (Erg. 97), S. 77 (1968) erhalten. Falls gewünscht, kann eine in T-Zellen angereicherte (bis etwa 95%) Zellfraktion mit Standardtechniken erhalten werden, z.B. indem B-Zellen durch Rosetting entfernt werden: Gmelig-Meyling et al., Vox-Sang., Bd. 33, S. 5 (1977). Im allgemeinen werden PBLs aus frischem Blut durch Dichtegradienten-Zentrifugation in Ficoll-Hypag erhalten. Vorzugsweise ist mRNA aus PBLs für die Hybridisierung mit der Sonde nach folgender Vorschrift verankert. Isolierte PBLs werden durch Suspendieren in einem Lysispuffer (0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl pH 8,6, 0,5% Nonidet P-40 (ein nichtionisches Detergens, z.B. von Sigma)) bei 4 ºC, bei einer Endkonzentration von 1 x 10&sup8; Zellen/ml lysiert. Die Suspension wird 10 s auf dem Vortex geschüttelt, und die Kerne werden pelletiert (13 000 g, 2,5 Min). Die entstandenen cytoplasmatischen Lysate werden dann in ein steriles 1,5 ml Röhrchen überführt, das 0,3 Volumenanteile 20 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat (Standard-Kochsalz-Citratlösung)) und 0,2 Volumenanteile 37% (G/G) Formaldehyd enthält. Die Mischung wird dann 15 Min bei 60 ºC inkubiert und in Aliquots bei -70 ºC aufbewahrt. Für die Analyse werden 15 ul jeder Probe in einer seriellen Dreifachverdünnung in 15 x SSC in eine 96 Vertiefungen enthaltende Mikrotiterplatte mit flachen Böden (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) in 0,1 ml titriert. Jede Verdünnung wird auf ein Nytranblatt (ein modifizierter Nylonträger von Schleicher und Schuell, Keene, NH; Porengröße 0,45 um), getragen von einem Filterpapier (Whatman 3 mm Chr, Whatman Inc., Clifton, NJ) unter Verwendung eines 96-fachen Minifold Apparates (Schleicher und Schuell) gesaugt. Das Nytranpapier wird dann getrocknet (80 ºC, 2 Stunden) und mit einer Vorhybridisierungslösung, die aus 50% Formamid (BRL, Gaithersburg, MD) 6 x SSC, 50 ug/ml E. coli tRNA (Sigma), jeweils 0,2% (G/V) Ficoll (Molgew. = 400 000), Polyvinylpyrrolidon und bovines Serumalbumin (BSA) besteht, behandelt. Die Sonde wird dem Nytranträger in einer Konzentration von etwa 50 ng Sonde/ml der Vorhybridisierungslösung beigegeben. Bei der folgenden Hybridisierung wird der Träger zweimal jeweils 15 Min bei Raumtemperatur in 2 x SSC, dann zweimal 30 Min bei 60 ºC in jeweils 2 x SSC/0,5% SDS gewaschen. Der Träger wird dann unter Verwendung eines verstärkenden Films abgelichtet und durch Abtasten mit einem Laserdensitometer quantifiziert (z.B. Ultroscan XL. LKB Instruments Inc., Galthersburg MD).
- Wenn der cytoplasmatischen Dot-Hybridisierung ausreichende Empfindlichkeit fehlt, wird vorzugsweise vor dem Blotten die RNA zuerst vom PBLs extrahiert. Z.B. kann RNA mit der Guanidinthiocyanat-Methode extrahiert werden, die von Chirgwin et al., in Biochemistry, Bd. 18, S. 5294-5299 (1979) offenbart ist.
- Die Anmelder haben E. coli JM101, der pcD(SRα)-H400 trägt, in der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter der Zugangs-Nr. 67614 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde nach dem Budapester Vertrag gemacht, der sich auf die Hinterlegung von Mikroorganismen bezieht.
Claims (10)
1. Ausgereiftes Polypeptid, codiert durch das offene
Leseraster, das die folgende Sequenz von Aminosäuren
definiert:
2. Ausgereiftes Polypeptid nach Anspruch 1, definiert durch
die folgende Aminosäuresequenz:
3. Immunogenes Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 1
oder 2.
4. Immunogenes Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 3,
bestehend aus 6 bis 40 Aminosäuren.
5. Immunogenes Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 4,
ausgewählt aus den Peptiden [Ala&sub1; - Ser&sub2;&sub0;]&sub6;&submin;&sub2;&sub0; und
[Thr&sub4;&sub3; - Asn&sub6;&sub8;]&sub6;&submin;&sub2;&sub4;.
6. Nucleinsäure, die fähig ist, ein Polypeptid nach
Anspruch 1 oder 2 oder ein Fragment eines Polypeptids nach
irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5 zu codieren.
7. Nucleinsäure nach Anspruch 6, die fähig ist, das
ausgereifte Polypeptid des offenen Leserasters, das durch die
folgende Aminosäuresequenz definiert ist, zu codieren.
8. Nucleinsäure nach Anspruch 7, definiert durch die
folgende Nucleotidsequenz:
9. Antikörper, der fähig ist, an ein Polypeptid nach
Anspruch 1 oder 2 oder ein Fragment eines Polypeptids nach
irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5 zu binden.
10. Nucleinsäuresonde, die fähig ist, mit einer mRNA
entsprechend einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 oder
einem Fragment eines Polypeptids nach irgendeinem der
Ansprüche 3 bis 5 zu hybridisieren.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/157,743 US5001230A (en) | 1988-02-18 | 1988-02-18 | T cell activation markers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE68905633D1 DE68905633D1 (de) | 1993-05-06 |
| DE68905633T2 true DE68905633T2 (de) | 1993-07-08 |
Family
ID=22565071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE8989301341T Expired - Fee Related DE68905633T2 (de) | 1988-02-18 | 1989-02-13 | Markierer der t-zelle aktivierung. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5001230A (de) |
| EP (2) | EP0329363B1 (de) |
| JP (1) | JP2910861B2 (de) |
| AT (1) | ATE87655T1 (de) |
| AU (1) | AU3192889A (de) |
| CA (1) | CA1340869C (de) |
| DE (1) | DE68905633T2 (de) |
| ES (1) | ES2046462T3 (de) |
| WO (1) | WO1989007646A1 (de) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5705612A (en) | 1984-10-18 | 1998-01-06 | Institut Pasteur And Centre National De La Recherche Scientifique | NEF peptide encoded by human immunodefiency virus type 1 (HIV-1) |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| US5637488A (en) * | 1987-06-01 | 1997-06-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | HIV protease gene and method for its expression |
| WO1989005823A1 (en) * | 1987-12-23 | 1989-06-29 | The Upjohn Company | Chimeric glycoproteins containing immunogenic segments of the glycoproteins of human respiratory syncytial virus |
| WO1990004020A1 (en) * | 1988-10-06 | 1990-04-19 | Dana Farber Cancer Institute | H. saimiri-htlv-x region vector |
| IL92685A0 (en) * | 1988-12-16 | 1990-09-17 | Us Commerce | Dna encoding lymphokine/cytokine like proteins,cells transformed thereby and production of said proteins and antibodies against them |
| JP2903414B2 (ja) * | 1989-05-31 | 1999-06-07 | 味の素株式会社 | 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 |
| US6004776A (en) * | 1989-07-07 | 1999-12-21 | Unilever Patent Holdings, B.V. | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
| JP3273609B2 (ja) * | 1989-07-07 | 2002-04-08 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 発現ベクターのマルチコピー組込みにより形質転換した真菌による蛋白質の製法 |
| JPH04503309A (ja) * | 1989-07-28 | 1992-06-18 | アメリカ合衆国 | 効果的な方向性遺伝子クローニング系 |
| US5541083A (en) * | 1989-10-24 | 1996-07-30 | The Regents Of The University Of California | Method for producing secretable glycosyltransferases and other golgi processing enzymes |
| US5976877A (en) * | 1990-01-08 | 1999-11-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Proteins produced by human lymphocytes DNA sequence encoding these proteins and their pharmaceutical and biological uses |
| FR2656800B1 (fr) * | 1990-01-08 | 1992-05-15 | Roussy Inst Gustave | Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques. |
| FR2656866B1 (fr) * | 1990-01-10 | 1992-05-15 | Cis Bio Int | Derives de porphyrine et metalloporphyrines eventuellement couples a une molecule biologiquement active, et composition pharmaceutique les contenant. |
| US5652118A (en) * | 1991-03-11 | 1997-07-29 | Creative Biomolecules, Inc. | Nucleic acid encoding a novel morphogenic protein, OP-3 |
| US5403581A (en) * | 1991-07-12 | 1995-04-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Coccidiosis vaccines |
| US6008342A (en) * | 1991-07-12 | 1999-12-28 | Roche Vitamins Inc. | DNA encoding eimeria antigen |
| US5413927A (en) * | 1991-09-03 | 1995-05-09 | North Carolina State University | Feline immunodeficiency virus isolate NCSU1Lb |
| WO1993011244A1 (en) * | 1991-11-29 | 1993-06-10 | Weyerhaeuser Company | Cyclic di-guanylate metabolic enzymes |
| TW318189B (de) * | 1991-12-06 | 1997-10-21 | American Cyanamid Co | |
| US5721349A (en) * | 1992-02-26 | 1998-02-24 | Vanderbilt University | Vacuolating toxin-deficient H. pylori |
| US5792751A (en) * | 1992-04-13 | 1998-08-11 | Baylor College Of Medicine | Tranformation of cells associated with fluid spaces |
| IL108707A (en) * | 1993-02-19 | 1999-06-20 | Weiner David B | Pharmaceutical compositions and diagnostic kits containing RPH protein or RPV-binding proteins |
| US5597707A (en) * | 1993-04-15 | 1997-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Tumor associated antigen recognized by the murine monoclonal antibody L6, its oligonucleotide sequence and methods for their use |
| WO1995016705A1 (en) * | 1993-12-15 | 1995-06-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vpr receptor protein |
| US5653686A (en) * | 1995-01-13 | 1997-08-05 | Coulter Corporation | Closed vial transfer method and system |
| US6087486A (en) * | 1996-01-29 | 2000-07-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleotide sequences encoding vpr receptor protein |
| US6060587A (en) | 1996-01-29 | 2000-05-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cellular receptor for HIV-1 VPR essential for G2/M phase transition of the cell cycle |
| US6616927B2 (en) * | 1997-05-29 | 2003-09-09 | Agresearch Limited | Processes for production of immunoglobulin A in milk |
| US6121021A (en) * | 1997-12-16 | 2000-09-19 | Connaught Laboratories Limited | Constitutive expression of non-infectious HIV-like particles |
| US6087128A (en) | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
| US6448078B1 (en) | 1998-10-09 | 2002-09-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cellular receptor for HIV-1 Vpr essential for G2/M phase transition of the cell cycle |
| TWI290146B (en) * | 1999-07-29 | 2007-11-21 | Dyax Corp | Binding moieties for fibrin |
| TWI240632B (en) | 2001-07-30 | 2005-10-01 | Epix Medical Inc | Purified peptides for peptide-based multimeric targeted contrast agents |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US4483920A (en) * | 1982-05-17 | 1984-11-20 | Hahnemann University | Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material |
| EP0194626A3 (de) * | 1985-03-15 | 1988-05-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Verfahren zur Transformation und direkten Selektion von Transformanten in eukaryotischen Zellen |
| US4788137A (en) * | 1985-10-29 | 1988-11-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Detection of activated T-cells |
| EP0616811A1 (de) * | 1985-12-03 | 1994-09-28 | T Cell Sciences, Inc. | Zellfreier T-Zell-Antigenrezeptor und dessen klinische Verwendungen |
| DE260880T1 (de) * | 1986-09-11 | 1988-11-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc., Boston, Mass. | Verfahren zur ausloesung der zytotoxizitaet. |
-
1988
- 1988-02-18 US US07/157,743 patent/US5001230A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-13 AU AU31928/89A patent/AU3192889A/en not_active Abandoned
- 1989-02-13 AT AT89301341T patent/ATE87655T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-02-13 ES ES198989301341T patent/ES2046462T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-13 DE DE8989301341T patent/DE68905633T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-13 WO PCT/US1989/000488 patent/WO1989007646A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-02-13 EP EP89301341A patent/EP0329363B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-13 JP JP1502671A patent/JP2910861B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-13 EP EP89902878A patent/EP0415930A1/de active Pending
- 1989-02-16 CA CA000591285A patent/CA1340869C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1989007646A1 (en) | 1989-08-24 |
| DE68905633D1 (de) | 1993-05-06 |
| JP2910861B2 (ja) | 1999-06-23 |
| ATE87655T1 (de) | 1993-04-15 |
| EP0329363B1 (de) | 1993-03-31 |
| CA1340869C (en) | 2000-01-04 |
| JPH03504316A (ja) | 1991-09-26 |
| ES2046462T3 (es) | 1994-02-01 |
| EP0329363A1 (de) | 1989-08-23 |
| EP0415930A1 (de) | 1991-03-13 |
| US5001230A (en) | 1991-03-19 |
| AU3192889A (en) | 1989-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE68905633T2 (de) | Markierer der t-zelle aktivierung. | |
| US6264953B1 (en) | Method of preparation and use for zona pellucida antigens and antibodies for sterilization and contraception | |
| DE69006306T2 (de) | Synthetische peptide des konjugates von ubiquitin und histon h2a. | |
| DE68929043T2 (de) | Für androgen-rezeptor-protein kodierende dna | |
| DE3588219T2 (de) | T-Zellenrezeptor, spezifisch für Antigenpolypeptide und verwandte Polynukleotide | |
| DE69634449T2 (de) | Verfahren zum identifizieren von geschlechtsspezifischen und speziesspezifischen molekülen, mit verfahren identifizierte moleküle und verwendung der moleküle | |
| DE68910590T2 (de) | cDNAs, die für Mitglieder der Karzinoembryonalantigen-Familie kodieren. | |
| DE69117949T2 (de) | Mit akuter pankreatitis assoziiertes protein, mittel zur diagnose von akuter pankreatitis | |
| DE69132864T2 (de) | Antikörper gegen hypophysäre adenylatzyklase aktivierende peptid-pacap, hybridome und bestimmung von pacap | |
| DE68926658T2 (de) | Diagnostische gene zum nachweis von toxoplasmose | |
| EP0562123A1 (de) | Die neuartige, physiologisch aktive substanz epimorphine, das für sie kodierende gen und antikörper gegen epimorphine | |
| DE60219645T2 (de) | Antikörper gegen metastin und dessen verwendung zur diagnose von schwangerschaft | |
| JP4593106B2 (ja) | 着床前因子の新しいアッセイ方法および着床前因子ペプチド | |
| EP0470565B1 (de) | Peptide mit für alpha-1-Mikroglobulin charakteristischer antigener Determinante | |
| ZA200208963B (en) | Neucleotide sequences involved in increasing or decreasing mammalian ovulation rate. | |
| DE69316388T2 (de) | CRF Bindungsproteine | |
| US5136022A (en) | T cell activation markers | |
| DE3650327T2 (de) | Monoklonaler Antikörper gegen die polymorphe Determinante B27 des HLA. | |
| DE68918399T2 (de) | Lymphokine, DNS-Sequenzen, die diese Lymphokine kodieren, und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. | |
| EP0226069A1 (de) | HLA-B 27, dafür codierende DNA und ihre Verwendung | |
| AU630862C (en) | Method of preparation and use for zona pellucida antigens and antibodies for sterilization and contraception | |
| Chand et al. | A reference preparation of buffalo pituitary follicle stimulating hormone using lectin affinity chromatography | |
| CN118146364A (zh) | 一种通过噬菌体展示获得胶原蛋白抗体的方法 | |
| WO1985000503A1 (en) | Monoclonal antibodies to the h-y antigen, methods of production, applications, and products of manufacture | |
| Appella et al. | Amino acid sequence of the variable region of M149 mouse myeloma light chain: comparison with the nucleotide sequence of K2 and K3 clones |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: SCHERING CORP., KENILWORTH, N.J., US |
|
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |