DE60305884T2 - Igg3 immunogloblin als schutzsmarker gegen viren infektiösen krankheiten und seine verwendungen - Google Patents

Igg3 immunogloblin als schutzsmarker gegen viren infektiösen krankheiten und seine verwendungen Download PDF

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biologie und betrifft insbesondere eine neue Variante von isoliertem und/oder gereinigtem Immunglobulin IgG3, welche als Marker zum Schutz vor viralen Infektionskrankheiten, wie AIDS, und als Diagnosewerkzeug (Diagnose-Tool) oder als präventives und kuratives Arzneimittel nützlich ist.
  • AIDS ist für viele Länder in der Welt ein extrem schwerwiegendes und besorgniserregendes Problem der öffentlichen Gesundheit. So übersteigt beispielsweise in den USA die Anzahl von ausgebrochenen AIDS-Fällen die 100000 und die Anzahl von infizierten Personen wurde auf mehr als eine Million geschätzt. Die Ausbreitung der Krankheit wird aufgrund der Anzahl von chronischen Trägern des Virus, welches für AIDS verantwortlich ist, die während zahlreicher Jahre, wenn nicht ihr gesamtes Leben lang symptomlos bleiben und folglich nicht-identifizierte Kontaminationsquellen darstellen, verstärkt. Diese Krankheit, die auf sexuellem Wege und über das Blut übertragbar ist, greift das Immunsystem des Wirts an, wodurch das Auftreten von opportunistischen Infektionen oder von Pathologien, gegen welche ein gesundes Immunsystem den Wirt schützen würde, begünstigt wird. Wenn AIDS ausgebrochen ist, tritt der Tod im Allgemeinen zwei bis drei Jahre nach der Diagnose ein infolge eines Zusammenbruchs der Immunabwehren des Patienten und zahlreicher opportunistischer Infektionen. Es ist sehr schwierig, die AIDS-Viren angesichts der extremen genetischen und Antigen-bezogenen Variabilität, die sie an den Tag legen, in Klassen einzuteilen: es ist klassischerweise anerkannt, dass es zwei Virustypen gibt, die für AIDS beim Menschen verantwortlich sind: HIV-1 und HIV-2 (für „human immunodeficiency virus"). Aus zahlreichen Gründen wirft der Replikationsmechanismus von HIV für die Erzielung einer wirksamen Therapie zahlreiche Probleme auf. Tatsächlich verhält sich die provirale DNA durch ihre Integration in das zelluläre Genom wie ein genetisches Element des Wirts. Andererseits verbreitet sich das HIV-Virus quer durch den gesamten Körper hindurch in den T-Lymphozyten, den Monozyten, den Makrophagen wie auch im Zentralnervensystem. Schließlich weist das HIV-Virus eine extrem bedeutende Antigen-Variabilität auf. Die verschiedenen kurativen Therapien, die gegenwärtig im Bereich der Klinik eingesetzt werden, bestehen im Wesentlichen entweder darin, die Aktivität der reversen Transkriptase zu blockieren oder die Aktivität von viralen Enzymen, welche für die Infektion oder die Replikation unerlässlich sind (Proteasen, Integrasen), zu hemmen. Die Wirksamkeit dieser Therapien bleibt beschränkt in dem Maße, wo die Einnahme dieser Antivirusmittel Nebenwirkungen zur Folge hat. Aufgrund der hohen Mutationsrate des HIV-Virus wird dieses außerdem schnell gegen die Arzneimittel, wie AZT und die anderen Nukleotidanaloga, während der Therapie resistent. Das Auftreten von resistenten Stämmen macht die Erhöhung der den Patienten verabreichten therapeutischen Dosen erforderlich. Der Misserfolg der gegenwärtigen kurativen Therapien erfordert folglich die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien, um die retrovirale Infektion zu bekämpfen.
  • Im Rahmen ihrer Forschungen zur Entwicklung von neuen kurativen Strategien wurden die Erfinder dazu veranlasst, die durch das HIV infizierten seropositiven und Non-Progressors, d.h. welche kein AIDS entwickeln, darstellenden Populationen zu untersuchen. Sie konnten so erstmals nachweisen, dass bei diesen durch HIV infizierten seropositiven und als Non-Progressors eingestuften Patienten eine besondere Variante von IgG3 existiert. Die Erfinder haben nachgewiesen, dass diese IgG3-Variante sich durch ihre Primärstruktur mit einem geringeren Molekulargewicht, ihre längere Halbwertszeit wie auch durch ihre höhere Serumkonzentration als bei den klassischen IgG3 unterscheidet. Das durch die Erfinder nachgewiesene, isolierte und gereinigte IgG3-Immunglobulin erweist sich als ein Schutzmarker für AIDS wie auch als ein Mittel, welches das kausale Agens dieser Krankheit neutralisiert.
  • Die humanen IgG-Immunglobuline verteilen sich auf vier Unterklassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), die sich durch geringfügige Unterschiede in der Primärstruktur von deren schwerer Kette unterscheiden. Die hauptsächlichen Unterschiede betreffen die Gelenkregion und die Anzahl von Disulfidbrücken zwischen den Ketten. So ist die Gelenkregion des IgG3 sehr lang, was sein höheres Molekulargewicht (170 kDa) und bestimmte biologische Eigenschaften, wie die Halbwertszeit (in Tagen), die für die IgG3-Immunglobuline viel kürzer (7 Tage) als für die anderen IgG-Unterklassen, die eine Halbwertszeit in der Größenordnung von 20 Tagen haben, ist, erklärt. Die IgG3 sind in der Lage, sich selektiv an bestimmte Rezeptoren an dem Fc-Fragment der Immunglobuline, wie RFcγI, RFcγIIa, RFcγIIIa, zu binden. Die Immunglobuline, deren Hauptfunktion darin besteht, das Antigen zu binden, um dieses zu neutralisieren, haben gleichfalls als Funktion, sekundäre Effektorfunktionen insbesondere durch den Weg des Komplements zu aktivieren. Das Komplementsystem, welches eine komplexe Gruppe von Serumproteinen ist, welche an den Entzündungsreaktionen beteiligt sind, ist einer der wichtigsten Effektormechanismen für die humanen IgG1, IgG3 und IgGM. Nachdem sie das Antigen gebunden haben, können die IgG1, die IgG3 und die IgGM tatsächlich die Enzymkaskade des klassischen Komplement-Wegs, bezeichnet als C1q, aktivieren, wohingegen die IgG2 ihrerseits wenig wirksam sind und die IgG4 dazu nicht in der Lage sind. Die Bindung von C1q an das Immunglobulin ist der erste Schritt in der Komplement-Kaskade, die zur Zelllyse führt. Dieser Mechanismus ist besonders wichtig, um die Infektionskrankheiten und viralen Krankheiten, wie beispielsweise AIDS, zu bekämpfen, und spielt eine entscheidende Rolle bei der Zerstörung der infizierten Zellen.
  • Die Arbeiten, die durch die Erfinder ausgeführt wurden, erlauben folglich, auf einen dringenden Bedarf zu reagieren, nämlich die Notwendigkeit, neue präventive und/oder kurative Arzneimittel oder Zusammensetzungen zu entwickeln, die dazu bestimmt sind, das AIDS-Virus zu neutralisieren, wie auch neue diagnostische Tests zu entwickeln, welche erlauben, die Therapie abhängig von dem Serotyp des Patienten anzupassen.
  • Das amerikanische Patent US 6,113,902 , erteilt am 05. September 2000 (CHERMANN et al.) beschreibt die Verwendung des Epitops R7V, um Antikörper im Serum von Patienten nachzuweisen und um das Vorhandensein von schützenden Antikörpern im Serum der seropositiven Patienten, die kein AIDS entwickelt haben, zu zeigen.
  • Das Dokument GALEA et al. (Cellular Pharmacology, Band 3, Nr. 5, 1996, S. 311–316) offenbart die Existenz von Antikörpern, welche gegen das Epitop R7V gerichtet sind und die Tatsache, dass deren Anwesenheit mit einer bestimmte Stämme von HIV in vitro neutralisierenden Aktivität und einer symptomlosen Form der Krankheit assoziiert ist.
  • Das IgG3 gemäß der Erfindung unterscheidet sich von diesen Antiseren durch die Tatsache, dass es sich um die gereinigte und aktive Verbindung der durch das Antiserum gebildeten Mischung handelt.
  • Das Dokument SCHARF et al. (J. Vir., Juli 2001, Band 75, Nr. 14, S. 6558–6565) offenbart die Existenz von Immunglobulinen vom Typ IgG3, welche gegen das HIV-Virus gerichtet sind, und die etwaige Verwendung von deren neutralisierender Aktivität für eine passive Immunisierung.
  • Das erfindungsgemäße IgG3 weist Eigenschaften auf, die sich von einem Standard-IgG3 unterscheiden, nämlich eine längere Lebensdauer, eine schwere Kette mit niedrigerem Molekulargewicht und eine höhere Serumkonzentration.
  • Die Erfindung hat ein gereinigtes und/oder isoliertes humanes Immunglobulin der Klasse IgG3 zum Gegenstand, welches die folgenden Merkmale aufweist: (i) eine Lebensdauer im Serum des Patienten, die höher ist als die Lebensdauer der normalerweise im menschlichen Serum vorhandenen IgG3, und insbesondere von wenigstens 15 Tagen, vorzugsweise wenigstens einem Monat; (ii) eine schwere Kette, deren Molekulargewicht, bestimmt anhand von elektrophoretischer Mobilität, geringer ist als das Molekulargewicht der normalerweise im menschlichen Serum vorhandenen IgG3 (60 kDa), wobei die schwere Kette ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa aufweist und die Komplementbindungsstelle umfasst. Diese Verringerung des apparenten Molekulargewichts, bestimmt durch Elektrophorese, reflektiert entweder eine Ver ringerung der Länge der Primärstruktur des IgG3 oder eine unterschiedliche dreidimensionale Konformation oder eine Verringerung der posttranslationalen Modifizierungen, wie beispielsweise der Glycosylierung, der schweren Kette.
  • Die IgG3-Immunglobulin-Variante gemäß der Erfindung im Serum ist schließlich durch eine Serumkonzentration gekennzeichnet, welche höher ist als die IgG3-Konzentration eines normalen Serums um das wenigstens einfache, wenigstens zweifache, im Allgemeinen wenigstens dreifache, was eine Serumkonzentration dieser neuen IgG3-Variante von ungefähr 1 g/l darstellt.
  • Gemäß einer Ausführungsweise der Erfindung wird die IgG3-Immunglobulin-Variante isoliert und/oder gereinigt ausgehend von hinsichtlich HIV seropositiven Patienten, wobei diese Patienten Non-Progressors sind, d.h. Personen, die seit mehreren Jahren durch HIV infiziert sind ohne Verlust von Immunabwehren, folglich symptomlos sind. Mehr bevorzugt bindet das erfindungsgemäße IgG3-Immunglobulin selektiv das Epitop R7V des gp160-Proteins des HIV-1-Virus, wobei das Epitop die Sequenz Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val umfasst.
  • In der Beschreibung werden die Begriffe Immunglobuline und Antikörper unterschiedslos eingesetzt. Mit Epitop soll eine jegliche Determinante des Proteins, welche für die spezifische Wechselwirkung mit dem Antikörper verantwortlich ist, bezeichnet werden; Epitope bestehen gewöhnlich aus Gruppen von Molekülen, welche chemisch aktive Oberflächen aufweisen, wie Aminosäuren oder Seitenketten von Zuckern, und eine spezifische dreidimensionale Struktur und/oder eine spezifische charakteristische Ladung aufweisen.
  • Die Verfahren zur Isolierung und/oder zur Reinigung der Immunglobuline, die Verfahren zur Bestimmung der Länge der schweren Kette der Immunglobuline wie auch die Verfahren zur Bestimmung der Lebensdauer der IgG3 im Serum sind dem Fachmann, der auf dem Gebiet der Immunologie arbeitet, bekannt. Zur Veranschaulichung sind verschiedene Verfahren und Protokolle, die eingesetzt werden können, in „Current Protocols in Immunology", welche jährlich aktualisiert werden (4 Bände), herausgegeben von den „National Institutes of Health" durch John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober – Wiley Interscience, beschrieben.
  • Zur Veranschaulichung erfolgt die Reinigung der IgG3 der Erfindung unter Verwendung der Immunaffinitätssäulen HitrapTM Protein G HP (Ref. 17-0404-01) und HitrapTM Protein A HP (Ref. 17-0402-01) von Amersham-Pharmacia. Nach dem Hindurchleiten des Serums/Plasmas durch die HitrapTM Protein A HP-Säule, die nur die IgG1, IgG2 und IgG4 bindet, wird das an IgG1, IgG2 und IgG4 erschöpfte Serum/Plasma durch die HitrapTM Protein G HP-Säule geleitet, um die IgG3 zu reinigen.
  • Die Bestimmung des Molekulargewichts der schweren und leichten Ketten der IgG erfolgt beispielsweise durch Elektrophorese auf einem 12%-igen Polyacrylamidgel (Ready Gel Tris-HCl glycine, BIORAD, Ref. 161-0901). Kurz zusammengefasst, werden die durch Immunaffinitätssäulen gereinigten IgG3 durch dreiminütiges Erwärmen bei 95°C in Gegenwart von reduzierendem Puffer (Laemmli Sample Buffer, BIORAD, Ref. 161-0737 + β-Mercaptoethanol) reduziert, dann auf das Gel aufgetragen. Die Wanderung erfolgt in 40 min bei 200 V, 35 mA. Die Gele werden durch eine kommerzielle Lösung (Bio-Safe Coomassie BIORAD, Ref. 161-0786) angefärbt.
  • Schließlich erfolgt die Bestimmung der Lebensdauer der IgG3-Varianten durch einen ELISA-Test, der jeden Monat oder jedes Trimester am Serum oder Plasma von Non-Progressor-Patienten ausgeführt wird, welcher erlaubt, das Vorhandensein von IgG3 zu bestätigen.
  • Unter Isolierung der erfindungsgemäßen IgG3-Immunglobulin-Variante versteht man gleichfalls die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers vom IgG3-Variante-Typ. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten kann man sich auf die Techniken, die insbesondere in dem Handbuch „Antibodies" (Harlow et al., 1988) beschrieben worden sind, oder auf die Herstellungstechnik ausgehend von Hybridomen, die von Kohler und Milstein 1975 beschrieben worden ist, beziehen. Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können beispielsweise ausgehend von Zellen eines Tiers, welches mit dem Protein gp160 oder einem seiner Fragmente, und welches das Epitop R7V umfasst, immunisiert worden ist, erhalten werden. Die Reinigung des erfindungsgemäßen Antikörpers kann beispielsweise an einer Affinitätssäule, auf welcher man vorab das Ziel-Antigen oder -Epitop, beispielsweise das Epitop R7V des gp160-Proteins von HIV, immobilisiert hat, ausgeführt werden.
  • Das erfinderische Konzept, welches der Erfindung zugrunde liegt, reduziert sich nicht auf die aus einem Patienten, bei welchem AIDS ausgebrochen ist, gereinigten und/oder isolierten IgG3-Immunglobuline allein. Tatsächlich wird die Art von IgG3-Immunglobulin-Varianten, die durch die Erfinder nachgewiesen wurden, gleichfalls im Serum von Patienten exprimiert, bei denen andere Pathologien, an welchen eine Virusinfektion beteiligt ist, ausgebrochen sind. Unter diesen Pathologien, an welchen eine Infektion durch Viren beteiligt sind, kann man als nicht erschöpfende Beispiele die Pathologien aufführen, die mit den humanen T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV), dem Zytomegalievirus (CMV), den Herpes-Viren (HSV-1, HSV-2), dem Epstein-Barr-Virus (EBV), den Hepatitis-Viren (HBV, HCV) assoziiert sind. Die Erfindung betrifft gleichfalls die IgG3-Immunglobulin-Varianten, die ausgehend von einem Patienten, bei dem eine Infektionskrankheit mit variabler Entwicklung ausgebrochen ist, wie neurologische Erkrankungen, wie multiple Sklerose, Hautkrankheiten, wie Psoriasis, Autoimmunerkrankungen, wie disseminierter Lupus erythematodes, Krebserkrankungen retroviralen Ursprungs, wie familiär gehäuft auftretender entzündlicher Brustkrebs, isoliert und/oder gereinigt werden.
  • Der Fachmann hat zu seiner Verfügung die Werkzeuge der Molekular- und Zellbiologie, um die Klonierung, die Sequenzierung und die Expression der IgG3-Immunglobulin-Varianten auf rekombinantem Wege auszuführen (Sambrook et al., 1989; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, siehe Seite 4). Diese rekombinanten IgG3, die gleichfalls zum Umfang der Erfindung gehören, können so in vitro produziert werden und fakultativ durch Techniken der in vitro-DNA-Rekombination oder der Chemie modifiziert werden, um diesen besondere Eigenschaften zu verleihen.
  • Gemäß den gewünschten diagnostischen Anwendungen kann der erfindungsgemäße Antikörper auf einem Träger immobilisiert werden. Die Immobilisierung oder Kopplung kann auf zahlreichen Trägern, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, ausgeführt werden. Diese Immobilisierung oder Kopplung erfolgt auf einem festen Träger vorzugsweise direkt oder indirekt durch das Zwischenglied eines Spacer- oder Abstandshalterarms. Die festen Träger können insbesondere Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon oder natürliche oder modifizierte Cellulosen umfassen. Diese Träger können löslich oder unlöslich sein.
  • Für andere Anwendungen kann der erfindungsgemäße Antikörper direkt oder indirekt durch einen Marker markiert werden derart, dass ein Konjugat erhalten wird, welches erlaubt, ein detektierbares und/oder quantifizierbares Signal zu erzeugen, welches für die in vivo- oder in vitro-Diagnostik einsetzbar ist. Der entsprechende diagnostische Kit, welcher den markierten Antikörper enthält, ist gleichfalls einer der Gegenstände der Erfindung. Der Marker kann ausgewählt werden unter den Enzymen, den Färbemitteln, den Haptenen, den lumineszierenden Mitteln, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Mitteln, den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxigenin, den radioaktiven Isotopen. So ist das erfindungsgemäße Immunglobulin beispielsweise mit Enzymen, wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoseamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphatdehydrogenase, oder mit einem Molekül, wie Biotin, Digoxigenin oder 5-Bromdesoxyuridin, konjugiert. Fluoreszierende Marker können gleichfalls mit dem Immunglobulin gemäß der Erfindung konjugiert werden und umfassen beispielsweise Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin, Texas-Rot, Dansyl, Umbelliferon und die autofluoreszierenden Protei ne, wie GFP (GFP für „Green Fluorescent Protein") u.s.w. Andere Konjugate können gleichfalls chemolumineszierende Marker, wie Luminol und die Dioxetane, oder biolumineszierende Marker, wie die Luciferase und Luciferin, umfassen.
  • Unter den radioaktiven Isotopen, die an das Immunglobulin gemäß der Erfindung gebunden werden können, bevorzugt man gleichfalls die radioaktiven Marker, wie 14C, 36Cl, 57Co, 58Co, 51Cr, 152Eu, 59Fe, 3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 75Se und 99mTc, die durch bekannte Mittel und Maßnahmen, wie den Gamma- oder Szintillationszähler, durch Autoradiographie u.s.w. detektiert werden können. Die Erfindung umfasst gleichfalls die Konjugate, bei denen der detektierbare Marker ausgewählt wird unter den Markern, die bei Bildgebungs-Anwendungen in vivo eingesetzt werden können. Beispiele für solche Marker gemäß der Erfindung sind 72As, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 133I, 125I, 131I, 111In, 97Ru, 99mTc, 201Tl und 89Zn. Die Erfindung umfasst gleichfalls die paramagnetischen Isotope, die im Bereich der Kernspinresonanztomographie (MRI) eingesetzt werden und welche insbesondere 52Cn, 162Dy, 56Fe, 157Gd und 55Mn umfassen. Der Begriff „Bildgebung in vivo" muss im Rahmen der Beschreibung als eine jegliche Methode verstanden werden, welche den Nachweis eines markierten Antikörpers gemäß der Erfindung, der sich spezifisch an das Epitop des Proteins von Interesse im Körper des Patienten bindet, erlaubt. Der Patient wird vorzugsweise ein Mensch sein, bei welchem die Wahrscheinlichkeit besteht, dass er durch ein Virus infizierte Zellen aufweist, oder der von einer Infektionskrankheit mit variabler Entwicklung, bei welcher das Protein von Interesse in abnormaler Weise exprimiert wird, befallen ist.
  • Solche Konjugate können durch den Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Sie können mit den Markern direkt oder durch das Zwischenglied einer funktionellen intermediären Gruppe, einer Abstandshalter- oder Spacer-Gruppe oder einer Verbindungsgruppe, wie einen Polyaldehyd, wie Glutaraldehyd, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA) oder in Gegenwart von Kopplungsmitteln, wie Periodat, Benzochinon u.s.w., gekoppelt werden. Die Konjugate, die Marker vom Fluorescein-Typ umfassen, können durch Reaktion mit einem Isothiocyanat hergestellt werden.
  • Es ist gleichfalls einer der Gegenstände der Erfindung, ein in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder zur quantitativen Bestimmung einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, bereitzustellen, welches die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen einer Probe von Körperflüssigkeit und/oder von Körpergewebe, welche von einem Patienten stammt, bei welchem man das Vorliegen der Pathologie vermutet, mit einem Immunglobulin gemäß der Erfindung; und (ii) Detektion des Vorhandenseins eines Immunkomplexes zwischen dem Immunglobulin und einem für die Pathologie spezifischen Epitop. Mit Körperflüssigkeit oder biologischer Flüssigkeit sollen Fluide, wie Serum, Vollblut, Urin, Sperma, Zellen, eine Gewebeprobe oder Biopsien humaner Herkunft bezeichnet werden. Die Verfahren zur Detektion des Immunkomplexes sind zahlreich und dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt; sie hängen von der Art der Diagnose und der quantitativen Bestimmung, welche auszuführen sind, ab. Es kann sich um einen ELISA-Test, RIA-Test, ein Sandwich-Verfahren, eine Immunpräzipitation, einen Agglutinationstest, einen Test durch Kompetition oder einen jeglichen Test, welcher den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, welcher von der Bildung eines Antikörper-Antigen-Immunkomplexes abhängig ist, handeln. Als Beispiel setzt eine bevorzugte Methode immun-enzymatische Methoden gemäß der ELISA-Technik, Methoden durch Immunfluoreszenz oder radio-immunologische Methoden (RIA) oder eine äquivalente Methode ein. Alle diese Methoden beruhen vorzugsweise auf der Bindung der fraglichen Immunglobuline an antigene Peptide, dann auf dem Nachweis dieser Bindung.
  • Insbesondere umfasst die Erfindung gleichfalls ein in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder zur quantitativen Bestimmung des humanen Immundefektsyndroms (AIDS), welches die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen einer Probe von Körperflüssigkeit und/oder von Körpergewebe, welche von einem Patienten stammt, bei welchem man das Vorhandensein des HIV vermutet, mit einem Immunglobulin gemäß der Erfindung; (ii) Detektion des Vorhandenseins eines Immunkomplexes zwischen dem Immunglobulin und dem Protein gp160 des HIV und insbesondere dem Epitop R7V dieses Proteins, welches in der Probe enthalten ist.
  • Die Erfindung betrifft gleichfalls ein in vitro- oder in vivo-Verfahren zur Behandlung eines biologischen Fluids von einem Patienten, welcher von einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen, insbesondere HIV, und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, befallen ist, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, eine wirksame Menge Immunglobulin gemäß der Erfindung mit dem biologischen Fluid in Kontakt zu bringen derart, dass ein für die Pathologie spezifisches Epitop in dem Fluid neutralisiert wird. Das Verfahren umfasst außerdem gegebenenfalls den zusätzlichen Schritt, aus der Reaktionsmischung den so gebildeten Immunkomplex zu entfernen. Im Rahmen eines in vitro-Verfahrens zur Behandlung des biologischen Fluids kann das Verfahren außerdem den zusätzlichen Schritt umfassen, dem Patienten die Gesamtheit oder einen Teil des so behandelten biologischen Fluids wieder zu injizieren. Mit Neutralisation beispielsweise des HIV-Virus soll ein jeglicher Mechanismus bezeichnet werden, der in vivo zur Wirkung hat, die Vermehrung der Viren zu vernichten und/oder zu verhindern. Es erweist sich, dass die IgG3-Immunglobulin-Variante gemäß der Erfindung aufgrund ihres G3-Subtyps und ihrer Stabilität ein hervorragendes Mittel bildet, um eine jegliche Körperflüssigkeit oder ein jegliches Körperfluid, welches) dazu bestimmt ist, in ein Individuum erneut inokuliert oder eingeführt zu werden, wie Blut von einem HIV-seropositiven Menschen für die Bluttransfusion eines Individuums, ein Gewebe von einem HIV-seropositiven Menschen in dem Falle eines Ge webetransplantats oder das Sperma eines HIV-seropositiven Mannes für die Befruchtung einer seronegativen Frau, zu neutralisieren. Da der IgG3-Subtyp das Komplement bindet, induzieren die erfindungsgemäßen Immunglobuline tatsächlich die Lyse der infizierten Zellen.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsweise stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Neutralisation von durch das HIV infizierten Zellen in einer biologischen Probe von Körperflüssigkeit und/oder von Körpergewebe, welche von einem seropositiven Patienten stammt, bereit. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
    • (i) gleichzeitig, getrennt oder zeitlich gestaffelt das erfindungsgemäße Immunglobulin mit der biologischen Probe, welche die durch das HIV infizierten Zellen, die auf ihrer Oberfläche das Protein gp160 aufweisen, enthält, und mit dem an magnetische Teilchen angehefteten Protein G zusammenzugeben:
    • (ii) die in (i) erhaltene Mischung zu inkubieren unter Bedingungen, welche die Bindung des Immunglobulins an das Protein gp160 und bevorzugt an das Epitop R7V erlauben, um einen Komplex zu bilden, wobei der Komplex den Antikörper gebunden an eine durch das HIV infizierte Zelle, fixiert auf dem genannten magnetischen Teilchen, umfasst;
    • (iii) dieses magnetische Teilchen in Richtung einer vorher festgelegten Stelle des Behälters, welcher diese Reaktionsmischung enthält, zu verschieben, wobei die Verschiebung durch ein magnetisches Feld, welches auf das magnetische Teilchen einwirkt, bewerkstelligt wird.
  • Die Erfindung umfasst gleichfalls ein in vitro-Verfahren zur Diagnose eines „Non-Progressor"-Patienten, welcher von einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen, insbesondere AIDS, und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, befallen ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man bevorzugt durch einen immunologischen Test das Vorhandensein von Immunglobulin IgG3, welches die folgenden Merkmale aufweist: (i) eine Lebensdauer im Serum des Patienten, welche länger ist als jene der normalerweise vorhandenen IgG3 und insbesondere von wenigstens 15 Tagen, vorzugsweise von wenigstens einem Monat; (ii) eine schwere Kette, deren Molekulargewicht, bestimmt anhand von elektrophoretischer Mobilität, geringer ist als das Molekulargewicht der normalerweise im menschlichen Serum vorhandenen IgG3 (60 kDa), wobei die schwere Kette ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa aufweist und die Komplementbindungsstelle umfasst, und (iii) fakultativ eine Serumkonzentration aufweist, welche wenigstens einmal, wenigstens zweimal, wenigstens dreimal (entsprechend 1 g/l) höher ist als die IgG3-Konzentration eines normalen Serums, detektiert. Der eingesetzte Diagnosetest wird vorzugsweise ausgewählt unter einem ELISA-Test, einem RIA-Test, einem Sandwich-Verfahren, einer Immunpräzipitation, einem Agglutinationstest. Diese der Detektion der IgG3-Variante gemäß der Erfindung dienende Diagnostik weist einen beträchtlichen Vorteil auf. Tatsächlich sind die Patienten, die in diesem Falle HIV-seropositiv und Träger dieser IgG3- Variante sind, Non-Progressors. In diesem Falle ist die Diagnose sehr günstig und es ist möglich, anstrengende therapeutische Behandlungen zu vermeiden. Dies trifft insbesondere in dem Falle einer Schwangerschaft zu, wo das Vorhandensein dieser Antikörper bei der Mutter (HIV+) zu einer Nicht-Infektion des Neugeborenen zu führen scheint. Die Erfindung zielt folglich darauf ab, die IgG3-Immunglobulin-Variante gemäß der Erfindung als Schutzmarker bei den Pathologien, welche unter den Viruserkrankungen, insbesondere AIDS, und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung ausgewählt werden, einzusetzen.
  • Allgemeiner zielt die Erfindung darauf ab, die Verwendung eines Immunglobulins gemäß der Erfindung für die Ausführung eines immunologischen Tests, welcher unter dem ELISA-Test, dem RIA-Test, dem Sandwich-Verfahren, der Immunpräzipitation, dem Agglutinationstest ausgewählt wird, mit abzudecken.
  • Die Erfindung zielt gleichfalls darauf ab, das Einsetzen des erfindungsgemäßen Immunglobulins als Arzneimittel und genauer als therapeutischer Antikörper oder als Targeting-Mittel mit zu umfassen. Mit therapeutischer Antikörper sollen IgG3-Immunglobuline oder ein Serum, Plasma, welches dieses enthält, bezeichnet werden, die auf venösem Wege Progressor-Patienten und im Allgemeinen bei Misserfolg einer klassischen Therapie injiziert werden.
  • Die IgG3-Immunglobulin-Variante ist bei der Herstellung eines Arzneimittels, welches für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung einer Viruserkrankung, insbesondere AIDS, aber gleichfalls von Erkrankungen, bei denen das kausale Agens ein Virus, wie zuvor aufgelistet, ist, bestimmt ist, nützlich. Wenn die Krankheit AIDS ist, ist die IgG3-Immunglobulin-Variante, welche für die Herstellung eines Arzneimittels, welches dazu bestimmt ist, bei einem Menschen, bei welchem AIDS ausgebrochen ist, das Protein gp160 von HIV zu neutralisieren, eingesetzt wird, vorzugsweise gegen das Epitop R7V des Proteins gp160 des HIV gerichtet. Die IgG3-Immunglobulin-Variante ist gleichfalls bei der Herstellung eines Arzneimittels, welches für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung einer Infektionskrankheit mit variabler Entwicklung bestimmt ist, nützlich.
  • Das erfindungsgemäße IgG3-Immunglobulin kann als Arzneimittel in Form einer Mischung mit wenigstens einem anti-retroviralen Mittel, welches ausgewählt wird in der Gruppe, bestehend aus den Inhibitoren der reversen Transkriptase und/oder der viralen Antiproteasen, als Kombinationsprodukt für eine gleichzeitige, getrennte oder zeitlich gestaffelte Verwendung im Rahmen einer antiviralen Therapie eingesetzt werden. Der Inhibitor der reversen Transkriptase wird vorzugsweise ausgewählt unter 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT), 2',3'-Didesoxyinosin (ddI), 2',3'-Didesoxycytidin (ddC), (–)-2',3'-Didesoxy-3'-theacytidin (3TC), 2',3'-Didehydro-2',3'- didesoxythymidin (d4T) und (–)-2'-Desoxy-5-fluor-3'-theacytidin (FTC), TIBO, HEPT, TSAO, α-APA, Nevirapin, BAHP, Phosphonoameisensäure (PFA); die virale Antiprotease wird unter Indinavir und Saquinavir ausgewählt.
  • Im Rahmen eines Einsatzes des Antikörpers als Targeting-Mittel wird jener gegebenenfalls durch die Techniken der Chemie und/oder der in vitro-DNA-Rekombination modifiziert, um seine Stabilität, seine Affinität, seine biologische Verfügbarkeit oder seine Verträglichkeit. ... zu modifizieren. Als Targeting-Mittel wird das erfindungsgemäße Immunglobulin direkt oder indirekt mit wenigstens einem Mittel, ausgewählt in der Gruppe der antiproliferativen, antineoplastischen oder zytotoxischen Mittel, konjugiert. Unter den Mitteln, die mit den erfindungsgemäßen Antikörpern konjugiert werden können, sind außer den radioaktiven Isotopen und den zuvor beschriebenen Markern insbesondere die alkylierenden Verbindungen, wie Mechlorethamin, Triethylenphosphoramid, Triaziquon, Camustin, Semustin, Methotrexat, Mercaptopurin, Cytarabin, Fluoruracil, die Antibiotika, wie Actinomycin, die Hormone oder die Antagonisten von Hormonen, wie die Corticosteroide, wie Prednison oder die Progestine, die bakteriellen oder viralen Toxine mit enthalten. Bei einer besonderen Ausführungsweise ist das antiproliferative und/oder antineoplastische und/oder zytotoxische, keine Isotopen aufweisende Mittel ein Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, einzelsträngige RNA, insbesondere eine Antisinn-RNA, doppelsträngige RNA, ein RNA/DNA-Hybrid. Diese Nukleinsäure kodiert fakultativ ein Proteinprodukt von Interesse.
  • Es liegt gleichfalls im Rahmen der Erfindung, einen Impfstoff oder eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder die Verhütung einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, umfassend einen Immunglobulin-Antikörper gemäß der Erfindung in Kombination mit einem Transportmittel, einem Träger oder einem Verdünnungsmittel, welche pharmazeutisch annehmbar sind, bereitzustellen. Die pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen insbesondere Wasser, die Kochsalzlösungen, die Puffer oder eine jegliche andere Verbindung, die beispielsweise im Merck-Index beschrieben ist.
  • Die Zusammensetzungen oder der Impfstoff gemäß der Erfindung können gleichfalls Komponenten umfassen, welche die Immunogenität erhöhen, insbesondere spezifische oder nichtspezifische Immunitätsadjuvantien, wie das Freund'-Adjuvans, Polysaccharide oder äquivalente Verbindungen. Es handelt sich hier um Verbindungen, die dem Fachmann auf dem Gebiet des Impfens bekannt sind. Die Zusammensetzungen können in irgendeiner Form vorliegen, welche mit dem gewählten Verabreichungsweg verträglich ist. Die Verabreichung dieser Verbindungen an den Patienten kann lokal oder systemisch erfolgen und auf intravenösem, intraarteriellem, intramuskulärem, intraperitonealem Wege, über die Rückenmarksflüssigkeit, auf intradermalem Wege, auf oralem, nasalem, analem Wege bewerkstelligt werden. Gleichwohl können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen über andere Wege, insbesondere über den Aerosol-Weg, eingesetzt werden, um einen Schutz der Schleimhäute zu induzieren.
  • Die Menge an IgG3-Immunglobulin-Variante, die in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten und für eine wirksame Therapie erforderlich ist, wird von verschiedenen Faktoren, wie der Verabreichungsweise, dem Zielkörperteil, dem physiologischen Zustand und dem Alter des Patienten, etwaigen Nebenwirkungen, Kontraindikationen, wenn es solche gibt, Begleittherapien oder anderen Variablen abhängen, welche ein Fachmann auf diesem Gebiet anzupassen wissen wird. Die Dosierung wird für solche Präventionen oder therapeutischen Behandlungen derart ausgeführt werden müssen, dass deren Sicherheit und deren Wirksamkeit optimiert werden. Im Allgemeinen können die in vitro eingesetzten Dosierungen einen Hinweis auf die Mengen, welche für die Verabreichung von Antikörpern in situ eingesetzt werden, liefern und es können beispielsweise Tiermodelle eingesetzt werden, um die wirksamen Mengen von erfindungsgemäßen Immunglobulinen für die Behandlung einer bestimmten Pathologie, insbesondere AIDS, zu bestimmen.
  • Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bilden gleichfalls ein Mittel zur immunzytochemischen oder immunhistochemischen Analyse der Expression des Proteins von Interesse auf Elektrophoresegelen oder Transfermembranen oder Schnitten von speziellen Geweben, beispielsweise durch Immunfluoreszenz, durch enzymatische, radioaktive oder mittels Gold erfolgende Markierung. Sie erlauben insbesondere, das spezifische normale oder abnormale Vorhandensein des Proteins von Interesse in den Geweben oder biologischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren, was diese nützlich macht für die Identifizierung und die Lokalisierung der Expression des Proteins von Interesse, für die Diagnose von Pathologien, die mit dem abnormalen Vorhandensein des Proteins von Interesse, wie beispielsweise gp160, verbunden sind, aber gleichfalls für das Verfolgen der Entwicklung von Methoden zur Verhütung oder zur Behandlung einer Pathologie, bei welcher die Detektion oder die quantitative Bestimmung erforderlich sind. Allgemeiner können die erfindungsgemäßen Antikörper vorteilhafterweise in einer jeglichen Situation, wo die Expression eines Proteins von Interesse, beispielsweise des Proteins gp160, welches das R7V-Epitop enthält, auf qualitative und/oder quantitative Weise beobachtet werden muss, eingesetzt werden.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der Folge der Beschreibung mit den Beispielen und den Figuren, deren Legenden nachfolgend aufgeführt sind, ersichtlich.
  • FIGUREN
  • 1.
    • 1a: Vergleich eines IgG3 eines normalen Serums (SN1) mit jenem eines HIV-positiven Non-Progressor-Patienten (ARG).
    • 1b: Bestätigung des niedrigeren Molekulargewichts der schweren Kette gegenüber einem anderen Patienten (ETC).
    • 1c: Andere Patienten (THO, GEM).
    • 1d: Anderer Patient (VAL) und andere seronegative Person (SN2).
    • 1e: Anderer Patient (BOL).
  • 2. Protokoll der Immunpräzipitation des HIV-Retrovirus durch die IgG3-Variante als Beispiel.
  • 3. Immunpräzipitation des Virus durch die IgG3 von drei verschiedenen Patienten.
  • 4. Immunpräzipitation von variablen Virusmengen mit einer festgelegten Menge von IgG3-Antikörper.
  • 5. Immunpräzipitation von verschiedenen und voneinander entfernten Stämmen durch eine festgelegte Menge von IgG3.
  • 6. Schema, welches das Protokoll zur Neutralisation der Viren zusammenfasst.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1: Nachweis von IgG3-Varianten bei bestimmten, durch das HIV infizierten Patienten, welche als Non-Progressors eingestuft werden.
  • Die Immunglobulin-Antikörper unterteilen sich in vier Unterklassen und im Allgemeinen gehören die Antikörper, die nach einer Immunisierung induziert werden, zu den IgG1, die eine sehr lange Halbwertszeit haben.
  • Die Erfinder beschreiben hier das Vorhandensein von schützenden Antikörpern, die mit den IgG3 assoziiert sind, bei durch das HIV infizierten Patienten, wohingegen die Antikörper, die die Infektion kennzeichnen, noch stets IgG1 sind. Bei bestimmten durch das HIV infizierten Individuen, die als Non-Progressors eingestuft werden, existiert eine Variante von IgG3.
  • 1.1. Die IgG3-Variante hat eine Lebensdauer von mehreren Monaten
  • Diese Variante unterscheidet sich von den klassischen IgG3 durch ihre Halbwertszeit; sie beträgt sieben Tage für die klassischen IgG3 und mehrere Monate für die Variante, wie dies die Untersuchung mittels reihenweiser Weiterbeobachtung von Patienten zeigt, wobei die Seren in einem Zeitraum von mehreren Monaten entnommen wurden (Tabelle 1).
  • In der Tabelle 1 sieht man die Ergebnisse eines ELISA-Tests für die Untersuchung der schützenden Antikörper, die gegen ein mit dem HIV assoziiertes Epitop, welches als R7V bezeichnet wird, gerichtet sind. Diese Antikörper werden durch sekundäre Antikörper, die die verschiedenen Unterklassen der humanen Immunglobuline unterscheiden, sichtbar gemacht.
  • Die schützenden anti-R7V-Antikörper sind stets IgG3 oder/und IgG4, aber niemals IgG1 oder IgG2 und deren hoher Titer bleibt über mehrere Monate bestehen.
  • Tabelle 1 : Untersuchung der Unterklassen von anti-R7V-IgG von Serumreihen
    Figure 00150001
  • 1.2. Die IgG3-Variante hat eine schwere Kette von ungefähr 50 kDa.
  • Die elektrophoretischen Analysen der 1 zeigen, dass die IgG3-Variante bei den durch das HIV infizierten Non-Progressor-Patienten eine schwere Kette mit einer größeren elektrophoretischen Mobilität aufweist, was bezeichnet, dass ihr Molekulargewicht niedriger ist als jenes eines klassischen IgG3, welches bei einem normalen HIV-negativen Individuum gereinigt wird.
  • Die 1a bis 1e zeigen die Wanderung der entweder ausgehend von normalen HIV-negativen Individuen oder ausgehend von HIV-positiven Patienten gereinigten IgG3 auf einem 12%-igen Polyacrylamidgel. Die schweren Ketten haben ein Molekulargewicht im Bereich von 50 kDa, wohingegen die leichten Ketten ein Molekulargewicht von 25 kDa haben. (Molekular gewichtsmarker: M1: 250; 150; 100; 75; 50; 37; 25; 15; 10 kDa/M2: 200; 116; 97; 66; 45; 31; 21,5; 14,4; 6,5 kDa).
  • Die IgG3-Variante wird entweder durch Antikörper, die gegen den Fab-Anteil der IgG3 gerichtet ist, oder durch Antikörper, die gegen den Gelenk-Abschnitt gerichtet sind, erkannt. Die Variation müsste sich folglich auf das Fc-Fragment erstrecken, wahrscheinlich auf der Ebene der Glycosylierung.
  • 1.3. Die Variante des IgG3 findet sich bei der Hauptzahl der HIV-seropositiven Non-Progressors (Tabelle 2).
  • Tabelle 2 : Bestimmung der Unterklasse der anti-R7V-IgG durch ELISA
    Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • So erweist sich beim Lesen dieser Tabelle, dass keines der getesteten Seren anti-R7V-Antikörper vom IgG1- oder IgG2-Typ aufweist. Von 28 unterschiedlichen und R7V-positiven Patienten sind 13 Patienten IgG3-positiv (46,4%), sind 3 Patienten IgG3-positiv und IgG4-positiv (10,7%) und sind 12 Patienten IgG4-positiv (42,8%). Bei ein und demselben Patienten findet man stets die gleiche anti-R7V-IgG-Unterklasse unabhängig vom Datum der Probennahme, wenn die Reaktion positiv ist (BER YV, COU DI, ETC MA, MART DO, SAU CH).
  • Die Unterklasse von Antikörpern, die gegen das Hüllglycoprotein des Virus (gp 160) gerichtet sind, wurde durch einen ELISA-Test bestimmt (Tabelle 3).
  • Tabelle 3 : Bestimmung der Unterklasse von anti-pp160-IgG (Kit Sanofi Diagnostics Pasteur
    Figure 00190001
  • Beim Lesen dieser Tabelle erweist sich, dass keines der getesteten Seren anti-gp160-Antikörper vom Typ IgG2 aufweist. Bei 27 unterschiedlichen Patienten sind 27 Patienten IgG1-positiv (100%), sind 6 Patienten nur IgG1-positiv (22,2%), sind 10 Patienten IgG1-positiv und IgG3-positiv (40,7%), sind 2 Patienten IgG1-positiv und IgG4-positiv (7,4%) und sind 9 Patienten IgG1-positiv, IgG3-positiv und IgG4-positiv (29,6%).
  • Dieses Experiment bestätigt die Streuung oder Dispersion der Antwort an gegen das Hüllglycoprotein gp160 des Virions gerichteten Antikörpern und die Beständigkeit der IgG3 oder IgG4 bei den geschützten Personen.
  • BEISPIEL 2: Immunpräzipitation des HIV durch die gesamten IgG3, welche ausgehend von HIV-seropositiven und Non-Progressor-Patienten gereinigt worden sind.
  • 2.1. Experimentelles Protokoll
  • Zu einer gegebenen IgG3-Menge setzt man eine gewünschte Menge von reinem HIV-Virus zu und man lässt die Mischung 1 h bei +4°C inkubieren.
  • Man setzt dann zu:
    • – entweder 50–100 μl Protein G, welches an magnetische Kügelchen gebunden ist, und man inkubiert 1 h bei +4°C (das Protein G bindet die IgG1-, IgG2-, IgG3- und IgG4-Antikörper)
    • – oder 50–100 μl Protein A, welches an magnetische Kügelchen gebunden ist, und man inkubiert 1 h bei +4°C (das Protein A bindet die IgG1-, IgG2- und IgG4-Antikörper, nicht aber die IgG3).
  • Die Kügelchen binden sich an die Wand des Röhrchens in größter Nähe zum Magnetfeld, welches man anlegt, und der Kügelchen mit Protein G-IgG3-Virus-Komplex kann dann isoliert werden. Das Virus, welches an die Antikörper gebunden ist, wird dann durch die Messung des viralen Proteins P24, welches nach Lyse des Virus aus dem immunpräzipitierten Virus freigesetzt wird (Kit COULTER (6604535), und/oder durch die RT-PCR-Technik, um die virale RNA nachzuweisen, (siehe Figur Nr. 2) nachgewiesen.
  • 2.2. Ergebnisse
  • Eine Art von Experiment ist in der Tabelle 4 gezeigt, wo 65% der Viren durch 20 μg IgG3 von einem HIV-positiven Non-Progressor-Patienten präzipitiert worden sind, wohingegen die IgG3 eines seronegativen Individuums ohne Wirkung sind.
  • Tabelle 4: Immunpräzipitation (NDK/PBL-Virus vom 29/02/96)
    Figure 00210001
  • Die 3 zeigt die Immunpräzipitation des Virus durch die IgG3 von drei unterschiedlichen Patienten. Diese Immunpräzipitation des Virus für eine festgelegte Menge Virus ist dosisabhängig. Die 4 zeigt, dass man mit einer festgelegten Menge von IgG3 verschiedene Virus-Verdünnungen einfangen kann. Die 5 zeigt uns, dass unabhängig von dem HIV-Typ dieses durch die IgG3, hier von drei Patienten, immunpräzipitiert wird. Die eingesetzten Virusstämme sind primäre Isolate, welche als Phänotyp die Kladen von A bis F aufweisen, oder ein YBF 30-Stamm, der weder O noch M ist.
  • Diese Experimente bestätigen, dass man ein Virus durch Immunpräzipitation ausgehend von IgG3, die mittels des Proteins G gereinigt worden sind, isolieren kann.
  • BEISPIEL 3: Neutralisierung des HIV durch die Gesamt-IgG3, die ausgehend von HIV-seropositiven und Non-Progressor-Patienten gereinigt worden sind
  • 3.1. Experimentelles Protokoll
  • 50 μl Lösung von IgG3 + 50 μl verdünntes Virus (in RPMI-Medium 10%) lässt man 1 h bei 37°C in einer Platte mit 96 Vertiefungen inkubieren. Dann werden 0,3 106 Zellen pro Vertiefung zu der Mischung hinzugesetzt und 1 h bei 37°C aufgestellt. Nach zwei Wäschen durch RPMI 0%-Medium werden die Zellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen in RMPI 10%-Medium in Gegenwart von IgG3 gebracht (6).
  • 3.2. Ergebnisse (siehe Tabelle 5).
  • Tabelle 5: Neutralisierung von NDK/PBL (29/02/96) durch die IgG3 oder IgG1.2.4 von ARG CH, ETC MA, AUR PH und THO MI.
    Figure 00220001
  • Die aus zwei Patienten isolierten IgG3 neutralisieren das HIV, wie in der Tabelle 5 gezeigt wird. Bei 40 μg und 20 μg IgG3 stellt man eine Neutralisierung des Virus fest, d.h. ein Fehlen von Syncytien, wohingegen die IgG1,2,4 auf die Dosis von 40 μg/ml beschränkt sind.
  • BEISPIEL 4: Virolyse von HIV durch das Komplement und die Gesamt-IgG3, welche ausgehend von HIV-seropositiven und Non-Progressor-Patienten gereinigt worden sind.
  • 4.1. Experimentelles Protokoll
  • 10 oder 20 μg IgG3 + 12,5 μl reines Virus lässt man 1 h bei 4°C unter drehender Bewegung inkubieren. Dann wird 1 ml Kaninchen-Komplement in einer Verdünnung von 1/12 (Verdünnung des Komplements in RPMI 10%-Medium, erwärmt auf 37°C) zu der Mischung hinzugesetzt und man lässt 30 min bei 37°C inkubieren. Die Proben werden verdünnt und das P24 quantitativ bestimmt (Kit COULTER 6604535).
  • 4.2. Ergebnisse: (Tabelle 6)
  • Tabelle 6: Untersuchung einer Lyse durch das Komplement (Virus NDK/PBL vom 29/02/96)
    Figure 00230001
  • Das Komplement bindet sich an den IgG3-Virus-Komplex und lysiert das Virus, wie dies in der Tabelle 6 gezeigt wird, wo 60% des Virus in Gegenwart von 10 μg IgG3 lysiert wird.
  • Die Neutralisation der Viren und die Virolyse in Gegenwart von Komplement hat zur Folge, dass die IgG3 ein bedeutendes Potential für deren Einsatz als therapeutische Antikörper bei der HIV-Infektion oder bei einer jeglichen anderen Virusinfektion, wo die IgG3 vorhanden sind, entweder in klassischer Weise oder in Form der Variante, aufweisen.
  • Diese Untersuchung legt nahe, dass das Komplement in Kombination mit den anti-R7V-Antikörpern im Blut der durch HIV infizierten Personen das Virus lysieren und seine Infektiosität zerstören können.
  • Das Vorhandensein von infektiösen Viren im Plasma ist 10- bis 100-mal höher bei den Progressors als bei den Non-Progressors. Da die Progressor-Patienten keine anti-R7V-Antikörper und folglich kein anti-R7V-IgG3 haben, gibt es tatsächlich weder Neutralisation noch Virolyse und folglich das Vorhandensein von Viren.
  • Als Schlussfolgerung haben die Erfinder gezeigt, dass die Antikörper von IgG3-Natur mit therapeutischer Absicht, die das Komplement binden und eine Virolyse sicherstellen, sehr wirksam sind, indem sie nicht nur das Virus präzipitieren und neutralisieren, sondern auch indem sie es zerstören.
  • BIBLIOGRAPHISCHE REFERENZEN
    • Coligan et al., Current Protocols in Immunology [jährlich aktualisiert] (4 Bände), herausgegeben durch die „National Institutes of Health" durch – Wiley Interscience.
    • Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, S. 726.
    • Köhler und Milstein (1975) Nature, 256: 495–497.
    • Sambrook, J., Frischt, E.F., und Maniatis, T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Claims (24)

  1. Gereinigtes und/oder isoliertes humanes Immunglobulin der Klasse IgG3, welches die folgenden Merkmale aufweist: – eine Lebensdauer im Serum des Patienten von wenigstens einem Monat; – eine schwere Kette, deren Molekulargewicht, bestimmt anhand von elektrophoretischer Mobilität, geringer ist als das Molekulargewicht der normalerweise im menschlichen Serum vorhandenen IgG3, welches 60 kDa beträgt, wobei die schwere Kette ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa aufweist und die Komplementbindungsstelle umfasst.
  2. Immunglobulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Immunglobulins im Serum wenigstens dreimal höher ist als die Konzentration von IgG3 eines normalen Serums, was ungefähr 1 g/l entspricht.
  3. Immunglobulin nach den Ansprüchen 1 bis 2, welches ausgehend von einem von einer Pathologie, ausgewählt unter den Infektionen durch Viren, den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, wie den neurologischen Erkrankungen, den Hauterkrankungen, den Autoimmunerkrankungen, den Krebserkrankungen retroviralen Ursprungs, befallenen Patienten isoliert und/oder gereinigt worden ist.
  4. Immunglobulin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ausgewählt wird unter dem "human immunodeficiency virus" (HIV), den humanen T-Zell-Leukämieviren (HTLV), dem Zytomegalievirus (CMV), den Herpes-Viren (HSV-1, HSV-2), dem Epstein-Barr-Virus (EBV), den Hepatitis-Viren (HBV, HCV).
  5. Immunglobulin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus das HIV ist und das Individuum ein seropositiver "Non-Progressor"-Patient ist.
  6. Immunglobulin nach Anspruch 5, welches selektiv das Epitop R7V des Proteins gp160 des HIV-1-Virus bindet, wobei das Epitop die Sequenz Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val umfasst.
  7. Immunglobulin nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunglobulin direkt oder indirekt durch einen Marker, ausgewählt unter den radioaktiven Isotopen, den Enzymen, den Färbemitteln, den Haptenen, den lumineszierenden Mitteln, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Mitteln, den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxigenin, markiert ist.
  8. Immunglobulin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es direkt oder indirekt über einen Spacer-Arm mit einem festen Träger verknüpft ist.
  9. In vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder zur quantitativen Bestimmung einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, welches die Schritte umfasst: – (i) Inkontaktbringen einer Probe von Körperflüssigkeit und/oder von Körpergewebe, welche von einem Patienten stammt, bei welchem man das Vorliegen der Pathologie vermutet, mit einem Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 8; und – (ii) Detektion des Vorhandenseins eines Immunkomplexes zwischen dem Immunglobulin und einem für die Pathologie spezifischen Epitop.
  10. In vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder zur quantitativen Bestimmung des humanen Immundefektsyndroms (AIDS), welches die Schritte umfasst: – (i) Inkontaktbringen einer Probe von Körperflüssigkeit und/oder von Körpergewebe, welche von einem Patienten stammt, bei welchem man das Vorhandensein des HIV vermutet, mit einem Immunglobulin nach einem der Ansprüche 4 bis 6; – (ii) Detektion des Vorhandenseins eines Immunkomplexes zwischen dem Immunglobulin und dem Epitop R7V des Proteins gp160 des HIV, welches in der Probe enthalten ist.
  11. In vitro-Verfahren zur Behandlung eines biologischen Fluids von einem Patienten, welcher von einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, befallen ist, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, eine wirksame Menge Immunglobulin nach den Ansprüchen 1 bis 8 mit dem biologischen Fluid in Kontakt zu bringen derart, dass ein für die Pathologie spezifisches Epitop in dem Fluid neutralisiert wird.
  12. In vitro-Verfahren zur Neutralisation von durch das HIV infizierten Zellen in einer biologischen Probe von Körperflüssigkeit und/oder von Körpergewebe, welche von einem seropositiven Patienten stammt, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) gleichzeitig, getrennt oder zeitlich gestaffelt zusammenzugeben: – das Immunglobulin nach den Ansprüchen 5 bis 6, – die biologische Probe, welche die durch das HIV infizierten Zellen, die auf ihrer Oberfläche das Protein gp160 aufweisen, enthält, und – das an magnetische Teilchen angeheftete Protein G; b) die in a) erhaltene Mischung zu inkubieren unter Bedingungen, welche die Bindung des Immunglobulins an das Protein gp160 und bevorzugt an das Epitop R7V erlauben, um einen Komplex zu bilden, wobei der Komplex den Antikörper gebunden an eine durch das HIV infizierte Zelle, fixiert auf diesem magnetischen Teilchen, umfasst; c) dieses magnetische Teilchen in Richtung einer vorher festgelegten Stelle des Behälters, welcher diese Reaktionsmischung enthält, zu verschieben, wobei die Verschiebung beispielsweise durch ein magnetisches Feld, welches auf das magnetische Teilchen einwirkt, bewerkstelligt wird.
  13. In vitro-Verfahren zur Diagnose eines "Non-Progressor"-Patienten, welcher von einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, befallen ist, dadurch gekennzeichnet, dass man das Vorhandensein von Immunglobulin IgG3, welches die folgenden Merkmale aufweist: – eine Lebensdauer im Serum des Patienten von wenigstens einem Monat; – eine schwere Kette, deren Molekulargewicht, bestimmt anhand von elektrophoretischer Mobilität, geringer ist als das Molekulargewicht der normalerweise im menschlichen Serum vorhandenen IgG3 (60 kDa), wobei die schwere Kette ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa aufweist und die Komplementbindungsstelle umfasst, detektiert.
  14. Verfahren nach den Ansprüchen 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusinfektion AIDS ist.
  15. Verfahren nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels eines immunologischen Tests, ausgewählt unter einem ELISA-Test, einem RIA-Test, einem Sandwich-Verfahren, einer Immunpräzipitation, einem Agglutinationstest, ausgeführt wird.
  16. Verwendung eines Immunglobulins nach den Ansprüchen 1 bis 8, für die Ausführung eines immunologischen Tests, welcher unter dem ELISA-Test, dem RIA-Test, dem Sandwich-Verfahren, der Immunpräzipitation, dem Agglutinationstest ausgewählt wird.
  17. Immunglobulin nach Anspruch 1 bis 7 als Arzneimittel.
  18. Verwendung eines Immunglobulins nach Anspruch 17 als Arzneimittel als therapeutischer Antikörper.
  19. Verwendung eines Immunglobulins nach Anspruch 17 als Arzneimittel als Targeting-Mittel.
  20. Verwendung eines Immunglobulins nach den Ansprüchen 1 bis 7 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung einer Viruserkrankung oder Infektionskrankheit mit variabler Entwicklung bestimmt ist.
  21. Verwendung eines Immunglobulins nach den Ansprüchen 1 bis 7 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung von AIDS bestimmt ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 21 eines Immunglobulins nach den Ansprüchen 5 oder 6 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches dafür bestimmt ist, bei einem von AIDS befallenen Menschen das Protein gp160 von HIV zu neutralisieren.
  23. Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder die Verhütung einer Pathologie, ausgewählt unter den Virusinfektionen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung, umfassend ein Immunglobulin nach den Ansprüchen 1 bis 7 in Kombination mit einem Transportmittel, einem Verdünnungsmittel oder einem Träger, welche pharmazeutisch annehmbar sind.
  24. Verwendung eines Immunglobulins nach den Ansprüchen 1 bis 7 als Schutzmarker bei den Pathologien, welche unter den Viruserkrankungen und den Infektionskrankheiten mit variabler Entwicklung ausgewählt werden.
DE60305884T 2002-02-15 2003-02-13 Igg3 immunogloblin als schutzsmarker gegen viren infektiösen krankheiten und seine verwendungen Expired - Lifetime DE60305884T2 (de)

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