DE60310525T2

DE60310525T2 - Ultraviolette licht zur lichtaktivierten gentransduktion bei der genzuführung

Info

Publication number: DE60310525T2
Application number: DE60310525T
Authority: DE
Inventors: M. Edward Rochester SCHWARZ; Thomas Rochester FOSTER; J. Regis Pittsford OKEEFE; C. Jarod Rochester FINLAY; T. Paul Honeoye Falls RUBERY
Original assignee: University of Rochester
Current assignee: University of Rochester
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2023-02-01
Also published as: US7524327B2; EP1472348A4; WO2003064680A2; AU2003210820B2; EP1472348B1; EP1867715B1; DE60326781D1; US20030236394A1; EP1939285A1; CA2474485A1; EP1472348A2; US20090093867A1; ATE426020T1; EP1867715A1; ATE348884T1; WO2003064680A3; DE60310525D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Technischer Bereich
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Gentherapie. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden medizinische Ausrüstungen für die kombinierte Verwendung der lichtaktivierten Gentransduktion (LAGT) geschaffen, die Ultraviolettlicht und ein rekombinantes adeno-assoziiertes Virus (r-AAV) für die Einführung eines gewünschten Gens in das Gewebe eines Patienten nutzt.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Behandlung verletzter Dornfortsätze umfasst gegenwärtig häufig die "Verschmelzung" oder das Anregen der biologischen Vereinigung von Knochen durch Einführen von Knochentransplantaten oder -vorrichtungen in die Funktionsspinaleinheiten (FSU), z. B. zwischen zwei Wirbeln. Außerdem kann die effektive Manipulation bestimmter osteobiologischer Moleküle über Gentherapie verwendet werden, um die Knochenverschmelzung in einer Funktionsspinaleinheit (FSU) anzuregen. Eine FSU besteht aus zwei Wirbeln, einer nahe gelegenen Nervenwurzel und einer menschlichen Zwischenwirbelscheibe zwischen den zwei Wirbeln. Diese Scheibe, die den Stoß für den Dornfortsatz dämpft und der FSU Festheit verleiht, besteht aus Wasser, Kollagen (Typ I und II) und Glykosaminoglykan (GAG).
Eine alternde oder entartete Scheibe ist häufig durch verringertes Wasser, erhöhtes Typ-I-Kollagen, verringertes Typ-II-Kollagen und verringertes GAG charakterisiert. Diese Alterung oder Entartung, die unvollständig verstanden ist, führt allgemein zu verringerter biomechanischer Stoßabsorption, erhöhtem Bewegungsbereich und Schmerz und/oder Behinderung.
Die somatische Zellgentherapie ist eine Form der Behandlung, die auf den Dornfortsatz sowie auf andere Bereiche, in denen das genetische Material einer Zielzelle durch die Verabreichung von Nukleinsäure, üblicherweise in Form von DNA, geändert wird, anwendbar ist. Bei der Verfolgung effektiver In-vivo-Verabreichungsrouten nutzen Wissenschaftler die ansonsten potentiell schädliche Fähigkeit von Viren, in eine Zielzelle einzudringen und die Zelle durch die Einführung von Viren-DNA "umzuprogrammieren". Durch Kapseln von gewünschtem genetischem Material in einem Virenpartikel oder "-vektor", abzüglich einiger Viren-DNA, ist die effektive und gezielte Lieferung von genetischem Material in vivo möglich. Wie die Gentherapie in spezifischen Behandlungen angewendet wird, bietet sie die Fähigkeit, die Ausprägung gewünschter Moleküle einschließlich sowohl intrazellularer als auch extrazellularer Proteine einzustellen, um ein gewünschtes biologisches Ergebnis herbeizuführen.
Insbesondere die gewünschten Qualitäten adeno-assoziierter Viren (AAV) haben zur weiteren Untersuchung potentieller Gentherapieverwendungen geführt. Als ein Mittel für die Gentherapie bieten rekombinante Formen von AAV oder r-AVV viele Vorteile einschließlich der Fähigkeit des Vektors, sich nicht teilende Zellen (z. B. Knorpelzellen, Zellen mit Knorpel) zu infizieren, der ununterbrochenen Zielgen-Ausprägung, der niedrigen Immunreaktion auf den Vektor und der Fähigkeit, eine große Vielfalt von Geweben zu transduzieren. Das AAV enthält ein einstrangiges DNA-Genom (ssDNA-Genom). Wegen der Tatsache, dass das AAV allein die für die Replikation des zweiten DNA-Strangs erforderlichen Enzyme nicht codiert, ist das AAV unter normalen Bedingungen in Menschen in replikationsunfähiger Form vorhanden. Eine erfolgreiche r-AAV-Transduktion erfordert häufig die Anwesenheit einer Koinfektion mit einem Adenovirus oder, dass die Host-Zelle DNA-schädigenden Mitteln wie etwa γ-Strahlung ausgesetzt wird. Die Einführung entweder einer Koinfektion oder der DNA-schädigenden Mittel induziert drastisch den ratenbegrenzenden Schritt der Synthese des zweiten Strangs, d. h. des zweiten Strangs der DNA, der anhand des in den ersten Strang eingeführten Vektors synthetisiert wird. Allerdings ist die Verwendung dieser DNA-schädigenden Mittel unbrauchbar, da die Verabreichung einer Adenovirus-Koinfektion an einen Patienten weder brauchbar noch erwünscht ist und die standortspezifischen Probleme und Sicherheitsprobleme, die die Verwendung von γ-Strahlung betreffen, ebenfalls unerwünscht sind.
In der Vergangenheit sind Versuche unternommen worden, eine r-AAV-Transduktion in vivo unter Verwendung von UV-Strahlung mit einer Wellenlänge von 254 nm zu induzieren. Siehe z. B. J. Rheumatol., Bd. 27, 2000, 983–9, und Oncology Reports, National Hellenic Research Foundation, Athen, GR, Bd. 5, Nr. 4, 1998, 793–797. Leider wurde wegen der langen beteiligte Belichtungszeiten bei Verwendung von 254 nm-UV-Strahlung, wegen der Schwierigkeiten der Zuführung von 254 nm-UV-Strahlung zu einer chirurgischen Zielstelle und wegen der Unfähigkeit, die 254 nm-UV-Lichtquelle so zu positionieren, dass sie ein effektives Durchdringen einer Zielzelle zulässt, auf der Grundlage dieser Experimente kein effektives therapeutisches Verfahren oder keine effektive therapeutische Vorrichtung entwickelt.
Darstellung der Erfindung
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schaffen Strukturen zur Behandlung eines Patienten unter Verwendung einer lichtaktivierten Gentherapie.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Ausrüstung zum Einführen eines gewünschten Gens in das Gewebe eines Patienten geschaffen. Die Ausrüstung enthält einen mittels Ultraviolettlicht aktivierbaren Virusvektor und eine Lichtquelle, die ein Ultraviolettlichtbündel erzeugen kann. Außerdem enthält die Ausrüstung eine Lichtsonde, die mit der Lichtquelle funktional verbunden ist, wobei die Lichtsonde Ultraviolettlicht mit einer Wellenlänge von 320 nm bis 400 nm liefern kann.
In Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Implantationsausrüstung zum Einführen eines gewünschten Gens in das Gewebe eines Patienten geschaffen. Die Ausrüstung enthält ein Implantat, das so konfiguriert ist, dass es in einem minimal störenden Eingriff in das Gewebe eines Patienten eingeführt wird, und einen mit dem Implantat integrierten mittels Ultraviolettlicht aktivierbaren Virusvektor. Außerdem enthält die Ausrüstung eine Lichtsonde, die so konfiguriert ist, dass sie, wenn sie in das Gewebe eines Patienten eingeführt ist, Zugang zu dem Implantat hat, wobei sie dem Vektor lokal langwelliges Ultraviolettlicht verabreichen kann.
Ein Merkmal bestimmter bevorzugter Ausführungsformen dieser Erfindung ist die Vermeidung der Probleme, die an der Verwendung von UV- und γ-Strahlung durch die Verwendung lokal verabreichter langwelliger UV-Strahlung (320–400 nm-UV-Strahlung), um zu induzieren, dass die Zielzelle die Transduktion eines UV-aktivierten Virusvektors wie etwa eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus (r-AAV) effektiver stimuliert, beteiligt sind.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Ablaufplan eines Verfahrens der Behandlung von Zielzellen im Gewebe eines Patienten durch Aktivieren der Transduktion eines mittels UV-Licht aktivierten Virusvektors unter Verwendung einer Lichtsonde in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
2A ist eine schematische Seitenansicht einer Komponente eines Systems mit langwelliger UV-Strahlung, das eine Lichtquelle und eine Nutzerschnittstelle enthält.
2B ist eine schematische Darstellung einer weiteren Komponente des Systems mit langwelliger UV-Strahlung, das eine Lichtsonde enthält, das in Verbindung mit der Lichtquelle und mit der Nutzerschnittstelle, die in 2A gezeigt sind, das In-vivo-UV-Strahlungszufuhrsystem in Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet.
2C ist eine perspektivische schematische Darstellung einer externen Lichtsonde, die in Verbindung mit der Komponente, die die Lichtquelle und die Nutzerschnittstelle besitzt, die in 2A gezeigt sind, ein Ex-vivo-UV-Strahlungszufuhrsystem, das für externe Anwendungen konfiguriert ist, in Übereinstimmung mit einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet.
3 ist eine schematische Darstellung einer Injektionsvorrichtung zum Einführen eines mittels UV aktivierten Vektors in das Gewebe eines Patienten in Verbindung mit einem in den 2A und 2B gezeigten System mit langwelliger UV-Strahlung.
4 ist ein Verfahren zur Behandlung von Knorpel eines Patienten unter Verwendung eines mittels UV aktivierten Virusvektors und eines Systems mit langwelliger UV-Strahlung in Übereinstimmung mit einer abermals weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
5A–5D sind perspektivische schematische Darstellungen von Implantaten zur Verwendung in Verbindung mit den hier geschaffenen Systemen und Verfahren mit langwelliger UV-Strahlung in Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
5E ist eine schematische Querschnittsdarstellung des gedehnten Implantats aus 6D, wobei das gedehnte Implantat zwischen zwei Wirbeln befindlich gezeigt ist.
6 ist ein Ablaufplan eines Verfahrens zur Behandlung von Gewebe eines Patienten unter Verwendung eines mittels UV-Licht aktivierten Virusvektors und einer festen Plattform in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
7 ist ein Ablaufplan eines Verfahrens zur Behandlung von Spinalgewebe eines Patienten unter Verwendung eines mittels UV-Licht aktivieren Virusvektors und einer UV-Lichtsonde in Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
8 ist ein Ablaufplan eines Verfahrens zur Behandlung von Spinalgewebe eines Patienten mit einem Spinalimplantat in Übereinstimmung mit einer abermals weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
9–11 sind graphische Darstellungen der Ergebnisse des Beweises des Prinzipexperiments aus Beispiel 1.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Der Begriff "AAV" bezieht sich auf adeno-assoziiertes Virus, während sich der Begriff "r-AVV" auf rekombinantes adeno-assoziiertes Virus bezieht. Vorzugsweise enthält das r-AAV nur das gewünschte Gen, das in das Gewebe des Patienten eingeführt werden soll, und die flankierenden AAV-invertierten terminalen Repetitionen (ITRs), die als die Packungssignale dienen.
"Ultraviolettstrahlung" und "Ultraviolettlicht", auch als "UV" bekannt, beziehen sich auf die Abschnitte des elektromagnetischen Spektrums, die kürzere Wellenlängen als sichtbares Licht haben. Der Bereich von Wellenlängen, die als Ultraviolettstrahlung betrachtet werden, von etwa 4 Nanometern bis etwa 400 Nanometern, ist in drei Untergruppen, UVA, UVB und UVC, weiter unterteilt. "UVA" ist der Abschnitt der Ultraviolettstrahlung, der Wellenlängen von 320 nm bis einschließlich 400 nm enthält. "UVB" ist der Abschnitt der Ultraviolettstrahlung, der Wellenlängen von 280 nm bis einschließlich 320 nm enthält. "UVC" ist der Abschnitt der Ultraviolettstrahlung mit einer Wellenlänge kleiner als 280 nm.
Der Begriff "langwelliges UV" bezieht sich auf Ultraviolettstrahlung oder -licht mit einer Wellenlänge gleich oder größer als 255 nm, jedoch nicht mehr als 400 nm.
Ein "Virusvektor" bezieht sich auf ein Virus oder auf ein Rekombinantes davon, das gewünschtes genetisches Material kapseln und das gewünschte genetische Material in eine Zielzelle übertragen und integrieren kann, womit es die effektive und gezielte Lieferung von genetischem Material sowohl ex vivo als auch in vivo ermöglicht. Ein "mittels UV aktivierter Virusvektor", ein "mittels UV-Licht aktivierter Virusvektor" ist im Kontext der vorliegenden Erfindung ein adeno-assoziierter Virusvektor oder einstrangiger Virusvektor oder ein Rekombinantes davon, dessen Replikation durch Ultraviolettlicht reguliert wird. Ein rekombinantes adeno-assoziiertes Virus (r-AAV) ist in der Gruppe von Vieren enthalten, die als mittels UV aktivierte Virenvektoren bezeichnet werden. Eine "feste Plattform" ist irgendeine Struktur, die dafür ausgelegt ist, in den Körper eingeführt zu werden, um in der Nähe, wo die feste Plattform eingeführt wird, bei der Behandlung der Zielstelle zu helfen.
Der Begriff "LAGT" bezieht sich auf mittels Licht aktivierte Gentransduktion, während sich "LAGT-Sonde" oder "Lichtsonde" oder "Lichtsonde mit langer UV-Wellenlänge" auf die medizinische Vorrichtung bezieht, die der Zielstelle langwelliges Ultraviolettlicht zuführt und die Transduktion des gewünschten von dem Vektor getragenen Gens bewirkt.
Anhand von 1 ist ein Verfahren zur Behandlung von Gewebe eines Patienten gezeigt. Eine Lichtsonde wird in der Nähe von Zielzellen lokalisiert 100. Daraufhin wird durch ein Lichtzufuhrkabel langwelliges Ultraviolettlicht (UV-Licht) zu der Lichtsonde übertragen 110. Durch lokales Verabreichen von Ultraviolettlicht an die Zielzellen unter Verwendung der Lichtsonde wird die Transduktion des Virusvektors aktiviert 120. Die Wellenlänge des UV-Lichts liegt im Bereich von 320 nm bis einschließlich 400 nm. Ein mittels UV aktivierter Virusvektor, der ein gewünschtes Gen enthält, wird in die Nähe von Zielzellen im Gewebe eines Patienten geliefert 130.
Es wird angemerkt, dass das Verfahren aus 1 in anderen bevorzugten Ausführungsformen in einer anderen Reihenfolge als der oben im Text dargelegten ausgeführt werden kann. Zum Beispiel wird der Vektor in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor dem lokalen Verabreichen des Ultraviolettlichts geliefert.
Die 2A–2C veranschaulichen getrennte Komponenten eines UV-Strahlungszufuhrsystems, wobei 2A den UV-Lichtgenerator 10 und das Nutzerschnittstellensystem zeigt und 2B und 2C In-vivo- beziehungsweise Ex-vivo-Versionen der Lichtsonde 26, 42 zeigen. Es wird angemerkt, dass die Lichtsonde 26, 42 durch das Lichtzufuhrkabel 24 funktional mit dem UV-Lichtgenerator 10 verbunden ist.
2A zeigt ein UV-Strahlungszufuhrsystem, das eine Lichtquelle 12 mit ausreichend langwelliger UV-Ausgabe enthält. Außerdem überträgt Lichtkanalisierungsoptik wie etwa ein Optokoppler 14 das Licht von der Lichtquelle 12 zu einem Lichtzufuhrkabel 24 wie etwa einem Glasfaserkabel oder -bündel, das das Licht für In-vivo-Zwecke über eine Lichtsonde 26 zu der Zielstelle überträgt (2B). Um die Länge der Zeit zu steuern, die der Patient mit dem UV-Licht über die Lichtsonde 26 (2B) belichtet wird, befindet sich in dem Weg des Lichtbündels zwischen der Lichtquelle 12 und dem Optokoppler 14 ein zeitgesteuerter Verschluss 16. Der zeitgesteuerte Verschluss 16 ist über Verbinder 22 funktional mit einer Verschlusssteuereinheit 18 und mit einer Verschlusssteuereinheits-Schnittstelle 20 verbunden. Es wird angemerkt, dass die in 2A offenbarten Komponenten in alternativen Ausführungsformen, die für Ex-vivo-Behandlungen konfiguriert sind, in Verbindung mit den in 2C gezeigten Ex-vivo-Lichtsondenkomponenten verwendet werden.
2B zeigt eine Lichtsonde 26 als Teil eines In-vivo-UV-Strahlungszufuhrsystems zur Verwendung mit der Lichtquelle und mit der Nutzerschnittstelle wie etwa jenen, die in 2A gezeigt sind. Die Lichtsonde 26 ist so konfiguriert, dass sie Zielzellen, die von einem mittels UV aktivierten Virusvektor infiziert sind, lokal mit langwelligem Ultraviolettlicht (UV-Licht) bestrahlt. Die Lichtsonde 26 ist durch einen optischen Verbinder 28 mit dem Lichtzufuhrkabel verbunden. Die Lichtsonde 26 ist so konfiguriert, dass sie mittels Glasfaser Licht mit einer geeigneten UV-Wellenlänge, das von der Lichtquelle 12 ausgeht, durch einen Lichtleiter 30 zu einem Lichtleiterterminator 34 wie etwa zu einer Mikrolinsenspitze oder zu einer Spitze mit zylindrischer Diffusionslinse überträgt, um die r-AAV-Transduktion in den Zielzellen "zu aktivieren". Die Lichtsonde 26 ist vorzugsweise sowohl in Form eines Arthroskops geformt als auch mit alternativen Lichtsonden mit anderen Konfigurationen austauschbar. Zum Beispiel kann die Lichtsonde so konfiguriert sein, dass sie verschiedene Formen hat, um effektiver zu verschiedenen Behandlungsstellen Zugang zu bekommen. Vorzugsweise ermöglicht der Optikverbinder 28 außerdem, dass die Lichtsonde 26 auf Wunsch wahlweise von dem Lichtzufuhrkabel 24 gelöst wird. Außerdem ist die Lichtsonde 26 vorzugsweise steril und als Einwegartikel konfiguriert. In bestimmten alternativen Ausführungsformen enthält das UV-Strahlungszufuhrsystem außerdem ein Ziel-Laserbündel (nicht gezeigt), um die genaue Zufuhr des Lichts zu ermöglichen. In das offenbarte Verfahren können außerdem chirurgische Standardhilfsmittel wie etwa Kanülen und Trokare integriert werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
In der in 2A gezeigten Ausführungsform ist die Lichtquelle 12 in einem Gehäuse enthalten, während die Lichtquelle 12 in bestimmten alternativen Ausführungsformen funktional mit dem Gehäuse verbunden ist. Wie für den Fachmann selbstverständlich ist, variieren die genaue Form und Größe der in 2A gezeigten Lichtsonde 26 und insbesondere der Lichtsondenspitze selbstverständlich je nach der besonderen Anwendung und Zielstelle. Zum Beispiel kann die Lichtsonde 26 so konfiguriert sein, dass sie zu einer Zwischenwirbelscheibe im Dornfortsatz eines Patienten oder zum Knorpel im Gelenk eines Patienten Zugang bekommt. Die bevorzugten Ausführungsformen enthalten eine Lichtquelle, die einen Laser umfasst, der auf die geeignete lange UV-Wellenlänge abgestimmt ist. In bevorzugten Ausführungsformen wird das UV-Strahlungszufuhrsystem, sei es ein lampen- oder ein lasergestütztes System, auf der Grundlage von Betrachtungen wie etwa Kosten und technischer Einfachheit optimiert. Um die genaue Zufuhr des Lichts zu ermöglichen, kann das Lampenzufuhrsystem zusätzlich außerdem ein Ziel-Laserbündel enthalten. Chirurgische Standardhilfsmittel, z. B. Kanülen und Trokare, können ebenfalls verwendet werden.
Wie in 2C gezeigt ist, ist in Übereinstimmung mit alternativen bevorzugten Ausführungsformen eine Ex-vivo-Lichtsonde 42 zur Verwendung mit der Lichtquelle und mit der Nutzerschnittstellenkomponente aus 2A vorgesehen, um ein Ex-vivo-UV-Strahlungssystem zu bilden. In dieser Ex-vivo-Ausführungsform ist die Lichtsonde 42 für die nicht chirurgische Verwendung wie etwa für die Bestrahlung der Haut eines Patienten oder für die Bestrahlung von Gewebe, das von einem Patienten entnommen wurde, um es später in den Patienten zurückzugeben, ausgelegt. Die ex vivo konfigurierte Lichtsonde 42 besitzt einen Griff 44, vorzugsweise einen Formanpassungsgriff, der so konfiguriert ist, dass er die effektive manuelle Manipulation der Sonde 42 zulässt. Die für externe Anwendungen konfigurierte Lichtsonde 42 besitzt außerdem ein Schaftgehäuse 46, das einen Lichtleiter 30 und einen Lichtleiterterminator 34 umgibt. Ein optischer Verbinder 28 leitet das Licht von dem Lichtzufuhrkabel 24 und ermöglicht vorzugsweise, dass die Lichtsonde 42 auf Wunsch wahlweise von dem Lichtzufuhrkabel 24 gelöst wird.
Alternative Ausführungsformen nutzen als eine Lichtquelle eine Lampe wie etwa eine Argonlampe hoher Intensität. In diesen alternativen Ausführungsformen enthält das UV-Strahlungszufuhrsystem ferner eine Wellenlängenauswahlvorrichtung wie etwa einen dichroitischen Spiegel und/oder ein optisches Filter, die so eingestellt sind, dass sie langwelliges UV durchlassen und unerwünschte Lichtwellenlängen zurückweisen. In dieser Ausführungsform sind die Wellenlängenauswahlvorrichtung und der dichroitische Spiegel vorzugsweise in demselben Gehäuse wie die Lichtquelle enthalten.
Wie in 3 gezeigt ist, wird in Verbindung mit dem UV-Strahlungszufuhrsystem der 2 und 2B vorzugsweise eine Injektionsvorrichtung 36 mit einem Gehäuse 38 und mit einem Tauchkolbenmechanismus 40 genutzt. Vorzugsweise ist die Injektionsvorrichtung 36 zum Liefern eines mittels UV aktivierten Virusvektors wie etwa eines r-AAV zu der Zielstelle unter Verwendung minimal invasiver Operationstechniken konfiguriert. In alternativen bevorzugten Ausführungsformen kann die Injektionsvorrichtung zum Injizieren eines Implantats oder einer festen Plattform an eine Zielstelle in einem Patienten (6 und 8) konfiguriert sein.
Andere chirurgische Hilfsmittel als die in 3 gezeigte Injektionsvorrichtung 36, die in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beteiligt sein können, enthalten eine Kanüle, einen Trokar und einen perkutanen Motorscheibenausschneider (alle nicht gezeigt), der den Raum innerhalb eines Scheibenraums vergrößert. Es wird angemerkt, dass die Größe und die Konstruktion dieser Hilfsmittel variieren, um sie sowohl an das Behandlungsziel als auch an die Zielstelle anzupassen. Alternative Spinalausführungsformen dieser Hilfsmittel sind so konstruiert, dass sie auf Hals-, Brust-, und Lendenscheibenräume sowie auf die Zwischenwirbelgelenke Zugriff erhalten. Weitere Hilfsmittel, die der Fachmann als vorteilhaft erkennt, können in Verbindung mit den hier gegebenen Ausführungsformen ebenfalls verwendet werden.
Anhand von 4 wird ein Verfahren für die Behandlung des Risses eines beschädigten Knorpels geschaffen. In die Nähe einer Knorpelzielstelle wird eine UV-Sonde eingeführt 200. Vorzugsweise wird der gerissene Knorpel auf Wunsch über eine Standardarthroskopie entfernt. Über ein Glasfaserkabel der UV-Sonde wird langwelliges Ultraviolettlicht (320–400 nm) zu den Zielzellen übertragen 210, wobei die Zielzellen mit dem langwelligen Ultraviolettlicht bestrahlt werden 220, um die Erneuerung der Zielknorpelstelle zu bewirken. Ein mittels UV aktivierter Virusvektor wie etwa ein r-AAV wird vorzugsweise durch Injektion in die Nähe der Zielstelle geliefert 230.
Es wird angemerkt, dass das Verfahren aus 4 in anderen bevorzugten Ausführungsformen in einer anderen Reihenfolge als der oben im Text umrissenen ausgeführt werden kann. Zum Beispiel wird der Vektor in einer anderen bevorzugten Ausführungsform vor dem lokalen Verabreichen des Ultraviolettlichts geliefert.
Anhand der 5A–5E schaffen alternative bevorzugte Ausführungsformen ein Implantationssystem und ein Verfahren zu dessen Verwendung, die die Verwendung von Implantaten enthalten, die an der Zielstelle als feste Plattformen (z. B. zum Erzeugen einer vorübergehenden mechanischen Starrheit zwischen Wirbeln) dienen, während die Zielzellen auf die Einführung des gewünschten Gens in das Gewebe des Patienten reagieren. Vorzugsweise können diese sorgfältig entwickelten Implantate dehnbar sein, um die Einführung durch einen minimalen Einschnitt zu ermöglichen. Außerdem können diese Implantate in einer Anzahl von Formen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) einer sich entfaltenden geodosischen Kuppel 52 oder eines sich entfaltenden Tetraeders (nicht gezeigt), eines Regenschirms/einer Kuppel (nicht gezeigt), eines sich dehnenden Zylinders 54 und von Federn, die sich strecken, um den Durchmesser zu erhöhen, gebildet sein. Der sich dehnende Zylinder 54 ist in 5C in einer gepressten Form und in 5D (siehe auch 5E) in einem gedehnten Zustand gezeigt, während die sich entfaltende geodosische Kuppel 52 in 5A in einer gepressten Form und in 5B in einem gedehnten Zustand gezeigt ist. Vorzugsweise werden diese Implantate mit einem integrierten mittels UV aktivierten Implantat-Virusvektor hergestellt. Zum Beispiel kann das r-AAV mit dem Implantat durch Verbinden oder Beschichten des r-AAV mit dem Implantat, Absorbieren des r-AAV in das Implantat und/oder Austrocknen des r-AAV auf der Implantatoberfläche integriert werden. In alternativen bevorzugten Ausführungsformen wird das Implantat getrennt von dem mittels UV-aktivierten Virusvektor an eine Zielstelle geliefert.
5E zeigt eine feste Plattform 54, mit der vorzugsweise ein mittels UV aktivierter Virusvektor integriert ist und die zwischen zwei Wirbeln 50 platziert ist, um den Neubau oder die Reparatur der Zwischenwirbelscheibe 48 zu ermöglichen. Vorzugsweise sind diese festen Plattformen als chirurgische Implantate konstruiert. Beispiele fester Plattformen, die den allgemeinen Erfindungsgedanken nicht einschränken, mit denen mittels UV aktivierte Virusvektoren integriert werden könnten, enthalten Spinalabstandshalter, wie sie in 5E gezeigt sind, und außerdem Gesamtgelenkersätze wie etwa Hüftimplantate, Herzkranzarterienstents und andere chirurgische Implantate. Diese Beispiele werden nur für Veranschaulichungszwecke gegeben und sollten in keiner Weise als Einschränkung der vorliegenden Erfindung betrachtet werden. Bestimmte bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten einen mittels UV aktivierten Virusvektor, der mit einer festen Plattform integriert ist, die so ausgelegt ist, dass sie die Infektion von Zellen in der Nähe der Zielstelle, bei der die feste Plattform eingeführt wird, erleichtert. In einer alternativen Ausführungsform wird der Vektor in einem von der Einführung des Implantats getrennten Schritt an die Zielstelle geliefert.
Selbstverständlich sind Strukturunterstützungsimplantate, die solche herkömmlichen Strukturen wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Platten, Stäbe, Drähte, Kabel, Haken, Schrauben enthalten, mit den hier geschaffenen Ausrüstungen und bevorzugten Ausführungsformen ebenfalls vorteilhaft nutzbar. Die Stützstruktur kann aus einem Material wie etwa, aber nicht beschränkt auf, Metall, Kohlenstofffaser, Kunststoff und/oder einem resorbierbaren Material gebildet sein.
6 bietet ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten unter Verwendung eines mittels UV aktivierten Virusvektors in Verbindung mit einer festen Plattform. Ein mittels UV aktivierter Virusvektor, der ein gewünschtes Gen enthält, wird mit einer festen Plattform integriert 300. Vorzugsweise wird der Vektor durch Verbinden, Austrocknen, Beschichten und/oder Absorbieren mit der festen Plattform integriert. Daraufhin wird die feste Plattform in die Nähe der Zielzellen im Gewebe eines Patienten in einen Patienten eingeführt 310. In der Nähe der Zielzellen wird eine Lichtsonde lokalisiert 320 und durch ein Lichtzufuhrkabel wie etwa ein Glasfaserkabel oder -bündel wird langwelliges Ultraviolettlicht mit einer Wellenlänge von 320 nm bis 400 nm zu der Lichtsonde übertragen 330. Durch Bestrahlen der Zielzellen unter Verwendung der Lichtsonde wird die Transduktion des Virusvektors aktiviert 340.
7 zeigt ein Verfahren der Behandlung von Spinalgewebe eines Patienten. Eine Lichtsonde wird in der Nähe der Zielzellen im Spinalgewebe eines Patienten lokalisiert 400. Die Transduktion eines mittels ultraviolett aktivierten Virusvektors wird durch lokales Verabreichen von Ultraviolettlicht an die Zielzellen unter Verwendung der Lichtsonde aktiviert 410. Der mittels Ultraviolett (UV) aktivierte Virusvektor, der ein gewünschtes Gen enthält, wird in die Nähe der Zielzellen geliefert 420.
In einer in 8 gezeigten weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Implantat, vorzugsweise unter Verwendung einer minimal invasiven Route wie etwa eines Sticheinschnitts, bei einer Spinalzielstelle eingeführt 500. Die Zielzellen werden, vorzugsweise durch Befestigen des Vektors an dem Implantat vor der Einführung, mit einem mittels UV aktivierten Virusvektor wie etwa einem r-AAV, das ein gewünschtes Gen enthält, infiziert 510. Zum Beispiel kann das r-AAV mit dem Implantat durch Beschichten oder Verbinden des r-AAV mit dem Implantat, Absorbieren des r-AAV in das Implantat und/oder Austrocknen des r-AAV auf der Implantatoberfläche integriert werden. In der Nähe der Zielzellen wird eine Lichtsonde platziert oder lokalisiert 520. Die Lichtsonde aktiviert 530 die mittels UV aktivierte Virusvektortransduktion der infizierten Zielzelle. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird ein Strukturunterstützungsimplantat an Knochen befestigt, um Raum erzeugen zu helfen und die Geometrie der Spinalzielstelle zu erhalten. In einer alternativen Ausführungsform wird der Vektor in einem von der Einführung des Implantats getrennten Schritt an die Zielstelle geliefert.
In bestimmten Ausführungsformen, die Spinalimplantate nutzen, können die Abstandshalterimplantate verwendet werden, um die Scheibenhöhe wiederherzustellen und die FSU-Geometrie zu erhalten, während die Verschmelzung des umgebenden Knochens fortschreitet. In diesen Ausführungsformen enthält der mittels UV aktivierte Virusvektor knochenbildende Gene. Die Lichtsonde würde dann die Zielzellen direkt aktivieren, um den Virusvektor zu transduzieren.
In weiteren Ausführungsformen, die Spinalimplantate nutzen, können die Abstandshalterimplantate verwendet werden, um die Scheibenhöhe wiederherzustellen und die FSU-Geometrie zu erhalten, während sich die Zwischenwirbelscheibe neu bildet, um eine reparierte oder verjüngte Zwischenwirbelscheibe zu bilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Strukturunterstützungsimplantate verwendet werden, um die Scheibenhöhe wiederherzustellen und die FSU-Geometrie zu erhalten, während sich die Zwischenwirbelscheibe neu bildet, um eine reparierte oder verjüngte Zwischenwirbelscheibe zu bilden. In diesen Ausführungsformen enthält der mittels UV aktivierte Virusvektor Scheibenneubildungsgene. Die Lichtsonde würde dann die Zielzellen direkt aktivieren, um den Virusvektor zu transduzieren.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten sowohl In-vivo- als auch Ex-vivo-Anwendungen. In der Ex-vivo-Anwendung wird die Dosis langwelligen UV-Lichts auf Zellen oder biologisches Material außerhalb des Patienten angewendet und daraufhin, vorzugsweise durch Injektion, an die gewünschte Behandlungsstelle geliefert. In der In-vivo-Anwendung werden die LAGT-Sonde und der mittels UV aktivierte Virusvektor vorzugsweise unter Verwendung minimal invasiver Operationstechniken wie etwa von Sticheinschnitten zu der Behandlungsstelle eingeführt. Alternative In-vivo-Ausführungsformen nutzen chirurgische Direktvisualisierungstechniken.
Ein mittels UV aktivierter Virusvektor ist im Kontext der vorliegenden Erfindung ein einstrangiger Virusvektor, wobei das Virus eine therapeutisch wesentliche Zunahme der Virustransduktion ermöglichen kann, wenn eine mit dem Virus infizierte Zielzelle mit einer therapeutischen Dosis Ultraviolettstrahlung belichtet wird. Bevorzugtere Ausführungsformen enthalten mittels UV aktivierte Virusvektoren, die sich nicht teilende Zellen infizieren können, eine anhaltende Zielgen-Ausprägung bewirken können, eine niedrige Immunreaktion auf den Vektor auslösen können und die Fähigkeit besitzen, eine große Vielfalt von Geweben zu transduzieren.
Das LAGT-System der vorliegenden Erfindung führt langwellige Ultraviolettstrahlung in dem Bereich von 320 nm bis 400 nm zu.
Spezieller ist die Wellenlänge des Ultraviolettlichts, das zum Aktivieren der mittels UV aktivierten Virusvektortransduktion einschließlich der r-AAV-Transduktion in den Zielzellen erzeugt wird, 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395 oder 400 Nanometer oder 322, 325, 327, 332, 337, 342, 347, 352, 357, 362, 367, 372, 377, 382, 387, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398 oder 399 Nanometer. Insbesondere ist die Wellenlänge des Ultraviolettlichts 325 Nanometer.
Die Tabellen 1–3 sind Tabellen beispielhafter Wachstumsfaktoren, Signalisierungsmoleküle und/oder Transkriptionsfaktoren, die die in einen mittels UV aktivierten Virusvektor eingeführten gewünschten Gene, die anhand der gewünschten Verwendung (z. B. integriertes Implantat gegenüber in Lösung) und des Ergebnisses (z. B. Knochenintegration, Spinalverschmelzung, perioprothetische Knochenauflösung und/oder Knorpelreparatur/-neubildung) ausgewählt wurden, codieren könnten. Die in den Tabellen 1–3 enthaltenen Listen werden für Veranschaulichungszwecke gegeben und sollten in keiner Weise als Beschränkung der Ausführungsformen der Erfindung verstanden werden.
TABELLE 1 Knochenintegration und/oder Dornfortsatzverschmelzung
TABELLE 2 Perioprothetische Knochenauflösung
TABELLE 3 LAGT für Knorpel:
Beispiel
I. Verfahren
A. Abtrennung menschlicher Mesenchym-Stammzellen
Aus Patientenblutproben, die von einem Beckenbeinkamm geerntet wurden, wurden menschliche Mesenchym-Stammzellen (hMSC) abgetrennt. Die Blutproben wurden in einem gleichen Volumen steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt. Daraufhin wurde die verdünnte Probe über 10 ml Lymphoprep (Media Prep) in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen (Corning) sanft geschichtet. Daraufhin wurden die Proben 30 Minuten bei 1800 min^–1 zentrifugiert. Das Abtrennungsprotokoll ist eine Standardlabortechnik, wobei der resultierende Gradient, der sich bildete, die Abtrennung der hMSCs aus der Schicht unmittelbar über dem Lymphoprep ermöglichte. Die abgetrennte Fraktion wurde zusammen mit zusätzlichen 20 ml steriler PBS in einem neuen 50 ml-Falcon-Röhrchen platziert. Die Probe wurde 8 Minuten bei 1400 min^–1 zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, das Zellenpellet wurde in 20 ml frischer PBS erneut aufgeschwemmt und wieder 8 Minuten bei 1400 min^–1 zentrifugiert. Danach wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Zellenpellet in 10 ml Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Fetalknochenserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) (Invitrogen) erneut aufgeschwemmt. Die hMSCs wurden gezüchtet und nach Bedarf in einen 37°/5%-CO₂-Wassermantelinkubator (Forma Scientific) übergeben.
B. 325 nm-UV-Behandlung menschlicher Mesenchym-Stammzellen
Vor der Bestrahlung wurden die hMSCs mit einer Dichte von 5·10⁴ Zellen/Wanne in 12-Wannen-Platten plattiert. Über Nacht wurden die Zellen absetzen gelassen. Am nächsten Morgen wurden die Medien unmittelbar vor der Bestrahlung entfernt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Helium-Cadmium-Lasersystems (Melles Griot) mit verschiedenen Dosen (500 J/m², 1000 J/m², 3000 J/m², 6000 J/m² oder 10.000 J/m²) von 325 nm-UV-Licht bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden frische Medien, entweder mit oder ohne rekombinantes adeno-assoziiertes Virus, in die Wannen zugegeben.
C. Infektion menschlicher Mesenchym-Stammzellen mit rekombinantem adeno-assoziiertem Virus
Die Infektionen wurden in 12-Wannen-Schalen ausgeführt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus, das das bakterielle β-Galaktosidase-Reportergen trägt (rAAV-LacZ über die Gentherapie-Vektorkerneinrichtung der UNC Chapel Hill), in verschiedenen Infektionsmultiplizitäten (MOIs = 10, 100 und 1000) infiziert. Nachdem sie bestrahlt wurden, wurden die Zellen in einem Gesamtvolumen von 500 μl DMEM/10% FBS/1% P/S mit der vorgegebenen Menge Viren infiziert. Zwei Stunden nach der Anfangsinfektion wurden zusätzlich 1 ml der Medien zu den Kulturen zugegeben. Daraufhin wurden die Kulturen achtundvierzig Stunden im Inkubator (37°/5% CO₂) gelassen, bevor sie für die Analyse geerntet wurden.
D. Quantifizierung der rekombinanten Genausprägung
Achtundvierzig Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet; unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Strahlungs-β-Gal-Reportersystems wurden Zellenlysate hergestellt und analysiert. (BD Biosciences). Kurz gesagt, wurden aus der 12-Wannen-Schale unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA experimentelle Zellproben entnommen. Die Zellensuspension wurde in ein 1,5 ml-Falcon-Röhrchen übertragen und die Zellen wurden über eine 15-Sekunden-Zentrifugierung bei 13.000 min^–1 pelletiert. Das Zellenpellet wurde unter Verwendung zweier aufeinanderfolgender Runden erneuter Suspension in eiskalter PBS gewaschen und 15 Sekunden bei 13.000 min^–1 pelletiert. Das Endpellet wurde in 75 μl Lysise-Puffer (100 mM K₂HPO₄, 100 mM KH₂PO₄, 1 M DTT) erneut aufgeschwemmt und in einem Isopropanol-Trockeneisbad sowie in einem 37°-Wasserbad drei Runden Frieren/Tauen ausgesetzt. Die Lysate wurden ein letztes Mal 5 Minuten bei 13.000 min^–1 zentrifugiert. Proben (15 μl) der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurden für eine Stunde mit der bereitgestellten Substrat/Puffer-Lösung in einen Inkubator getan und daraufhin unter Verwendung eines Standardrohr-Luminometers analysiert. Die Ablesung dieser Analyse ist im Ergebnisabschnitt in relativen Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt.
II. Ergebnisse
A. Belichtung mit 325 nm UV erhöhte den Pegel der Reportergen-Ausprägung
Belichtung mit 325 nm UV vor Infektion mit rAAV-LacZ hatte bei jeder der verwendeten MOIs eine dosisabhängige Zunahme der LacZ-Reportergen-Ausprägung. Die Steuerungen für jedes Experiment waren wie folgt: Attrappe (Zellen allein, keine Behandlung) und Zellen, die mit jeder der verschiedenen UV-Dosen (500 J/m², 1000 J/m², 3000 J/m², 6000 J/m²) behandelt wurden, die RLU-Niveaus hatten, die mit den Attrappenkulturen verträglich sind (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung des Student-T-Tests wurde die statistische Signifikanz berechnet. Die Ergebnisse sind im Folgenden in den 9–11 gezeigt.

Claims

Ausrüstung zum Einführen eines gewünschten Gens in das Gewebe eines Patienten, wobei die Ausrüstung umfasst: einen mittels Ultraviolettlicht aktivierbaren Virusvektor, wobei der aktivierte Virusvektor das Gen an das Gewebe liefern kann, wobei der Virusvektor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem adeno-assoziierten Virusvektor und aus einem einstrangigen Virusvektor besteht, wobei der genannte Virusvektor seine Transduktionseffizienz in einer Zelle, die mit Ultraviolettlicht von 320 nm bis 400 nm belichtet wird, erhöhen kann und wobei die genannte Erhöhung der Effizienz eine Erhöhung über die Effizienz hinaus ist, die der Vektor in einem Gewebe besitzt, das nicht mit Ultraviolettlicht von 320 nm bis 400 nm belichtet wird; eine Lichtquelle, die ein Ultraviolettlichtbündel von Licht mit einer Wellenlänge von 320 nm bis 400 nm erzeugen kann; und eine Lichtsonde, die mit der Lichtquelle funktional verbunden ist, wobei die Lichtsonde so konfiguriert ist, dass sie das Licht an das Gewebe liefert.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der das Ultraviolettlicht eine Wellenlänge aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395, 400, 322, 325, 327, 332, 337, 342, 347, 352, 357, 362, 367, 372, 377, 382, 387, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398 und 399 nm.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der das Ultraviolettlicht eine Wellenlänge von etwa 325 nm aufweist, wobei die Lichtquelle vorzugsweise ein Helium-Cadmium-Laser ist.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der – der Virusvektor ein rekombinantes adeno-assoziiertes Virus (r-AAV) ist, und – die Lichtquelle ein Laser ist.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der die Lichtsonde für die arthroskopische Chirurgie, vorzugsweise für die minimal invasive Chirurgie, ausgelegt ist.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, die ferner einen Abstandshalter umfasst, der so konfiguriert ist, dass er für Therapiezwecke chirurgisch in einen Patienten eingeführt wird; wobei vorzugsweise: – der Abstandshalter so ausgelegt ist, dass er Raum in einem Gelenk aufrechterhält, – der Virusvektor an den Abstandshalter integriert ist, oder – der ultraviolettaktivierbare Virusvektor ein rekombinantes adeno-assoziiertes Virus (rAAV) ist.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der das gewünschte Gen so ausgewählt ist, dass es: – eine Gewebeneubildung bewirkt, – eine Gewebereparatur bewirkt, oder – eine Gewebefunktion bewirkt.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, die ferner umfasst: – ein Lichtzufuhrkabel, das so konfiguriert ist, dass es das Ultraviolettlicht von der Lichtquelle zu der Lichtsonde überträgt; und eine Lichtkanalisierungsoptik, die so konfiguriert ist, dass sie das Ultraviolettlichtbündel in das Lichtzufuhrkabel kanalisiert.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der die Lichtquelle eine Lampe ist, die vorzugsweise ferner eine Wellenlängenauswahlvorrichtung, die so eingestellt ist, dass sie eine therapeutisch geeignete Wellenlänge von Ultraviolettlicht überträgt; und eine Fokussierungsoptik umfasst.
Ausrüstung gemäß Anspruch 8, bei der – die Lichtsonde so konfiguriert ist, dass sie zu einer Wirbelbehandlungsstelle Zugang hat, oder – die Lichtsonde so konfiguriert ist, dass sie zu einer Knorpelbehandlungsstelle Zugang hat.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der die Lichtquelle mit dem UV-Strahlungszufuhrsystem mit einer Injektionsvorrichtung in Verbindung steht, die ein Gehäuse und einen Tauchkolbenmechanismus aufweist.
Ausrüstung gemäß Anspruch 1, bei der die Behandlungsstelle, für die die Lichtsonde so konfiguriert ist, dass sie Zugang zu ihr hat, eine Behandlungsstelle außerhalb eines Patienten, der behandelt wird, ist.
Ausrüstung gemäß Anspruch 8, die ferner umfasst: – eine feste Plattform, die den mittels Ultraviolettlicht aktivierbaren Virusvektor enthält; oder – einen Optokoppler für die Kanalisierung des Lichtbündels in das Lichtzufuhrkabel.
Implantationsausrüstung zum Einführen eines gewünschten Gens in das Gewebe eines Patienten, wobei die Implantationsausrüstung umfasst: ein Implantat, das so konfiguriert ist, dass es in einem minimal störenden Eingriff in das Gewebe eines Patienten eingeführt wird; einen mit dem Implantat integrierten mittels Ultraviolettlicht aktivierbaren Virusvektor, wobei der aktivierte Virusvektor das Gen an das Gewebe liefern kann, wobei der Virusvektor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem adeno-assoziierten Virusvektor und aus einem einstrangigen Virusvektor besteht, wobei der genannte Virusvektor seine Transduktionseffizienz in einer Zelle, die mit Ultraviolettlicht von 320 nm bis 400 nm belichtet wird, erhöhen kann und wobei die genannte Erhöhung der Effizienz eine Erhöhung über die Effizienz hinaus ist, die der Vektor in einem Gewebe besitzt, das nicht mit Ultraviolettlicht von 320 nm bis 400 nm belichtet wird; und eine Lichtsonde, die so konfiguriert ist, dass sie, wenn sie in das Gewebe eines Patienten eingeführt ist, Zugang zu dem Implantat hat und dem Vektor lokal Ultraviolettlicht verabreicht, wobei die Lichtsonde Ultraviolettlicht zwischen 320 nm und 400 nm verabreichen kann.
Ausrüstung nach Anspruch 14, bei der: das r-AAV an das Implantat gebunden ist, oder das Implantat als ein Abstandshalter konfiguriert ist, der so ausgelegt ist, dass er unter Verwendung minimal invasiver Operationstechniken eingeführt wird.