DE679194T1 - Verfahren zur voraussage des bakterienzuwachses auf einer oberfläche. - Google Patents

Verfahren zur voraussage des bakterienzuwachses auf einer oberfläche.

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DE679194T1 DE0679194T DE94907825T DE679194T1 DE 679194 T1 DE679194 T1 DE 679194T1 DE 0679194 T DE0679194 T DE 0679194T DE 94907825 T DE94907825 T DE 94907825T DE 679194 T1 DE679194 T1 DE 679194T1
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bacterial
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Gary Dunny
William Liljemark
Bernard Reilly
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EP 94 907 825.7 31. Januar 1996 WO 94/16096 V23094DE DO/MK/an The Regents of the University of Minnesota Patentansprüche:
1. Verfahren zur Vorhersage des Zeitpunkts des aktiven Wachstums von Bakterien, die an einer Oberfläche haften, wobei das Verfahren
&iacgr;&ogr; die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Bestimmen einer ersten Populationsdichte von lebensfähigen Bakterien auf der Oberfläche,
is (b) Vergleichen der ersten Populationsdichte mit einer zweiten
Populationsdichte mit einem stimulierten oder erhöhten Anteil von aktiv wachsenden Bakterien zu lebensfähigen Bakterien in der zweiten Population und
(c) Vorhersagen des aktiven Bakterienwachstums, sobald die erste Populationsdichte größer als die zweite Populationsdichte ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dichte in (b) zwischen etwa 400,000 Bakterien/mm2 bis etwa 6,300,000 Bakterien/mm2 liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterienwachstum auf einer Oberfläche erfolgt, die für Bakterienbefall empfänglich ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterienwachstum auf der Oberfläche eines Zahnimplantats erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterienwachstum auf implantiertem Biomaterial erfolgt.
6. Verfahren zur Vorhersage des aktiven Wachstums von Bakterien auf einer Oberfläche, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Bestimmen einer Populationsdichte von lebensfähigen wachsenden Bakterien auf der Oberfläche,
&iacgr;&ogr; (b) Bestimmen einer Population von aktiv wachsenden Bakterien auf
der Oberfläche,
(c) Berechnen des Verhältnisses von aktiv wachsenden Bakterien zu lebensfähigen Bakterien auf der Oberfläche und
(d) Vorhersagen des aktiven Bakterienwachstums auf der Oberfläche, sobald das Verhältnis in Stufe (c) im Bereich von etwa 5 &khgr; 10" 4: 1 bis 20 &khgr; 10'2:l liegt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Population von aktiv wachsenden Bakterien bestimmt wird durch Zugeben eines Überschusses an markiertem Nucleosid zu den Bakterien für eine Zeit, die kürzer ist als die minimale Zellteilungszeit der Bakterien, Wachsenlassen der Bakterien für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Einverleibung des markierten Nucleotids in die Bakterien zu erlauben, und Identifizieren der" Menge an der DNA der Bakterien einverleibtem, markiertem Nucleotid.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das markierte Nucleosid aus der Gruppe bestehend aus radioaktiv markierten Purinen und Pyrimidinen ausgewählt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das markierte Nucleosid aus der Gruppe bestehend aus [Methyl-3H]-thymidin und [C14]-Adenin und Gemischen davon ausgewählt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verhältnis in Stufe (c) im &iacgr;&ogr; Bereich zwischen etwa 10 &khgr; 10"4:l bis 40 &khgr; 10"4:l liegt.
11. Verfahren zur Inhibierung von Bakterienwachstum auf einer Oberfläche, wobei das Verfahren die folgende Stufe umfaßt:
is (a) Steuern der Bakterienpopulation auf der Oberfläche durch Aufrechterhalten der Populationsdichte der Bakterien unterhalb einer Populationsdichte, die mit einer Erhöhung oder Stimulation des Anteils von wachsenden Zellen zu lebensfähigen Zellen in der Population zusammenhängt oder damit verbunden ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Populationsdichte der Bakterien auf der Oberfläche gesteuert wird, indem man den Kontakt von das Anhaften fördernden Mitteln mit den Bakterien beschränkt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Anhaften fördernde Mittel aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, Glycoproteinen und Kohlenhydraten ausgewählt wird.
"·
14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Populationsdichte der Bakterien auf der Oberfläche gesteuert wird, indem man die Hydrophobi-
zität der Oberfläche mit einem das Anhaften unterdrückenden Mittel modifiziert.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das das Anhaften unterdrückende Mittel Natriumoctadecylsulfat ist.
16. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Populationsdichte der Bakterien auf der Oberfläche gesteuert wird, indem man ein Material mit einem mittleren dynamischen Kontaktwinkel beim Ausbreiten größer
&iacgr;&ogr; als etwa 60 Grad und einem mittleren dynamischen Kontaktwinkel
beim Zurückweichen größer als etwa 20 Grad auswählt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der mittlere dynamische Kontaktwinkel beim Ausbreiten größer als etwa 90 Grad ist.
18. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Bakterienwachstum in Gegenwart eines wäßrigen Fluids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Körperflüssigkeiten, Seren, Kohlenhydrat-haltigen Fluiden, Polypeptid-haltigen Fluiden, Glycoprotein-haltigen Fluiden oder Wasser erfolgt.
19. Zusammensetzung aufweisend einen mikrobiellen Start- oder Ausgangsreplikationsfaktor, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor durch Bakterien erzeugt worden ist und ein Molekulargewicht von weniger als etwa 3000 gemessen durch Größenausschlußmembranfiltration besitzt.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor beständig'gegen Autoklavieren ist.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor aus Streptococcus sanguis isoliert ist.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor aus S. gordonii Challis Stamm, ATCC Hinterlegungsnummer 35105 isoliert ist.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor aus E. coli 149, Stamm ATCC Hinterlegungsnummer 55535 isoliert ist.
24. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor das Wachstum von Bakterien stimuliert.
is 25. Zusammensetzung nach Anspruch 19, weiter umfassend Komponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kationen, Anionen, Enzymen, Transportpolypeptiden, Coenzymen, Cofaktoren und Polypeptiden.
26. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor das Wachstum von Bakterien bei einer Populationsdichte stimuliert, die unterhalb einer Dichte liegt, die mit einer Erhöhung oder Stimulation des Anteils von aktiv wachsenden Zellen zu lebensfähigen Zellen in einer Population verbunden ist oder damit zusammenhängt.
27. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor das Wachstum von Bakterienzellen in einer Population stimuliert oder erhöht, um ein Verhältnis von wachsenden
Zellen zu lebensfähigen Zellen in der Population von etwa 5 &khgr; 10" 4:1 bis 20 &khgr; 10"2:l zu erreichen.
28. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor aus auf einer Oberfläche wachsenden Bakterien isoliert ist.
29. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der mikrobielle Startreplikationsfaktor aus in Suspension wachsenden Bakterien isoliert ist.
30. Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines antimikrobiellen Mittels, aufweisend die Stufe des Kontaktierens von Bakterien mit dem antimikrobiellen Mittel in Gegenwart des mikrobiellen Startreplikationsfaktors nach Anspruch 19, um aktives Wachstum der Bakterien einzuleiten.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das mikrobielle Mittel für die Bakterien spezifisch ist.
32. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Mittel die Aktivität eines mikrobiellen Startreplikationsfaktors inhibiert oder erhöht, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Kontaktieren einer Population von Bakterien mit einem Mittel, von dem man vermutet, daß es einen mikrobiellen Startreplikationsfaktor verstärkt oder inhibiert, und dem mikrobiellen Startreplikationsfaktor nach Anspruch 19, um eine behandelte Population zu bilden,
(b) Bestimmen eines Anteils von wachsenden Bakterien in der behandelten Population; und
(c) Bestimmen einer Erhöhung oder Inhibierung von mikrobiellem Startreplikationsfaktor durch Vergleichen des Anteils an wachsenden Bakterien in der behandelten Population zu dem Anteil an wachsenden Zellen in einer Bakterienpopulation, die mit dem mikrobiellen Startreplikationsfaktor kontaktiert worden ist.
&iacgr;&ogr;
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Ausmaß des Wachstums durch Messen der Menge an pro Bakterium einverleibtem, radioaktiv markierten Nucleotid bestimmt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Bakterium S, gordonii is Challis, ATCC Hinterlegungsnummer 35105 ist.
35. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Bakterien an eine Oberfläche gebunden werden.
36. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Mittel, von dem man vermutet, daß es einen mikrowellen Startreplikationsfaktor inhibiert oder verstärkt, an eine Oberfläche gebunden wird.
37. Verfahren zur Messung der Aktivität eines mikrowellen Startreplikationsfaktors auf Bakterien, umfassend:
(a) Kontaktieren einer Bakterienpopulation mit dem mikrowellen Startreplikationsfaktor nach Anspruch 19, um eine behandelte Population zu bilden; und
(c) Bestimmen des Ausmasses an Stimulation des mikrobiellen Wachstums durch Vergleichen des mikrobiellen Wachstums in der behandelten Population zum mikrobiellen Wachstum in einer unbehandelten Bakterienpopulation.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das mikrobielle Wachstum durch Messen der Menge an pro Bakterium einverleibtem, radioaktiv markiertem Nucleotid bestimmt wird.
&iacgr;&ogr; 39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Bakterienpopulation eine biologisch reine Population von S. gordonii Challis, ATCC Hinterlegungsnummer 35105 ist.
40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Bakterienpopulation an eine Oberfläche gebunden wird.
41. Verfahren zur Stimulierung mikrobiellen Wachstums, umfassend: Kontaktieren einer Population mit einer Menge an mikrobiellem Startreplikationsfaktor nach Anspruch 19, die wirksam ist, um den Anteil von aktiv wachsenden Zellen zu lebensfähigen Zellen in der Bakterienpopulation zu erhöhen.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Anteil an aktiv wachsenden Zellen zu lebensfähigen Zellen in der Population auf ein Verhältnis von etwa 5 &khgr; 10"4:l bis 20 &khgr; 10"2:l erhöht wird.
43. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Bakterienpopulation an eine Oberfläche gebunden wird.
44. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Bakterienpopulation in Suspension vorliegt.
45. Genetische Kassette, aufweisend:
(a) eine erste, für ein bakterielles Reportergen codierende DNA-Sequenz, die verbunden ist mit den 3'-Ende
(b) einer zweiten DNA-Sequenz, die an ein Gen oder einen Abschnitt davon hybridisiert, dessen Expression koordinativ durch
Zellwachstum reguliert wird und das bzw. der in dem Bakterienchromosom angeordnet ist, um die genetische Kassette zu bilden, wobei die zweite DNA-Sequenz für die Rekombination und Integration der genetischen Kassette oder eines Abschnitts davon is in das Gen im Bakterienchromosom sorgt.
46. Genetische Kassette nach Anspruch 45, wobei die erste DNA-Sequenz für eine bakterielle Amylase codiert.
47. Genetische Kassette nach Anspruch 45, wobei die zweite DNA-Sequenz für einen Abschnitt eines streptogenen 16S ribosomalen RNA-Gens codiert.
48. Genetische Kassette nach Anspruch 45, weiter umfassend ein auswählbares Markergen, das mit der ersten und zweiten DNA-Sequenz verbunden ist.
49. Plasmid mit einer genetischen Kassette nach Anspruch 45.
50. Bakterienstamm mit einer genetischen Kassette oder einem Abschnitt davon nach Anspruch 45, stabil integriert in das Bakterienchromosom an einer Stelle unter der Steuerung eines Promotors,, dessen Expression koordinativ durch Zellwachstum reguliert wird.
51. Bakterienstamm nach Anspruch 50, wobei die bakterielle Wirtszelle S. gordonii Challis, Stamm MSP818, ATCC Nr. 69529 ist.
52. Bakterienstamm gemäß Anspruch 50, wobei die Wirtszelle S. gordonü Challis, Stamm MSP812, ATCC Nr. 69528 ist.
53. Bakterienstamm mit einer genetischen Kassette oder einem Abschnitt davon nach Anspruch 45, wobei der Bakterienstamm keine endogene, für das bakterielle Reportergenprodukt codierende DNA-Sequenz besitzt.
54. Verfahren zur Messung der Aktivität eines mikrobiellen Startreplikationsfaktors, umfassend:
(a) Bereitstellen einer Bakterienpopulation, wobei die Bakterienpopulation eine stabil integrierte genetische Kassette oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung eines Promotors besitzt, dessen Expression koordinativ durch Zellwachstum reguliert wird, wobei die Kassette aufweist:
(i) eine erste, für ein bakterielles Reportergenprodukt codierende DNA-Sequenz, die verbunden ist mit dem 3'-Ende
(ii) einer zweiten DNA-Sequenz, die an ein Gen oder einen Abschnitt davon hybridisiert, dessen Expression koordinativ durch Zellwachstum reguliert wird und das bzw. der im Bakterienchromosom angeordnet ist, um die genetische Kassette zu bilden, wobei die zweite DNA-Sequenz aus
reichend Sequenzidentität zu dem Gen oder dem Abschnitt davon besitzt, um für eine Rekombination und Integration der genetischen Kassette oder eines Abschnitts davon in das Gen im Bakterienchromosom zu sorgen,
(b) Kontaktieren der Bakterienpopulation mit einem mikrobiellen Startreplikationsfaktor, um eine behandelte Population zu bilden; und
(c) Bestimmen der Menge an mikrobiellem Wachstum durch Messen der Menge an Reportergenprodukt, das pro Zeiteinheit pro Zelle in der behandelten Population erzeugt wird, verglichen mit der Menge an Reportergenprodukt pro Zeiteinheit pro Zelle in einer unbehandelten Population.
55. Verfahren zur Messung mikrobiellen Wachstums, umfassend:
(a) Bereitstellen einer Bakterienpopulation, wobei die Bakterienpopulation eine stabil integrierte genetische Kassette oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung eines Promotors besitzt, dessen Expression koordinativ durch die Rate an Zellwachstum reguliert wird, wobei die Kassette umfaßt:
(i) eine erste, für ein bakterielles Reportergenprodukt codierende DNA-Sequenz, die verbunden ist mit dem 3'-Ende
(ii) einer zweiten DNA-Sequenz, die an ein Gen oder einen
Abschnitt davon hybridisiert, dessen Expression koordinativ durch Zellwachstum reguliert wird und das bzw. der im Bakterienchromosom angeordnet ist, um die genetische Kassette zu bilden, wobei die zweite DNA-Sequenz für
&iacgr;&ogr; Rekombination und Integration der genetischen Kassette
oder eines Abschnitts davon in das Gen im Bakterienchromosom sorgt; und
(b) Bestimmen der Menge an Reportergenprodukt in der Population.
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